CN113462762A

CN113462762A - 多糖核酸免疫调节药物的质量检测方法

Info

Publication number: CN113462762A
Application number: CN202010234469.7A
Authority: CN
Inventors: 周云喜; 谢安; 童春义; 杨胜梅; 务勇圣; 黄胜; 徐向平; 刘斌
Original assignee: Hunan Jiuzhitang Siqi Biopharmaceutical Co ltd; Jiuzhitang Co Ltd
Current assignee: Hunan Jiuzhitang Siqi Biopharmaceutical Co ltd; Jiuzhitang Co Ltd
Priority date: 2020-03-30
Filing date: 2020-03-30
Publication date: 2021-10-01
Anticipated expiration: 2040-03-30
Also published as: CN113462762B

Abstract

本发明涉及一种多糖核酸免疫调节药物的质量检测方法，包括以下步骤：提取所述多糖核酸免疫调节药物中的核酸组分；对所述核酸组分进行测序得到样品测序数据；分析统计所述样品测序数据，得到所述核酸组分中CpG基序的出现频次；将所得频次数据与所述核酸组分供体生物的相应CpG基序频次的参比信息进行比较以确定质量。本发明的质量检测方法通过测序技术对多糖核酸免疫调节药物中的核酸片段进行测序，再利用生物信息学技术进行分析探讨，即可确定具有免疫活性的CpG结构在药物产品中的存在情况，从而用于阐述产品的核酸物质基础，实现产品质量的快速有效检测。若与生产企业制定的标准数据进行比对，还可有效地分辨产品真伪。

Description

多糖核酸免疫调节药物的质量检测方法

技术领域

本发明涉及医药技术领域，特别是涉及一种多糖核酸免疫调节药物的质量检测方法。

背景技术

卡介菌多糖核酸注射液是在卡介苗素基础上，通过改进工艺生产得到的一种新型非特异性免疫调节剂，主要由核酸及多糖等多种免疫活性物质组成，解决了其它免疫调节剂大分子蛋白清除不全等缺点，使其更易于吸收，减少了过敏反应，副作用更小。20世纪70年代我国开始对卡介菌多糖核酸提取物进行免疫活性的研究，80年代末将其用于临床，现在相关的注射液产品已经畅销国内外30年，是免疫调节剂产品中的明星产品。卡介菌多糖核酸能双向调节机体细胞免疫和体液免疫功能，具有抗感染、抗变态反应、抗肿瘤等作用。除了广泛用于慢性支气管炎、哮喘和反复呼吸道感染的防治外，临床应用上也取得了一些新的进展，比如在肿瘤免疫治疗等领域。

目前，企业和国家标准中，该类型产品的质量只能通过核酸浓度来粗略判断，无法有效鉴定产品质量水平，或者需要通过细胞和动物实验来判断，费时费力。

发明内容

基于此，有必要提供一种快速有效的多糖核酸免疫调节药物的质量检测方法。

一种多糖核酸免疫调节药物的质量检测方法，包括以下步骤：

提取所述多糖核酸免疫调节药物中的核酸组分；

对所述核酸组分进行测序得到样品测序数据；

分析统计所述样品测序数据，得到所述核酸组分中CpG基序的出现频次；

将所得频次数据与所述核酸组分供体生物的相应CpG基序频次的参比信息进行比较以确定质量。

发明人通过研究发现，多糖核酸免疫调节药物对超敏反应引起的各种过敏性疾病的优越调节作用，与药物的核酸物质中非甲基化胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸(CpG)序列结构密切相关。核酸组分中CpG基序的出现频次能够体现多糖核酸免疫调节药物的质量水平，从而可以作为该类药物产品的质量评价指标。本发明的质量检测方法通过测序技术对多糖核酸免疫调节药物中的核酸片段进行测序，再利用生物信息学技术进行分析探讨，比较核酸组分中CpG基序的出现频次与供体生物的相应CpG基序频次，即可确定具有免疫活性的CpG结构在药物产品中的存在情况，从而用于阐述产品的核酸物质基础，实现产品质量水平的快速有效检测。若与生产企业制定的标准数据进行比对，还可有效地分辨产品真伪。

