CN107304420A - 牛胰腺rna的提取方法及其产品和用途 - Google Patents

牛胰腺rna的提取方法及其产品和用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了牛胰腺RNA的提取方法及其产品和用途。本发明经过大量实验条件摸索和尝试，提出了两种新的可用于牛胰腺RNA的提取方法，分别得到核‑A与核‑B。脾细胞增殖免疫学实验结果表明，核‑A和核‑B在适当浓度范围内均可刺激脾细胞体外增殖，而且相较于核II，核‑A和核‑B均含有更多的功能RNA序列，且在高浓度情况下，核‑A以及核‑B对脾细胞的毒性明显降低。分别对核II经过液相分离得到的AD1组分、应用RNA提取试剂盒得到的RNA提取物以及核‑B通过microarray技术筛选与疾病有关的microRNA序列，结果表明核‑B的筛选结果中相关miRNA含量多于核II，响应值明显提高。本发明的提出为牛胰腺RNA的提取提供了一种新的技术手段，对于疾病的研究及治疗具有深远的意义。

Description

牛胰腺RNA的提取方法及其产品和用途
技术领域
本发明涉及牛胰腺RNA提取的新方法，还涉及由该方法提取得到的产品及其用途。本发明属于生物医药技术领域。
背景技术
注射用核糖核酸II(简称核II,BP素,吉林敖东延吉药业)是应用现代生物工程技术，从牛胰腺中提取的一种新型广谱抗肿瘤药物，主要成分为核糖核酸(RNA)。当与其它化疗药物同步使用，能够表现出较好的免疫学活性以及抗肿瘤活性。研究人员表示，在应用BP素的基础上，结合应用其他低毒性药物，有望发展出一种“温和药物疗法”，可为处在无法接受放化疗阶段的病人继续施治。动物实验结果表明，其对小鼠脾脏以及胸腺免疫器官重量没有明显影响，它能增强小鼠DTH反应；提高Con A刺激的脾淋巴细胞增殖能力，提高腹腔巨噬细胞吞噬功能。临床使用过程中对慢性阻塞性肺病以及恶性胸腔积液有较好治疗效果。但是该药物同样也能引起一些副反应的发生，包括头晕﹑恶心﹑胸闷﹑心悸以及荨麻疹﹑体温升高、注射部位可能产生局部红肿疼痛等，而这与所采用的提取的方法以及所提取的到的功能寡核酸的数量和种类有关。
目前，对于动物脏器RNA的提取工业上多采用传统的苯酚提取法，以及之后发展的比较剧烈的胍-酸-酚抽提法，实验室小量提取多采用市售的Trizol试剂以及更为便捷的RNA提取试剂盒(采用了硅胶滤器)等。
功能寡聚核苷酸对生物学过程的调控作用非常重要，干扰RNA(siRNA,19bp双链)和微小RNA(miRNA,23-25nt单链)能够序列特异性识别并沉默疾病mRNA，核酸适配体利用其独特三维结构特异性调控靶标蛋白或基因功能，均广泛应用于各种疾病、特别是肿瘤的治疗学研究中。
L.L.Coutinho和L.K.Matukumalli等人，应用人类micro RNA茎环序列与牛的基因组编码的一些序列作用，结果筛选出了334条预期的miRNA序列，其中有100条序列与人类的miRNA序列是一致的，说明不同物种间的miRNA的调控作用是有一定同源性的。他们对牛的不同组织进行筛选，发现不同组织器官的miRNA是有 差异的(Physiol.Genomics,2007,29,35–43)。
RNA适配体由于其的特殊性成为转录因子调控的有力候选药物。有研究表明，一些原核以及真核生物体内的RNA可以调控转录因子的活性，这些内源性的RNA包括5S RNA，6S RNA，7SK，HDV-RNA，神经限制性沉默因子(NRSE)-RNA，Gas5，固醇类受体RNA激活剂(SRA),TSU,mRNA的3’UTR序列，HSR1等(Nucleic Acid Ther.2015,26,29-43)。
核II有显著的免疫学以及抗肿瘤活性，同时也是一个天然的寡核苷酸序列库，应用microarry筛选技术，可得到多种与疾病相关的miRNA序列，以及一些研究比较少的相关序列。同样，其也可以作为核酸适配体的一个天然的RNA文库，进一步的筛选工作可以应用SELEX(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,指数富集的配体系统进化)技术筛选获得能够折叠成特定的三维构象、通过空间结构互补与靶标分子或细胞结合的较短的单链寡核苷酸序列，以及应用细胞SPR技术获取有意义的寡核苷酸序列。因此，建立具有更高含量的功能寡聚核苷酸序列库，进而筛选到更多的与疾病相关的miRNA序列，对于疾病的研究及治疗具有深远的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供两种改进后的，可用于牛胰腺RNA提取的新方法，采用本发明的方法获得的牛胰腺RNA提高了功能RNA序列的含量，且具有更低的毒性。
为了达到上述目的本发明采用了以下技术手段：
