CN106093221A - 一种复方中药茵栀黄的质量控制方法 - Google Patents

一种复方中药茵栀黄的质量控制方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种复方中药茵栀黄的质量控制方法，该方法包括：通过进行多种色谱柱选择、流动相的选择、柱温、流速的设定、前处理方法的优化、流动相梯度的设置，建立茵栀黄注射液的色谱‑紫外‑质谱指纹图谱；利用LCMS‑IT‑TOF技术对茵栀黄注射液进行定性分析：对30个峰进行推导，归属推导出24种成分，对剩余的6个峰进行分子式的推导，鉴定11种物质。本发明利用先进的LCMS‑IT‑TOF对茵栀黄注射液进行定性分析，发现了11种未报到的新物质，还利用三重四级杆线性离子阱液质联用和液相技术，测定了五种茵栀黄制剂中16种成分的含量。

Description

一种复方中药茵栀黄的质量控制方法
技术领域
本发明属于医药技术领域，尤其涉及一种复方中药茵栀黄的质量控制方法。
背景技术
茵栀黄注射液作为一剂传统中药注射液，可抗菌消炎、利湿退黄，在临床上应用广泛，疗效已得到肯定。但是，近年来有关茵栀黄注射液的不良反应的报道也时有发生，这不得不让深思，并采取相应的措施：1、严格按照药品说明书中推荐的剂量使用，2、要重视对患者既往过敏史的询问要重视对患者既往过敏史的询问，3、合理配伍，除此以外，质量监管部门还有必要制定比较完善的标准来加大监管力度，中国药典(2010版)中讲述了茵栀黄口服液的鉴别方法，通过薄层色谱法对照茵陈、栀子对照药材进行鉴别，另外还要检查它的相对密度，pH值，对于含量测定，规定茵栀黄口服液中黄芩提取物每一毫升含黄芩苷应为0.34～0.46g，栀子提取物中栀子苷的含量不得少于0.8mg/mL。茵栀黄注射液质量标准收载于卫生部药品标准中药成方制剂第十四册)，明确规定的茵栀黄注射液检查项目有pH值、热源、炽灼残渣、含量测定，其中含量测定采用分光光度法，要求每毫升黄黄芩苷应为20.0-22.5mg，但是茵栀黄复方制剂各味药材所含化学成分复杂，仅仅测定茵栀黄制剂中黄芩苷、绿原酸、栀子苷的含量是远远不够的，还有必要对它所含其他主要成分进行定性定量分析，建立质量控制体系。
茵栀黄注射液作为一剂传统中药注射液，由茵陈、栀子、金银花提取物和黄芩甙组方配伍而成，用于清热，解毒，利湿，退黄，在临床上应用广泛，疗效已得到肯定。
但茵栀黄复方制剂各味药材所含化学成分复杂，依据中国药典和有关部颁标准(中药成方制剂第十四册WS3-B-2736-97)，仅测定茵栀黄制剂中黄芩苷、 绿原酸、栀子苷的含量不尽合理，有必要对它所含其他主要成分进行化学指纹和定量分析，建立质量控制体系。
发明内容
本发明的目的在于提供一种复方中药茵栀黄的质量控制方法，旨在解决目前测定茵栀黄制剂中黄芩苷、绿原酸、栀子苷的含量不尽合理，对含有的其他主要成分没有进行化学指纹和定量分析，没有建立质量控制体系的问题。
本发明是这样实现的，一种复方中药茵栀黄的质量控制方法，该复方中药茵栀黄的质量控制方法包括以下步骤：
建立茵栀黄注射液的色谱-紫外吸收指纹图谱：通过进行多种色谱柱选择、检测波长的选择、流动相的选择、柱温、流速的设定、前处理方法的优化、流动相梯度的设置，建立茵栀黄注射液的高效液相色谱-光二极管阵列HPLC-DAD指纹图谱；
茵栀黄注射液化学成分的高分辨质谱表征：运用色谱-离子阱-飞行时间质谱技术LCMS-IT-TOF对来源于茵陈、栀子、黄芩和金银花四味药材的主要成分进行系统分析，根据分子离子和分子离子的多级特征碎片信息，结合对照标准品相应数据及相关信息，初步鉴定茵栀黄注射液中的化学成分；
茵栀黄中药制剂中化学组分的定量测定：利用三重四极杆线性离子阱液-质联用仪中多反应检测的分析方法，测定并比较茵栀黄注射液、口服液及几种制剂中多个化学成分的含量。
进一步，进行多种色谱柱选择、检测波长的选择、流动相的选择、柱温、流速的设定、前处理方法的优化、流动相梯度的设置具体方法为：
在色谱条件一致的情况下根据Diamosil(钻石)C18柱(5um，2504.6mm)，AgilentC18柱(5um，2504.6mm)，AgilentC8(5um，2504.6mm)柱三种色谱柱对混标的分离效果进行色谱柱选择；
根据240nm，280nm，335nm和大部分物质强吸收波长210nm这四个不同检测波长下绿原酸、栀子苷、黄芩苷的分离情况选择检测波长；
根据甲醇+0.1％磷酸水，甲醇+0.1％乙酸水，甲醇+0.1％甲酸水三种流动相对样品溶液的分离情况进行流动相的选择和流动相梯度的设置；
对不控制、25℃、30℃、35℃、40℃五个条件比较后进行柱温选择；
对流速选用0.5mL/min，0.8mL/min，1.0mL/min三种流速比较后进行设定；
前处理方法为：原液直接过膜，经冻干机冻干呈冻干粉后用一比一的甲醇水溶解提取得到样液、用乙腈提取加盐分相所得样液、过MAX固相萃取小柱、经旋转蒸发后用一比一的甲醇水溶解提取得到样液。
进一步，茵栀黄注射液的HPLC-DAD色谱条件为：
安捷伦C8柱(250mm 4.6um)，
检测波长240nm，
柱温30C，
流动相为甲醇(A)+0.1％乙酸(B)，
流动相梯度设置为0～15min：92％～88％B，15～40min：88％～70％B，40～50min：70％～50％B，50～65min：50～65％B，65～70min：65％B，70～75min：65％～92％B，75～80min：92％B，
流速选择1mL/min，
原液过膜上机，进样量10uL。
进一步，采用LCMS-IT-TOF技术对茵栀黄注射液化学成分进行分析方法为：
通过改流动相为甲醇+5mM乙酸铵对HPLC色谱条件优化；选用负离子模式扫描，雾化N2气压力345kpa，干燥N2流速10L/min，干燥N2气温度350℃；毛细管电压4000V，碎裂电压100V，锥孔电压65V完成HPLC-MS质谱条件的优化；
通过HPLC-MS质谱条件的优化对30个峰进行推导，归属推导出24种成分，对剩余的6个峰进行分子式的推导并鉴定推导出的11种物质。
进一步，鉴定推导出的11种物质为对肌醇、新绿原酸、异绿原酸A、甲基条叶蓟素、千层质素A、鸡矢藤次苷甲酯、2’，3,5,6’,7-pentahydroxyflavone、6-dihydroxy-7-O-glucosideflavone、黄芩素、Aloeemodin-w-o-β -D-glucopyranoside、emodim-1-o-β——D-glucopyranoside。
进一步，利用三重四极杆线性离子阱液-质联用仪中多反应检测的分析方法，测定五种茵栀黄制剂中16种成分的含量。
进一步，所述的五种茵栀黄制剂为2种软胶囊、颗粒、口服液、注射液；16种成分为：咖啡酸、栀子酸，表儿茶素，大黄酚，大黄素、槲皮素，木犀草苷，大黄素甲醚，滨蒿内酯、肌醇、新绿原酸、黄芩苷、栀子苷、绿原酸、汉黄芩苷、黄芩素。
本发明从柱子的选择、流动相的选择、柱温、流速的设定，前处理方法的优化、流动相梯度的设置，建立了茵栀黄注射液的色谱-紫外-质谱(HPLC-DAD-MS)指纹图谱，利用先进的LCMS-IT-TOF技术对茵栀黄注射液进行定性分析，综合色谱、紫外光谱、质谱和有关文献对有关药材的信息，对30个峰进行推导，归属推导了24种成分，对剩余的6个峰进行了分子式的推导，发现了11种未报到的新物质，还利用三重四级杆线性离子阱液质联用和液相技术，测定了五种茵栀黄制剂中13种成分的含量。
