CN114748616A - 一种成人青少年用无细胞百白破联合疫苗及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于疫苗制备技术领域，本发明提供了一种成人青少年用无细胞百白破联合疫苗及其制备方法。本发明提供的联合疫苗以0.85～0.95wt％浓度的氯化钠溶液为溶剂，包括如下浓度的组分：百日咳毒素10～20μg/mL，百日咳丝状血凝素10～20μg/mL，百日咳粘附素4～8μg/mL，白喉毒素3～8Lf/mL，破伤风毒素3～8Lf/mL和氢氧化铝1.4～3mg/mL。本发明提供的成人青少年用无细胞百白破联合疫苗对成人和青少年预防百日咳、白喉、破伤风有重要的作用，能带来良好的社会效应和经济效益。

Description

一种成人青少年用无细胞百白破联合疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及疫苗制备技术领域，尤其涉及一种成人青少年用无细胞百白破联合疫苗及其制备方法。
背景技术
无细胞百白破三联疫苗(DTaP)是用于预防百日咳、白喉、破伤风的联合疫苗。百日咳传染性强，R0为5～17，人群对百日咳普遍易感且一生可多次感染，其发病率逐年提高，出现这种情况最重要的一个原因是百日咳疫苗接种或自然感染后的抗体会自然消退。研究发现，通过接种疫苗产生的百日咳特异性抗体可以持续4～12年。同样，疫苗诱导的白喉、破伤风保护期限一般也在10年左右。中国目前DTaP的免疫程序为3、4、5月龄各接种1剂次，在18～24月龄加强1剂次DTaP，另外在6岁时加强1剂次白喉破伤风联合疫苗。由于在青少年时期不再加强接种，百日咳在青少年成人中的抗体保护率较低。根据研究表明，>6岁的PT血清阳性率不高于10％，百日咳鲍特菌在成人中的传播，最终会感染婴幼儿，低月龄百日咳患儿易出现重症肺炎、呼吸衰竭、肺实变、百日咳脑病等并发症；白喉、破伤风在成人中的保护率也较低，20岁以上白喉抗体保护率为40.2％，18岁以上人群破伤风抗体保护率仅为18.3％。
多项研究表明中国百白破的母传抗体水平很低，3月龄以下婴儿白喉保护率为18.3％，破伤风保护率为8.5％，百日咳保护率为4.2％。3月龄以下婴儿存在感染百白破的风险，需要对孕妇接种百白破疫苗，给婴儿带来母传抗体，减少感染风险。因此，急需研制一种全新的成人青少年用无细胞百白破联合疫苗以减少疾病负担。
发明内容
为克服现有技术中存在的上述缺陷，本发明提供了一种成人青少年用无细胞百白破联合疫苗及其制备方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种成人青少年用无细胞百白破联合疫苗，所述联合疫苗以0.85～0.95wt％浓度的氯化钠溶液为溶剂，包括如下浓度的组分：百日咳毒素10～20μg/mL，百日咳丝状血凝素10～20μg/mL，百日咳粘附素4～8μg/mL，白喉毒素3～8Lf/mL，破伤风毒素3～8Lf/mL和氢氧化铝1.4～3mg/mL。
本发明还提供了一种成人青少年用无细胞百白破联合疫苗的制备方法，包括如下步骤：
(1)对百日咳杆菌发酵产物进行离心，得上清液和菌体，取上清液进行强阳离子分离分别得到百日咳毒素和百日咳丝状血凝素，依次采用复合配基的阳离子交换层析法和复合强阴离子交换填料纯化百日咳毒素，得纯化后的百日咳毒素，再采用复合强阴离子交换填料纯化百日咳丝状血凝素，得纯化后的百日咳丝状血凝素；对菌体进行加热提取，得百日咳粘附素，依次采用复合强阴离子交换填料和强阳离子交换填料纯化百日咳粘附素，得纯化后的百日咳粘附素；
(2)对白喉杆菌发酵产物进行离心，取上清液进行硫酸铵两级盐析，得白喉毒素；
(3)对破伤风芽孢杆菌发酵产物进行离心，取上清液进行硫酸铵两级盐析，得破伤风毒素；
(4)将步骤(1)所得的纯化后的百日咳毒素与缓冲液和终浓度为20～50vt％的甘油混合，使纯化后的百日咳毒素的质量浓度为200～400μg/mL，然后加入终浓度为0.05～1vt％的戊二醛进行脱毒，脱毒后加入终浓度为0.05～0.5wt％的天冬氨酸溶液，反应2～4h，得脱毒后的百日咳毒素；
