CN101491545A - 一种从卡介菌中提取多糖和核酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及从卡介菌中提取多糖和核酸的新工艺，特别是涉及采用高压均质机对卡介菌进行破壁。本发明的目的在于提供了从卡介菌中提取多糖及核酸的新工艺，采用高压均质机联合常规的高速组织捣碎技术进行破菌，提取卡介菌中的多糖和核酸。本发明改变了传统的破壁方法，减少了大量的人力物力，适于在大生产中推广应用。

Description

一种从卡介菌中提取多糖和核酸的方法

技术领域

本发明涉及从卡介菌中提取多糖和核酸的新工艺，特别是涉及采用高压均质机对卡介菌进行破壁。

背景技术

卡介菌多糖核酸是从卡介菌经热酚法提取的多糖核酸制剂，内含多糖核酸等多种具有免疫活性的物质，不仅能通过调节机体内的细胞免疫、体液免疫、刺激网状内皮系统、激活单核-巨噬细胞功能，增强自然杀伤细胞功能来增强机体抗病能力；还可以通过稳定肥大细胞，封闭IgE功能，减少脱颗粒细胞释放活性物质，以及具有抗乙酰胆碱所致的支气管痉挛作用，达到抗过敏及平喘作用。进一步研究发现卡介菌多糖核酸具有双向调节作用，在哮喘、慢性支气管炎等变态反应性疾病中可以促进Th0细胞向Th1细胞的转化，促进IL-2、IFN-γ的产生，抑制IL-4的分泌，维持Th1/Th2细胞的平衡；卡介菌多糖核酸可以促进免疫抑制小鼠CD4+细胞的恢复，使CD4+/CD8+比值恢复正常，从而发挥免疫调节作用。卡介菌多糖核酸目前在临床上通过注射给药广泛用于哮喘、变态反应性疾病的治疗及预防。

现有的卡介菌多糖核酸原粉制备过程包括破菌、提取、精制、制备干粉和制备制剂。其中破菌过程为整个制备过程的关键步骤，破菌的优略严重影响产品的收率和质量。目前生产中一般采用高速组织捣碎法进行破壁。

现有的卡介菌多糖、核酸制备过程中破菌方法为将所得菌体和注射用水置于高速组织捣碎机内，开动机器进行破菌，所得匀浆进入下一步工序，最后制得原粉及其制剂。然而由于刀具转动(约6000转/分)过程中破菌液形成涡流，菌体和刀具接触不够充分，因此破菌不够彻底，收得率及含量均明显低于《2000年版生物制品规程》的规定。

另外，中国授权专利ZL200510135882.3公开了一种采用高剪切分散乳化法进行破壁以提取卡介菌中的多糖和核酸的方法。其主要原理再用利用高转速(大于10000转/分)的剪切机刀片产生强大的紊流，使得刀片和菌体充分接触，同时刀片和菌体的作用过程为剪切过程，因此破菌较彻底。尽管与常规方法相比该方法具有更高的产率，但是该方法要求长时间(大于3小时)操作条件，不但时间长、耗能多，并且长时间的高转速(大于10000转/分)操作对高速剪切机存在一定的损伤作用，相对于而言提高了生产成本，因此在实际生产中不能得到大范围的推广。

