CN103357003A - 疫苗 - Google Patents

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M.迪谢纳
A.玛丽
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Abstract

本发明涉及疫苗。具体涉及用于预防脊髓灰质炎的疫苗领域，尤其涉及用于预防脊髓灰质炎、白喉、破伤风和百日咳疾病的联合疫苗。具体来说，提供包含降低剂量的灭活脊髓灰质炎病毒(IPV)的疫苗，其能够维持足够的或改善的抗脊髓灰质炎的保护水平。

Description

疫苗
本申请是申请日为2007年9月7日的中国专利申请200780041457.5“疫苗”的分案申请。
技术领域
本发明涉及用于预防脊髓灰质炎的疫苗领域，尤其涉及用于预防脊髓灰质炎、白喉、破伤风和百日咳疾病的联合疫苗。
背景技术
为了使赋予抗多种病原体的保护所需的免疫次数最少、降低给药成本和增加接受率和覆盖率，联合疫苗(其提供抗多种病原体的保护)是非常理想的。许多资料记载的抗原竞争(或干扰)现象使多组分疫苗的开发复杂化。抗原干扰是指观察到施用多种抗原经常导致针对某些抗原的应答相对于这些抗原单独施用时的应答减小。
已知联合疫苗可预防百日咳杆菌(Bordetella pertussis)，破伤风杆菌(Clostridium tetani)，白喉杆菌(Corynebacterium diphtheriae)，和可选的预防灭活的脊髓灰质炎病毒(IPV)和/或乙肝病毒和/或B型嗜血杆菌(Haemophilus)感染(参见例如WO 93/24148，WO97/00697和WO2000/030678)。
在多年研究后，在疫苗领域内被视为有效的标准剂量的脊髓灰质炎疫苗包括40D抗原单位的灭活1型脊髓灰质炎病毒(Mahoney)，8D抗原单位的灭活2型脊髓灰质炎病毒(MEF-1)以及32D抗原单位的灭活3型脊髓灰质炎病毒(Saukett)(例如Infanrix-IPVTM)。
本发明人令人惊讶地发现，降低剂量的IPV能够维持足够的或提高的抗脊髓灰质炎保护水平。这种疫苗具有重要的优点，包括为需要该疫苗的个体提供更高剂量的IPV疫苗的能力。
发明内容
因此，本发明提供各种降低剂量的IPV疫苗(其可以只含有IPV组分或可以含有IPV组分以及其他抗原)。
因此，一方面本发明提供一种本发明的IPV疫苗，其包含剂量大于10D抗原单位并小于20D抗原单位(例如11，12，13，14，15，16，17，18或19D抗原单位)的灭活1型脊髓灰质炎病毒。
在一个实施方案中，本发明提供一种本发明的IPV疫苗，其包含剂量为8-20D抗原单位(例如8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19或20D抗原单位)的灭活3型脊髓灰质炎病毒。
在另一个实施方案中，本发明提供一种本发明的IPV疫苗，其包含剂量为2-4D抗原单位(例如2、3或4D抗原单位)的灭活2型脊髓灰质炎病毒。
在另一个实施方案中，本发明提供一种本发明的IPV疫苗，其还包含白喉类毒素和/或破伤风类毒素和/或采用灭活全细胞Pw疫苗或非细胞百日咳抗原形式的百日咳疫苗。
在另一方面，本发明提供一种本发明的IPV疫苗，其是不含硫柳汞的DTP-IPV联合疫苗，包含剂量为10-36D抗原单位的灭活1型脊髓灰质炎病毒。
在另一个实施方案中，本发明提供一种本发明不含硫柳汞的DTP-IPV联合疫苗，其包含剂量为2-7D抗原单位(例如5、6或7D抗原单位)的灭活2型脊髓灰质炎病毒。
在另一个实施方案中，本发明提供一种本发明不含硫柳汞的DTP-IPV联合疫苗，其包含剂量为8-29D抗原单位(例如21、22、23、24、25、26、27、28或29D抗原单位)的灭活3型脊髓灰质炎病毒。
在另一个实施方案中，本发明的疫苗还可以包含选自下列组的一种或多种抗原：乙肝表面抗原，b型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)抗原，A型脑膜炎球菌(Neisseria meningitidis)抗原，C型脑膜炎球菌抗原，W型脑膜炎球菌抗原，Y型脑膜炎球菌抗原，B型脑膜炎球菌bleb或抗原，甲肝抗原和伤寒沙门氏菌((Salmonella typhi))抗原，尤其是来自所述细菌的荚膜糖。
还提供本发明制备疫苗的方法。
定义
术语“疫苗”可选的可以用“免疫原性组合物”替换，反之亦然。
“D抗原单位”(还称为“国际单位”或IU)：脊髓灰质炎病毒的D抗原形式诱导保护性中和抗体。本文提及的D抗原单位(例如在本发明的疫苗中)是在终疫苗配制前在每个未吸附初始IPV抗原类型中测得的总D抗原单位，所述终疫苗被添加到配制疫苗的每人剂量中(通常终体积为0.5mL)。测量D抗原单位的可靠方法是本领域公知的，例如由欧洲药典(European Pharmacopoeia)公开。例如，可以按照下文实施例1(“通过ELISA的D抗原定量”)描述的ELISA试验测量D抗原单位。欧洲药典提供试验样品(European Pharmacopoeia Biological ReferencePreparation(欧洲药典生物参考制品)，获自Ph.Eur.Secretariat，例如CodeP 216 0000)，以便在制造商之间将该方法标准化(Pharmeuropa SpecialIssue，Bio96-2)。因此D抗原单位值在本领域是公知的。
本文的术语“剂量”通常是本发明疫苗的一次施用量，其通常是一次注射量。典型的人剂量是0.5mL。当然在疫苗施用方案中可以施用各种剂量。
本文中术语“IPV”或包含这些组分的疫苗旨在表示灭活的脊髓灰质炎病毒1型(例如作为优选使用的Mahoney，或Statens Serum Institut出售的Brunhilde，称为DiTeKiPol)、2型(例如MEF-1)或3型(例如Saukett)，或这些类型的两种或全部三种的组合。用于本发明目的完整(或标准)剂量(分别是1、2和3型IPV的40-8-32D)IPV疫苗的实例可以是
Figure BDA00003345376500031
(GSK Biologicals S.A.)。因此，当在本文描述IPV标准剂量的X％存在于本发明疫苗时，它表示分别等于1、2和/或3型IPV的40、8和/或32D抗原单位(在每个初始IPV抗原类型中测定)的X％的D抗原单位被配制到每剂量的所述疫苗中。
术语“脂多糖”(LPS)和“脂寡糖”(LOS)是可以互换的。
在本说明书自始至终，术语“糖”表示多糖或寡糖，并且包括这两者。荚膜糖抗原可以是全长多糖，或其可以扩展到疫苗领域公知的细菌‘分级的糖(sized-saccharides)’和‘寡糖’(其天然具有较低数量的重复单位，或其是为了便于操纵在大小方面减小的多糖，但仍能够在宿主中诱导保护性的免疫应答)(参见例如EP 497525)。
本文的术语“核酸”包括单链或双链脱氧核糖核酸(DNA)，或单链或双链核糖核酸(RNA)，或其混合物。
在本发明疫苗范围内的术语来自病原体的“组分”或“给予对这种病原体保护的组分”旨在表示来自该病原体的一种或多种抗原。
本文的术语“大概”或“大约”旨在表示指定值的±10％，但应当符合有效范围。
附图说明
图1.含有IPV剂量的DTPwSF-HB-IPV“制备方法3”的相对效力(RP)的衍变。
在体内检测降低剂量IPV的制剂“制备方法3”的效力，与参照制剂(Poliorix制剂和DTPaIPVHB)进行比较。按照标准IPV剂量(对于1/2/3型来说是40/8/32D抗原单位)的100％、50％、25％和12.5％剂量测量IPV的RP。