(5)将步骤(1)所得的纯化后的百日咳丝状血凝素与缓冲液和终浓度为20～50vt％的甘油混合，使纯化后的百日咳丝状血凝素的质量浓度为200～600μg/mL，然后加入终浓度为0.1～0.4wt％的赖氨酸，再加入终浓度为0.02～0.1vt％的甲醛溶液进行脱毒，得脱毒后的百日咳丝状血凝素；
(6)将步骤(2)所得的白喉毒素先与终浓度为0.05～0.5wt％的赖氨酸混合，再与终浓度为0.1～0.5vt％的甲醛溶液混合，进行脱毒，得脱毒后的白喉毒素；
(7)将步骤(3)所得的破伤风毒素先与终浓度为0.05～0.3wt％的赖氨酸混合，再与终浓度为0.1～0.5vt％的甲醛溶液混合，进行脱毒，得脱毒后的破伤风毒素；
(8)将步骤(1)所得的纯化后的百日咳粘附素、步骤(4)所得的脱毒后的百日咳毒素、步骤(5)所得的脱毒后的百日咳丝状血凝素、步骤(6)所得的脱毒后的白喉毒素、步骤(7)所得的脱毒后的破伤风毒素与氢氧化铝和氯化钠溶液混合，得成人青少年用无细胞百白破联合疫苗。
优选的，步骤(1)中所述离心的转速为7000～10000rpm，所述离心的时间为10～18min；
所述加热提取的温度为55～65℃，所述加热提取的时间为0.6～1.2h。
优选的，步骤(2)中所述离心的转速为7000～10000rpm，所述离心的时间为10～18min。
优选的，步骤(3)中所述离心的转速为7000～10000rpm，所述离心的时间为10～18min。
优选的，步骤(4)中所述脱毒的温度为35～39℃，所述脱毒的时间为4～6h。
优选的，步骤(5)中所述脱毒的温度为35～39℃，所述脱毒的时间为35～46d。
优选的，步骤(4)和步骤(5)中所述缓冲液独立包括如下浓度的组分：PB0.02～0.05M，NaCl0.3～0.6M。
优选的，步骤(6)中所述脱毒的温度为35～39℃，所述脱毒的时间为30～40d。
优选的，步骤(7)中所述脱毒的温度为35～39℃，所述脱毒的时间为30～40d。
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
1、本发明提供的成人青少年用无细胞百白破联合疫苗对成人和青少年预防百日咳、白喉、破伤风有重要的作用，能带来良好的社会效应和经济效益。与DTaP有不同，DTaP不能用于成人的免疫。
2、本发明氢氧化铝的吸附方式：氢氧化铝分别吸附百日咳毒素(PT)、百日咳丝状凝血素(FHA)和百日咳粘附素(PRN)，再加入白喉毒素(DT)，破伤风毒素(TT)。该吸附顺序和方式优于其他吸附方式，能获得高的效价和抗体水平。
3、本发明百日咳毒素(PT)、百日咳丝状凝血素(FHA)、百日咳粘附素(PRN)的抗原纯化方式操作简单，纯化后的抗原纯度高。
4、本发明能有效预防青少年、成人以及低月龄婴儿感染百日咳、白喉、破伤风。对减少疾病负担，降低婴幼儿死亡率以及非新生儿破伤风死亡率有重要的意义。
具体实施方式
本发明提供了一种成人青少年用无细胞百白破联合疫苗，所述联合疫苗以0.85～0.95wt％浓度的氯化钠溶液为溶剂，包括如下浓度的组分：百日咳毒素10～20μg/mL，百日咳丝状血凝素10～20μg/mL，百日咳粘附素4～8μg/mL，白喉毒素3～8Lf/mL，破伤风毒素3～8Lf/mL和氢氧化铝1.4～3mg/mL。
在本发明中，所述联合疫苗优选以0.88～0.92wt％浓度的氯化钠溶液为溶剂，包括如下浓度的组分：百日咳毒素16～19μg/mL，百日咳丝状血凝素16～19μg/mL，百日咳粘附素4.5～5.5μg/mL，白喉毒素4～5.5Lf/mL，破伤风毒素4～5.5Lf/mL和氢氧化铝2～2.9mg/mL。
在本发明中，所述联合疫苗进一步优选以0.9wt％浓度的氯化钠溶液为溶剂，包括如下浓度的组分：百日咳毒素18μg/mL，百日咳丝状血凝素18μg/mL，百日咳粘附素5μg/mL，白喉毒素5Lf/mL，破伤风毒素5Lf/mL和氢氧化铝2.8mg/mL。
本发明还提供了一种成人青少年用无细胞百白破联合疫苗的制备方法，包括如下步骤：