因此，需要一种更加有效、操作简便的从卡介菌中提取多糖及核酸的新工艺。

发明内容

本发明的目的在于提供了从卡介菌中提取多糖及核酸的新工艺，采用高压均质机联合常规的高速组织捣碎技术进行破菌，提取卡介菌中的多糖和核酸。

本发明的方法包括：

(1)取卡介菌菌体，加入一定比例的去热源注射用水进行混合；

(2)用高压均质机对混合液进行破壁，连续运转3个小时进行破壁；

(3)收集高压均质好的匀浆，采用常规的高速组织捣碎技术(约6000转/分)进行破菌；

(4)收集匀浆进入下一步工序，最后制得原粉及其制剂。

在一个具体实施方案中，卡介菌菌体和去热原注射用水的质量比例为1∶1-1∶4，优选1∶1-1∶2，更优选为1∶1。其中，去热原优选是超滤法和双蒸或三蒸法去热原。

在另一个具体实施方案中，所述的高压均质机的工作参数是50Hz、1000MPa，优选30-50Hz、50-500MPa，更优选是50Hz、60MPa。

在另一个具体实施方案中，经过高压均质机破壁的同时，加入按混合液体积比20％的絮凝剂(质量浓度1％)，从而凝固蛋白质使其沉淀。其中所述的絮凝剂是壳聚糖溶液。

术语：

“热原”系指由微生物产生的能引起恒温动物体温异常升高的致热物质。它包括细菌性热原、内源性高分子热原、内源性低分子热原及化学热原等。这里所指的“热原”，主要是指细菌性热原，是某些细菌的代谢产物、细菌尸体及内毒素。致热能力最强的是革兰氏阴性杆菌的产物，其次是革兰阳性杆菌类，革兰阳性球菌则较弱，霉菌、酵母菌、甚至病毒也能产生热原。热原通常是磷脂多醇与蛋白质结合而成的复合物。磷脂多醇是复合物的活性中心，致热作用最强。其化学组成因菌种不同而有所差异。分子量为5×104～5×105，分子量越大致热作用也越强。

去热原的方法包括：

1.高温法：热原的耐热性能良好，60℃加热1h不被分解破坏，100℃不降解，但180℃3～4h、200℃60min或250℃30～45min可使热原彻底破坏。因此耐热物品如玻璃制品、金属制品、生产过程中所用的容器和其它用具以及注射时使用的注射器等，均可采用此法破坏热原。但在通常使用的注射剂热压灭菌条件下不足以破坏热原。

2.吸附法：热原在水溶液中可被活性炭、石棉、白陶土等吸附而除去。由于活性炭性质稳定、吸附性强兼具助滤和脱色作用，故广泛用于注射剂生产，但应注意吸附药液所造成的主药的损失。

3.超滤法：热原分子量为1×10⁶左右，体积较小，约1～5nm，可以通过一般滤器和微孔滤膜，但采用超滤法如用3.0～15nm超滤膜可将其除去。

4.蒸馏法：热原能溶于水但不挥发，但可随水蒸气的雾滴进入注射用水中，因此制备注射用水时，原水中的热原可经蒸馏除去，但需多次蒸馏，，并加有隔沫装置，单次蒸馏往往效果不理想。

5.酸碱法：热原能被强酸、强碱、强氧化剂破坏。玻璃容器及用具如配液用玻璃器皿、输液瓶等可用重铬酸钾硫酸清洁液或稀氢氧化钠处理，破坏热原。

6.其它：包括离子交换法、凝胶滤过法、反渗透法等。

有益效果：

1.本发明改变了原有传统的破菌方式，采用高压均质机进行破菌，在不增加任何赋形剂、以及其他提取工艺未改变的情况下，使得多糖和核酸的提取率提高10％左右；

2.本方法改变了原有的传统的研磨破壁方法，采用高压均质机进行破壁，破壁完全，相比于通过提高转速进行破菌的现有技术，本发明还具有耗时少、节能多、不会影响生产设备；

3.本方法所使用的有机试剂量少，并可回收化学药品；

4.本方法可减小污染排放、降低生产成本；

5.本方法对传统方法进行了改进，减少了大量的人力物力，适于在大生产中推广应用。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的描述，虽然以上具体描述了本发明某些实施方案和实施例，但本领域所属技术人员应当理解，在不脱离本发明基本精神和范围的前提下可对本发明实施方案进行各种修改和替换，而这些修改和替换均应包括在本发明的等同范围内。

实施例1：

加入5kg卡介菌，5kg经超滤去热原的注射用水，混匀后用高压均质机以60MPa、50Hz破壁，加入质量浓度1％的1kg壳聚糖作为絮凝剂，连续运转3个小时进行破壁，收集高压均质好的匀浆；