在其中一个实施例中，所述CpG基序包括GACGTT、AACGTT、GTCGTT和TTCGTT中的一种或多种。

在其中一个实施例中，所述参比信息通过以下步骤获取：

获取所述供体生物的基因组测序数据；

分析统计所述基因组测序数据，得到所述供体生物的基因组中CpG基序的出现频次。

在其中一个实施例中，还包括以下步骤：根据所述样品测序数据和所述基因组测序数据得到所述核酸组分的全基因组覆盖倍数。

在其中一个实施例中，还包括以下步骤：

根据所述样品测序数据构建所述核酸组分中CpG基序的序列位置-出现频次曲线；

根据所述基因组测序数据构建所述供体生物的基因组中CpG基序的序列位置-出现频次曲线；

将所述核酸组分中CpG基序的序列位置-出现频次曲线与所述供体生物的基因组中CpG基序的序列位置-出现频次曲线进行比对。

在其中一个实施例中，所述多糖核酸免疫调节药物为卡介菌多糖核酸免疫调节药物，所述供体生物为结核分支杆菌。

在其中一个实施例中，还包括以下步骤：分析统计所述样品测序数据，得到片段有效率；所述片段有效率为可读片段数占总测序片段数的百分比。

在其中一个实施例中，提取所述核酸组分的方法包括以下步骤：将所述多糖核酸免疫调节药物与BA Buffer混合均匀后，转移至核酸纯化柱，离心后弃去接液管中液体；向核酸纯化柱加入G Binding Buffer，离心后弃去接液管中液体；向核酸纯化柱加入WashBuffer，离心后弃去接液管中液体；再向纯化柱中加Elution Buffer，室温温育，然后离心并收集接液管中液体。

在其中一个实施例中，所述核酸组分采用第二代宏测序技术进行测序。

在其中一个实施例中，所述核酸组分的测序方法包括以下步骤：将所述核酸组分经过Covaris随机打断成350bp～500bp的DNA片段，采用TruSeq DNA LT Sample Prep kit试剂盒进行建库，DNA片段经过末端修复、加ployA尾、加测序接头、纯化和PCR扩增完成文库构建，然后利用测序仪进行双端测序，获得所述样品测序数据。

附图说明

图1为卡介菌基因组和卡介菌多糖核酸注射液的核酸物质电泳图；其中a为卡介菌基因组核酸电泳图(泳道1)，泳道2为分子量Marker DL10k，b为不同批次注射液的核酸物质提取纯化前后电泳图；

图2为卡介菌基因组中CpG基序的分布图；

图3为卡介菌基因组中四种CpG基序的频次及比例图；

图4为卡介菌多糖核酸注射液与卡介菌基因组核酸序列比对覆盖频次比较分析；

图5为以100000bp为间距分析的卡介菌多糖核酸注射液核酸物质中四种CpG基序出现的频次情况；

图6为不同核酸处理组对细胞因子释放能力比较。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明一实施例的一种多糖核酸免疫调节药物的质量检测方法，包括以下步骤S1～S4：

S1、提取多糖核酸免疫调节药物中的核酸组分。

S2、对核酸组分进行测序得到样品测序数据。

S3、分析统计样品测序数据，得到核酸组分中CpG基序的出现频次。

S4、将所得频次数据与核酸组分供体生物的相应CpG基序频次的参比信息进行比较以确定质量。

在一个具体示例中，上述CpG基序包括GACGTT、AACGTT、GTCGTT和TTCGTT中的一种或多种。核酸免疫往往以基序(6～20个核酸碱基组成的功能序列)的形式展现其免疫功能，因此对基序的分析更为重要。这四种CpG基序(GACGTT、AACGTT、GTCGTT、TTCGTT)是对人特异免疫的CpG基序，分析这四种基序的频次分布情况可以更准确地体现药物产品的质量水平。