附图说明
图1是本发明提供的复方中药茵栀黄的质量控制方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下面结合附图对本发明的应用原理作进一步描述。
如图1所示：
一种复方中药茵栀黄的质量控制方法，该复方中药茵栀黄的质量控制方法包括以下步骤：
S101：建立茵栀黄注射液的色谱-紫外吸收指纹图谱：通过进行多种色谱柱选择、检测波长的选择、流动相的选择、柱温、流速的设定、前处理方法的优 化、流动相梯度的设置，建立茵栀黄注射液的高效液相色谱-光二极管阵列HPLC-DAD指纹图谱；
S102：茵栀黄注射液化学成分的高分辨质谱表征：运用色谱-离子阱-飞行时间质谱技术LCMS-IT-TOF对来源于茵陈、栀子、黄芩和金银花四味药材的主要成分进行系统分析，根据分子离子和分子离子的多级特征碎片信息，结合对照标准品相应数据及相关信息，初步鉴定茵栀黄注射液中的化学成分；
S103：茵栀黄中药制剂中化学组分的定量测定：利用三重四极杆线性离子阱液-质联用仪中多反应检测的分析方法，测定并比较茵栀黄注射液、口服液及几种制剂中多个化学成分的含量。
进行多种色谱柱选择、检测波长的选择、流动相的选择、柱温、流速的设定、前处理方法的优化、流动相梯度的设置具体方法为：
在色谱条件一致的情况下根据Diamosil(钻石)C18柱(5um，2504.6mm)，AgilentC18柱(5um，2504.6mm)，AgilentC8(5um，2504.6mm)柱三种色谱柱对混标的分离效果进行色谱柱选择；
根据240nm，280nm，335nm和大部分物质强吸收波长210nm这四个不同检测波长下绿原酸、栀子苷、黄芩苷的分离情况选择检测波长；
根据甲醇+0.1％磷酸水，甲醇+0.1％乙酸水，甲醇+0.1％甲酸水三种流动相对样品溶液的分离情况进行流动相的选择和流动相梯度的设置；
对不控制、25℃、30℃、35℃、40℃五个条件比较后进行柱温选择；
对流速选用0.5mL/min，0.8mL/min，1.0mL/min三种流速比较后进行设定；
前处理方法为：原液直接过膜，经冻干机冻干呈冻干粉后用一比一的甲醇水溶解提取得到样液、用乙腈提取加盐分相所得样液、过MAX固相萃取小柱、经旋转蒸发后用一比一的甲醇水溶解提取得到样液。
茵栀黄注射液的HPLC-DAD色谱条件为：
安捷伦C8柱(250mm 4.6um)，
检测波长240nm，
柱温30℃，
流动相为甲醇(A)+0.1％乙酸(B)，
流动相梯度设置为0～15min：92％～88％B，15～40min：88％～70％B，40～50min：70％～50％B，50～65min：50～65％B，65～70min：65％B，70～75min：65％～92％B，75～80min：92％B，
流速选择1mL/min，
原液过膜上机，进样量10uL。
采用LCMS-IT-TOF技术对茵栀黄注射液化学成分进行分析方法为：
通过改流动相为甲醇+5mM乙酸铵对HPLC色谱条件优化；选用负离子模式扫描，雾化N2气压力345kpa，干燥N2流速10L/min，干燥N2气温度350℃；毛细管电压4000V，碎裂电压100V，锥孔电压65V完成HPLC-MS质谱条件的优化；
通过HPLC-MS质谱条件的优化对30个峰进行推导，归属推导出24种成分，对剩余的6个峰进行分子式的推导，鉴定11种物质。
鉴定11种物质为对肌醇、新绿原酸、异绿原酸A、甲基条叶蓟素、千层质素A、鸡矢藤次苷甲酯、2’，3,5,6’,7-pentahydroxyflavone、6-dihydroxy-7-O-glucosideflavone、黄芩素、Aloeemodin-w-o-β-D-glucopyranoside/emodim-1-o-β—D-glucopyranoside11种物质的鉴定。
本发明从柱子的选择、流动相的选择、柱温、流速的设定，前处理方法的优化、流动相梯度的设置，建立了茵栀黄注射液的色谱-紫外-质谱(HPLC-DAD-MS)指纹图谱。利用先进的LCMS-IT-TOF技术对茵栀黄注射液进行定性分析，综合色谱、紫外光谱、质谱和有关文献对有关药材的信息，对30个峰进行推导，归属推导了24种成分，对剩余的6个峰进行了分子式的推导，发现了11种未报到的新物质，还利用三重四级杆线性离子阱液质联用和液相技术，测定了五种茵栀黄制剂中16种成分的含量。
所述的五种茵栀黄制剂为2种软胶囊、颗粒、口服液、注射液；16种成分为：咖啡酸、栀子酸，表儿茶素，大黄酚，大黄素、槲皮素，木犀草苷，大黄 素甲醚，滨蒿内酯、肌醇、新绿原酸、黄芩苷、栀子苷、绿原酸、汉黄芩苷、黄芩素。
下面结合实验方法对本发明进一步说明。
茵栀黄注射液HPLC-DAD指纹图谱的建立
2.2实验部分
2.2.1仪器
1260型液相色谱仪(安捷伦公司，其中包括：G1311Agilent 1200四元泵、G1322Agilent 1200系列真空脱气机、G1328Agilent 1200手动进样器、G1314BVWD检测器、LC3D系统化学工作站00033740)，电子分析天平(湖南省计量检测研究院)，BransonB3200S-T超声仪快速混匀器(常州澳华仪器有限公司)，德国sigma 1-6P离心机，TurboVapII样品全自动定量浓缩仪(瑞典Biotage公司)，德国海道夫(HEIDOLPH)旋转蒸发仪Laborota 4000。
2.2.2试剂
乙腈(色谱纯，德国Merck KGaA)，甲醇(色谱纯，德国Merck KGaA)，磷酸(分析纯，国药集团化学试剂公司)，甲酸(分析纯，国药集团化学试剂公司)，乙酸(分析纯，国药集团化学试剂公司)，Millipore超纯水(自制)。
2.2.3药品
黄芩苷(中国药品生物制品检定所)，栀子苷(中国药品生物制品检定所)，绿原酸(中国药品生物制品检定所)，茵栀黄注射液(河北神威药业股份有限公司)。
2.3实验结果
在茵栀黄注射液指纹图谱检测方法的获取过程中，我们对不同色谱柱、检测波长、柱温、流速、仪器、流动相等因素进行了优化考察，分别说明如下。
2.3.1色谱柱的选择
由于不同生产厂家不同牌号的色谱柱存在填料及性能上的差异，比较了Diamosil(钻石)C18柱(5um，250×4.6mm)，AgilentC18柱(5um，250×4.6mm)， AgilentC8(5um，250×4.6mm)柱三种色谱柱对混标的分离效果。
表2-1各个厂家的色谱柱信息
其他色谱条件：流量：1ml/min，柱温：不控制，进样量：10.00μL，检测波长：240nm，流动相：甲醇(A)+0.1％磷酸水(B)，梯度：0-4min：95％B，4-6min：95％-70％B，6-15min：70％-40％B，15-20min：40％-10％B，20-25min：10％-0B，25-26min：0-95％B，26-30min：95％B。
2.3.2检测波长的考察
比较了210nm，240nm，280nm，335nm四个不同波长下绿原酸、栀子苷、黄芩苷的分离情况。