将匀浆在20升容积的不锈钢桶内，将破菌刀具伸入液体中，刀具离桶底5厘米左右，开启电源，以6000转/分钟连续运转，直至收集需要的匀浆；

将制备的匀浆采用通用提取方法进一步提取，得到核酸和多糖的原粉，计算产品收得率及组分含量。

所得数据与采用普通研磨方法破碎组织提取出的多糖和核酸的提取率进行比较，结果见表1。

比较实施例1：

取5公斤菌体和5升注射用水置于捣碎机容器内，盖上盖子，连接刀具，慢速启动，刀具旋转至匀速(6000转/分钟)，然后开启快速档，运行时间1分钟，并用手把扶容器，以免捣碎机震移。间隔1分钟后，再按以上方法进行第二次操作，共捣碎3分钟，将制备的匀浆进入下一道工序进行提取，最后制得卡介菌多糖、核酸原粉。计算产品收得率和检测产品中组分含量，结果见表1。

比较实施例2(参照中国授权专利ZL200510135882.3)：

将5公斤菌体放入20升容积的不锈钢桶内，加注射用水5升，将破菌刀具伸入液体中，刀具离桶底5厘米左右，开启电源，连续运转(10000转/分钟)3小时，制备的匀浆进入下一道工序进一步提取，最后制得卡介菌多糖、核酸原粉。计算产品收得率和检测产品中组分含量，结果见表1。

表1、卡介菌多糖、核酸含量及收率表

	含量标准	传统方法	ZL200510135882.3	本发明方法
					多糖含量	70-80％	72.3％	79.5％	79.8％
核酸含量	10-20％	9.5％	19.6％	19.8％
					收得率	-------	1.6％	2.6％	2.8％

应当指出，由于在生产过程中存在系统差异(如菌种批次、培养时间、环境条件等)，或是上述生产条件、不同技术人员等客观因素的影响，单个进行实施例1、比较实施例1-2，所得到的卡介菌多糖、核酸含量可能会出现一定的差异。但本发明的实施例1和比较实施例1-2，使用同一批次、质量的菌种和菌体，因此在表1中反应的产率，尽管与现有技术可能存在差异，但三者彼此之间的产量关系是恒定不变的。

因此，通过上表可以得出，采用本发明方法对卡介菌进行破菌，多糖及核酸的含量收率较传统的方法有较大的提高，同时也优于ZL200510135882.3的方法，同时所得数值均符合《2000年版生物制品规程》的规定，更重要的是提供一种不同于ZL200510135882.3的方法、同时具有耗时少、节能多、不会过度损害生产设备的方法。

关于上表的说明：

1、糖含量与核酸含量参照《2000年版生物制品规程》；

2、收得率＝卡介菌多糖、核酸原粉质量/菌体质量×100％

通过实施例，我们可以得出，本发明方法可提高卡介菌多糖、核酸原粉的收得率与核酸的含量，通过高压对细胞进行破壁、混匀，破壁较为完全，同时操作时只需单人看管，从而节约了大量人力、物力，降低了生产成本。

Claims (5)

1、一种从卡介菌中提取多糖和核酸的方法，包括：

(1)取卡介菌菌体，加入一定比例的去热源注射用水进行混合；

(2)用高压均质机对混合液进行破壁，连续运转3个小时进行破壁；

(3)收集高压均质好的匀浆，采用常规的高速组织捣碎技术(约6000转/分)进行破菌；

(4)收集匀浆进入下一步工序，最后制得原粉及其制剂。

2、权利要求1中所述的方法，卡介菌菌体和去热原注射用水的质量比例为1∶1-1∶4，优选1∶1-1∶2，更优选为1∶1。

3、权利要求1所述的方法，其中去热原是超滤法和双蒸或三蒸法去热原。

4、权利要求1或2所述的方法，其中所述的高压均质机的工作参数是50Hz、1000MPa，优选30-50Hz、50-500MPa，更优选是50Hz、60MPa。

5、权利要求4所述的方法，其中经过高压均质机破壁的同时，加入按混合液体积比20％的絮凝剂(质量浓度1％)，从而凝固蛋白质使其沉淀。其中所述的絮凝剂是壳聚糖溶液。