图2.DTPwSF-HB-IPV制剂相对效力(RP)衍变的流程图。
在体内检测两种制剂“制备方法3”和“制备方法4”的降低剂量IPV的效力，与参照制剂(Poliorix制剂和DTPaIPVHB)进行比较。与只含25％IPV的安慰剂相比，检测含25％标准IPV剂量(对于1/2/3型是40/8/32D抗原单位)的“制备方法3”和“制备方法4”的RP。
图3.在开始和第8个月时1、2和3型IPV的相对效力。
检测IPV的相对效力[相对于DTPaHBIPV(Pediarix)(图3a)或Poliorix(图3b)]以确定Hib组分是否影响IPV效力，并评价不同IPV剂量条件下IPV随时间的稳定性。
图4.用于白喉类毒素吸附的制备方法。
图5.用于破伤风类毒素吸附的制备方法。
图6.用于Pw吸附的制备方法。
图7.用于HBsAg吸附的制备方法。
图8.白喉类毒素的吸附流程图。
图9.破伤风类毒素的吸附流程图。
图10.HBsAg的吸附步骤。
图11.Pw吸附的流程图。
图12.DTPw-HBV疫苗的制备流程图。
具体实施方式
本发明提供一种疫苗(例如联合疫苗)，其包含来自脊髓灰质炎病毒(IPV)和可选的白喉杆菌(D)、破伤风杆菌(T)、百日咳杆菌(P)或乙肝的抗原。
本发明的抗原
IPV疫苗组分
本发明的疫苗可以由1型IPV或2型IPV或3型IPV组成，或由1和2型IPV组成，或由1和3型IPV组成，或由2和3型IPV组成，或由1、2和3型IPV组成。
制备灭活脊髓灰质炎病毒(IPV)的方法是本领域公知的。在一个实施方案中，就如疫苗本领域常见的，IPV包括1、2和3型，可以是用甲醛灭活的沙克脊髓灰质炎疫苗(参见例如，Sutter等人，2000，Pediatr.Clin.North Am.47：287；Zimmerman & Spann 1999，Am Fam Physician59：113；Salk等人，1954，Official Monthly Publication of the AmericanPublic Health Association44(5)：563；Hennesen，1981，Develop.Biol.Standard 47：139；Budowsky，1991，AdV.Virus Res.39：255)。
在一个实施方案中，IPV是不吸附的(例如如果存在其他组分，在与这些组分混合之前)。在另一个实施方案中，本发明的IPV组分可以吸附到铝盐诸如氢氧化铝(例如如果存在其他组分，在与这些组分混合之前或之后)。在另一个实施方案中，本发明的IPV组分可以吸附到铝盐诸如磷酸铝。在另一个实施方案中，IPV组分可以吸附到氢氧化铝和磷酸铝的混合物。如果是吸附的，一种或多种IPV组分可以单独吸附或一起吸附成混合物。可以通过如WO2004/039417描述的特定干燥过程稳定IPV。
脊髓灰质炎病毒可以在细胞培养物中生长。所述细胞培养物可以是VERO细胞系或PMKC，其是源自猴肾的连续细胞系。可以方便地在微载体中培养VERO细胞。在病毒感染之前及期间培养VERO细胞可能需要使用来自牛的原料诸如小牛血清，并且该原料应该获自没有牛海绵状脑炎(BSE)的来源。培养可能还涉及诸如乳白蛋白水解物等材料。在增殖后，可以利用诸如超滤、透析过滤和层析法等技术纯化病毒粒子。在给患者施用前，病毒必须被灭活，这可以通过用甲醛处理来实现。
病毒可以单独增殖、纯化和灭活，然后将其混合得到浓缩的初始混合物用于IPV疫苗用途，或添加到吸附的白喉和破伤风抗原及百日咳组分用于包含DTPw-IPV或DTPa-IPV的疫苗。
本发明疫苗中的抗原将以“免疫有效量”存在，即给个体施用所述量(以单剂量或作为连续剂量的一部分的形式)能够有效治疗或预防疾病。剂量治疗可以是单剂量方案或多剂量方案(例如包括加强剂量)。
现在脊髓灰质炎疫苗的标准剂量倾向于包括40D抗原单位的灭活1型脊髓灰质炎病毒，8D抗原单位的灭活2型脊髓灰质炎病毒，以及32D抗原单位的灭活3型脊髓灰质炎病毒(例如Infanrix-IPVTM)。
但是，本发明人意外地发现可以使用降低剂量的IPV获得良好免疫应答。在一个实施方案中，本发明的IPV疫苗剂量可以包含10-36D抗原单位的1型IPV(例如11-32、12-28、13-24、14-20或15-19D抗原单位)。在另一个实施方案中，本发明的IPV疫苗剂量可以包含剂量为10-20D抗原单位的1型IPV，或剂量大于10D抗原单位并小于20D抗原单位。在另一个实施方案中，本发明的疫苗剂量可以包含1型IPV的标准40D抗原单位剂量的26-49％、30-45％、33-40％、35-37％，或大约或精确的三分之一(等于大约10.4-19.6、12-18、13.2-16、14-14.8或13.3D抗原单位)。在另一个实施方案中，本发明的IPV疫苗剂量可以包含11-32抗原单位，12-28D抗原单位，13-24D抗原单位或14-20D抗原单位的1型IPV。
可选择地，本发明的IPV疫苗剂量可以包含10-19.5抗原单位，12-19D抗原单位，14-18.5D抗原单位或15-17D抗原单位的1型IPV；例如大约或精确的16D抗原单位的1型IPV。
在另一个实施方案中，本发明的疫苗可以包含小于4D抗原单位、2-4D抗原单位(等于25-50％的标准8D抗原单位剂量)或大约或精确的3D抗原单位的2型IPV(等于37.5％的标准8D抗原单位剂量)。
在另一个实施方案中，本发明的疫苗可以包含大约或精确的三分之一的标准8D抗原单位剂量的2型IPV(等于大约2.7D抗原单位)。
在另一个实施方案中，本发明的疫苗可以包含2-7D抗原单位的2型IPV。在另一个实施方案中，本发明的IPV疫苗剂量可以包含3-6D抗原单位或4-5D抗原单位的2型IPV。
可选择地，本发明的IPV疫苗剂量可以包含2-4.5D抗原单位、2.5-4D抗原单位或3-3.5D抗原单位的2型IPV。
在另一个实施方案中，本发明的疫苗可以包含8-20D抗原单位，大于8但小于20D抗原单位，9-19D抗原单位，10-18D抗原单位，11-17D抗原单位，12-16D抗原单位，或13-15D抗原单位的3型IPV；例如大约或精确的14D抗原单位的3型IPV(等于25-62.5％、28.125-59.375％、31.25-46.875％或43.75％的标准32D抗原单位剂量)。
在另一个实施方案中，本发明的疫苗可以包含大约或精确的三分之一的标准32D抗原单位剂量的3型IPV(等于大约10.7D抗原单位)。
在另一个实施方案中，本发明的IPV疫苗剂量可以包含8-29D抗原单位，9-26D抗原单位，10-23D抗原单位，11-20D抗原单位，12-17D抗原单位，或13-14D抗原单位的3型IPV。
可选择地，本发明的IPV疫苗剂量可以包含8-19.5D抗原单位，9-19D抗原单位，10-18.5D抗原单位，11-18D抗原单位，12-17.5D抗原单位，13-17D抗原单位，或14-16D抗原单位；例如大约或精确的15D抗原单位。
DTP疫苗组分
DTP疫苗是公知的用于预防或治疗白喉、破伤风和百日咳杆菌(B.pertussis)疾病的疫苗。本发明的疫苗可以包含白喉、破伤风和/或百日咳组分。