其他色谱条件：柱型：AgilentC8(5um，250×4.6mm)色谱柱，流量:1ml/min，柱温：不控制，流动相：甲醇+0.1％磷酸水，进样量:10μL，梯度梯度：0-4min：95％B，4-6min：95％B-70％B，6-15min：70％B-40％B，15-20min：40％B-10％B，20-25min：10％B-0B，25-26min：0B-95％B，26-30min：95％B。
在检测波长为210nm的时候各个峰的分离情况还算理想，但是基线很不平整，而在波长280nm和波长335nm处，虽然基线比较平整，但是栀子苷的峰没有出来，而在波长为240nm处无论是分离度还是灵敏度都还比较理想，故选择检测波长为240nm。
2.3.3柱温的选择
色谱条件：柱型：AgilentC8(5um，250×4.6mm)色谱柱，流量:1mL/min，进样量:10.00μL，检测波长：240nm，流动相：甲醇+0.1％磷酸水，梯度梯度：0-4min：95％B，4-6min：95％B-70％B，6-15min：70％B-40％B，15-20min：40％B-10％B，20-25min：10％B-0B，25-26min：0B-95％B，26-30min：95％B。对柱温选用了不控制、25℃、30℃、35℃，40℃五个条件样品分离。
柱温不仅仅影响仪器和柱子的使用，还将导致色谱峰保留时间的迁移。随着温度的上升，色谱峰的分离情况没有什么改变，但有着一定程度的前移，综合仪器和峰分离情况，选择30℃。
2.3.4流速的考察
色谱条件：柱型：AgilentC8(5um，250×4.6mm)色谱柱，柱温：不控制，流动相：甲醇+0.1％磷酸水，梯度保持不变，进样量:10μL，检测波长：240nm。对流速选用了0.5mL/min，0.8mL/min，1.0mL/min三种流速，
随着流速的增大分离效果没有什么区别，但是随着流速的增大色谱峰有一定程度的前移，选择1mL/min的流速。
2.3.5不同仪器适用性选择
色谱条件：柱型：AgilentC8(5um，250×4.6mm)，流量：1ml/min，柱温：不控制，流动相：甲醇+0.1％磷酸水，进样量:10μL，检测波长：240nm。选用不同的仪器型号Agilent1200，Agilent1260。
在两台仪器上分离效果差不多，为了与前面实验保持一致，选择了Agilent1260。
2.3.6流动相的考察
流动相(不同的流动相对峰型和各物质的分离情况不同)，本文考虑了甲醇+0.1％磷酸水，甲醇+0.1％乙酸水，甲醇+0.1％甲酸水三种流动相对样品溶液的分离情况。色谱条件：色谱条件色谱柱:AgilentC8柱(5um，250×4.6mm)流量:1ml/min，柱温：不控制，流动相：甲醇+0.1％磷酸水，梯度梯度：0-4min：95％B，4-6min：95％-70％B，6-15min：70％-40％B，15-20min：40％-10％B，20-25min：10％-0B，25-26min：0-95％B，26-30min：95％B，进样量:10μL，检测波长：240nm。
在三种流动相下，分离的效果差不多，甲醇+0.1％甲酸水的流动相下基线不太平整，0.1％磷酸水不能作为液质联用的流动相，故选用甲醇+0.1％乙酸水作为流动相，以便于与后面的质谱检测器作比较。
2.3.7前处理方法的比较
实验条件：色谱柱：AgilentC8柱(250mm×4.6um)，进样量:10μL，柱温：30℃，检测波长：240nm，流动相：甲醇(A)+0.1％乙酸水(B)，0-15min：8％-12％A，15-40min：12％-60％A，40-50min：60％A，50-55min：60％-8％A，55-65min：8％A。
冻干粉用甲醇定容：取茵栀黄注射液10mL冻干成冻干粉，用5mL甲醇溶解，涡旋1min，超声10min，6000rpm离心5min，取上清液过0.22um有机滤膜，上机。
用乙腈分相：取茵栀黄注射液5mL，加入5mL乙腈，涡旋一分钟充分混匀，加入2gNaCl，涡旋1min钟后，在振荡混匀器上混匀10min，6000rpm离心5min，取上清液过0.22um有机滤膜，上机。
过MAX柱(产品货号：186000367，产品名称：Waters Oasis MAX固相萃取小柱，规格：30um，3cc/60mg)。活化：用3mL甲醇3mL水依次活化；上样：茵栀黄原液用水稀释10倍上样；清洗：用3mL5％氨水，3mL甲醇依次清洗；洗脱：3mL含5％甲酸90％甲醇水和3mL甲醇依次洗脱，将得到的洗脱液收集于氮吹管中，40℃氮吹吹至尽干，用1mL甲醇涡旋溶解，过0.22um有机滤膜，上机。
旋转蒸发：取茵栀黄注射液5mL至于旋蒸瓶中，40℃水浴旋转蒸发至尽干加入2.5mL甲醇，涡旋混匀，过0.22um有机滤膜。
前处理方法中原液直接过膜进样效果最好，故选择原液过膜进样来优化流动相梯度。
2.3.8流动相梯度的优化
实验条件：色谱柱：AgilentC8柱(250mm×4.6um)，前处理方法：原液直接过膜，进样量:10μL，柱温：30℃，检测波长：240nm，流动相：甲醇(A)+0.1％乙酸水(B)，梯度：0-15min：92％B，15-40min：88％-40％B，40-50min：40％B，50-55min：40％-92％B，55-65min：92％B。
峰集中在25min到40min之间，在这期间的峰分离情况不怎么好，说明极性较小的物质需要较长时间才能洗脱出来，所以考虑延长洗脱时间，并加大水 相的比例，看看色谱峰的分离情况是否有所改善。甲醇(A)+0.1％乙酸水(B)，梯度：0-15min：92％-88％B，15-25min：88％-70％B，25-40min：70％-50％B，40-50min：50％-70％B，50-55min：70％-92％B，55-65min：92％B。
色谱峰的信息比较丰富，峰仍然主要集中在20min到45min，分离情况不太理想，还需把这段时间内有机相的比例减小，梯度：0-15min：92％-88％B，15-25min：88％-70％B，25-40min：70％-50％B，40-70min：50％-70％B，70-75min：70％-92％B，75-80min：92％B。
色谱峰的信息差不多，前50min分离度较好，50min后色谱峰比较分散，考虑在这一时间段加大有机相的比例，看看后30min的色谱峰有何变化，梯度0-15min：92％-88％B，15-40min：88％-50％B，40-70min：50％-65％B，70-75min：65％-92％B，75-80min：92％B。
加大有机相之后，发现色谱峰的变化不大在40min到70min分段，试图使梯度变化加快，得到下面的梯度情况。梯度：0-15min：92％-88％B，15-40min：88％-70％B，40-50min：70％-50％B，50-65min：50％-65％B，65-70min：65％B，70-75min：65％-92％B，75-80min：92％B，
色谱峰的分离情况、色谱峰信息都差不多，但是呈现的峰型比前面几次的都要好，选择这一梯度。
2.4实验小结