在一个具体示例中，参比信息通过以下步骤S5～S6获取：

S5、获取供体生物的基因组测序数据。

S6、分析统计基因组测序数据，得到供体生物的基因组中CpG基序的出现频次。

在一个具体示例中，质量检测方法还包括以下步骤S7：

S7、根据样品测序数据和基因组测序数据得到核酸组分的全基因组覆盖倍数。通过研究发现，药物产品中核酸组分的全基因组覆盖倍数也可以有效地体现该产品的质量水平，全基因组的覆盖倍数低则产品的质量水平也比较低。

在一个具体示例中，质量检测方法还包括以下步骤S8～S10：

S8、根据样品测序数据构建核酸组分中CpG基序的序列位置-出现频次曲线。

S9、根据基因组测序数据构建供体生物的基因组中CpG基序的序列位置-出现频次曲线。

S10、将核酸组分中CpG基序的序列位置-出现频次曲线与供体生物的基因组中CpG基序的序列位置-出现频次曲线进行比对。

如此，通过两个曲线的比对，结合位置信息和频次信息，能够更加准确直观地确定药物产品的质量水平，若将待测样品的曲线与企业制定的标准曲线进行比对，也能够快速直观地鉴定产品真伪。

在一个具体示例中，多糖核酸免疫调节药物为卡介菌多糖核酸免疫调节药物，例如卡介菌多糖核酸注射液，供体生物则为结核分支杆菌(卡介菌)。可以理解，多糖核酸免疫调节药物不限于这一种，供体生物也可相应根据产品种类进行调整。

在一个具体示例中，质量检测方法还包括以下步骤S11：

S11、分析统计样品测序数据，得到片段有效率。其中，片段有效率为可读片段数占总测序片段数的百分比。通过研究发现，药物产品中核酸组分的片段有效率也可以有效地体现该产品的质量水平，片段有效率低则产品的质量水平也比较低。

在一个具体示例中，提取核酸组分的方法包括以下步骤：将多糖核酸免疫调节药物与BA Buffer混合均匀后，转移至核酸纯化柱，离心后弃去接液管中液体；向核酸纯化柱加入G Binding Buffer，离心后弃去接液管中液体；向核酸纯化柱加入Wash Buffer，离心后弃去接液管中液体；再向纯化柱中加Elution Buffer，室温温育，然后离心并收集接液管中液体。可以理解，核酸组分的提取方法可以根据需要进行选择，不限于此。

在一个具体示例中，核酸组分采用第二代宏测序技术进行测序。具体地，核酸组分的测序方法包括以下步骤：将核酸组分经过Covaris随机打断成350bp～500bp的DNA片段，采用TruSeq DNA LT Sample Prep kit试剂盒进行建库，DNA片段经过末端修复、加ployA尾、加测序接头、纯化和PCR扩增完成文库构建，然后利用测序仪进行双端测序，获得样品测序数据。可以理解，测测序方法不限于此，可以根据需要进行调整。

以下结合附图以特定的具体实施例来详细说明本发明内容，但这些具体实施例对本发明的权利要求的范围不构成任何限制。

实施例1

1、材料与方法

1.1实验材料与试剂

卡介菌菌体以及卡介菌多糖核酸制剂(注射制剂，批号分别为20170601[A],20170642[B],20170661[C],20170682[D],20170691[E]和20180110[a])：湖南斯奇生物制药有限公司提供；Biospin细菌基因组DNA提取试剂盒：杭州博日科技有限公司；小鼠TNF-αELISA试剂盒：欣博盛生物科技有限公司；PCR引物：生工生物工程(上海)股份有限公司；2×Power Taq PCR MasterMix：北京百泰克生物技术有限公司；溶菌酶：生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2主要仪器