白喉抗原通常是白喉类毒素。白喉类毒素(DT)制品被大量文献记载。可以使用任意合适的白喉类毒素。例如，可以通过从白喉杆菌的培养物纯化毒素，继之以化学脱毒制备DT，但可选的通过纯化所述毒素的重组或遗传脱毒类似物来制备(例如，CRM197，或其他突变体，如US4,709,017、US5,843,711，US5,601,827和US5,917,017中的描述)。在一个实施方案中，每0.5mL剂量中DT以5-50、7-30Lf或大约或精确的7.5Lf或25Lf的量存在。在另一个实施方案中，每0.5mL剂量中DT以小于5Lf或1-4Lf或大约或精确的2Lf的低剂量存在。在一个实施方案中，本发明的白喉类毒素可以吸附到铝盐诸如氢氧化铝上。在另一个实施方案中，本发明的白喉类毒素可以吸附到铝盐诸如磷酸铝上。在另一个实施方案中，白喉类毒素可以吸附到氢氧化铝和磷酸铝的混合物上。
本发明的破伤风抗原通常是破伤风类毒素。制备破伤风类毒素(TT)的方法是本领域公知的。在一个实施方案中，通过从破伤风杆菌的培养物中纯化毒素，继之以化学脱毒来制备TT，但可选的通过纯化所述毒素的重组或遗传脱毒类似物来制备(例如EP 209281中所述)。可以使用任意合适的破伤风类毒素。“破伤风类毒素”可以包括全长蛋白的免疫原性片段(例如Fragment C-参见EP478602)。在一个实施方案中，每0.5mL剂量中TT以2.5-30Lf、3-20Lf、5-15Lf或精确的或大约10Lf的量存在。在一个实施方案中，本发明的破伤风类毒素可以吸附到铝盐诸如氢氧化铝上。在另一个实施方案中，本发明的破伤风类毒素可以吸附到铝盐诸如磷酸铝上。在另一个实施方案中，破伤风类毒素可以吸附到氢氧化铝和磷酸铝的混合物上。
本发明的百日咳组分可以是非细胞的(Pa)(其中使用纯化的百日咳抗原)或全细胞的(Pw)(其中使用灭活的全细胞百日咳作为百日咳组分)。Pw可以通过数种已知的方法(包括不含汞的方法)灭活。这类方法可以包括加热(例如55-65℃或56-60℃共5-60分钟或10-30分钟，例如60℃共30分钟)，甲醛(例如0.1％在37℃，24小时)，戊二醛(例如0.05％在室温，10分钟)，丙酮-I(例如在室温下处理三次)或丙酮-II(例如在室温下处理三次并在37℃进行第四次处理)灭活(参见例如Gupta等人，1987，J.Biol.Stand.15：87；Gupta等人，1986，Vaccine，4：185)。制备适合本发明的灭活、全细胞百日咳杆菌(Pw)的方法公开于WO93/24148，其也是产生DT-TT-Pw-HepB疫苗的合适制备方法。在过去，硫柳汞被用于灭活的全细胞百日咳杆菌的制备(见下文)。但是，在一个实施方案中，它不被用于本发明疫苗的制备步骤。
通常使用的Pw剂量为5-50IOU、7-40IOU、9-35IOU、11-30IOU、13-25IOU、15-21IOU或大约或精确的20IOU。
非细胞的Pa疫苗也是公知的，可以包括以下2种或更多种抗原：百日咳类毒素(PT)，丝状血细胞凝集素(FHA)，百日咳杆菌粘附素(pertactin)(PRN)，凝集原2&3。在一个实施方案中，Pa疫苗包含PT、FHA和PRN。本发明的试剂盒或疫苗可以包括通过公知的甲醛处理方法或通过突变(PT衍生物)脱毒的PT。已经发现蛋白S1亚基内残基的取代导致该蛋白保留PT的免疫和保护性质，但毒性降低或没有毒性(EP322533)。在EP322533权利要求中描述的脱毒突变体是本发明DT脱毒突变体的实例。这种突变体可以使用低于20-25μg的剂量。
在一个实施方案中，每0.5mL剂量中使用的PT量为2-50μg、5-40μg、10-30μg或精确的或大约25μg。在另一个实施方案中，每0.5mL剂量中使用的PT量为2.5或8μg。
在一个实施方案中，每0.5mL剂量中使用的FHA量为2-50μg、5-40μg、10-30μg或精确的或大约25μg。在另一个实施方案中，每0.5mL剂量中使用的FHA量为精确的或大约2.5或8μg。
在一个实施方案中，每0.5mL剂量中使用的PRN量为0.5-20μg、0.8-15μg、2-10μg或精确的或大约8μg。在另一个实施方案中，每0.5mL剂量中使用的PRN量为精确的或大约0.8或2.5μg。
在一个实施方案中，本发明的百日咳组分可以吸附到铝盐诸如氢氧化铝上。在另一个实施方案中，本发明的百日咳组分可以吸附到铝盐诸如磷酸铝上。在另一个实施方案中，百日咳组分可以吸附到氢氧化铝和磷酸铝的混合物上。例如在一个实施方案中，至少PRN吸附到氢氧化铝上，并且PT/FHA吸附到氢氧化铝、磷酸铝或这两者的混合物上。
其他抗原
本发明的疫苗制剂，任选的还包含DTP(DTPw或DTPa)，还可以包括选自以下的一种或多种抗原：乙肝表面抗原，b型流感嗜血杆菌抗原，A型脑膜炎球菌抗原，C型脑膜炎球菌抗原，W-135型脑膜炎球菌抗原，Y型脑膜炎球菌抗原，B型脑膜炎球菌bleb或纯化抗原，甲肝抗原，伤寒沙门氏菌抗原和RTS，S。通常可以使用这些病原体的荚膜糖或LOS抗原。抗原通常以至少每种1μg/mL的浓度存在，例如1-20μg/mL、2-15μg/mL、2.5-10μg/mL、3-8μg/mL或4-6μg/mL。通常，任意抗原的浓度将足以引发抗该抗原的免疫应答。优选的单个抗原的保护效果不因为它们的混合而被去除，但是事实上免疫原性(例如ELISA滴度)可能被减弱。
在本发明的一个实施方案中，其他抗原可以吸附到铝盐诸如氢氧化铝上。在另一个实施方案中，本发明的其他抗原可以吸附到铝盐诸如磷酸铝上。在另一个实施方案中，其他抗原可以吸附到氢氧化铝和磷酸铝的混合物上，或可以是不吸附的。
当使用荚膜糖或LOS抗原时，其可以被缀合到包含T辅助表位的载体蛋白，以便增强免疫原性。本发明也可以包括游离的“载体蛋白”。
作为在本发明组合物中使用蛋白抗原的替换，可以使用编码所述抗原的核酸。因此本发明组合物的蛋白组分可以被编码该蛋白的核酸(例如DNA，其可以采用质粒的形式)取代。类似地，本发明的组合物可以包括模拟糖抗原诸如模拟位或抗个体基因型抗体的蛋白。这些可以取代单独的糖组分，或对它们进行补充。
乙肝抗原
乙肝表面抗原(HBsAg)制品被大量文献记载。参见例如，Hartford等人，1983，Develop.Biol.Standard 54：125，Gregg等人，1987，Biotechnology5：479，EP0226846，EP0299108。它可以按照如下方法制备。一种方法涉及从慢性乙肝携带者的血浆纯化微粒形式的抗原，因为大量HBsAg在肝脏中合成，并在HBV感染期间释放到血流中。另一种方法涉及通过重组DNA方法表达该蛋白。可以通过在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、毕赤酵母、昆虫细胞(例如Hi5)或哺乳动物细胞中表达来制备HBsAg。可以将HBsAg插入质粒，并通过启动子诸如“GAPDH”启动子(来自甘油醛-3-磷酸胶氢酶基因)控制其在质粒中的表达。所述酵母可以在合成培养基中培养。然后通过包括诸如沉淀、离子交换层析和超滤等步骤的方法纯化HBsAg。纯化后，可以将HBsAg进行透析(例如用半胱氨酸)。可以使用微粒形式的HBsAg。
如本文使用的表述“乙肝表面抗原”或“HBsAg”包括任意HBsAg抗原或其显示HBV表面抗原的抗原性的片段。应了解除HBsAg S抗原226氨基酸序列(参见Tiollais等人，1985，Nature317：489及其中的参考文献)之外，如果需要，本文描述的HBsAg可以包括上述参考文献和EP0278940描述的pre-S序列的全部或部分。尤其是，HBsAg可以包括一种包含氨基酸序列的多肽，相对于ad血清型的乙肝病毒的开放阅读框，所述氨基酸序列包含残基133-145后面是HBsAg的L蛋白的残基(该多肽被称作L*；参见EP0414374)。本发明范围内的HBsAg还可以包括EP0198474(Endotronics)描述的preS1-preS2-S多肽或其类似物，诸如EP0304578(McCormick and Jones)描述的那些。本文描述的HBsAg还可以涉及突变体，例如WO91/14703或EP0511855A1描述的“逃逸突变体(escape mutant)”，尤其是145位的氨基酸取代是从甘氨酸变为精氨酸的HBsAg。