从柱型、柱温、检测波长、流动相、流速、流动相梯度、样品前处理方法入手，确立了茵栀黄注射液的HPLC-DAD色谱条件：安捷仑C8柱(250mm×4.6um)，检测波长240nm，柱温30℃，流动相加酸特别是乙酸的效果最好，流动选择甲醇(A)+0.1％乙酸(B)，相梯度设置为0-15min：92％-88％B，15-40min：88％-70％B，40-50min：70％-50％B，50-65min：50％-65％B，65-70min：65％B，70-75min：65％-92％B，75-80min：92％B，流速选择1mL/min，茵栀黄注射液选择原液上机，进样量10uL。
茵栀黄注射液化学成分鉴定
3.2实验部分
3.2.1试剂
乙腈(色谱纯，德国Merck KGaA)，甲醇(色谱纯，德国Merck KGaA)乙酸(分析纯，国药集团化学试剂公司)，Millipore超纯水(自制)。
3.2.2药品
绿原酸(99％)，黄芩苷(98％)，大黄酚(98％)，大黄素(98％)，大黄素甲醚(98％)，表儿茶素(99％)，栀子苷(99％)，咖啡酸(99％)，黄芩素(98.5％)，槲皮素(99％)，木犀草苷(98％)，栀子酸(96％)，滨蒿内酯(99％)均购于中国药品生物制品检定所，新绿原酸(98％)购于Nature Standard，汉黄芩苷(WGS，98％)购于TAUTO Biotech，肌醇(99％)购于sigma。茵栀黄注射液(批号：12061543，国药准字Z13020772，10mL/支)由神威药业有限公司提供(河北省石家庄市栾城县城南口)。
岛津LCMS-IT-TOF高端质谱仪，LC系统：System controller：CBM-20A，PumpA：LC-20AD，PumpB:LC-20AD，Autosampler：SIL-20A，Oven：CTO-20A，PDA：SPD-M20A，MS(日本岛津公司)，电喷雾电离源，离子阱飞行时间质量分析器、LCMSsolution控制软件、LCMSsolution再分析软件、LCMSsolution的分子式预测软件(Accurate Mass Calculator、Formular Predictor)，KQ-700DE型数控超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)，BS224S型电子天平(赛多利斯，北京)。
3.2.3实验方法
3.2.3.1对照品溶液的制备
分别精密称取标准品称取1mg，用甲醇溶解并定容至1mL，配制成1mg/mL左右的标准溶液，其中大黄酚和大黄素甲醚用丙酮溶解，步骤一致。用1:1的甲醇水配制成10ug/mL左右的混标溶液，进如LCMS-IT-TOF进行分析。
3.2.3.2供试品溶液的制备
茵栀黄注射液，用甲醇稀释五倍后12000rpm离心5min，过0.22um膜，上样，待分析。
3.2.3.3样品分析
LCMS-IT-TOF分析条件
色谱柱：shimadzushim-pack VP-ODS(5um，2.0m×150)，柱温：40℃，PDA检测范围：190-510nm，流动相：甲醇(A)+5mM乙酸铵(B)，梯度：0-40min：5％-50％A，40-50min：50％-90％A，50-55min：90％-5％A，55-60min：5％A，进样量：10uL，流速：0.3mL/min。
NaTFA作为调谐LCMS-IT-TOF的标准溶液进行自动调谐，雾化气(N2)：1.5mL/min，干燥气(N2)压力值：0.1MPa，探针电压：+4.5kv，-3.5kv，CDL温度：200℃，IT Area Vacuum：约2×10-2Pa，TOF Area Vacuum<5×10-4Pa，质谱全扫描方式，自动多级碎片扫描。一级质荷比范围：100-1500m/z，重复次数：1次。MS2和MS3：50-1500，离子累积时间30ms，碰撞气：氩气，碰撞能量：30％，80％，150％。
3.3结果与讨论
3.3.1条件优化
HPLC色谱条件的优化：本发明考查了0.1％甲酸、0.1％乙酸、5mM乙酸铵、0.1％甲酸+2mM乙酸铵对HPLC-DAD图的影响。发现当流动相中加入乙酸、甲酸可有效抑制这些化合物的解离，改善峰形，使得色谱分离条件良好，但由于离子化效应，总离子流图的效果不太理想，改流动相为甲醇+5mM乙酸铵，色谱峰分离良好，总离子流图也良好，故选择甲醇+5mM乙酸铵。
本发明还考察了色谱柱对实验结果的影响，发现Agilent ZORBAX SB-C8柱(5um，250×4.6um)的灵敏度比较低，导致TIC信号响应弱，Phenomenx柱(2.1um，150mm×3.5um)色谱条件分离情况不够理想，最后选择shimadzushim-pack VP-ODS(5um，2.0×150mm)。
HPLC–MS质谱条件的优化：质谱检测比较了正、负离子两种扫描模式，结果发现负离子模式下，色谱峰较多且质谱响应较好，故选择负离子模式扫描。另外还对其他质谱参数(毛细管电压、碎裂电压、锥孔电压、干燥气温度、干 燥气流速、雾化气压力)进行了优化，最佳的质谱条件为：负离子模式扫描，雾化N2气压力345kPa，干燥N2气流速10L/min，干燥N2气温度350℃；毛细管电压4000V，碎裂电压100V，锥孔电压65V。
3.3.2茵栀黄注射液化学成分的HPLC–MS分析
本发明根据标准品中各个物质的出峰时间、裂解规律，结合文献中对茵栀黄注射液各味药材有效成分的相关报道，结合IT-TOF的高分辨率定性分析，来发现和总结茵栀黄注射液所含的相关化学成分。
表3-1各个标准品的保留时间和MS信息表
根据实验所得的高效液相色谱紫外吸收光谱、质谱裂解碎片、提取离子流结果，结合标准品所得的质谱裂解碎片、文献对茵栀黄注射液所含物质及其各组分药材中各成分的研究报道，对负离子模式下的总离子流图为本体，用240nm波长的色谱图，正离子模式下的总离子流图得以佐证，共找到了30个峰，将这些峰进行归属、鉴定，发现这些峰分别为黄酮类、环烯醚萜苷类、有机酸类等，将其中23种成分进行推导(见表3-2和表3-3)。
由标准品的色谱分离时间和质谱裂解信息定性的物质有肌醇、栀子酸、绿原酸、新绿原酸、栀子苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素八个物质。其中肌醇、栀子酸、新绿原酸在以往的文献中没有相关报道，其中2号峰和5号峰分属肌醇和栀子酸，肌醇的的准分子离子峰[M-H]-为m/z 179.0555，失去一分子水变成161.0463，继续脱去两分子水变成125.0314。
肌醇的质谱及其裂解规律如下：
栀子酸在负离子模式下的准分子离子峰为373.1201，当脱去C6H11O5时分子量变到211.0668，继续脱去一分子CO2变到167.0780再继续脱去一分子CO2得到123.0508[M-H-C6H11O5-2CO2]-，当它在正离子模式下，加合K，使得分子量变为413.0845，当以413.0845作为先导离子得到301.1429碎片离子，与标准品一致，可以推导出栀子酸脱去一分子CO2再脱去一分子CH2OH得到301.1429。
栀子酸在负离子模式下的规律如下：
栀子酸在正离子模式下的规律：