(1)对百日咳杆菌发酵产物进行离心，得上清液和菌体，取上清液进行强阳离子分离分别得到百日咳毒素和百日咳丝状血凝素，依次采用复合配基的阳离子交换层析法和复合强阴离子交换填料纯化百日咳毒素，得纯化后的百日咳毒素，再采用复合强阴离子交换填料纯化百日咳丝状血凝素，得纯化后的百日咳丝状血凝素；对菌体进行加热提取，得百日咳粘附素，依次采用复合强阴离子交换填料和强阳离子交换填料纯化百日咳粘附素，得纯化后的百日咳粘附素；
(2)对白喉杆菌发酵产物进行离心，取上清液进行硫酸铵两级盐析，得白喉毒素；
(3)对破伤风芽孢杆菌发酵产物进行离心，取上清液进行硫酸铵两级盐析，得破伤风毒素；
(4)将步骤(1)所得的纯化后的百日咳毒素与缓冲液和终浓度为20～50vt％的甘油混合，使纯化后的百日咳毒素的质量浓度为200～400μg/mL，然后加入终浓度为0.05～1vt％的戊二醛进行脱毒，脱毒后加入终浓度为0.05～0.5wt％的天冬氨酸溶液，反应2～4h，得脱毒后的百日咳毒素；
(5)将步骤(1)所得的纯化后的百日咳丝状血凝素与缓冲液和终浓度为20～50vt％的甘油混合，使纯化后的百日咳丝状血凝素的质量浓度为200～600μg/mL，然后加入终浓度为0.1～0.4wt％的赖氨酸，再加入终浓度为0.02～0.1vt％的甲醛溶液进行脱毒，得脱毒后的百日咳丝状血凝素；
(6)将步骤(2)所得的白喉毒素先与终浓度为0.05～0.5wt％的赖氨酸混合，再与终浓度为0.1～0.5vt％的甲醛溶液混合，进行脱毒，得脱毒后的白喉毒素；
(7)将步骤(3)所得的破伤风毒素先与终浓度为0.05～0.3wt％的赖氨酸混合，再与终浓度为0.1～0.5vt％的甲醛溶液混合，进行脱毒，得脱毒后的破伤风毒素；
(8)将步骤(1)所得的纯化后的百日咳粘附素、步骤(4)所得的脱毒后的百日咳毒素、步骤(5)所得的脱毒后的百日咳丝状血凝素、步骤(6)所得的脱毒后的白喉毒素、步骤(7)所得的脱毒后的破伤风毒素与氢氧化铝和氯化钠溶液混合，得成人青少年用无细胞百白破联合疫苗。
在本发明中，步骤(1)中所述离心的转速优选为7000～10000rpm，进一步优选为8500rpm，所述离心的时间优选为10～18min，进一步优选为14min。
在本发明中，步骤(1)中所述加热提取的温度优选为55～65℃，进一步优选为60℃，所述加热提取的时间优选为0.6～1.2h，进一步优选为0.9h。
在本发明中，步骤(2)中所述离心的转速优选为7000～10000rpm，进一步优选为8500rpm，所述离心的时间优选为10～18min，进一步优选为14min。
在本发明中，步骤(3)中所述离心的转速优选为7000～10000rpm，进一步优选为8500rpm，所述离心的时间优选为10～18min，进一步优选为14min。
在本发明中，步骤(4)中所述脱毒的温度优选为35～39℃，进一步优选为37℃，所述脱毒的时间优选为4～6h，进一步优选为5h。
在本发明中，步骤(4)中所述将步骤(1)所得的纯化后的百日咳毒素与缓冲液和终浓度为20～50vt％的甘油混合，使纯化后的百日咳毒素的质量浓度为200～400μg/mL，然后加入终浓度为0.05～1vt％的戊二醛进行脱毒，脱毒后加入终浓度为0.05～0.5wt％的天冬氨酸溶液，反应2～4h，进一步优选为将步骤(1)所得的纯化后的百日咳毒素与缓冲液和终浓度为35vt％的甘油混合，使纯化后的百日咳毒素的质量浓度为370μg/mL，然后加入终浓度为0.4vt％的戊二醛进行脱毒，脱毒后加入终浓度为0.1wt％的天冬氨酸溶液，反应3h。
在本发明中，步骤(5)中所述脱毒的温度优选为35～39℃，进一步优选为37℃，所述脱毒的时间优选为35～46d，进一步优选为40d。
在本发明中，步骤(5)中所述将步骤(1)所得的纯化后的百日咳丝状血凝素与缓冲液和终浓度为20～50vt％的甘油混合，使纯化后的百日咳丝状血凝素的质量浓度为200～600μg/mL，然后加入终浓度为0.1～0.4wt％的赖氨酸，再加入终浓度为0.02～0.1vt％的甲醛溶液进行脱毒，进一步优选为将步骤(1)所得的纯化后的百日咳丝状血凝素与缓冲液和终浓度为25vt％的甘油混合，使纯化后的百日咳丝状血凝素的质量浓度为250μg/mL，然后加入终浓度为0.2wt％的赖氨酸，再加入终浓度为0.04vt％的甲醛溶液进行脱毒。