MiSeq二代测序仪(美国illumina公司)、PacBio Sequel三代测序仪(美国PacBio公司)、细胞培养箱(美国Eppendorf公司)、YP1002N型电子分析天平(上海精密科学仪器有限公司)、THD-0506型恒温水浴(宁波天恒仪器厂)、5418R/5702R型台式冷冻离心机(德国Eppendorf公司)、NanoDrop2000型超微量紫外分光光度计(Thermo公司)、Tanon3500型凝胶成像系统(天能公司)等。

1.3样品核酸提取与纯化

核酸提取参照试剂盒说明进行。取注射液样品溶液加BA缓冲液(BABuffer)混合均匀，转移至核酸纯化柱高速离心，弃去接液管中液体。然后向核酸纯化柱加入G BindingBuffer后高速离心，弃去接液管中液体。之后向核酸纯化柱加入Wash Buffer后高速离心，弃去接液管中液体。再次将核酸纯化柱高速离心，并将纯化柱转移至新的1.5mL离心管，最后向纯化柱中加Elution Buffer，室温温育2min，于10000g离心2min并弃去纯化柱，1.5mL离心管中液体即为纯化核酸得到的DNA样品。

1.4卡介菌基因组和注射液核酸片段测序

1.4.1第三代测序技术对卡介菌基因组测序：将从卡介菌菌体提取的全基因组核酸进行电泳检测，合格后上第三代测序仪测序，获得测序原始数据。接着基于测序数据进行基因组的从头组装，首先使用falcon软件进行原始数据的自我矫正及基因组初步组装，基于Overlap-Layout-Consensus算法初步组装得到一致性序列，之后采用GenomicConsensus软件基于其中的arrow算法以原始数据为辅助再次对一致性序列进行校正，再使用sprai程序矫正过的原始序列作为辅助数据将组装出来的一致性序列进行circulator环化处理，得到最终的基因组序列数据。

1.4.2第二代宏测序技术对注射液核酸片段测序：将注射液分离提取的DNA进行电泳检测，合格后进行测序建库。检测合格的DNA样品先经过Covaris随机打断成350bp～500bp的片段，采用TruSeq DNALT Sample Prep kit试剂盒进行建库，DNA片段经过末端修复、加ployA尾、加测序接头、纯化、PCR扩增等步骤，最终完成文库构建。文库检验合格后利用测序仪进行双端测序，获得所有片段的核酸序列信息。测序下机获得原始测序数据(Rawdata)后，进入生物信息分析，主要通过对测序错误率、数据量、比对率、覆盖度等进行统计，评估建库测序是否达到了标准，符合标准则获得注射液核酸片段的测序数据。

1.5测序数据分析及数据统计

将获得的基因序列数据转化为excel格式，应用MATLAB软件分析，撰写分析函数程序，提取和寻找数据中CG和CpG基序的位置及出现频次，构建频次曲线及位置-频次曲线。

1.6免疫因子TNF-α检测实验

首先将培养瓶中的巨噬细胞RAW264.7细胞800g离心5min，弃上清，加新鲜培养基重悬细胞，计数并调整细胞浓度为1×10⁶/mL，之后将细胞接种于24孔培养板内然后置37℃，5％CO₂，95％湿度的培养箱内培养。将细胞分以下几组：A组代表从注射液中提取总核酸刺激细胞组；CpG组代表以注射液核酸为模板，PCR扩增得到富含CpG序列的核酸片段刺激细胞组；No-CpG组代表以注射液核酸为模板，PCR扩增得到不含CpG序列的核酸片段刺激细胞组；No-primer组代表扩增时未加引物的PCR体系(为CpG扩增的阴性对照)刺激细胞组；control组为未做任何处理空白组。不同细胞组分别加入相同体积的核酸样品，然后将24孔板置于37℃，5％CO₂，95％湿度的培养箱内培养12h后，1000g离心20min，取上清进行检测。