本发明通过对牛胰腺RNA提取新方法进行摸索和研究，确定了以下两种可用于牛胰腺RNA提取的新方法，即液氮迅速冷冻剥离了油脂的牛胰腺组织，然后研磨粉碎，再经：方法一(SDS热酚法)：室温放置适当时间，再进行后续提取过程，得到提取物核-A，该提取方法减少了链长15nt以下的RNA，且减少了容易引起过敏反应的长链RNA,提高了功能RNA的含量；或方法二(NP40裂解液法)：使用NP40裂解液代替苯酚进行细胞裂解，直接进行后续提取过程，得到提取物核-B，该方法明显提高了20nt-30nt的RNA含量，提取效果优于方法1。初步免疫学结果表明，核-A和核-B在适当浓度范围内均可刺激脾细胞体外增殖，而且相较于核II，核-A和核-B均含有更多的功能RNA序列，在高浓度情况下，核-A以及核-B对脾细胞的毒性明显降低。
具体的，方法一(SDS热酚法)包括如下步骤：
(1)将已经摘除油脂部分牛胰腺组织从-80℃冰箱中取出，迅速置于液氮中，用研钵研成粉末状，放于1.5ml的离心管中，于37℃水浴放置75min；
(2)加入SDS缓冲液，涡旋混匀，再加入苯酚溶液，混匀，60±2℃恒温震荡20min，迅速冷却至20℃以下，冰上静置2～5min；4℃离心15min，取上清，转入一个新的离心管中；
(3)上清液计量后，加入药液量2/5体积的苯酚溶液和1/10体积氯仿，混匀，置于冰上震荡15min，4℃离心15min，取上清，转入一个新的离心管中；
(4)重复(3)2次；
(5)上清液中加入氯仿，混匀，置于冰上震荡5min，4℃离心15min，取上清，转入一个新的离心管中；
(6)上清液加入pH 5.0的乙酸钠缓冲溶液，使乙酸钠浓度为0.15M，加药液体积2倍量的95％(v/v)乙醇，充分搅拌，静置12h以上，4℃离心15min，弃上清，得到白色沉淀；
(7)向沉淀中加入0.3M乙酸钠-氯化钠溶液，搅拌直至沉淀全部溶解为止，药液中再加2倍体积95％(v/v)乙醇，充分混匀，静置1.5h，4℃离心15min，弃上清，得到白色沉淀，适当挥干；
(8)重复(7)2次；
(9)沉淀中加入70％(v/v)的乙醇溶液，轻弹，冰上静置15min，4℃离心15min，弃上清，得到白色沉淀，适当挥干；
(10)沉淀中加入无水乙醇，轻弹，冰上静置5min，4℃离心15min，弃上清，得到白色沉淀，即为牛胰腺RNA。
在本发明方法一中，优选的，离心机使用的转速均为12,000转/分钟。
在本发明方法一中，优选的，步骤(2)中所述的SDS缓冲液为含有3.0g/ml的十二烷基硫酸钠，2.8g/ml氯化钠以及0.01M乙酸钠的DEPC水溶液。
在本发明方法一中，优选的，步骤(2)中每100mg的牛胰腺组织加入0.9ml SDS缓冲液，涡旋混匀后，再加入苯酚溶液0.54ml。
在本发明方法一中，优选的，步骤(3)中所述的苯酚溶液是将苯酚固体于60℃融化，加入其体积1/9的DEPC水，再加入8-羟基喹啉使其溶液终浓度为0.1％(w/v)，混匀即可，4℃保存。
在本发明方法一中，优选的，步骤(3)中所述的0.3M乙酸钠-氯化钠溶液为 含有0.3M乙酸钠的0.9％(w/v)的氯化钠溶液。
在本发明方法一中，优选的，步骤(5)中氯仿的加入量为上清液体积的1/5。
方法二(NP40裂解液法)，包括以下步骤：
(1)将已经摘除油脂部分牛胰腺组织从-80℃冰箱中取出，迅速置于液氮中，用研钵研成粉末状，放于1.5ml的离心管中，加入NP 40裂解液，涡旋混匀后，于冰上静置10-15min，13000r/min，4℃离心10min；
(2)离心后取上清于新的离心管中，加入Na2-EDTA溶液，混匀，得到混合液；
(3)向步骤(2)得到的混合液中加入有机抽提液3，混匀，冰上静置10min，期间多次上下颠倒，然后于55℃水浴中保温5min，之后于冰上静置5min，14800r/min，4℃离心10min；
(4)离心后取上清于新的离心管中，加入有机抽提液2或3，混匀，冰上静置10min，期间多次上下颠倒，然后13000r/min，4℃离心10min；
(5)重复步骤(4)一次；
(6)离心后取上清于新的离心管中，加入氯仿，混匀，冰上静置2min至5min，期间多次上下颠倒，然后13000r/min，4℃离心10min；
(7)离心后取上清液于新的离心管中，加pH 5.0的乙酸钠缓冲溶液，使乙酸钠浓度为0.15M，然后加入药液体积2倍量的95％(v/v)乙醇溶液，充分搅拌，静置12h以上，4℃离心15min，弃上清，得到白色沉淀，适当挥干；
(8)向沉淀中加入乙酸钠-氯化钠溶液搅拌直至沉淀全部溶解为止，向得到的药液中加入95％(v/v)的乙醇溶液，充分混匀，静置1.5h，4℃离心15min，弃上清，得到白色沉淀，适当挥干；
(9)重复步骤(8)操作2次，得到白色沉淀，适当挥干；
(10)向沉淀中加入70％(v/v)的乙醇溶液，轻弹，冰上静置15min，4℃离心15min，弃上清，得到白色沉淀，适当挥干；
(11)向沉淀中加入无水乙醇，轻弹，冰上静置5min，4℃离心15min，弃上清，得到白色沉淀，即为牛胰腺RNA；
其中，所述的抽提液3是将苯酚(苯酚固体于60℃融化)与Tris-SDS缓冲液按照体积比1:1混合，形成Tris-SDS饱和的苯酚溶液，之后加入等体积的氯仿与异戊醇的混合液，其中氯仿与异戊醇的体积比为24:1，混合均匀，加入8-羟基喹啉，使其终浓度达到1mg/ml，提前一天配好，静置到分层明显，使用下层有机层；