在本发明中，步骤(4)和步骤(5)中所述缓冲液独立优选包括如下浓度的组分：PB0.02～0.05M，NaCl0.3～0.6M，进一步优选包括如下浓度的组分：PB0.03M，NaCl0.5M。
在本发明中，步骤(6)中所述脱毒的温度优选为35～39℃，进一步优选为37℃，所述脱毒的时间优选为30～40d，进一步优选为35d。
在本发明中，步骤(6)中所述将步骤(2)所得的白喉毒素先与终浓度为0.05～0.5wt％的赖氨酸混合，再与终浓度为0.1～0.5vt％的甲醛溶液混合，进一步优选为将步骤(2)所得的白喉毒素先与终浓度为0.1wt％的赖氨酸混合，再与终浓度为0.3vt％的甲醛溶液混合。
在本发明中，步骤(7)中所述脱毒的温度优选为35～39℃，进一步优选为37℃，所述脱毒的时间优选为30～40d，进一步优选为35d。
在本发明中，步骤(7)中所述将步骤(3)所得的破伤风毒素先与终浓度为0.05～0.3wt％的赖氨酸混合，再与终浓度为0.1～0.5vt％的甲醛溶液混合，进一步优选为将步骤(3)所得的破伤风毒素先与终浓度为0.15wt％的赖氨酸混合，再与终浓度为0.3vt％的甲醛溶液混合。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
以下实施例中的菌种库制备过程如下：百日咳杆菌菌种库建立：毒种购买自中国食品药品检定研究院原始菌种，建立主代及工作代种子库；白喉棒状杆菌菌种库建立：毒种购买自中国食品药品检定研究院原始菌种，建立主代及工作代种子库；破伤风芽孢杆菌菌种库建立：毒种购买自中国食品药品检定研究院原始菌种，建立主代及工作代种子库。
以下实施例中的活性炭半综合培养基、百日咳液体综合培养基、白喉菌种培养基、破伤风碎肉培养基和破伤风产毒培养基的组分及浓度分别如表1～5所示。
表1活性炭半综合培养基
组分 浓度(g/L)
赫氏干粉 40
酸水解酪蛋白 8
酵母粉 4
磷酸二氢钠 1
氯化钠 3
氯化镁 0.8
硫酸铁 0.01
活性炭 4
表2百日咳液体综合培养基
Figure BDA0003656095900000071
Figure BDA0003656095900000081
表3白喉菌种培养基
组分 加入量
胰酶胨 150g/L
酵母粉 5g
乳酸 3g/L
磷酸氢二钠 1g/L
氯化钙 4g/L
生长因子 5mL
表4破伤风碎肉培养基
组分 加入量
蛋白胨 10g/L
酵母膏 5g/L
磷酸氢二钾 3.5g/L
刃天青 0.1mL
碎肉 50g/L
牛肉浸液 加至1L
表5破伤风产毒培养基
Figure BDA0003656095900000082
Figure BDA0003656095900000091
实施例1
(1)将百日咳杆菌接种于百日咳活性炭半综合培养基，依次进行第一代、第二代和第三代培养，第一代培养条件为35℃、48h，第二、三代培养条件为35℃、22h，然后将第三代培养物接种于百日咳液体综合培养基，依次进行第四代和第五代培养，第四代培养条件为35℃、22h，第五代培养条件为35℃、18h，最后将第五代培养物进行发酵罐培养，培养过程应取样做染色镜检，检查是否有其他杂菌。在对数生长期后期或静止期前期39h收获，得百日咳杆菌发酵产物；
(2)将白喉杆菌接种于白喉菌种培养基，依次进行第一代、第二代和第三代培养，第一代培养条件为35℃、36h，第二、三代培养条件为35℃、18h，然后将第三代培养物进行发酵培养，采用发酵罐深层搅拌通气法培养48h得白喉杆菌发酵产物；
(3)将破伤风芽孢杆菌接种于破伤风碎肉培养基，依次进行第一代和第二代培养，然后将第二代培养产物接种于破伤风产毒培养基进行第三代培养，第一代、第二代和第三代的培养条件均为35℃、36h，最后将第三代培养产物进行发酵培养，采用深层间歇搅拌通气法培养3d得破伤风芽孢杆菌发酵产物；