HBsAg可以采用颗粒形式。所述颗粒可以包括诸如单独的S蛋白或可以是复合颗粒(诸如L*，S)，其中L*如上所述，S表示HBsAg的S蛋白。所述颗粒有利地采用在酵母中表达的形式。
在一个实施方案中，HBsAg是EngerixBTM(GlaxoSmithKlineBiologicals S.A.)中使用的抗原，其在WO93/24148中被进一步描述。
在一个实施方案中，每5mL剂量中HBsAg以5-20μg、8-15μg或大约或精确的10μg的量存在。
乙肝表面抗原可以吸附到磷酸铝上，这可以在与其他组分混合前完成(描述于WO93/24148)。乙肝组分应当基本上不含硫柳汞(无硫柳汞的HBsAg的制备方法先前已经公开于EP1307473)。
b型流感嗜血杆菌抗原
WO97/00697已经描述了包含来自B型流感嗜血杆菌抗原的疫苗。本发明的疫苗可以使用任意合适的B型流感嗜血杆菌抗原。所述抗原可以是与载体蛋白(Hib)缀合的来自B型流感嗜血杆菌的荚膜糖(PRP)。所述糖是核糖、核糖醇和磷酸酯的聚合物。Hib抗原可以任选的如WO97/00697所述吸附到磷酸铝上，或如WO02/00249所述是不吸附的，或还没有经历特定的吸附步骤。
本文中“未吸附到铝佐剂盐上”的抗原是指例如抗原在新鲜铝佐剂盐上的明确或专一吸附步骤不参与配制组合物的步骤。
Hib可以缀合到任何载体，所述载体提供至少一个T辅助表位(其实例在下文描述)，其可以是破伤风类毒素、白喉类毒素、CRM-197(白喉毒素突变体)或蛋白D。
Hib可以被冻干，并可以临用前重建(例如用稀释剂，任选的包含本发明疫苗的其他抗原成分)。
在一个实施方案中，每5mL剂量中Hib以5-20μg、8-15μg或大约或精确的10μg糖的量存在。
在另一个实施方案中，Hib以WO02/00249所述的低剂量(例如1-6μg、2-4μg或大约或精确的2.5μg糖)存在。
脑膜炎球菌A、C、W或Y型抗原
本发明的疫苗还可以包括细菌的荚膜糖，其选自：A型脑膜炎球菌(MenA，任选的与载体蛋白缀合)，C型脑膜炎球菌(MenC，任选的与载体蛋白缀合)，W-135型脑膜炎球菌(MenW，任选的与载体蛋白缀合)和Y型脑膜炎球菌(MenY，任选的与载体蛋白缀合)。
本发明的疫苗可以包括来自脑膜炎球菌不同株的一种或多种抗原，如下文的详细描述，其可以单独使用或以2、3或4种组分的任意组合形式使用：
MenA，MenC，MenW，MenY，或MenA+MenC，MenA+MenW，MenA+MenY，MenC+MenW，MenC+MenY，MenW+MenY或MenA+MenC+MenW，MenA+MenC+MenY，MenA+MenW+MenY，MenC+MenW+MenY或MenA+MenC+MenW+MenY。
在一个实施方案中，本发明的脑膜炎球菌组分可以吸附到铝盐诸如氢氧化铝上。在另一个实施方案中，本发明的脑膜炎球菌组分可以吸附到铝盐诸如磷酸铝上。在另一个实施方案中，脑膜炎球菌组分可以吸附到氢氧化铝和磷酸铝的混合物上。在一个实施方案中，脑膜炎球菌组分可以不吸附到佐剂诸如铝佐剂盐上。
B型脑膜炎球菌型bleb或抗原
本发明的疫苗还可以包括MenB组分，诸如外膜囊泡或bleb(在WO01/09350、WO03/105890、WO04/014417或WO04/014418中描述)或缀合的MenB荚膜糖(或其衍生物)抗原(例如参见WO96/40239)或游离或缀合的L2或L3或L2和L3脑膜炎球菌的LOS(根据WO2004/014417)。在一个实施方案中，本发明的MenB组分可以吸附到铝盐诸如氢氧化铝上。在另一个实施方案中，本发明的MenB组分可以吸附到铝盐诸如磷酸铝上。在另一个实施方案中，MenB组分可以吸附到氢氧化铝和磷酸铝的混合物上。在一个实施方案中，MenB组分可以不吸附到佐剂诸如铝佐剂盐上。
伤寒沙门氏菌抗原
本发明的疫苗还可以包括来自伤寒沙门氏菌的Vi糖，其可以是注册的产品
Figure BDA00003345376500121
描述于EP1107787，或其缀合物(例如与本文描述的载体蛋白)。可以按照WO2007/000343的描述进行缀合步骤。在一个实施方案中，本发明的Vi糖可以吸附到铝盐诸如氢氧化铝上。在另一个实施方案中，本发明的Vi糖可以吸附到铝盐诸如磷酸铝上。在另一个实施方案中，Vi糖可以吸附到氢氧化铝和磷酸铝的混合物上。在一个实施方案中，Vi糖可以不吸附到佐剂诸如铝佐剂盐上。
甲肝抗原
能够预防甲肝的组分可以是灭活的减毒甲肝疫苗，诸如称为HavrixTM的产品(GlaxoSmithKline Biologicals S.A.的注册商标)，其是源自甲肝病毒(HAV)的HM-175株的灭活减毒疫苗(参见“InactivatedCandidate Vaccines for Hepatitis A(甲肝的灭活候选疫苗)”，F.E.Andre等人，1980，Prog.Med.Virol.37：72和产品专题文章“Havrix”，由SmithKline Beecham Biologicals在1991年出版)。Flehmig等人(1990，Prog.Med Virol.37：56)综述了甲肝的临床状况、病毒学、免疫学和流行病学，并描述了开发抗这类常见病毒感染的疫苗的方法。如本文使用的表述“HAV抗原”是指能够在人体中刺激针对HAV的中和抗体的任何抗原。在一个实施方案中，HAV抗原包含灭活的减毒病毒颗粒，或在另一个实施方案中，HAV抗原可能是HAV衣壳或HAV病毒蛋白，其可以方便地通过DNA重组技术获得。在一个实施方案中，本发明的甲肝组分可以吸附到铝盐诸如氢氧化铝上。在另一个实施方案中，本发明的甲肝组分可以吸附到铝盐诸如磷酸铝上。在另一个实施方案中，甲肝组分可以吸附到氢氧化铝和磷酸铝的混合物上。
疟疾抗原
本发明的疫苗还可以包括疟疾抗原。疟疾抗原可以是RTS，S(CS和HBsAg的杂合蛋白-描述于US6,306,625和EP0614465)。在一个实施方案中，RTS，S可以用于本发明的疫苗以替代HBsAg。其他疟疾抗原也可用于本发明的疫苗，包括CS蛋白，RTS，TRAP，B2992的16kD蛋白，AMA-1，MSP1，任选的包括CpG(WO2006/029887，WO98/05355，WO01/00231)。
在一个实施方案中，本发明的疟疾抗原可以吸附到铝盐诸如氢氧化铝上。在另一个实施方案中，本发明的疟疾抗原可以吸附到铝盐诸如磷酸铝上。在另一个实施方案中，疟疾抗原可以吸附到氢氧化铝和磷酸铝的混合物上。在一个实施方案中，疟疾抗原用水包油乳液和/或类脂A衍生物(诸如MPL)和/或甾醇(诸如胆固醇)和/或生育酚(诸如α-生育酚)作为佐剂。在另一个实施方案中，疟疾抗原可以不吸附到佐剂诸如铝佐剂盐上。
缀合物