其中，所述的抽提液2是将苯酚溶液与等体积的氯仿与异戊醇的混合液混合均 匀，其中氯仿与异戊醇的体积比为24:1，提前一天配好，静置到分层明显，使用下层有机层；其中所述的苯酚溶液是将苯酚固体于60℃融化，加入其重量10％的纯化水，再加入8-羟基喹啉使其溶液终浓度为0.1％(w/v)，混匀即可，4℃保存。
在本发明方法二中，优选的，步骤(1)中每100mg的牛胰腺组织，加入1ml的NP 40裂解液。
在本发明方法二中，优选的，步骤(2)中加入Na2-EDTA溶液使其终浓度为10mmol/L。
在本发明方法二中，优选的，步骤(3)中有机抽提液3的加入量为步骤(2)混合液体积的1/2，步骤(4)中有机抽提液2或3的加入量为上清液体积的1/2。
在本发明方法二中，优选的，步骤(6)中氯仿的加入量为上清液体积的1/5。
在本发明方法二中，优选的，所述的NP 40裂解液为含有140mmol/L NaCl，1.5mmol/L MgCl2，0.5％(v/v)NP 40的10mmol/L Tris-Cl溶液，pH 8.5。
在本发明方法二中，优选的，所述乙酸钠-氯化钠溶液为含有0.3M乙酸钠的0.9％(w/v)的氯化钠溶液。
在本发明方法二中，优选的，所述的Tris-SDS缓冲液为含有100mmol/L NaCl，1mmol/L Na2EDTA·2H2O以及0.5％(w/v)SDS的10mmol/L Tris溶液，pH 8.5。
进一步，本发明还提出了按照本发明方法一或方法二提取得到的牛胰腺RNA以及
所述的牛胰腺RNA在制备广谱型抗肿瘤药物中的用途。以及
所述的牛胰腺RNA在筛选与疾病相关的miRNA序列中的用途。
相较于现有技术，本发明的优点在于：
1.提出了两种牛胰腺RNA的提取新方法，方法一：应用液氮将牛胰腺组织磨制粉末，减少了提取前功能RNA的降解，同时增加了提取物的均一性，同时将组织37℃放置不同时间(75min，2.5h以及4.5h)，降解过长RNA链，并且发现降解时间不同，提取的RNA链长范围也不同，在本发明中优选放置75min。方法二：应用了NP 40为裂解液降低了提取过程中苯酚的使用量，从而减少对于环境的污染，此外方法一和方法二均提高了功能RNA序列的含量。与市售的注射用核糖核酸II比较，改进RNA提取方法后，链长在20-30nt的RNA链增加(260/280≈2.0；260/230≥2.0)，在凝胶电泳图中,上样量为1500ng/孔时，加样孔处的较长链明显减少，其中方法2更为明显(见图2)。
2.对比新方法提取的核-A，核-B与核II的免疫学活性，刺激小鼠脾细胞增殖 免疫学实验结果表明，在一定浓度范围内核-A,核-B与核II均可以刺激小鼠脾细胞增殖，相较于核II，核-A，核-B在较高浓度时对脾细胞的毒性相对较低。
3.考察了核-A，核-B与核II对MCF-7，HL-60和K562细胞的细胞毒作用，结果表明核II，核-A与核-B均表现出对K562、MCF-7以及HL-60细胞的细胞毒作用。且相较于核II，改进提取方法后得到的核-A，核-B抑制MCF-7肿瘤细胞生长的作用明显加强。
4.通过microarray技术对比核II经液相分离得到的AD1组分以及应用市售的RNA提取试剂盒提取的牛胰腺RNA和方法二提取的牛胰腺RNA提取物中的micro RNA序列进行筛选，共筛选得到677条micro RNA序列，其中有多种与肿瘤发生发展以及免疫相关的microRNA序列，为进一步研究牛胰腺RNA的作用机制，发现治疗白血病的新靶点奠定了基础。
附图说明
图1为本发明方法一的流程图；
图2为本发明方法二的流程图；
图3为采用本发明方法提取的RNA以及核II的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
图3a：1.30nt双链DNA；2.21nt双链RNA；3,5,7.核II，上样量分别为1500ng,750ng,375ng；4,6,8.方法一提取的RNA，上样量分别为1500ng,750ng,375ng；
图3b：1.30nt双链DNA；2.21nt双链RNA；2,5,7.核II，上样量分别为1500ng,750ng,375ng；4,6,8.方法二提取的RNA，上样量分别为1500ng,750ng,375ng；
图4为核-A，核-B以及核II对K562细胞的细胞毒性实验结果；
图5a为CLD包载核II的聚丙烯酰胺凝胶电泳图；
1.30bp双链DNA；2.1250ng核II；3.50ng核II；4，5,6分别为以250ng,125ng,25ng的核II与等体积0.6nmol/μl的CLD溶液制备的脂质体；7,8,9分别为以250ng,125ng,25ng的核II与等体积0.06nmol/μl的CLD溶液制备的脂质体；
图5b为图5a中25ng的核II与等体积0.06nmol/μl的CLD溶液制备的脂质体的粒径分布图；