(4)对步骤(1)所得百日咳杆菌发酵产物于7000rpm的条件下离心10min，得上清液和菌体，取上清液进行强阳离子分离分别得到百日咳毒素和百日咳丝状血凝素，依次采用复合配基的阳离子交换层析法和复合强阴离子交换填料纯化百日咳毒素，得纯化后的百日咳毒素，再采用复合强阴离子交换填料纯化百日咳丝状血凝素，得纯化后的百日咳丝状血凝素；将菌体匀化后对其于55℃的条件下加热提取0.6h，得百日咳粘附素，依次采用复合强阴离子交换填料和强阳离子交换填料纯化百日咳粘附素，得纯化后的百日咳粘附素；
(5)对步骤(2)所得白喉杆菌发酵产物于7000rpm的条件下离心10min，取上清液进行硫酸铵两级盐析，得白喉毒素；
(6)对步骤(3)所得破伤风芽孢杆菌发酵产物于7000rpm的条件下离心10min，取上清液进行硫酸铵两级盐析，得破伤风毒素；
(7)将步骤(4)所得的纯化后的百日咳毒素与缓冲液(0.02M PB+0.3MNaCl)和终浓度为20vt％的甘油混合，使纯化后的百日咳毒素的质量浓度为200μg/mL，然后加入终浓度为0.05vt％的戊二醛于35℃的条件下脱毒4h，脱毒后加入终浓度为0.05wt％的天冬氨酸溶液，反应2h，得脱毒后的百日咳毒素；
(8)将步骤(4)所得的纯化后的百日咳丝状血凝素与缓冲液(0.02M PB+0.3MNaCl)和终浓度为20vt％的甘油混合，使纯化后的百日咳丝状血凝素的质量浓度为200μg/mL，然后加入终浓度为0.1wt％的赖氨酸，再加入终浓度为0.02vt％的甲醛溶液于35℃的条件下脱毒35d，得脱毒后的百日咳丝状血凝素；
(9)将步骤(5)所得的400lf白喉毒素先与终浓度为0.05wt％的赖氨酸混合，再与终浓度为0.1vt％的甲醛溶液混合，于35℃的条件下脱毒30d，得脱毒后的白喉毒素；
(10)将步骤(6)所得的400lf破伤风毒素先与终浓度为0.05wt％的赖氨酸混合，再与终浓度为0.1vt％的甲醛溶液混合，于35℃的条件下脱毒30d，得脱毒后的破伤风毒素；
(11)将步骤(4)所得的纯化后的百日咳粘附素、步骤(7)所得的脱毒后的百日咳毒素、步骤(8)所得的脱毒后的百日咳丝状血凝素、步骤(9)所得的脱毒后的白喉毒素、步骤(10)所得的脱毒后的破伤风毒素与氢氧化铝和氯化钠溶液按照以0.85wt％浓度的氯化钠溶液为溶剂，包括百日咳毒素10μg/mL，百日咳丝状血凝素10μg/mL，百日咳粘附素4μg/mL，白喉毒素3Lf/mL，破伤风毒素3Lf/mL和氢氧化铝1.4mg/mL的量混合，得成人青少年用无细胞百白破联合疫苗。
实施例2
(1)将百日咳杆菌接种于百日咳活性炭半综合培养基，依次进行第一代、第二代和第三代培养，第一代培养条件为35℃、60h，第二、三代培养条件为35℃、30h，然后将第三代培养物接种于百日咳液体综合培养基，依次进行第四代和第五代培养，第四代培养条件为35℃、30h，第五代培养条件为35℃、23h，最后将第五代培养物进行发酵罐培养，培养过程应取样做染色镜检，检查是否有其他杂菌。在对数生长期后期或静止期前期40h收获，得百日咳杆菌发酵产物；
(2)将白喉杆菌接种于白喉菌种培养基，依次进行第一代、第二代和第三代培养，第一代培养条件为35℃、42h，第二、三代培养条件为35℃、21h，然后将第三代培养物进行发酵培养，采用发酵罐深层搅拌通气法培养52h得白喉杆菌发酵产物；
(3)将破伤风芽孢杆菌接种于破伤风碎肉培养基，依次进行第一代和第二代培养，然后将第二代培养产物接种于破伤风产毒培养基进行第三代培养，第一代、第二代和第三代的培养条件均为35℃、42h，最后将第三代培养产物进行发酵培养，采用深层间歇搅拌通气法培养4d得破伤风芽孢杆菌发酵产物；
(4)对步骤(1)所得百日咳杆菌发酵产物于8500rpm的条件下离心14min，得上清液和菌体，取上清液进行强阳离子分离分别得到百日咳毒素和百日咳丝状血凝素，依次采用复合配基的阳离子交换层析法和复合强阴离子交换填料纯化百日咳毒素，得纯化后的百日咳毒素，再采用复合强阴离子交换填料纯化百日咳丝状血凝素，得纯化后的百日咳丝状血凝素；将菌体匀化后对其于60℃的条件下加热提取0.9h，得百日咳粘附素，依次采用复合强阴离子交换填料和强阳离子交换填料纯化百日咳粘附素，得纯化后的百日咳粘附素；