免疫因子TNF-α检测实验参照小鼠TNF-αELISA试剂盒说明书进行。提前将小鼠TNF-αELISA试剂盒试剂盒从4℃冰箱取出以平衡至室温，设置空白孔加标准品和标本通用稀释液以减除显色液的吸光度空白，其余孔中加不同浓度TNF-α标准品以及上清样品。封胶板纸封住反应孔孵育，洗板之后，空白孔加入生物素化抗体稀释液，其余孔加生物素化抗体工作液，封板孵育。然后洗板，空白孔加酶结合物稀释液，其余孔加入酶结合物工作液，封板孵育，洗板5次，加入显色底物避光孵育，之后再加入终止液，混匀之后即刻使用酶标仪测量OD₄₅₀值，保存读数结果。将6批次产品核酸设置为6个平行孔，以计算平均值。以标准样品组测定的OD值与空白孔的OD值差值为纵坐标，标准品浓度为横坐标，绘制标准曲线，处理组测定OD值从标准曲线计算得出TNF-α浓度。

2、结果

2.1核酸物质分离纯化

2.2.1卡介菌菌体全基因组分离提取：卡介菌菌丝体提取总核酸，电泳结果如图1a所示，从图中可以看出，提取的总核酸条带清晰，无弥散带，满足第三代快速测序。

2.1.2注射液核酸物质分离提取：产品中核酸物质分离纯化后，DNA浓度得到进一步富集，使用超微量紫外分光光度计检测核酸，可发现260/280比值也得到显著提高(从1.6提高到1.9)，证明DNA得到纯化，蛋白质和多糖杂质降低。电泳结果如图1b所示，经过过滤提纯后，不同批次注射液核酸物质条带亮度增加，表明核酸物质经过离心过滤之后得到显著富集，但条带呈现弥散状态，不适用于第三代测序，而适用于第二代重测序，故注射液中核酸物质采用第二代宏测序技术进行序列测定。

2.2卡介菌基因组测序及注射液核酸宏测序

2.2.1卡介菌基因组测序情况：测序获得卡介菌完整基因组总长为4326779bp，GC含量为65.64％，与美国国家生物技术信息中心National Center for BiotechnologyInformation(NCBI)数据库中卡介菌基因组数据基本一致。

2.2.2注射液核酸序列宏测序情况：核酸序列测序获得9311544个读数片段，解读出1350520724bases，有效解读率达92％以上，与测序基因组比对发现，覆盖率达99.22％，说明注射液核酸中99.22％以上来自卡介菌菌体基因组，其他部分为未解读部分(片段太小未读出)或来源不明。

2.3卡介菌全基因组免疫核酸序列分布和定位分析

2.3.1卡介菌基因组中CG含量及分布分析:以测序获得的基因组序列为数据源，分析了基因组中“CG”出现的频次、分布图(见图2)和分布情况(见表1)。采用400bp、1000bp、1×10⁴bp和1×10bp四种分析间隔分析基因组中CpG的出现频次，由表1、图2可知，卡介菌基因组中CpG出现总次数达55万余次(不同分析间隔出现次数差异为分段引起)，CpG占总基因组比例达25.5％左右，结果表明卡介菌基因组中富含CpG基元，容易形成大量满足要求的CpG片段，起到免疫作用。进一步对CpG组在基因组位置分布进行分析，结果显示CpG在整个基因组中每个区段均有分布，整体较平均，但也有部分区域比例偏高。

表1卡介菌基因组中CpG分布情况

分析间距	总频次	比例	最高频次	最低频次	平均频次
						400bp	550294	25.44％	89	23	51
1000bp	551166	25.48％	203	72	127
						1×10<sup>4</sup>bp	551617	25.50％	1770	812	1274
1×10<sup>5</sup>bp	551670	25.50％	13574	3413	12538