图6为核-A，核-B以及核II用阳离子脂质载体CLD包载对MCF-7，HL-60和K562细胞的细胞毒性实验结果；
图6a为核-A，核-B以及核II用阳离子脂质载体CLD包载对MCF-7细胞的细胞毒性实验结果；
图6b为核-A，核-B以及核II用阳离子脂质载体CLD包载对HL-60细胞的细胞毒性实验结果；
图6c为核-A，核-B以及核II用阳离子脂质载体CLD包载对K562细胞的细胞毒性实验结果；
图7为采用本发明方法提取的RNA以及核II对刺激脾细胞增殖的效果比较；
图7a.药物作用时间为24h；图7b.药物作用时间为48h；
图8为采用本发明方法提取的RNA以及核II在ConA或LPS辅助情况下刺激脾细胞增殖的实验结果；
图9为流式分析采用本发明方法提取的RNA以及核II对小鼠脾脏T淋巴细胞亚群影响的结果；
图9a.给药浓度0.0125mg/ml；图9b.给药浓度0.05mg/ml；
图10为采用本发明方法提取的RNA以及核II对脾细胞体外分泌TNF的影响；
图11为采用本发明方法提取的RNA以及核II对脾细胞体外分泌IFN的影响；
图12为采用本发明方法提取的RNA以及核II对脾细胞体外分泌IL4的影响；
图13为采用本发明方法提取的RNA以及核II对脾细胞体外分泌IL4的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明实施例所采用的试剂及细胞系：
miRNA提取试剂盒购自北京艾德莱生物科技有限公司，RN05；注射用核糖核酸II由吉林敖东药业集团延吉股份有限公司提供；CCK-8试剂盒购自日本株式会社同仁化学研究所。免疫因子检测试剂盒为应用流式技术检测的试剂盒：BD Cytometric Bead Array(CBA)Mouse Soluble Protein Master Buffer Kit的缓冲液试剂盒和MS IFN-GMA CBA Flex Set,MS IL-2 CBA Flex SetMS IL-4 CBA Flex Set,MS TNF CBA Flex Set相关因子的带有抗体的磁珠的试剂盒；来源于ATCC的人类红白血病细胞株K562细胞采用含有10％胎牛血清的1640培养液进行培养。宫颈腺癌上皮细胞株Hela、Balb-c小鼠脾细胞采用含有10％胎牛血清的DMEM培养液进行培 养，Balb-c小鼠来源于北京大学医学部动物部。Microarray选用Affymetrix GeneChip miRNA 3.0Array委托上海其明信息技术有限公司完成。
实施例1 SDS热酚法提取牛胰腺RNA
1、试剂的配制
1.1 SDS缓冲液配制：
配方如下：
原料 用量
十二烷基硫酸钠 0.15g
氯化钠 0.41g
2.5M乙酸钠(pH为5.0) 0.2ml
DEPC水 至总体积50ml
其中，2.5M乙酸钠(pH为5.0)的配方如下：
原料 用量
乙酸钠 10.25g
盐酸(根据pH值适量加入) 根据pH值适量加入
DEPC水 至总体积50ml
1.2苯酚溶液的配制：
苯酚固体于60℃融化，加入其体积1/9的DEPC水，再加入8-羟基喹啉使其溶液终浓度为0.1％(1mg/ml)，混匀即可，4℃保存。
1.3 0.3M乙酸钠-氯化钠溶液的配制
0.9％(w/v)氯化钠溶液中加入2.5M乙酸钠溶液，使乙酸钠浓度达到0.3M。
2、方法
(1)将已经摘除油脂部分牛胰腺组织(～100mg)从-80℃冰箱中取出，迅速置于液氮中，用研钵研成粉末状，放于1.5ml的离心管中，于37℃水浴放置75min；
(2)加入SDS缓冲液(0.9ml),涡旋混匀约5min,再加入苯酚溶液(0.54ml)，混匀，60±2℃恒温震荡20min，迅速冷却至20℃以下，冰上静置2～5min；
(3)4℃离心15min，取上清，转入一个新的离心管中；
(4)上清液计量后(约0.9ml)加入药液量2/5体积苯酚溶液(约0.4ml)和1/10体积氯仿(约0.1ml)，混匀，置于冰上震荡15min，4℃离心15min，取上清，转入 一个新的离心管中；
(5)重复(4)2次；
(6)上清液计量后(约0.8ml)加入药液量1/5体积的氯仿(约0.16ml)，混匀，置于冰上震荡5min，4℃离心15min，取上清，转入一个新的离心管中；
(7)最后上清液(约0.7ml)加乙酸钠缓冲溶液(45μl,pH 5.0)，使乙酸钠浓度为0.15M，然后加入药液体积2倍量的95％(v/v)乙醇溶液(约1.2ml)，充分搅拌，静置12h以上，4℃离心15min，弃上清，得到白色沉淀；
(8)向沉淀中加入乙酸钠-氯化钠溶液(0.2ml),搅拌直至沉淀全部溶解为止。药液中再加2倍体积95％(v/v)乙醇溶液(约0.35ml)，充分混匀，静置1.5h，4℃离心15min，弃上清,得到白色沉淀，适当挥干；
(9)重复(8)2次；
(10)沉淀中加入70％(v/v)的乙醇溶液(0.5ml),轻弹,冰上静置15min,4℃离心15min，弃上清，得到白色沉淀，适当挥干；
(11)沉淀中加入无水乙醇0.2ml，轻弹，冰上静置5min，4℃离心15min，弃上清，得到白色沉淀，即为牛胰腺RNA(命名为核-A)；