(5)对步骤(2)所得白喉杆菌发酵产物于8500rpm的条件下离心14min，取上清液进行硫酸铵两级盐析，得白喉毒素；
(6)对步骤(3)所得破伤风芽孢杆菌发酵产物于8500rpm的条件下离心14min，取上清液进行硫酸铵两级盐析，得破伤风毒素；
(7)将步骤(4)所得的纯化后的百日咳毒素与缓冲液(0.03M PB+0.5MNaCl)和终浓度为35vt％的甘油混合，使纯化后的百日咳毒素的质量浓度为370μg/mL，然后加入终浓度为0.4vt％的戊二醛于37℃的条件下脱毒5h，脱毒后加入终浓度为0.1wt％的天冬氨酸溶液，反应3h，得脱毒后的百日咳毒素；
(8)将步骤(4)所得的纯化后的百日咳丝状血凝素与缓冲液(0.03M PB+0.5MNaCl)和终浓度为25vt％的甘油混合，使纯化后的百日咳丝状血凝素的质量浓度为250μg/mL，然后加入终浓度为0.2wt％的赖氨酸，再加入终浓度为0.04vt％的甲醛溶液于37℃的条件下脱毒40d，得脱毒后的百日咳丝状血凝素；
(9)将步骤(5)所得的950lf白喉毒素先与终浓度为0.1wt％的赖氨酸混合，再与终浓度为0.3vt％的甲醛溶液混合，于37℃的条件下脱毒35d，得脱毒后的白喉毒素；
(10)将步骤(6)所得的950lf破伤风毒素先与终浓度为0.15wt％的赖氨酸混合，再与终浓度为0.3vt％的甲醛溶液混合，于37℃的条件下脱毒35d，得脱毒后的破伤风毒素；
(11)将步骤(4)所得的纯化后的百日咳粘附素、步骤(7)所得的脱毒后的百日咳毒素、步骤(8)所得的脱毒后的百日咳丝状血凝素、步骤(9)所得的脱毒后的白喉毒素、步骤(10)所得的脱毒后的破伤风毒素与氢氧化铝和氯化钠溶液按照以0.9wt％浓度的氯化钠溶液为溶剂，包括百日咳毒素18μg/mL，百日咳丝状血凝素18μg/mL，百日咳粘附素5μg/mL，白喉毒素5Lf/mL，破伤风毒素5Lf/mL和氢氧化铝2.8mg/mL的量混合，得成人青少年用无细胞百白破联合疫苗。
实施例3
(1)将百日咳杆菌接种于百日咳活性炭半综合培养基，依次进行第一代、第二代和第三代培养，第一代培养条件为36℃、72h，第二、三代培养条件为36℃、48h，然后将第三代培养物接种于百日咳液体综合培养基，依次进行第四代和第五代培养，第四代培养条件为36℃、48h，第五代培养条件为36℃、28h，最后将第五代培养物进行发酵罐培养，培养过程应取样做染色镜检，检查是否有其他杂菌。在对数生长期后期或静止期前期42h收获，得百日咳杆菌发酵产物；
(2)将白喉杆菌接种于白喉菌种培养基，依次进行第一代、第二代和第三代培养，第一代培养条件为36℃、48h，第二、三代培养条件为36℃、24h，然后将第三代培养物进行发酵培养，采用发酵罐深层搅拌通气法培养56h得白喉杆菌发酵产物；
(3)将破伤风芽孢杆菌接种于破伤风碎肉培养基，依次进行第一代和第二代培养，然后将第二代培养产物接种于破伤风产毒培养基进行第三代培养，第一代、第二代和第三代的培养条件均为36℃、48h，最后将第三代培养产物进行发酵培养，采用深层间歇搅拌通气法培养5d得破伤风芽孢杆菌发酵产物；
(4)对步骤(1)所得百日咳杆菌发酵产物于10000rpm的条件下离心18min，得上清液和菌体，取上清液进行强阳离子分离分别得到百日咳毒素和百日咳丝状血凝素，依次采用复合配基的阳离子交换层析法和复合强阴离子交换填料纯化百日咳毒素，得纯化后的百日咳毒素，再采用复合强阴离子交换填料纯化百日咳丝状血凝素，得纯化后的百日咳丝状血凝素；将菌体匀化后对其于65℃的条件下加热提取1.2h，得百日咳粘附素，依次采用复合强阴离子交换填料和强阳离子交换填料纯化百日咳粘附素，得纯化后的百日咳粘附素；
(5)对步骤(2)所得白喉杆菌发酵产物于10000rpm的条件下离心18min，取上清液进行硫酸铵两级盐析，得白喉毒素；
(6)对步骤(3)所得破伤风芽孢杆菌发酵产物于10000rpm的条件下离心18min，取上清液进行硫酸铵两级盐析，得破伤风毒素；