2.3.2基因组中CpG基序频次及分布分析：以对人特异免疫的四种CpG基序(GACGTT、AACGTT、GTCGTT、TTCGTT)为研究对象，分析了卡介菌基因组中这四种基序的频次分布情况，结果如图3所示，CpG基序在基因组中非常丰富，出现频次也非常多，四种基序在整个基因组中出现总频次为3631次，占整个基因组的0.5％，其中GACGTT和GTCGTT分布出现1337和1336次，各占总频次的37％，是四种基序的主要形式。对基序在基因组中的分布和定位发现，基序在基因组分布较为均匀，也有部分集中的区域。

2.4注射液核酸物质与基因组比对及CpG基序分析

2.4.1注射液核酸片段序列与基因组比对结果：注射液核酸物质测序共得到9311544个大小片段为300～500bp的测量数，测量得到总碱基数为1350520724bases，按照卡介菌全基因组含432万bases，则测量结果可大致为282个拷贝(基因组)的碱基信息结果。

将注射液核酸测序结果与卡介菌基因组测序结果进行比对发现，注射液核酸序列有99.22％以上均能在基因组中找到，而基因组中每个碱基覆盖1次和10次的概率均为100％，说明注射液中的核酸均来自卡介菌基因组。进一步对基因组各区域碱基的覆盖次数进行比对，如图4所示，注射液核酸片段在整个基因组中都出现较高程度的覆盖和重复，平均重复次数在280次左右，与测序基因组拷贝数282一致，说明注射液中核酸片段均来源于卡介菌基因组，且各片段的保留程度差异不大。同时从频次数据可以看出，核酸片段在部分区段(第4.0×10⁶～4.5×10⁶万，第3.6×10⁷～3.8×10⁷万碱基处)显著增多，说明这些区段核酸保留地较为丰富，但也有部分区域(第1.4×10⁷～1.45×10⁷碱基处)显著低于平均值，说明可能有部分核酸的缺失。

2.4.2注射液核酸CpG基序保留情况及分布分析：进一步对注射液核酸中保留的四种CpG基序进行分析，分别以10000和100000为间距进行统计分析，如图5，发现产品核酸中保留了大量的CpG基序，除少数几个显著升高的区域，在全基因组中分布也较为平均。从出现频次可以看出，在282个全基因组数据中保留了1085216次，相当于每个卡介菌中保留了3848次，该数据略高于从全基因组分析得到的3631次，说明注射液产品中核酸物质活性基序得到一定程度的富集。

进一步对四种CpG基序出现频次比较，四种基序出现概率分别为GACGTT和GTCGTT各占37％、AACGTT占12％、TTCGTT占14％，与从全基因组分析得到的结果几乎一致。其中，CpG基序中的GACGTT基序在整个产品核酸中出现频次最高，且在部分区域表现出显著升高，最高可达到4247次/10万碱基，表现出极高的比例。通过对CpG基序分布定位，有望找到富含CpG基序区域，为挖掘CpG免疫核酸制剂提供基础和数据资源。

2.5注射液中核酸物质刺激细胞释放免疫因子能力初探

为进一步考察卡介菌多糖核酸注射液中核酸物质是否具有免疫刺激活性，以免疫细胞因子TNF-α为检测细胞因子，研究了提取核酸及以提取核酸为模板克隆得到的含CpG和不含CpG核酸片段刺激巨噬细胞释放细胞因子的能力。结果如图6所示，从卡介菌注射液提取核酸物质(A)能够提高TNF-a释放，证明了卡介菌注射液中核酸物质能够增强细胞因子释放。使用GraphPad Prism 5软件通过T检验分析方法发现，相对于无CpG的核酸片段和克隆缓冲液，克隆得到的富含CpG的核酸片段显著刺激了细胞因子释放，证明细胞因子释放能力主要通过CpG起作用，通过对CpG基序分布定位，能够对卡介菌多糖核酸注射液的质量水平进行检测，且通过对卡介菌基因组测序有望筛选得到强免疫刺激能力核酸基序组合，为开发新产品提供依据。