注:以上离心机使用的转速均为12,000转/分钟。提取流程图如图1所示。
3、RNA的相对产量及分布：
经计算，每1g牛胰腺组织可以提取约2.5mg RNA，RNA相对提取率：RNA的质量/所需牛胰腺组织的质量*100％＝0.25％。
相较于核II，该提取方法减少了链长15nt以下的RNA，且减少了容易引起过敏反应的长链RNA(图3a)，通过凝胶电泳实验可以看到20-30nt的RNA明显增加(功能RNA多集中于这一长度)。
实施例2 NP 40裂解液法提取牛胰腺RNA
1、试剂的配制
1.1 NP 40裂解液的配制:
配方如下：
其中，Tris-Cl溶液(10mmol/L,pH 8.5)按照以下方法配制：
Tris 121.14mg，三羟甲基氨基甲烷48.5mg，加DEPC水至40ml，用HCl调节pH:用稀释5倍的浓盐酸调至pH为8.5。
1.2抽提液3的配制：
Tris-SDS缓冲液的配制：
原料 用量
NaCl 0.23g
Na2EDTA·2H2O 0.015g
10mmol/L Tris,pH 8.5 40ml
SDS 0.2g
抽提液3的配制：苯酚10ml(苯酚固体于60℃融化)与Tris-SDS缓冲液10ml混合，形成Tris-SDS饱和的苯酚溶液(20ml)，之后加入的氯仿:异戊醇(24:1,20ml),混合均匀，加入8-羟基喹啉(40mg),提前一天配好，静置到分层明显，使用下层有机层。
1.3 Na2-EDTA溶液(0.2M)的配制:
0.22g Na2-EDTA·2H2O加3ml DEPC水。
1.4 2.5M乙酸钠(pH为5.0)的配制：
乙酸钠10.25g溶于一定量的DEPC水中，加入盐酸，使其pH达到5.0，补充DEPC水至50ml。
1.5抽提液2的配制:
苯酚溶液配制:苯酚固体于60℃融化，加入其体积1/9的DEPC水，再加入8-羟基喹啉使其溶液终浓度为0.1％(1mg/ml)，混匀即可，4℃保存。
按照苯酚溶液:氯仿:异戊醇体积比为25:24:1的比例,混合均匀，提前一天配好，静置到分层明显，使用下层有机层。
1.6乙酸钠-氯化钠溶液:
0.9％(w/v)氯化钠溶液中加入2.5M乙酸钠溶液，使乙酸钠浓度达到0.3M。
2、方法
(1)将已经摘除油脂部分牛胰腺组织(～100mg)从-80℃冰箱中取出，迅速置于液氮中，用研钵研成粉末状，放于1.5ml的离心管中，加入NP 40裂解液(1ml)，将其用涡旋混匀后，于冰上静置10-15min，13000r/min，4℃，离心10min；
(2)取上清(约1ml)于新的离心管中，加入Na2-EDTA溶液(约20μl，0.2M)使其终浓度为10mmol/L，混匀；
(3)加入1/2体积的有机抽提液3(约0.5ml)，混匀，冰上静置10min，期间多次上下颠倒；将上述样品于55℃水浴中保温5min，之后于冰上静置5min，14800r/min，4℃，离心10min；
(4)取上清(约0.9ml)于新的离心管中，加入1/2体积的有机抽提液2或3(约0.45ml)，混匀，冰上静置10min,期间多次上下颠倒，13000r/min，4℃，离心10min；
(5)重复(4)一次
(6)取上清(约0.8ml)于新的离心管中，加入1/5体积的氯仿(约0.16ml)，混匀，冰上静置2min至5min,期间多次上下颠倒，13000r/min，4℃，离心10min。
(7)最后取上清液(约0.7ml)于新的离心管中，加乙酸钠缓冲溶液(45μl,pH 5.0)，使乙酸钠浓度为0.15M，加药液体积2倍量的95％(v/v)乙醇(约1.2ml)，充分搅拌，静置12h以上，4℃离心15min，弃上清，得到白色沉淀；
(8)沉淀中，加乙酸钠-氯化钠溶液(0.2ml)搅拌溶解，使沉淀全部溶解为止。药液中再加95％(v/v)乙醇溶液(0.4ml)，充分混匀，静置1.5h，4℃离心15min，弃上清，得到白色沉淀，适当挥干；
(9重复步骤(8)操作2次；
(10)沉淀中加入70％(v/v)的乙醇(0.5ml)，轻弹，冰上静置15min，4℃离心15min，弃上清，得到白色沉淀，适当挥干；
(11)沉淀中加入无水乙醇0.2ml,轻弹，冰上静置5min，4℃离心15min，弃上清，得到白色沉淀，即为牛胰腺RNA(命名为核-B)；
提取流程图如图2所示。
3、RNA相对产量及分布:
每1g牛胰腺组织可以提取约3mg RNA,RNA相对提取率：RNA的质量/所需牛胰腺组织的质量*100％＝0.30％。
与核II比较，改进RNA提取方法后，链长在20-30nt的RNA链增加(260/280≈2.0；260/230≥2.0)，在凝胶电泳图中,上样量为1500ng/孔时，加样孔处的较长链明显减少(见图3b)。
实施例3本发明提取得到的牛胰腺RNA的抗癌活性比较研究
1、方法
1.1 RNA提取方法：
注射用核糖核酸II(简称“核II”)的提取方法：为常规的SDS热酚法，以SDS苯酚溶液为裂解液，苯酚氯仿混合液为抽提液，再用乙醇溶液沉淀核酸。