本发明的细菌荚膜糖缀合物可以包括任何包含至少一个T辅助表位的载体肽、多肽或蛋白。使用的载体蛋白可以选自：破伤风类毒素，白喉类毒素，CRM197，重组白喉毒素(如US4,709,017、WO93/25210、WO95/33481或WO00/48638中任一所述)，来自肺炎链球菌(S.pneumoniae)的肺炎球菌溶血素(任选的化学脱毒，或脱毒突变体)(参见例如WO2004/081515及其引用的参考文献)，来自脑膜炎球菌的OMPC(EP0372501)，和来自流感嗜血杆菌的蛋白D(PD)(EP594610)。其他载体可以包括合成肽(EP0378881；EP0427347)，热休克蛋白(WO93/17712；WO94/03208)，百日咳蛋白(WO98/58668；EP0471177)，细胞因子(WO91/01146)，淋巴因子(WO91/01146)，激素(WO91/01146)，生长因子(WO91/01146)，包含来自各种病原体来源抗原的多种人CD4+T细胞表位的人工蛋白(Falugi等人，2001，Eur.J.Immunol.31：3816)，肺炎球菌表面蛋白PspA(WO02/091998)，铁摄取蛋白(WO01/72337)，艰难梭菌(C.difficile)的毒素A或B(WO00/61761)，肺炎球菌PhtD(WO00/37105)，肺炎球菌PhtDE(例如WO01/98334 & WO03/054007)，PhtX，等等。
所有糖都可以在相同载体上，尤其是来自一个特定生物体的所有糖，例如MenA、MenC、MenW和MenY糖都可以全部缀合到TT、DT或CRM-197上。但是，由于已知的载体抑制作用，如果将本发明每种组合物中包含的糖抗原(“n”个抗原)与超过一种载体缀合的话可能是有利的。因此所述糖的(n-1)个可以在一种载体类型上携带(单独的)，1个在不同载体上，或(n-2)个在一种载体类型上，2个在不同的载体上，等等。例如，在包含4个细菌糖缀合物的疫苗中，1、2或所有4个可以与不同的载体缀合。但是，蛋白D可用于组合物中的各种(2、3、4或更多个)糖并且没有显著的载体抑制作用。Hib可以TT、DT或CRM197缀合物的形式存在，MenA、MenC、MenY和MenW可以是TT、DT、CRM197或PD缀合物。Vi可以TT、DT或CRM197缀合物的形式存在。蛋白D是一种有用的载体，因为它提供一种能够预防流感嗜血杆菌的其他抗原。在一个实施方案中，所有糖都与相同的载体蛋白缀合。
例如通过利用碳化二亚胺(例如EDAC)缩合化学(考虑到Vi重复亚基包含羧基)的方法可以将Vi与载体蛋白缀合。这可以通过以下反应实现：(i)Vi的COOH和蛋白的NH2之间的单碳化二亚胺反应或(ii)双碳化二亚胺反应，其发生在Vi的COOH和接头分子的NH2以及蛋白的COOH和同质双功能接头分子的NH2之间，或Vi的COOH和异质双功能接头分子的NH2以及蛋白的NH2和异质双功能接头分子的COOH之间。
缀合可用于游离载体蛋白的连接。在一个实施方案中，当指定的载体蛋白在本发明组合物中以游离和缀合形式存在时，未缀合的形式不超过整个组合物中载体蛋白总量的5％，或在另一个实施方案中未缀合的形式按重量计小于2％。
可以使用任何已知的方法(例如，Likhite，美国专利4,372,945和Armor等人，美国专利4,474,757)，在必要时利用任何合适的接头，将糖与载体蛋白连接。
在缀合之前，糖通常被活化或功能化。活化可以涉及，例如，氰化(cyanylating)试剂诸如CDAP(1-氰基-二甲基氨基吡啶
Figure BDA00003345376500141
四氟硼酸盐)(WO95/08348 & WO96/29094)。氰化(cyanylating)反应可以在相对温和的条件下进行，这可以避免碱性敏感糖的水解。这种合成允许直接缀合到载体蛋白。其他合适的技术使用碳化二亚胺，酰肼，活性酯，降冰片烷，对硝基苯甲酸，N-羟基琥珀酰亚胺酯，S-NHS，EDC或TSTU。
可以利用任何已知的步骤，诸如US4,882,317和US4,695,624描述的步骤，完成通过接头基团的连接。一类连接涉及糖的还原性胺化，将所获氨基与已二酸接头基团的一个末端缀合(EP0477508，Porro等人，1985，Mol.Immunol.22：907，EP0208375)，然后将蛋白与己二酸接头基团的另一末端缀合。其他接头包括B-丙酰胺基(WO00/10599)，硝基苯基-乙胺(Gever等人，1979，Med.Microbiol.Immunol.165：171)，酰卤盐(US4,057,685)，糖苷键(US4,673,574；US4,761，283；US4,808,700)，6-氨基己酸(US4,459,286)，ADH(US4,965,338)，C4到C12基团(US4,663,160)，等等。作为使用接头的替代方法，可以使用直接连接。与蛋白的直接连接可以包括糖的氧化，继之以所述蛋白的还原性胺化，诸如US4,761,283和US4,356,170中的描述或直接CDAP反应。
缀合后，可以分离游离和缀合的糖。存在很多适合这类分离的方法，包括疏水层析，切向超滤，透析过滤，等等(还可参见Lei等人，2000，DevBiol.(Basel).103：259；WO00/38711；US6,146,902)。在一个实施方案中，如果疫苗包含游离和缀合两种形式的指定糖，未缀合形式在整个组合物中按重量计不超过该糖总量的20％(例如≤15％，≤10％，≤5％，≤2％，≤1％)。
能够为宿主提供保护的糖量(有效量)可以由技术人员确定。在一个实施方案，每剂量将包括0.1-100μg的糖，在另一个实施方案中每剂量将包括0.1-50μg，在进一步的实施方案中每剂量将包括0.1-10μg，仍在另一个实施方案中每剂量将包括1-5μg。
佐剂
本发明的疫苗可以包括药学上可接受的赋形剂诸如合适的佐剂。合适的佐剂包括铝盐诸如氢氧化铝或磷酸铝，但也可以是钙盐、铁盐或锌盐，或可以是酰化酪氨酸(MPL)的不溶性悬浮液，或酰化糖，或可以是阳离子或阴离子衍生的糖，聚磷腈，可生物降解的微球，单磷酸类脂A(MPL)，类脂A衍生物(例如具有减弱的毒性)，3-O-脱酰MPL，quil A，皂苷，QS21，生育酚(EP0382271)，弗氏不完全佐剂(Difco Laboratories，Detroit，MI)，Merck Adjuvant65(Merck and Company，Inc.，Rahway，NJ)，AS-2(Smith-Kline Beecham，Philadelphia，PA)，CpG寡核苷酸，生物粘附剂和粘膜粘附剂，微粒，脂质体，聚氧乙烯醚制剂，聚氧乙烯酯制剂，胞壁酰肽或咪唑并喹啉(例如咪喹莫特及其同系物)。在本发明中适合作为佐剂的人类免疫调节剂包括细胞因子诸如白介素(例如IL-1，IL-2，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-12，等等)，巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)，肿瘤坏死因子(TNF)，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)也可以作为佐剂使用。
在本发明的一个实施方案中，所述制剂的佐剂组合物主要诱导TH1型的免疫应答。高水平的TH1型细胞因子(例如IFN-γ、TNFα、IL-2和IL-12)倾向于促进诱导针对所施用抗原的细胞介导的免疫应答。在应答主要是TH1型的实施方案中，TH1型细胞因子的水平将增加到高于TH2型细胞因子水平的程度。利用标准分析可以轻易地评价这些细胞因子的水平。对于细胞因子家族的综述，可以参见Mosmann and Coffman，1989，Ann.Rev.Immunol.7：145。