(7)将步骤(4)所得的纯化后的百日咳毒素与缓冲液(0.05M PB+0.6MNaCl)和终浓度为50vt％的甘油混合，使纯化后的百日咳毒素的质量浓度为400μg/mL，然后加入终浓度为1vt％的戊二醛于39℃的条件下脱毒6h，脱毒后加入终浓度为0.5wt％的天冬氨酸溶液，反应4h，得脱毒后的百日咳毒素；
(8)将步骤(4)所得的纯化后的百日咳丝状血凝素与缓冲液(0.05M PB+0.6MNaCl)和终浓度为50vt％的甘油混合，使纯化后的百日咳丝状血凝素的质量浓度为600μg/mL，然后加入终浓度为0.4wt％的赖氨酸，再加入终浓度为0.1vt％的甲醛溶液于39℃的条件下脱毒46d，得脱毒后的百日咳丝状血凝素；
(9)将步骤(5)所得的1500lf白喉毒素先与终浓度为0.5wt％的赖氨酸混合，再与终浓度为0.5vt％的甲醛溶液混合，于39℃的条件下脱毒40d，得脱毒后的白喉毒素；
(10)将步骤(6)所得的1500lf破伤风毒素先与终浓度为0.3wt％的赖氨酸混合，再与终浓度为0.5vt％的甲醛溶液混合，于39℃的条件下脱毒40d，得脱毒后的破伤风毒素；
(11)将步骤(4)所得的纯化后的百日咳粘附素、步骤(7)所得的脱毒后的百日咳毒素、步骤(8)所得的脱毒后的百日咳丝状血凝素、步骤(9)所得的脱毒后的白喉毒素、步骤(10)所得的脱毒后的破伤风毒素与氢氧化铝和氯化钠溶液按照以0.95wt％浓度的氯化钠溶液为溶剂，包括百日咳毒素20μg/mL，百日咳丝状血凝素20μg/mL，百日咳粘附素8μg/mL，白喉毒素8Lf/mL，破伤风毒素8Lf/mL和氢氧化铝3mg/mL的量混合，得成人青少年用无细胞百白破联合疫苗。
实施例4
除氢氧化铝浓度为1.4mg/mL之外，其余步骤及条件均与实施例2保持一致。
实验例1
以实施例2和4所得成人青少年用无细胞百白破联合疫苗为例，研究不同疫苗在小鼠效价上的差异。其中，对照组为无细胞百白破疫苗(DTaP)，配方为：百日咳毒素(PT)50μg/ml，百日咳丝状凝血素(FHA)50μg/ml，百日咳粘附素(PRN)16μg/ml，白喉毒素(DT)25Lf/ml，破伤风毒素(TT)7Lf/ml，氢氧化铝1.4mg/mL。按照2020版《中国药典》无细胞百白破规程操作比较效价的差异，效价反应了实际抗感染的效力。小鼠两次免疫后28天，体内百日咳毒素、百日咳丝状凝血素、百日咳粘附素、白喉毒素、破伤风毒素的抗体水平如表1所示，效价检测结果如表2所示。
表1不同疫苗对抗体水平的影响
Figure BDA0003656095900000141
Figure BDA0003656095900000151
表2不同疫苗对小鼠效价的影响
分组 白喉效价 破伤风效价 百日咳效价
对照组 67.2 83.2 8.9
实施例4 45.2 42.1 6.3
实施例2 45.8 59.2 7.7
由表1可知，从抗体水平上来看，实施例4和实施例2的DT、TT、PT、FHA抗体水平低于对照组，PRN抗体水平高于对照组；实施例2的PT、FHA抗体水平高于实施例4，DT、TT、PRN抗体水平低于实施例4。
由表2可知，从效价上来看，对照组略高于实施例2和4，实施例4略低于实施例2。
与DTaP不同，DTaP不能用于成人的免疫，而本申请制备的疫苗可用于成人和青少年。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种成人青少年用无细胞百白破联合疫苗，其特征在于，所述联合疫苗以0.85～0.95wt％浓度的氯化钠溶液为溶剂，包括如下浓度的组分：百日咳毒素10～20μg/mL，百日咳丝状血凝素10～20μg/mL，百日咳粘附素4～8μg/mL，白喉毒素3～8Lf/mL，破伤风毒素3～8Lf/mL和氢氧化铝1.4～3mg/mL。