新绿原酸当其在负离子模式下时，准分子离子峰为353.0840，容易脱去C9H7O3得到191.0592的碎片离子，当脱去C7H11O5基团时得到179.0592的碎片离子，再在此基础上脱去一分子CO2得到135.0519的碎片离子，当其在正离子模式下时，新绿原酸的准分子离子峰355.1041，容易加合K得到393.0663的碎片离子，当以355.1041作为先导离子，可以得到163.0422的碎片离子峰，根据结构和质谱信息可以推导出是由[C9H7O3+H]+得到的。
新绿原酸当其在负离子模式下时如下：
当其在正离子模式下时如下：
另外根据茵栀黄四味药的组成成分可能含有的物质、LCMSsolution的分子式预测软件(Accurate Mass Calculator、Formular Predictor)和阅读文献，可以发现有一些物质的裂解规律和本发明中分析的物质物质有相同的裂解规律，又可以帮助本发明物质的确定。其中薄叶黄芩苷/高山黄芩苷、京尼平龙胆双糖苷、黄芩苷同分异构体、汉黄芩素在有各个物质的主要碎片峰和归属推导。异绿原酸、Chrysin-7-O-glucuronyflavone、异绿原酸A在异绿原酸、京尼平龙胆双糖苷、Aloeemodin-w-o-β-D-glucopyranoside/emodin-1-o-β-D-glucopyranoside等在正负离子模式下的裂解规律。
还有鸡矢藤次苷甲酯、甲基条叶蓟素、6-dihydroxy-7-O-glucosideflavone、2’,3,5,6’,7-pentahydroxyflavone未找到相应的文献报道，但是可以根据碎片离子和它们本身的结构进行推导。鸡矢藤次苷甲酯在负离子模式下本身的准分子离子峰(M-H＝403.1258)比较低，容易加合CH3COO-形成463.1442的峰，当以463.1442为先导离子，可以得到403.1322和241.0759的碎片离子峰，这分别的，当它在正离子模式下时，它容易加合K和Na得到443.0947和427.1211是鸡矢藤次苷甲酯加合一个H和加合氢后脱去C6H11O5所得到的离子峰，当先导离子是427.1211时得到265.0693的碎片离子峰，可以推出鸡矢藤次苷甲酯的裂解规律为(M+H+Na-C6H11O5)+后所得。
鸡矢藤次苷甲酯在负离子模式下裂解如下：
鸡矢藤次苷甲酯在正离子模式下裂解如下：
2’,3,5,6’,7-pentahydroxyflavone在负离子模式下得到301.0357的准分子离子峰，当失去一分子CO2时得到257.0495的碎片离子峰，而当它得到193.0151的碎片离子峰时可以推导的过程是[M-H-C6H4O2]-，甲基条叶蓟素在负离子模式下有343.0823的准分子离子峰，其裂解规律为269.0475[M-H-Glc-H2O]-，251.0346[M-H-Glc-2H2O]-，223.0399[M-H-2H2O]-，在正离子模式下有345.0967的准分子离子峰，当得到271.0637我们可以推导其裂解规律为[M+H-Glc-H2O]+。
6-dihydroxy-7-O-glucosideflavone在负离子模式下有431.0987的准分子离子峰，当其先导离子为431.0987时，可以得到269.0443碎片离子峰，推测其裂解过程为[M-H-(Glc-H2O)]-。
另外3、4、25、29、30六个峰根据碎片离子和LCMSsolution的分子式预测软件(Accurate Mass Calculator、Formular Predictor)可以得到其化学式，可能的结构式还得进一步研究，1号峰根据质谱信息在负离子模式下为238.8934，根据预测软件，得到的CH113N7O不符合条件，故无法鉴定。各个物质的色谱质谱信息见表3-2，其推导过程见表3-3。
表3-2茵栀黄注射液中各物质的保留时间和MS信息表
表3-3 The identification results of yinzhihuang injection by LC/ITMSn
采用了LCMS-IT-TOF技术分析研究了茵栀黄注射液中的主要化学成分，综合了色谱、紫外光谱、质谱和有关文献对有关药材的信息研究，找到了30个峰，归属推导了24种成分，对剩余的6个峰进行了分子式的推导，发现了11种新物质，分别是肌醇、新绿原酸、异绿原酸A、甲基条叶蓟素、千层质素A、鸡矢藤次苷甲酯、2’,3,5,6’,7-pentahydroxyflavone、6-dihydroxy-7-O-glucosideflavone、黄芩素、Aloeemodin-w-o-β-D-glucopyranoside/emodin-1-o-β-D-glucopyranoside，这是对茵栀黄注射液成分推导的拓展，使用的LCMS-IT-TOF技术分辨率高、灵敏度好，使得定性分析更加准确，为茵栀黄注射液及其复方试剂提供了新的思路。
茵栀黄制剂相关化学成分的含量测定
利用三重四级杆离子阱液质联用法对茵栀黄注射液、茵栀黄颗粒、茵栀黄口服液、茵栀黄软胶囊中各个成分进行了含量测定分析，将量与知行结合，给人用药就更加安全可靠。
4.2实验部分
4.2.1仪器
三重四级杆线性离子阱液质联用仪(LC系统：System controller：CBM-20A，PumpA：LC-20AD，PumpB:LC-20AD，Autosampler：SIL-20A，Oven：CTO-20A，PDA：SPD-M20A，MS(日本岛津公司))，1200型液相色谱仪(安捷伦公司，其中包括：G1311Agilent 1200四元泵、G1322Agilent 1200系列真空脱气机、G1328Agilent 1200手动进样器、G1314BVWD检测器、LC3D系统化学工作站00033740)，电子分析天平(湖南省计量检测研究院)，BransonB3200S-T超声仪，快速混匀器(常州澳华仪器有限公司)。
4.2.2试剂
乙腈(色谱纯，德国Merck KGaA)，甲醇(色谱纯，德国Merck KGaA)，乙酸(分析纯，国药集团化学试剂公司)，磷酸(分析纯，国药集团化学试剂公司)，Millipore超纯水(自制)。
4.2.3药品
绿原酸(99％)，黄芩苷(98％)，大黄酚(98％)，大黄素(98％)，大黄素甲醚(98％)，表儿茶素(99％)，栀子苷(99％)，咖啡酸(99％)，黄芩素(98.5％)，槲皮素(99％)，木犀草苷(98％)，栀子酸(96％)，滨蒿内酯(99％)均购于中国药品生物制品检定所，新绿原酸(98％)购于Nature Standard，汉黄芩苷(WGS，98％)购于TAUTO Biotech，肌醇(99％)购于sigma，茵栀黄制剂信息见下表。
表4-1茵栀黄制剂相关信息
4.3结果与讨论
4.3.1三重四级杆线性离子阱液质联用仪方法的建立
质谱参数的优化：将标准品用甲醇配成1ug/mL的标准溶液，进行流动泵注射，根据所查资料选择m/z的范围，先进行MS Scan确定母离子的m/z，输入母离子m/z，优化裂解电压，保证母离子的最大传输效率，即尽可能多到达碰撞池；输入母离子m/z，在子离子扫描模式下，得到最优DP值，再优化各个子离子的CE，最后得到的数据如表5.1所示，另外各个物质在流动泵注射下得到的图谱将在后面补充。