因此，主要促进TH1应答的合适佐剂系统包括，类脂A的衍生物(例如具有减弱的毒性)，单磷酸类脂A(MPL)或其衍生物，尤其是3-脱氧-酰化单磷酸类脂A(3D-MPL)，以及单磷酸类脂A的组合，任选的3-脱氧酰化单磷酸类脂A以及铝盐。增强系统涉及单磷酸类脂A和皂苷衍生物的组合，尤其是WO94/00153公开的QS21和3D-MPL的组合，或WO96/33739公开的致反应性较低的组合物，其中QS21用胆固醇猝灭。包括溶于水包油乳液的QS21、3D-MPL和生育酚的尤其有效的佐剂描述于WO95/17210。所述疫苗还可以包括皂苷，其可以是QS21。所述制剂还可以包括水包油乳液和生育酚(WO95/17210)。包含寡核苷酸的非甲基化CpG(WO96/02555)还是TH1应答的优选诱导物，并且适用于本发明。
本发明的疫苗还可以包含上述一种或多种本发明佐剂的组合。
本发明的任何佐剂可以吸附到本发明的IPV组分或与其组合。
当涉及氢氧化铝或磷酸铝时，所有氢氧化铝和/或磷酸铝的参考都按照Hem and White(Pharm Biotechnol.1995；6：249-276)的描述。
在一个实施方案中，磷酸铝也可以被称作羟基磷酸铝。在另一个实施方案中，磷酸铝在pH为7.4时带有负电荷。通常，磷酸铝的等电点(pI)是5-7或6-7或大约或精确的5。在另一个实施方案中，磷酸铝中磷酸∶铝的摩尔比例为0.3-0.9或0.3-0.6或0.8-0.9。
在一个实施方案中，氢氧化铝在pH为7.4时带有正电荷。通常，氢氧化铝的pI是8-11、9-11、10-11或大约或精确的11。
通常，每0.5mL剂量中铝的总量是200-1000μg，300-900μg，400-800μg，500-700μg或大约或精确的630μg Al3+。这适用于所有氢氧化铝或所有磷酸铝。可选择地，Al3+含量可能来自以下比例的氢氧化铝和磷酸铝的混合物：1∶8-8∶1、1∶4-4∶1、3∶8-8∶3、1∶2-2∶1或1∶1的磷酸铝∶氢氧化铝。在一个实施方案中，使用的磷酸铝∶氢氧化铝比例为12∶1-4∶1，11∶1-5∶1，10∶1-6∶1，9∶1-7∶1或8∶1。
尽管大部分铝在混合形成联合疫苗前以预吸附抗原的形式提供，一些铝可以在制备本发明的联合疫苗期间以游离形式添加，例如在本文描述的pH调节步骤前。通常，每0.5mL剂量中游离铝的含量可以是0-300μg，50-250μg，75-200μg，100-150μg或大约或精确的115μg的Al3+。游离的Al3+可以全部是Al(OH)3或全部是AlPO4，或以下比例的Al(OH)3和AlPO4的混合物(w∶w Al3+∶Al3+)：1∶1-1∶6，1∶1.1-1∶5，1∶1.2-1∶4，1∶1.3-1∶3，1∶1.4-1∶2，例如23/92或69/46或6∶1-1∶1，5∶1-1.1∶1，4∶1-1.2∶1，3∶1-1.3∶1，2∶1-1.4∶1，例如46/69或92/23。
可选的本发明疫苗的某些组分可以不是特意吸附到佐剂尤其是铝盐上。
IPV可以不吸附或吸附到Al(OH)3或Al(OH)3和AlPO4的混合物上。DT可以吸附到Al(OH)3或AlPO4上，TT可以吸附到Al(OH)3或AlPO4上，Pw可以吸附到AlPO4上或与其混合，PRN可以吸附到Al(OH)3上，FHA可以吸附到Al(OH)3上，PT可以吸附到Al(OH)3上，HB可以吸附到AlPO4上，Hib可以吸附到AlPO4上或不吸附，Men ACWY可以吸附到Al(OH)3或AlPO4上或不吸附，MenB组分可以吸附到Al(OH)3或AlPO4上或不吸附，Vi可以吸附到Al(OH)3或AlPO4上或不吸附，HepA可以吸附到Al(OH)3或AlPO4上。
预吸附到铝盐上的抗原可以在混合前单独预吸附。在另一个实施方案中，在与其他佐剂混合前可以将抗原的混合物预吸附。在一个实施方案中，IPV可以分别吸附或作为1、2和3型IPV的混合物吸附，或当与吸附的D和T组分混合时吸附。
“吸附的抗原”的含义是例如表示大于20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％或90％的吸附。
如本文使用的术语“磷酸铝”和“氢氧化铝”包括适合作为疫苗佐剂的所有形式的氢氧化铝或磷酸铝。例如，磷酸铝可以是不溶性磷酸铝的沉淀物(无定形的，半结晶的或结晶的)，其任选的但不是唯一的通过混合可溶性铝盐和磷酸盐来制备。“氢氧化铝”可以是不溶性氢氧化铝的沉淀物(无定形的，半结晶的或结晶的)，其任选的但不是唯一的通过中和铝盐溶液来制备。尤其合适的是可以从商品化来源获得的各种形式的氢氧化铝和磷酸铝凝胶，诸如Brenntag Biosector(Denmark)提供的Alhydrogel(氢氧化铝，溶于水的3％悬浮液)和Adjuphos(磷酸铝，溶于盐水的2％悬浮液)。
本发明疫苗的非免疫组分
除了上文提及的抗原和佐剂组分之外，本发明的疫苗通常包括一种或多种“药学上可接受的载体或赋形剂”，其包括自身不诱导对接受所述组合物的个体有害的抗体生成的任何赋形剂。合适的赋形剂通常是大的、代谢缓慢的大分子诸如蛋白，糖，聚乳酸，聚乙醇酸，多聚氨基酸，氨基酸共聚物，蔗糖(Paoletti等人，2001，Vaccine，19：2118)，海藻糖(WO00/56365)，乳糖和类脂聚集物(诸如油滴或脂质体)。这类载体对本领域普通技术人员来说是公知的。所述疫苗还可以包含稀释剂，诸如水，盐水，甘油，等等。此外，还可以存在辅助剂，诸如湿润剂或乳化剂，pH缓冲剂，等等。无菌无热原的、磷酸盐缓冲的生理盐水是一种典型载体。关于药学上可接受赋形剂的深入讨论可以参见参考文献Gennaro，2000，Remington：The Science and Practice of Pharmacy，20th版，ISBN：0683306472。
本发明的组合物可以是冻干的或采用水性形式，即溶液或悬浮液。这一类的液体制剂允许直接从组合物的包装形式进行施用，无需在水介质中重建，因此适用于注射。组合物可以存在于小瓶中，或它们可以存在于预填充的注射器中。所述注射器可以提供针头或不提供针头。注射将包括单剂量的组合物，而小瓶可以包括单剂量或多剂量(例如2个剂量)。在一个实施方案中，所述剂量是用于人的。在另一个实施方案中，所述剂量用于成人，青年，初学走路的孩子，婴儿或小于1岁的人，可以通过注射施用。
本发明的液体疫苗还适于从冻干形式重建其他疫苗。当疫苗用于临用前重建时，本发明提供一种试剂盒，其可以包括两个小瓶，或可以包括预填充的注射器和一个小瓶，具有在注射前用于重建小瓶中内含物的注射器内含物。
本发明的疫苗可以包装成单位剂量形式或多剂量形式(例如2个剂量)。对于多剂量形式来说，小瓶优于预填充注射器。有效的剂量体积可以按惯例确定，单用于注射的组合物的典型人剂量是0.5mL体积。
在一个实施方案中，本发明疫苗的pH为6.0-8.0，在另一个实施方案中，本发明疫苗的pH为6.3-6.9，例如6.6±0.2。可以将疫苗在这个pH进行缓冲。可以通过使用缓冲液维持稳定的pH。如果组合物包含氢氧化铝盐，可以使用组氨酸缓冲液(WO03/009869)。组合物应当是无菌和/或无热原的。
本发明的组合物对于人类来说应该是等渗的。
本发明的疫苗可以包括抗微生物剂，尤其是当包装为多剂量形式时。应当避免硫柳汞因为这导致IPV组分效力的损失。也可以使用其他抗微生物剂，诸如2-苯氧乙醇或对羟苯甲酸(甲基、乙基、丙基对羟苯甲酸)。任何防腐剂优选的是以低水平存在的。防腐剂可以外源添加，和/或可以是初始抗原的组分，其被混合形成所述组合物(例如作为百日咳抗原的防腐剂存在)。