2.权利要求1所述的成人青少年用无细胞百白破联合疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)对百日咳杆菌发酵产物进行离心，得上清液和菌体，取上清液进行强阳离子分离分别得到百日咳毒素和百日咳丝状血凝素，依次采用复合配基的阳离子交换层析法和复合强阴离子交换填料纯化百日咳毒素，得纯化后的百日咳毒素，再采用复合强阴离子交换填料纯化百日咳丝状血凝素，得纯化后的百日咳丝状血凝素；对菌体进行加热提取，得百日咳粘附素，依次采用复合强阴离子交换填料和强阳离子交换填料纯化百日咳粘附素，得纯化后的百日咳粘附素；
(2)对白喉杆菌发酵产物进行离心，取上清液进行硫酸铵两级盐析，得白喉毒素；
(3)对破伤风芽孢杆菌发酵产物进行离心，取上清液进行硫酸铵两级盐析，得破伤风毒素；
(4)将步骤(1)所得的纯化后的百日咳毒素与缓冲液和终浓度为20～50vt％的甘油混合，使纯化后的百日咳毒素的质量浓度为200～400μg/mL，然后加入终浓度为0.05～1vt％的戊二醛进行脱毒，脱毒后加入终浓度为0.05～0.5wt％的天冬氨酸溶液，反应2～4h，得脱毒后的百日咳毒素；
(5)将步骤(1)所得的纯化后的百日咳丝状血凝素与缓冲液和终浓度为20～50vt％的甘油混合，使纯化后的百日咳丝状血凝素的质量浓度为200～600μg/mL，然后加入终浓度为0.1～0.4wt％的赖氨酸，再加入终浓度为0.02～0.1vt％的甲醛溶液进行脱毒，得脱毒后的百日咳丝状血凝素；
(6)将步骤(2)所得的白喉毒素先与终浓度为0.05～0.5wt％的赖氨酸混合，再与终浓度为0.1～0.5vt％的甲醛溶液混合，进行脱毒，得脱毒后的白喉毒素；
(7)将步骤(3)所得的破伤风毒素先与终浓度为0.05～0.3wt％的赖氨酸混合，再与终浓度为0.1～0.5vt％的甲醛溶液混合，进行脱毒，得脱毒后的破伤风毒素；
(8)将步骤(1)所得的纯化后的百日咳粘附素、步骤(4)所得的脱毒后的百日咳毒素、步骤(5)所得的脱毒后的百日咳丝状血凝素、步骤(6)所得的脱毒后的白喉毒素、步骤(7)所得的脱毒后的破伤风毒素与氢氧化铝和氯化钠溶液混合，得成人青少年用无细胞百白破联合疫苗。
3.根据权利要求2所述的成人青少年用无细胞百白破联合疫苗的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述离心的转速为7000～10000rpm，所述离心的时间为10～18min；
所述加热提取的温度为55～65℃，所述加热提取的时间为0.6～1.2h。
4.根据权利要求2或3所述的成人青少年用无细胞百白破联合疫苗的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述离心的转速为7000～10000rpm，所述离心的时间为10～18min。
5.根据权利要求4所述的成人青少年用无细胞百白破联合疫苗的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述离心的转速为7000～10000rpm，所述离心的时间为10～18min。
6.根据权利要求5所述的成人青少年用无细胞百白破联合疫苗的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述脱毒的温度为35～39℃，所述脱毒的时间为4～6h。
7.根据权利要求6所述的成人青少年用无细胞百白破联合疫苗的制备方法，其特征在于，步骤(5)中所述脱毒的温度为35～39℃，所述脱毒的时间为35～46d。
8.根据权利要求7所述的成人青少年用无细胞百白破联合疫苗的制备方法，其特征在于，步骤(4)和步骤(5)中所述缓冲液独立包括如下浓度的组分：PB0.02～0.05M，NaCl0.3～0.6M。
9.根据权利要求8所述的成人青少年用无细胞百白破联合疫苗的制备方法，其特征在于，步骤(6)中所述脱毒的温度为35～39℃，所述脱毒的时间为30～40d。
10.根据权利要求9所述的成人青少年用无细胞百白破联合疫苗的制备方法，其特征在于，步骤(7)中所述脱毒的温度为35～39℃，所述脱毒的时间为30～40d。
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