实验室总RNA提取方法：采用市售的Trizol试剂提取，实验室miRNA的提取方法应用miRNA提取试剂盒提取。
SDS热酚法：按照本发明实施例1进行，提取得到的牛胰腺RNA命名为核-A。
NP40裂解液法：按照本发明实施例2进行，提取得到的牛胰腺RNA命名为核-B。
1.2细胞毒性检测—CCK-8法
制备待测细胞悬液，将细胞均匀加入到96孔板各孔中，K562细胞培养起始密度为8×104细胞/ml，每空100μl。37℃培养16～24h，使细胞密度达到80％～90％。核II，核-A，核-B以及实验室提取方法获得的RNA以适当给药浓度给药，做3个复孔。空白细胞对照组：加入与给药组等体积的OptiMEM。转染试剂对照组：加入与给药组等体积的用OptiMEM稀释的等量的转染试剂RNAiMAX。空白培养基对照组：不含有细胞以及RNA药物组分以及转染试剂，加入与给药组等体积的OptiMEM。实验组：加入不同提取方法得到的RNA，以及等量的转染试剂RNAiMAX。给药量浓度为为0.025mg/ml，转染试剂为每孔0.2μl。给药前分别将等体积的RNA与等体积的转染试剂混合，孵育5min，之后再分别给药。37℃培养细胞24h后每培养孔中加入10μl CCK-8试剂。37℃培养1h，测定450nm吸光度(BioTek Gen5酶标仪，美国伯腾仪器有限公司)，之后每小时测450nm吸光度，当吸光度达到1.5时，静置10min达到室温再测一次。IC50的计算方法：细胞存活率(％)＝(实验组的OD值-空白组的OD值)/(对照组的OD值-空白组的OD值)×100％。
进一步考察了核-A，核-B与核II的阳离子脂质载体包裹体对MCF-7，HL-60和K562细胞的细胞毒作用,制备待测细胞悬液，将细胞分别均匀加入到96孔板各孔中，MCF-7，HL-60和K562细胞培养起始密度为2×104细胞/ml，每孔200μl，37℃培养16～24h。以实验室合成的阳离子脂质载体CLD(该脂质体已记载在公开号为CN102925487A，发明名称为“一种阳离子脂质载体及其制备方法和应用”的专利申请中)包载提取的RNA，选用0.06nmol/μl CLD与等体积的25ng/μl的RNA制备脂质体。空白细胞对照组：加入与给药组等体积的OptiMEM。转染试剂对照组：加入与给药组等体积的用OptiMEM稀释的等量的阳离子脂质载体CLD。空白培养基对照组：不含有细胞以及RNA药物组分以及阳离子脂质载体CLD，加入与给药 组等体积的OptiMEM。实验组：加入阳离子脂质载体CLD包载的不同提取方法得到的RNA，给药量浓度为为0.0025mg/ml。37℃培养细胞48h后每培养孔中加入20μl CCK-8试剂。37℃培养1h，测定450nm吸光度(BioTek Gen5酶标仪，美国伯腾仪器有限公司)，之后每小时测450nm吸光度，当吸光度达到1.5时，静置10min达到室温再测一次。IC50的计算方法：细胞存活率(％)＝(实验组的OD值-空白组的OD值)/(对照组的OD值-空白组的OD值)×100％。
1.3体外刺激小鼠脾细胞增殖实验
1.3.1脾细胞悬液制备
取Balb-c小鼠断颈除死，无菌取脾脏，去除粘连的结缔组织，置于盛有适量PBS的平皿或六孔板中,准备三个大的圆形培养皿，一个加入适量75％的乙醇，另外两个加入适量PBS。将小鼠脾脏置于75％的乙醇中30s-1min,用无菌镊子将脾脏在PBS中漂洗静置1min，弃去漂洗的PBS。将小鼠脾脏置于另一干净的有PBS的培养皿中，用两片带有磨砂面的载玻片(已灭菌，急用可蘸取酒精，用酒精灯反复烧几次)，双手各持其一，将玻片毛面用PBS浸润，将脾脏移至其中一块玻片上，用另一块玻片压摸脾脏一角，逐渐将脾脏磨制单细胞悬液(注意用力均匀，避免出现大块组织)。将载玻片在PBS中漂洗，将脾脏细胞漂洗入PBS中，将两层100目的钢网置于15ml的离心管口，过滤脾细胞悬液，1500r,3min离心，去上清，再重复过两次网后，加入1ml红细胞裂解液RLB室温裂解1min,立即加入10ml PBS终止裂解，1500r,3min,离心，去上清。加入10ml PBS重悬，细胞计数，铺板。
1.3.2实验分组
1.3.2.1对照组：
(1)空白对照组：等体积的细胞培养液加入与给药量相等的PBS：
(2)空白细胞对照组：在含有细胞的培养液中加入等体积的PBS；
(3)ConA对照组：在含有细胞的培养液中加入5μl ConA工作液，使终浓度为0.8μg/ml；
(4)LPS对照组：在含有细胞的培养液中加入5μl LPS工作液，使终浓度为1.5μg/ml。
1.3.2.2实验组
将核II，核-A，核-B分别溶于PBS中并分为四个剂量，使每实验组终浓度分别为0.06,0.0125,0.025,0.05mg/ml；
(1)空白给药组：在含有细胞的培养液中加入5μl核酸药物总组分，使终浓度 分别为0.06,0.0125,0.025,0.05mg/ml；
(2)ConA给药组：在ConA对照组基础上加入5μl核酸药物总组分，使终浓度分别为0.06,0.0125,0.025,0.05mg/ml；