在一个实施方案中，本发明的疫苗是不含硫柳汞或基本上不含硫柳汞的。“不含硫柳汞”或“基本上不含硫柳汞”表示最终制剂中不存在足以对IPV组分的效力产生负面影响的硫柳汞。例如，如果在Pw或乙肝表面抗原纯化过程中使用硫柳汞，其应当在与IPV混合前被基本上去除。终疫苗中的柳硫汞含量应当低于0.025μg/μg蛋白，0.02μg/μg蛋白，0.01μg/μg蛋白或0.001μg/μg蛋白，例如0μg/μg蛋白。在一个实施方案中，既不添加硫柳汞，也不在任何组分的纯化中使用硫柳汞。对于乙肝来说参见例如EP1307473，对于Pw步骤来说参见上文，其中灭活是在无硫柳汞存在的情况下完成的。
本发明的疫苗可以包括去污剂例如Tween(聚山梨醇酯)，诸如Tween80。去污剂通常是以低水平存在，例如＜0.01％。
本发明的疫苗可以包括指定张力的钠盐(例如氯化钠)。所述组合物可以包括氯化钠。在一个实施方案中，本发明组合物中氯化钠的浓度范围是0.1到100mg/mL(例如1-50mg/mL，2-20mg/mL，5-15mg/mL)，在另一个实施方案中，氯化钠的浓度是10±2mg/mL NaCl，例如大约9mg/mL。
本发明的疫苗通常包括缓冲液。磷酸盐或组氨酸缓冲液是典型代表。
本发明的疫苗可以包括溶液中游离的磷酸盐离子(例如通过使用磷酸盐缓冲液)，以便有利于抗原的不吸附。在一个实施方案中，本发明组合物中游离磷酸盐离子的浓度为0.1-10.0mM，或在另一个实施方案中，其浓度为1-5mM，或在进一步的实施方案中其浓度为2.5mM。
本发明疫苗的性质
在一个实施方案中，将本发明的疫苗以下述方式配制为给宿主体内施用的疫苗，在该方式中组合物的单项组分被配制为使得单项组分的免疫原性基本上不被该组合物的其他单项组分损害。“基本上不被损害”表示在免疫时，获得的抗各个组分的抗体滴度大于该抗原单独施用时所获滴度的60％、70％、80％或90％，或95-100％。因此，在优选的实施方案中，与联合疫苗中其他组分的单独施用相比，不存在对联合疫苗中其他组分的(显著)不利影响(按照保护性效果来说)。
疫苗制剂
在一个实施方案中，将本发明的疫苗配制为给宿主体内施用的疫苗，这样的话它们在可接受比例的人类受试者中为各个抗原组分提供高于血清保护标准的抗体滴度。这是评价疫苗在整个群体中效果的一个重要试验。具有相关抗体滴度(超过该滴度就认为宿主被血清转化为抗该抗原)的抗原是公知的，并且所述滴度由机构(诸如WHO)公开。在一个实施方案中，受试者统计上显著的样品中超过80％是血清转化的，在另一个实施方案中，受试者统计上显著的样品中超过90％是血清转化的，在进一步的实施方案中，受试者统计上显著的样品中超过93％是血清转化的，仍在另一个实施方案中，受试者统计上显著的样品中96-100％是血清转化的。
每种疫苗剂量中抗原的量是经过选择，能够在典型疫苗中诱导免疫防护应答而且没有显著不良副作用的量。这种量将取决于使用的特异免疫原而不同。通常预期每个剂量将包括1-1000μg的全部免疫原，或1-100μg，或1-40μg，或1-5μg。特定疫苗最合适的量可以通过研究确定，所述研究涉及观察受试者的抗体滴度和其他反应。初次接种过程可以包括2-3次剂量的疫苗，间隔1到2个月，例如按照WHO对于DTP免疫的推荐(即在生命的第一年)。加强剂量可以在生命的第二年和/或之后的年份进行。
通过血清中和试验测定的大鼠中Polio效力
出于本发明的目的，用于IPV定量评价本发明包含IPV疫苗的疫苗效力的分析应当利用单剂量疫苗进行，并且应当通过测定试验疫苗几何平均滴度(GMT)对参照疫苗GMT的比例来实施，最后其被记录为相对反应(RR)或相对效力(RP)。参照GMT可以是由分别包含40-8-32D抗原单位的1-2-3型IPV的任何IPV疫苗获得的GMT，也可以是由已知疫苗
Figure BDA00003345376500211
获得的GMT。通常，如下进行RP试验：
通过血清中和试验确定大鼠中1、2和3型脊髓灰质炎病毒的效力：
●给10只健康大鼠(Sprague-Dawley(OFA)或任何事先批准的品系)的组肌内接种试验样品或参考材料的稀释物(1/1.25；1/3.125；1/7.81)(溶于磷酸盐水缓冲液)。如果必要，通过接种未稀释的疫苗和前面提及的3种稀释物将稀释范围扩展到4种稀释物。10只接种稀释剂的大鼠被用作阴性对照。每周一次观察大鼠以检测任何异常反应。接种后20到22天，对每只动物进行深度麻醉，采血并收集血清以通过血清中和试验进行分析。
●为了进行血清中和试验，通过在56℃的水浴中温育30分钟灭活血清。利用合适的稀释介质在微板上制备血清的3种系列稀释物，每种对应一种脊髓灰质炎类型。将板在4℃保存。
对于3种脊髓灰质炎病毒类型，将预定量的病毒(30-300CCID50)添加到血清稀释物中。3种病毒悬浮液根据它们各自的滴度进行稀释。最终稀释物被称为“工作稀释物”。将各个工作稀释物添加到相应的微板。然后将板密封，在37℃±1℃温育16小时。然后添加Hep-2细胞，将微板在37℃±1℃温育7天。在考马斯蓝染色后利用倒置显微镜记录病毒的细胞致病变作用(CPE)。抗脊髓灰质炎抗体的存在抑制病毒的生长以及相应CPE的出现。抗脊髓灰质炎病毒滴度(1、2和3型)等于没有任何CPE的最终稀释度的倒数。在每组中，记录具有中和抗体的动物，并测定每个血清样品中针对不同类型脊髓灰质炎病毒的抗体滴度。中和抗体滴度用血清样品最高稀释度(完全抑制脊髓灰质炎病毒对Hep-2细胞的细胞致病作用)的倒数的log2表示。
●还测定每组大鼠中每个稀释度和每种病毒类型的几何平均滴度(GMT)。
本发明疫苗的包装
本发明的疫苗可以包装到各种类型的容器中，例如小瓶，注射器，等等。多次剂量瓶通常将包括可再密封的塑料瓶口，通过该瓶口无菌针头可以插入吸取一次剂量的疫苗，当针头被移出后可以再次密封该瓶口。
所述疫苗可以在不同的容器中(例如2或3)提供。所述容器中的内含物可以在给宿主通过单次注射施用前临时混合，或可以将其同时在不同的位点施用。如果试剂盒是同时施用(在两个或更多个容器中)，则所述疫苗或各个疫苗的剂量通常是0.5mL。
在本发明这方面的一个实施方案中，提供包含两种多价疫苗的试剂盒，所述疫苗在宿主中提供抵抗疾病的保护，所述疾病由脊髓灰质炎病毒，百日咳杆菌，破伤风杆菌，白喉杆菌以及任选的乙肝、B型流感嗜血杆菌、A型脑膜炎球菌、C型脑膜炎球菌、W型脑膜炎球菌、Y型脑膜炎球菌、B型脑膜炎球菌、伤寒沙门氏菌、甲肝或疟疾中的一种或多种引起。
所述试剂盒包含第一容器，其包含：
(1)(a)本发明灭活的脊髓灰质炎病毒(IPV)，
(b)白喉类毒素(DT或D)(参见上文)，
(c)破伤风类毒素(TT或T)(参见上文)，
(d)灭活全-细胞百日咳杆菌(Pw)或2种或更多种非细胞百日咳组分(Pa)(参见上文)，
(e)任选的乙肝表面抗原(HepB或HB)(参见上文)，
(f)任选的载体蛋白与B型流感嗜血杆菌(Hib)荚膜糖的缀合物(参见上文)，
(g)任选的载体蛋白与A型脑膜炎球菌(MenA)荚膜糖或C型脑膜炎球菌(MenC)荚膜糖的缀合物的其中一种或两种(参见上文)，和
第二容器包含：
(2A)(a)载体蛋白与A型脑膜炎球菌(MenA)荚膜糖、C型脑膜炎球菌(MenC)荚膜糖、W型脑膜炎球菌(MenW)荚膜糖和/或Y脑膜炎球菌(MenY)荚膜糖的缀合物(参见上文本发明各种Men糖组合)，和
(b)任选的载体蛋白与B型流感嗜血杆菌(Hib)荚膜糖的缀合物；或
(2B)(a)任选的载体蛋白与B型流感嗜血杆菌(Hib)荚膜糖的缀合物，和
(b)任选的载体蛋白与伤寒沙门氏菌Vi糖的缀合物。
所述试剂盒任选的可以包括第三容器，其包含：
(3)(a)任选的乙肝表面抗原