液相条件：C8柱(Agilent，3.5um，4.5*150mm)，柱温：40℃，流速：0.5mL/min，进样量：10uL，流动相：乙腈(A)，0.1％乙酸水(B)，梯度为0-8mim：95％-60％B，8-10min：60％-0％B，10-13min：0B，13-13.1min：0-95％B，13.1-16min：停止。
表4-2 MRM质谱条件(其中＊为定量选择离子)
将15种负离子模式下的标准品配制成浓度为500ppb，100ppb，50ppb，20ppb，10ppb，5ppb，1ppb的混标，在正离子模式下进行MRM检测。滨蒿内酯的检测模式为正离子模式，也配成500ppb，100ppb，50ppb，20ppb，10ppb，5ppb，1ppb的混标在负离子模式下进行MRM检测。
茵栀黄软胶囊取10粒挤出内容物混匀，称取内容物0.5g至于10mL容量瓶，用1:1的甲醇水溶解，超声20min，取出，放冷，加50％甲醇水至刻度摇匀，过0.22um膜，待测。茵栀黄颗粒取三包研磨称，称取0.5g至于10mL容量瓶，用1:1的甲醇水溶解，超声20min，取出，放冷，加50％甲醇水至刻度摇匀，过0.22um膜，待测。茵栀黄口服液取2三支至于50mL离心管，涡旋混匀，取0.5mL至于10mL容量瓶，用1:1的甲醇水溶解，超声20min，取出，放冷，加50％甲醇水至刻度摇匀，过0.22um膜，待测。茵栀黄注射液取2三支至于50mL离心管，涡旋混匀，取0.5mL至于10mL容量瓶，用1:1的甲醇水溶解，超声20min，取出，放冷，加50％甲醇水至刻度摇匀，过0.22um膜，待测。稀释倍数均为20倍，后面在从这些样液中取出5mL至于50mL容量瓶中，稀释倍数为200倍。
从这两次的稀释液中可以测咖啡酸、栀子酸，表儿茶素，大黄酚，槲皮素，木犀草苷，大黄素甲醚，滨蒿内酯。另外肌醇在紫外检测器下没有响应，而新绿原酸在液相上无法与栀子酸分开，这两者只好再次选用三重四级杆线性离子阱液质联用来测定，将样品再次稀释，一共稀释10000倍，方法不改变，后得到各种茵栀黄制剂中各组分含量如表4-3所示。
表4-3三重四级杆线性离子阱检测到的各茵栀黄制剂各个组分的含量值
剩下的黄芩苷、栀子苷、绿原酸、汉黄芩苷、黄芩素含量特别高，在三重四级杆线性离子阱液质联用上检测需要稀释上万倍，使得检测结果偏差很大，所以改用高效液相色谱法对这五种成分进行测定，选用的标液浓度有100ug/mL，50ug/mL，20ug/mL，10ug/mL，5ug/mL，1ug/mL，0.2ug/mL，样品分别稀释100倍、1000倍、5000倍，实验结果如表4-4所示。
高效液相色谱法条件：色谱柱：AgilentC8柱(5um，250×4.6mm)，检测波长：240nm，200nm，柱温：30℃，流速1.00mL/min，流动相：甲醇(A)，0.1％磷酸水(B)，梯度设置：0-4min：95％-50％B，4-8min：50％-10％B，8-15min：10％-0B，15-16min：0-95％B，16-20min：95％B。
表4-4茵栀黄制剂中大含量成分的HPLC测定
4.4小结
随着中药的发展和普遍，茵栀黄制剂的剂型也越来越多，中国药典上之规定了茵栀黄口服液中黄芩苷和栀子苷的含量值。即每毫升黄芩苷提取物含黄芩苷的含量应在0.34-0.46g。每毫升栀子苷提取物栀子苷的含量每毫升不得少于0.8mg。中成药制剂第十四册126～127页规定了茵栀黄注射液每毫升注射液含黄芩苷的含量应在20.0～22.5mg。而其他像胶囊、颗粒的大量出现，还有各味药材中的其他高含量物质像汉黄芩苷、黄芩素、新绿原酸、肌醇、栀子酸等等并没有明确的含量规定，本发明旨在为茵栀黄质控的发展和完善提供帮助。
茵栀黄注射液在大鼠体内的药代动力学研究
HPLC-MS/MS采用AgilentC8柱，以乙腈(A)和0.1％乙酸水(B)为流动相，梯度洗脱(0-3mim：95％-60％B，3-9min：60％-5％B，9-10min：5％B，10-10.1min：5％-90％B，10.1-14min：停止)，流速0.5mL/min，以离子对的多反应监测(MRM)方式在负离子模式检测，同时测定八种有效成分(绿原酸、黄芩苷、栀子苷、黄芩素、咖啡酸、新绿原酸、栀子酸)在老鼠体内的药代动力学，血浆样品采用一锅法多杂质沉淀萃取法(single-tube multi-impurityprecipitation extraction，“SMIPE”)，用含抗坏血酸的甲醇(10mg/mL)沉淀蛋白，并加入2mgC18和20mg无水硫酸镁除去水分和杂质，基质效应在-18–7.7％，提取回收率在65–88％，在5，100，500ng/mL三个浓度下采用基质配标，平均准确度在82 –109％，日内精密度和日间精密度分别在9.3％和17％以内，灵敏度高、准确性好、可以快速可靠地测定血浆中各个成分的含量。该方法的建立为研究大鼠体内茵栀黄注射液中各个有效成分的药代动力学提供可靠的检测方法。
5.2实验部分
5.2.1仪器、试剂、试药与动物
5.2.1.1仪器
三重四级杆线性离子阱液质联用仪(LC系统：System controller：CBM-20A，PumpA：LC-20AD，PumpB:LC-20AD，Autosampler：SIL-20A，Oven：CTO-20A，PDA：SPD-M20A，MS(日本岛津公司))，电子分析天平(湖南省计量检测研究院)，sigma高速离心机1-15PK(德国sigma公司)，恒温水浴锅(德国HeidolphLR4000系列旋转蒸发仪)，TurboVapII样品全自动定量浓缩仪(瑞典Biotage公司)。5.2.1.2试剂、试药
乙腈(色谱纯，德国Merck KGaA)，甲醇(色谱纯，德国Merck KGaA)，乙酸铵，乙二胺(PSA，40um)，十八烷基键合硅胶(ODS，C18，40um)购于瓦里安，甲酸，乙酸，硫酸镁，抗坏血酸均购于购于美国迪玛科技公司，Millipore超纯水(实验室自制)。绿原酸(CGA，99％)，黄芩苷(BCL，98％)，栀子苷(GPS，99％)，咖啡酸(CFA，99％)，黄芩素(BCE，98.5％)，栀子酸(GSA，96％)均购于中国药品生物制品检定所，新绿原酸(NCA，98％)购于Nature Standard，汉黄芩苷(WGS，98％)购于TAUTO Biotech。动物试验用“茵栀黄注射液”(批号：12061543，国药准字Z13020772，10mL/支)由神威药业有限公司提供(河北省石家庄市栾城县城南口)。
5.2.1.3动物
健康雄性Sprague-Dawley大鼠5只(体重：190～220g)由中南大学实验动物中心提供。实验期间饲以该中心提供的固体饲料，自由饮水。
5.2.2各物质血药浓度测定方法
5.2.2.1 HPLC-MS/MS和GC-MS/MS方法的建立
液相条件：C8柱(Agilent，3.5um，4.5*150mm)，柱温：40℃，流速：0.5mL/min，进样量：10uL，流动相：乙腈(A)和0.1％乙酸水(B)，梯度为0.0-4.0mim：95％-60％B，4.0-10.0min：60％-0％B，10.0-13.0min：0B，13.0-13.1min：0～95％B，13.1-16.0min：停止。
5.2.2.2给药方案和血样采集