(3)LPS给药组：在LPS对照组基础上加入5μl核酸药物总组分，使终浓度分别为0.06,0.0125,0.025,0.05mg/ml；
每组设置3个重复孔，37℃孵箱继续孵育24小时。
1.3.3 CCK-8细胞活力检测：
每培养孔中加入10μl CCK-8。37℃培养1h，测定450nm吸光度，之后每小时测450nm吸光度，当吸光度OD值达到1.5时，静置10min达到室温再测一次，为最终OD值。
刺激指数(stimulation index，SI)计算方法：刺激指数＝实验组的OD值/空白组的OD值。
1.4免疫因子测试实验
前期获取小鼠脾细胞操作同体外刺激小鼠脾细胞增殖实验，培养24h后，取培养液上清，按照BD Cytometric Bead Array(CBA)Mouse Soluble Protein Master Buffer Kit说明说操作。
2.结果及分析
2.1细胞毒性检测—CCK-8法
以商用转染试剂RNAiMAX转染，在给药浓度为0.025mg/ml时，核II，核-A与核-B均表现出对K562细胞的细胞毒作用。说明核-A与核-B维持了核II对K562的细胞毒作用(见图4)。
进一步考察了核-A，核-B与核II对K562、MCF-7和HL-60的细胞毒作用,由于RNA药物本身不易入胞，采用了实验室合成的阳离子脂质载体CLD包载提取的RNA，之后给药，降低RNA药物给药浓度，提高了转染效率(包载效果见图5a,b)。本实验综合阳离子脂质载体CLD的自身毒性作用以及包载效果选用0.06nmol/μl CLD与等体积的25ng/μl的RNA制备脂质体。核-A，核-B与核II对MCF-7为人乳腺癌细胞有较好的细胞毒作用，0.0025mg/ml的给药浓度即可达到60％左右的细胞毒作用，改进提取方法后抑制MCF-7肿瘤细胞生长的作用明显加强，作用强于对前期研究工作筛选出的K562细胞，对于发现治疗乳腺癌领域的研究有一定意义。核-A，核-B与核II对HL-60人早幼粒白血病细胞也有较好的细胞毒作用(见图6)。
2.2体外刺激小鼠脾细胞增殖实验
2.2.1无Con A以及LPS辅助刺激体外刺激小鼠脾细胞增殖实验
研究结果表明，相较于核II，核-A和核-B在较低浓度(0.006mg/ml)便有免疫激活作用，可以刺激小鼠脾细胞增殖，且在较高浓度作用下，相较于核II，核-A和核-B具有更显著的刺激脾细胞增殖的作用。说明改进提取方法后在较高浓度下对免疫细胞的毒性降低(见图7)。
2.2.2 Con A和LPS辅助刺激体外刺激小鼠脾细胞增殖实验
Con A和LPS辅助下，核-A，核-B与核II并没有明显差异，用核-B效果稍强于其它两种(见图8)。
2.2.3核II与核-A，核-B对小鼠脾T淋巴细胞亚群比例的影响
通过流式细胞技术检测核II与核-A，核-B对小鼠脾T淋巴细胞亚群比例的影响。给药浓度为0.0125mg/ml时，改进提取方法后得到的核-A与核-B与核II对于小鼠脾T淋巴细胞的亚群比例，没有明显影响。给药浓度为0.05mg/ml时，核-A，核-B与核II的作用有较为明显的区别，可以看出，相较于核-II，核-A和核-B可以降低对CD4+T细胞的毒性(见图9)。
2.2.4脾细胞体外免疫因子分泌量检测实验
对比核-A,核-B与核II对脾细胞体外分泌免疫因子的影响。核II、核-A和核-B均能促进脾细胞对TNF和IFN的分泌，抑制IL-2和IL-4的分泌(见图10-13)。刺激脾细胞增殖的效果不一定和细胞因子的分泌量成正比。
实施例4本发明提取得到的牛胰腺RNA在筛选与疾病相关的miRNA中的应用
分别对核II液相分离得到的AD1组分、用micro RNA试剂盒提取的RNA以及改进提取工艺后得到的核-B应用miRNA 3.0 Array芯片进行了筛选，三次的筛选结果响应值最高的前十条序列分别如下。
表1.三轮筛选中响应值最高的miRNA序列对比
比较三次筛选结果，三次筛选得到的microRNA序列重现性较好，共677条microRNA序列，相较于AD1组分，核-B相关microRNA序列响应值明显提高。但上述的10个序列中，几乎所有序列的GC含量达到75％以上，或者含有10个以上的连续A碱基，均不符合常规microRNA的要求，其响应值高可能与其在检测过程中与芯片上的互补序列形成的双链较为稳定有关，因此进一步对筛选得到的响应值较高的序列进行考察，选择了GC含量在40-60％且具有较高响应值的序列。
表2.核-B筛选中响应值较高且GC含量适中的miRNA序列
其中，let-7b、let-7c均为已报道的具有抗癌抗肿瘤活性的miRNA，let-7b可以靶向Cthrc1和ING1而抑制胃癌细胞的增殖，同时具有抑制黑色素瘤和维持染色体平衡的作用，而let-7c可以通过靶向CDC25A和Mgat4a抑制肝癌细胞的增殖和代谢，同时可以抑制登革热病毒的复制和非小细胞肺癌的侵袭迁移等。
核-B的筛选结果中一些与疾病相关的miRNA含量多于核II，响应值明显提高， 接近于商用microRNA试剂盒的提取的RNA的筛选结果。