3结论

卡介菌多糖核酸注射液核酸物质中丰富的CpG基序序列和片段，通过对核酸进行宏测序，获得了详细的核酸序列情况，与卡介菌基因组比对发现，产品核酸绝大部分来自卡介菌基因组，基因组覆盖率达100％。注射液在制备过程中，基因组发生断裂形成核酸片段，但具有免疫刺激作用的CpG基序在注射液核酸中保留完整，还呈现略有富集增加的趋势，免疫因子刺激实验也证明了注射液中丰富的CpG基序保证了产品的免疫刺激能力。因此，分析具有免疫活性的CpG结构在产品中的存在情况，能够快速有效地对产品的质量水平进行鉴定。实验结果为阐述产品免疫功能提供了理论依据，也为进一步建立产品质控标准提供理论基础，同时为证明产品真伪提供依据。

实施例2

采用上述核酸提取、基因测序及分析统计方法，对不同批次的卡介菌多糖核酸注射液样品进行质量检测，结果如表2所示。同时，这不同批次的卡介菌多糖核酸注射液样品通过细胞和动物实验进行质量检测，S5和S6为合格产品，S9为不合格产品。

表2三批样品测序结果比较

从结果表明，不合格产品的CpG基序的出现总频次较低，与合格产品得到CpG基序数据相差较大，且获得的有效片段数和有效碱基数显著低于合格产品，其中片段有效率低于80％，有效测序碱基数低于70％，全基因组的覆盖倍数也低于合格产品(低于200倍)，说明不合格产品核酸中有效核酸浓度显著低于合格产品。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种多糖核酸免疫调节药物的质量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

提取所述多糖核酸免疫调节药物中的核酸组分；

对所述核酸组分进行测序得到样品测序数据；

2.根据权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于，所述CpG基序包括GACGTT、AACGTT、GTCGTT和TTCGTT中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的质量检测方法，其特征在于，所述参比信息通过以下步骤获取：

获取所述供体生物的基因组测序数据；

4.根据权利要求3所述的质量检测方法，其特征在于，还包括以下步骤：根据所述样品测序数据和所述基因组测序数据得到所述核酸组分的全基因组覆盖倍数。

5.根据权利要求3所述的质量检测方法，其特征在于，还包括以下步骤：

6.根据权利要求3所述的质量检测方法，其特征在于，所述多糖核酸免疫调节药物为卡介菌多糖核酸免疫调节药物，所述供体生物为结核分支杆菌。

7.根据权利要求1～6任一项所述的质量检测方法，其特征在于，还包括以下步骤：分析统计所述样品测序数据，得到片段有效率；所述片段有效率为可读片段数占总测序片段数的百分比。

8.根据权利要求1～6任一项所述的质量检测方法，其特征在于，提取所述核酸组分的方法包括以下步骤：将所述多糖核酸免疫调节药物与BA Buffer混合均匀后，转移至核酸纯化柱，离心后弃去接液管中液体；向核酸纯化柱加入G Binding Buffer，离心后弃去接液管中液体；向核酸纯化柱加入Wash Buffer，离心后弃去接液管中液体；再向纯化柱中加Elution Buffer，室温温育，然后离心并收集接液管中液体。

9.根据权利要求1～6任一项所述的质量检测方法，其特征在于，所述核酸组分采用第二代宏测序技术进行测序。

10.根据权利要求9所述的质量检测方法，其特征在于，所述核酸组分的测序方法包括以下步骤：将所述核酸组分经过Covaris随机打断成350bp～500bp的DNA片段，采用TruSeqDNA LT Sample Prep kit试剂盒进行建库，DNA片段经过末端修复、加ployA尾、加测序接头、纯化和PCR扩增完成文库构建，然后利用测序仪进行双端测序，获得所述样品测序数据。