雄性SD大鼠5只，体重190-220g，禁食过夜，试验期间自由饮水。以注射液4mL/kg的剂量经大鼠尾静脉注射给药(给药容积≤1mL)，于给药前和5，10，15，20，30，45，60，90，120，150，180min后经大鼠眼球后静脉丛取静脉血0.2～0.3mL，置肝素化试管中，3000rpm离心10min，分离血浆，按50uL分装，20℃保存待测，样品测定。
5.2.2.3血浆前处理优化过程
取50uL血浆，加入100uL0.01g/mL抗坏血酸甲醇，涡旋混匀3min，静置1min，加入0.02gMgSO4和2mgC18粉涡旋混匀1min，12000rpm高速离心5min，得到待测液。
本发明比较了不同沉淀剂(甲醇和乙腈)的沉淀效果和对回收率的影响，还比较了加抗坏血酸与不加抗坏血酸的影响、不同净化剂(C18、PSA、活性C粉)对回收率的影响，最后在确定好用含抗坏血酸的甲醇作为沉淀剂和C18作为净化剂后比较抗坏血酸和C18的量对实验的影响。
沉淀剂的优化。常用的沉淀剂有甲醇和乙腈，本文比较了血浆与沉淀剂不同体积的甲醇、乙腈，甲醇和乙腈1:1，对分析物提取回收率的影响，发现乙腈的沉淀效果虽好，但是由于在血清中加入乙腈后会使得血清中的蛋白凝聚成团状，难以提取出血清中的有效成分，而在血清中加入甲醇血清中的蛋白质就会比较分散成白色粉末状小颗粒，适于各个分析物的提取回收率相对乙腈要好，采用甲醇作为沉淀剂。
加酸化剂对回收率的影响。实验步骤：取1000uL血浆加入20uL 10ug/mL的混标溶液，混匀三分钟，用12个1.5ml的离心管，每管取该血浆50uL加入100uL不同含量的含抗坏血酸的甲醇溶液(0、0.001g/ml、0.005g/ml、0.01g/ml、0.05g/ml、0.1％甲酸，1％乙酸甲醇)沉淀蛋白，涡旋混匀3min，加入0.02g无水硫酸镁脱水，再加入不同2mg的C18除杂，混匀一分钟，高速离心(12000rpm)3min，取上清液进样，可以发现抗坏血酸的加入非常关键，且抗 坏血酸的含量0.01g/mL效果最好。
沉淀后净化剂的选择对回收率的影响。比较了C18、PSA、活性C粉的加入对回收率的影响，发现PSA、活性C粉的加入对分析物有吸附作用，只有C18对分析物没有影响，另外又对血浆有一个净化的作用，在此基础上还考察了C18的量对实验的影响。实验步骤：取1000uL血浆加入20uL10ug/mL的混标溶液，混匀三分钟，用12个1.5ml的离心管，每管取该血浆50uL加入100uL0.01g/mL的含抗坏血酸的甲醇溶液，涡旋混匀3min，加入0.02g无水硫酸镁，再加入不同含量的C18(0、0.5mg、1mg、2mg、4mg、8mg，每一含量的做一组平行)，混匀一分钟，高速离心(12000rpm)3min，取上清液进样。可以发现C18粉末的含量对实验的回收率影响不大，但是C18的使用可以除去血清中的杂质，选择中间量(2mg)的C18粉。
5.2.2.4标准溶液的配制：取1mg/mL的标准储备液，用甲醇逐级稀释成500ng/mL，200ng/mL，100ng/mL，50ng/mL，10ng/mL，5ng/mL的备用标液。
5.2.2.5基质配标：用十个1.5mL离心管每个取300uL血浆，再加入600uL的乙腈，涡旋混匀1分钟，12000rpm离心5min，取上清液作为基质，用此基质当溶剂配成5ng/mL，10ng/mL，50ng/mL，100ng/mL，200ng/mL，5000ng/mL的基质标液。
5.3结果与讨论
5.3.1 LC-MS/MS条件的优化
液相条件的优化：刚开始选用乙腈和水作为流动相，发现所得的TIC图，很多物质峰型不好，考虑加酸或者加盐，后来比较了0.1％甲酸、0.1％乙酸、5mM乙酸铵分别与乙腈作为流动相时的TIC图，发现无论是加入甲酸或是加入乙酸 峰型均有比较好的改善，这可能是茵栀黄注射液中所含的成分极性都比较大，当流动相为乙腈和0.1％乙酸时，各个物质分离比较明显，且各个物质的相应都比较好，最后选择乙腈和0.1％乙酸作为流动相。
质谱参数的优化：精密称取在五氧化二磷减压干燥器中干燥24h的绿原酸，黄芩苷，栀子苷，咖啡酸，黄芩素，栀子酸，新绿原酸，汉黄芩苷对照品，用甲醇制成1mg/mL的对照品溶液逐级稀释成1ug/mL的标准溶液，进行流动泵注射，根据所查资料，选择质荷比范围，先进行MS Scan确定母离子的m/z，输入相应的母离子m/z，优化裂解电压，保证母离子有最大传输效率，即尽可能多到达碰撞池；在子离子扫描模式下，输入母离子m/z，优化DP值，考察其碎裂后的子离子，此时可以用多个扫描段、每个扫描段设定不同的CE，获得不同碎裂能量下的子离子，确定最丰富、最稳定的子离子在MRM(多离子检测)模式下，输入母离子、子离子的m/z，考察不同CE值下的响应，找到最大响应时的CE值。气帘气：20，碰撞气：中速，喷雾电压：-4500V，离子化温度：500℃，射入电压(EP)：-10V，碰撞室射出电压(CXP)：-10V。
5.3.2标准曲线和定量下限
将栀子酸、绿原酸、新绿原酸、咖啡酸、栀子苷、汉黄芩苷、黄芩苷、黄芩素8物质按照5.2.2.5基质配标的方式配制的基质混标上HPLC-MS/MS检测，以峰面积为横坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。经线性回归方程得到各物质相关系数均大于0.9965，线性范围、最低检测限、质谱信息、保留时间见表5-1。
表5-1各个物质在大鼠血浆中的质谱条件、线性范围、LLOQ和保留时间
5.3.3专属性实验
用甲醇配制50ng/mL的标液，取空白大鼠血浆、空白血浆加标后浓度为2.5ng/mL、实际给药两小时后的大鼠血浆按照一锅法多杂质沉淀提取法，茵栀黄注射液用超纯水稀释300倍，在5.3.1LC-MS/MS条件下，八种物质的分离情况良好，各个峰的归属为：1、栀子酸，2、新绿原酸，3、绿原酸，4、栀子苷，5、咖啡酸，6、黄芩苷，7、汉黄芩苷，8、黄芩素。
5.3.3基质效应和提取回收率考察
基质效应的考察：取大鼠空白血浆50uL，按照5.2.2.3中血浆的处理方法制备5、100、500ng/mL的混标。同时用甲醇作为溶剂配制相同浓度的标液，上LC-MS/MS检测，
八种物质基质效应影响不大，在±20％以内。提取回收率的考察：取大鼠空白血浆50uL加入250、5000、25000ng/mL的8种物质混标2uL，充分混匀一分钟，加入100uL含抗坏血酸甲醇，再按照5.2.2.3中血浆的处理方法进行处理另外用甲醇配制相应浓度下的混标，上LC-MS/MS检测，
得到回收率在(100±40)％以内，
5.3.4精密度与准确度
取空白血浆50uL，按照按照5.2.2.3中血浆的处理方法制备5、100、500ng/mL的混标，每一浓度进行6样本分析，连续测定3d，并与标准曲线同时进行，根据当日的标准曲线计算QC样品的浓度，与配制浓度对照，计算方法的日内、日间精密度(RSD)和准确度(RE)。结果日内RSD<13％，日间RSD<13％，符合生物样品分析方法的要求。
表5-2精密度与准确度
Accuracy and precision for validation of SMIPE-based LC-MRM multi-componenr quantitation in rat plasma.