选取筛选的序列中部分序列，发现部分序列对K562细胞有明显的细胞毒作用，包括miRN11,miRN12,miRN13,miRN14，其中miRN13对K562的明显的细胞毒作用，有望发展为靶向白血病的适配体，或白血病治疗领域的新靶点。筛选的部分序列中mi RN12对K562细胞有靶向作用，且反义链荧光标记的miRN12序列对K562细胞的结合更强，有类似于核酸适配体的功能。

Claims (10)

1.一种牛胰腺RNA的提取方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将已经摘除油脂部分牛胰腺组织从-80℃冰箱中取出，迅速置于液氮中，用研钵研成粉末状,放于1.5ml的离心管中，加入NP 40裂解液，涡旋混匀后，于冰上静置10-15min，13000r/min，4℃离心10min；
(2)离心后取上清于新的离心管中，加入Na2-EDTA溶液，混匀，得到混合液；
(3)向步骤(2)得到的混合液中加入有机抽提液3，混匀，冰上静置10min，期间多次上下颠倒，然后于55℃水浴中保温5min，之后于冰上静置5min，14800r/min，4℃离心10min；
(4)离心后取上清于新的离心管中，加入有机抽提液2或3，混匀，冰上静置10min，期间多次上下颠倒，然后13000r/min，4℃离心10min；
(5)重复步骤(4)一次；
(6)离心后取上清于新的离心管中，加入氯仿，混匀，冰上静置2min至5min，期间多次上下颠倒，然后13000r/min，4℃离心10min；
(7)离心后取上清液于新的离心管中，加pH 5.0的乙酸钠缓冲溶液，使乙酸钠浓度为0.15M，然后加入药液体积2倍量的95％(v/v)乙醇溶液，充分搅拌，静置12h以上，4℃离心15min，弃上清，得到白色沉淀，适当挥干；
(8)向沉淀中加入乙酸钠-氯化钠溶液搅拌直至沉淀全部溶解为止，向得到的药液中加入95％(v/v)乙醇溶液，充分混匀，静置1.5h，4℃离心15min，弃上清，得到白色沉淀，适当挥干；
(9)重复步骤(8)操作2次，得到白色沉淀，适当挥干；
(10)向沉淀中加入70％(v/v)的乙醇溶液，轻弹，冰上静置15min，4℃离心15min，弃上清，得到白色沉淀，适当挥干；
(11)向沉淀中加入无水乙醇，轻弹，冰上静置5min，4℃离心15min，弃上清，得到白色沉淀，即为牛胰腺RNA；
其中，所述的抽提液3是将苯酚与Tris-SDS缓冲液按照体积比1:1混合，形成Tris-SDS饱和的苯酚溶液，之后加入等体积的氯仿与异戊醇的混合液，其中氯仿与异戊醇的体积比为24:1，混合均匀，加入8-羟基喹啉，使其终浓度达到1mg/ml，提前一天配好，静置到分层明显，使用下层有机层；
其中，所述的抽提液2是将苯酚溶液与等体积的氯仿与异戊醇的混合液混合均匀，其中氯仿与异戊醇的体积比为24:1，提前一天配好，静置到分层明显，使用下层有机层；其中所述的苯酚溶液是将苯酚固体于60℃融化，加入其体积1/9的DEPC水，再加入8-羟基喹啉使其溶液终浓度为0.1％(w/v)，混匀即可，4℃保存。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中每100mg的牛胰腺组织，加入1ml的NP 40裂解液。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中加入Na2-EDTA溶液使其终浓度为10mmol/L。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)中有机抽提液3的加入量为步骤(2)混合液体积的1/2，步骤(4)中有机抽提液2或3的加入量为上清液体积的1/2。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(6)中氯仿的加入量为上清液体积的1/5。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的NP 40裂解液为含有140mmol/L NaCl，1.5mmol/L MgCl2，0.5％(v/v)NP 40的10mmol/L Tris-Cl溶液，pH 8.5。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的乙酸钠-氯化钠溶液为含有0.3M乙酸钠的0.9％(w/v)的氯化钠溶液，所述的Tris-SDS缓冲液为含有100mmol/L NaCl，1mmol/L Na2EDTA·2H2O以及0.5％(w/v)SDS的10mmol/L Tris溶液,pH 8.5。
8.按照权利要求1-7任一项所述的方法提取得到的牛胰腺RNA。
9.权利要求8所述的牛胰腺RNA在制备广谱型抗肿瘤药物中的用途。
10.权利要求8所述的牛胰腺RNA在筛选与疾病相关的miRNA序列中的用途。
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