5.3.5血浆样品的测定与药代动力学
测定血浆样品时，每天建立一条标准曲线，并随行测定(5ng/mL)、中(100ng/mL)、高(500ng/mL)三个浓度的QC样品，每一浓度双样本分析。根据当日标准曲线求算QC样本和未知样品的浓度，当QC样品RSD和RE均≤25％时，当日数据方可接受。
表5-3各个物质的药代动力学参数
Average non-compartmental PK parameters of the major herbalingredients with a single iv administration of YZH-I in rats(n＝5，mean±SD).
5.4小结
优化了血浆的前处理方法，最后使用含抗坏血酸的甲醇作为沉淀剂沉淀效果好且使得茵栀黄注射液中易氧化成分得以保护，继续优化色谱条件，利用三重四级杆线性离子阱液质联用仪测定了茵栀黄注射液中八种主要有效成分在老鼠体内的药代动力学，分析时间短，灵敏度高，为茵栀黄注射液临床药代动力学研究提供了新思路。
本发明从柱子的选择、流动相的选择、柱温、流速的设定，前处理方法的优化、流动相梯度的设置，建立了茵栀黄注射液HPLC-DAD的方法。利用先进的LCMS-IT-TOF技术对茵栀黄注射液进行定性分析，综合了色谱、紫外光谱、质谱和有关文献对有关药材的信息分析，找到了30个峰，归属推导了24种成分，对剩余的6个峰进行了分子式的推导，发现了11种未报到的新物质，分别是肌醇、新绿原酸、异绿原酸A、甲基条叶蓟素、千层质素A、鸡矢藤次苷甲酯、2’,3,5,6’,7-pentahydroxyflavone、6-dihydroxy-7-O-glucosideflavone、黄芩素、Aloeemodin-w-o-β-D-glucopyranoside/emodin-1-o-β-D-glucopyranoside。又建立了三重四级杆线性离子阱液质联用的色谱方法和质谱方法，用三重四级杆线性离子阱液质联用仪和液相色谱测定了茵栀黄注射液、茵栀黄口服液、茵栀黄颗粒、和茵栀黄软胶囊中相关物质的含量。最后测定了茵栀黄注射液中主要有效成分在老鼠体内的药代动力学，优化了血浆的前处理方法和色谱梯度，使得样品回收率大大提高，另外空白血浆样品也处理得 更加干净。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种复方中药茵栀黄的质量控制方法，其特征在于，该复方中药茵栀黄的质量控制方法包括以下步骤：
建立茵栀黄注射液的色谱-紫外吸收指纹图谱：通过进行多种色谱柱选择、检测波长的选择、流动相的选择、柱温、流速的设定、前处理方法的优化、流动相梯度的设置，建立茵栀黄注射液的高效液相色谱-光二极管阵列HPLC-DAD指纹图谱；
茵栀黄注射液化学成分的高分辨质谱表征：运用色谱-离子阱-飞行时间质谱技术LCMS-IT-TOF对来源于茵陈、栀子、黄芩和金银花四味药材的主要成分进行系统分析，根据分子离子和分子离子的多级特征碎片信息，结合对照标准品相应数据及相关信息，初步鉴定茵栀黄注射液中的化学成分；
茵栀黄中药制剂中化学组分的定量测定：利用三重四极杆线性离子阱液-质联用仪中多反应检测的分析方法，测定并比较茵栀黄注射液、口服液及几种制剂中多个化学成分的含量。
2.如权利要求1所述的复方中药茵栀黄的质量控制方法，其特征在于，进行多种色谱柱选择、检测波长的选择、流动相的选择、柱温、流速的设定、前处理方法的优化、流动相梯度的设置具体方法为：
在色谱条件一致的情况下根据DiamosilC18柱，AgilentC18柱，AgilentC8柱三种色谱柱对混标的分离效果进行色谱柱选择；
根据240nm，280nm，335nm和大部分物质强吸收波长210nm四个不同检测波长下绿原酸、栀子苷、黄芩苷的分离情况选择检测波长；
根据甲醇+0.1％磷酸水，甲醇+0.1％乙酸水，甲醇+0.1％甲酸水三种流动相对样品溶液的分离情况进行流动相的选择和流动相梯度的设置；
对不控制、25℃、30℃、35℃、40℃五个条件比较后进行柱温选择；
对流速选用0.5mL/min，0.8mL/min，1.0mL/min三种流速比较后进行设定；
前处理方法为：原液直接过膜，经冻干机冻干呈冻干粉后用一比一的甲醇水溶解提取得到样液、用乙腈提取加盐分相所得样液、过MAX固相萃取小柱、经旋转蒸发后用一比一的甲醇水溶解提取得到样液。
3.如权利要求1所述的复方中药茵栀黄的质量控制方法，其特征在于，茵栀黄注射液的HPLC-DAD色谱条件为：
安捷伦C8柱，
检测波长240nm，
柱温30℃，
流动相为甲醇(A)+0.1％乙酸(B)，
流动相梯度设置为0～15min：92％～88％B，15～40min：88％～70％B，40～50min：70％～50％B，50～65min：50～65％B，65～70min：65％B，70～75min：65％～92％B，75～80min：92％B，
流速选择1mL/min，
原液过膜上机，进样量10uL。
4.如权利要求1所述的复方中药茵栀黄的质量控制方法，其特征在于，采用LCMS-IT-TOF技术对茵栀黄注射液化学成分进行分析方法为：
通过改流动相为甲醇+5mM乙酸铵对HPLC色谱条件优化；选用负离子模式扫描，雾化N2气压力345kpa，干燥N2流速10L/min，干燥N2气温度350℃；毛细管电压4000V，碎裂电压100V，锥孔电压65V完成HPLC-MS质谱条件的优化；
通过HPLC-MS质谱条件的优化对30个峰进行推导，归属推导出24种成分，对剩余的6个峰进行分子式的推导并鉴定推导出的11种物质。
5.如权利要求4所述的复方中药茵栀黄的质量控制方法，其特征在于，对推导出的11种物质鉴定为对肌醇、新绿原酸、异绿原酸A、甲基条叶蓟素、千层质素A、鸡矢藤次苷甲酯、2’，3,5,6’,7-pentahydroxyflavone、6-dihydroxy-7-O-glucosideflavone、黄芩素、Aloeemodin-w-o-β-D-glucopyranoside、emodim-1-o-β——D-glucopyranoside的鉴定。
6.如权利要求1所述的复方中药茵栀黄的质量控制方法，其特征在于，利用三重四极杆线性离子阱液-质联用仪中多反应监测的分析方法，测定五种茵栀黄制剂中16种成分的含量。
7.如权利要求6所述的复方中药茵栀黄的质量控制方法，其特征在于，所述的五种茵栀黄制剂为2种软胶囊、颗粒、口服液、注射液；16种成分为咖啡酸、栀子酸、表儿茶素、大黄酚、大黄素、槲皮素、木犀草苷、大黄素甲醚、滨蒿内酯、肌醇、新绿原酸、黄芩苷、栀子苷、绿原酸、汉黄芩苷、黄芩素。
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