(b)任选的载体蛋白与伤寒沙门氏菌Vi糖的缀合物
在这两种情况下所述容器都还可以包括HepA抗原和/或MenB抗原和/或RTS，S和/或肺炎链球菌抗原。
在这两种情况下，相同抗原不应该在两个容器中都存在。
在一个实施方案中，第一容器除了组分a)、b)、c)、d)之外，还具有组分e)、f)、g)、e)+f)、e)+g)、f)+g)或e)+f)+g)。
在一个实施方案中，第一容器中的疫苗可以是液体，第二容器中的疫苗可以是液体或冻干的(例如存在已知的稳定赋形剂诸如蔗糖或海藻糖)。
所述试剂盒的容器可以单独包装，或任选的包装在一起。在一个实施方案中，所述试剂盒提供用于施用两个或更多个容器中疫苗的一系列说明书。
在一个实施方案中，当试剂盒中的容器包含某个糖缀合物时，在该试剂盒的其他容器中不存在相同的缀合物。
发明人相信以上述方式提供的试剂盒有利地以最佳方式将各种抗原呈递给宿主的免疫系统。所述试剂盒给执业医师提供最佳的免疫宿主的方法，该方法具有以下一个或多个优点：对全部抗原的保护效果，最小的反应原性，最小的载体抑制干扰，最小的佐剂/抗原干扰，或最小的抗原/抗原干扰。按此方式用最少次数(2次)施用就可实现这些目标，任选的发生在同一次就医时。
在一个实施方案中，第一和第二容器中的疫苗在不同的位点同时施用(如下文“本发明疫苗的施用”中所述)，在一个选择性实施方案中，本发明人设想可将第一和第二容器中的内含物混合(任选的临用前)，然后作为单剂疫苗施用。
制备本发明的疫苗
本发明还提供一种制备疫苗制剂的方法，包括将疫苗组分与药学上可接受的赋形剂混合的步骤。
在本发明的一个实施方案中，提供本文所述疫苗在用于疾病的治疗或预防的药物中的用途，所述疾病由脊髓灰质炎病毒及任选的百日咳杆菌，破伤风杆菌，白喉杆菌，乙肝病毒，流感嗜血杆菌，A型脑膜炎球菌，C型脑膜炎球菌，W型脑膜炎球菌，Y型脑膜炎球菌，伤寒沙门氏菌、甲肝或甲肝的感染引起。
在本发明的另一个实施方案中，提供本发明的疫苗在制备用于疾病的治疗或预防的药物中的用途，所述疾病由脊髓灰质炎病毒及任选的百日咳杆菌，破伤风杆菌，白喉杆菌，乙肝病毒，流感嗜血杆菌，A型脑膜炎球菌，C型脑膜炎球菌，W型脑膜炎球菌，Y型脑膜炎球菌，伤寒沙门氏菌、甲肝或甲肝的感染引起。
此外，还提供一种免疫人类宿主抵抗疾病的方法，所述疾病由脊髓灰质炎病毒及任选的百日咳杆菌，破伤风杆菌，白喉杆菌，乙肝病毒，流感嗜血杆菌，A型脑膜炎球菌，C型脑膜炎球菌，W型脑膜炎球菌，Y型脑膜炎球菌，伤寒沙门氏菌或甲肝引起，该方法包括给宿主施用免疫保护剂量的本发明疫苗。
每种疫苗剂量中抗原的量是经过选择，能够在典型疫苗中诱导免疫防护应答而且没有显著不良副作用的量。这种量将根据使用的特异免疫原及其如何被呈递而不同。在一个实施方案，每剂量将包括0.1-100μg的糖，在另一个实施方案中每剂量将包括0.1-50μg，在进一步的实施方案中每剂量将包括0.1-10μg，仍在另一个实施方案中每剂量将包括1-5μg糖。
在一个实施方案中，所述疫苗中蛋白抗原的含量范围是1-100μg，在另一个实施方案中，所述疫苗中蛋白抗原的含量范围是5-50μg，在进一步的实施方案中，所述疫苗中蛋白抗原的含量范围是5-25μg。
疫苗制品一般描述于Vaccine Design(疫苗设计)[“The subunit andadjuvant approach”(eds Powell M.F.& Newman M.J.)(1995)PlenumPress New York]。Fullerton描述了脂质体内的包裹(美国专利4,235，877)。例如Likhite(美国专利4,372,945)和Armor等人(美国专利4,474,757)公开了蛋白与大分子的缀合。Dalsgaard等人(1977，Acta Vet Scand.18：349)公开了Quil A的使用。3D-MPL获自Ribi immunochem，USA，并公开于英国专利申请号2220211和美国专利4,912,094。QS21公开于美国专利5,057,540。
在本发明的另一个实施方案中，提供一种多价疫苗，其包括本发明灭活的脊髓灰质炎病毒(IPV)及任选的灭活全细胞百日咳杆菌(Pw)，破伤风类毒素(TT)，白喉类毒素(DT)，载体蛋白与B型流感嗜血杆菌荚膜糖的缀合物(Hib-任选的与TT、DT或CRM197缀合)，其中每0.5mL剂量的初始疫苗中缀合物的量是1-8μg，并且所述缀合物的免疫原性等于或被改善超过包括更大量缀合物的这类组合物。任选的，还可以包括乙肝表面抗原。
在一个实施方案中，每0.5mL剂量的初始疫苗中缀合物的量小于10μg(所述缀合物中的糖)，在另一个实施方案中缀合物的量是1-7，在另一个实施方案中缀合物的量是2-6μg，或在进一步的实施方案中是约2.5、3、4或5μg。
应理解某些组分诸如DTPw组分，可以在添加吸附的HBsAg或其他组分前单独组合。
还提供制备本发明疫苗的方法，其包括将1型IPV、2型IPV和/或3型IPV与药学上可接受的赋形剂混合的步骤。利用其他抗原制备本发明初始疫苗的典型步骤将向D和T组分的混合物中添加IPV组分，即DT组分与IPV组分混合。这种混合顺序允许在添加Pa或Pw组分前调节组合物的离子强度和/或pH(例如pH＜7)。通常，先添加预吸附到AlPO4上的HB(如果其被包括在组合物中)，然后添加预吸附到Al(OH)3或AlPO4上的DT，随后添加预吸附到Al(OH)3或AlPO4上的TT，然后添加任选的预吸附到Al(OH)3上的IPV，随手调节pH到例如pH5.9-7.2，或pH6-7，或pH6.2-6.8，或pH6.4-6.6，然后添加预吸附到AlPO4上的Pw。任选的，可以在该步骤的任一点添加Hib、Vi、MenA、MenC、MenW、Men Y、MenB和/或HepA抗原。在一个实施方案中，可以在pH调节前添加Hib、Vi、MenA、MenC、MenW、Men Y、MenB和/或HepA抗原。在一个实施方案中，本发明的一种或多种抗原吸附到磷酸铝或氢氧化铝或这两者的混合物上。在另一个实施方案中，本发明的抗原与药学上可接受的赋形剂和/或佐剂混合。
在一个实施方案中，按照以下顺序制备本发明的疫苗组合物：添加预吸附的HBsAg，继之以预吸附的白喉类毒素，继之以预吸附的破伤风类毒素和IPV，然后在添加预吸附的Pw前调节pH到大约6.5。
在另一个实施方案中，按照以下顺序制备本发明的疫苗组合物：添加预吸附的HBsAg，继之以IPV，继之以预吸附的HBsAg，继之以预吸附的白喉类毒素，在添加预吸附的Pw前调节pH到大约6.5。
通常，可以如下所述制备根据本发明任意方面的联合疫苗组合物：将IPV、DTPw、HepB、MenA、MenC、MenW、MenY、MenB、Vi、甲肝或其他组分预吸附到合适的佐剂上，尤其是氢氧化铝或磷酸铝或这两者的混合物。在提供足够相应组分完整和稳定吸附的时间之后，在合适的条件下组合不同的组分。在与DTPw疫苗混合之前，Hib、Vi、MenA、MenC、MenW和/或MenY缀合物可以吸附到或可以不吸附到铝佐剂盐上。
在一个实施方案中，在15℃到30℃之间(例如19℃到27℃之间，或23±4℃)制备本发明的疫苗。
本发明疫苗的施用
本发明提供一种在哺乳动物中激发免疫应答的方法，包括施用有效量的本发明疫苗的步骤。所述疫苗可以是预防性施用(即预防感染)。所述免疫应答优选的是保护性的，并且优选的包括抗体。所述方法可以激发加强应答。
在初次接种后，受试者可以接受有足够间隔的一次或数次加强(后续的)免疫。定量治疗可以是单剂量方案或多剂量方案。多剂量可用于初次免疫方案和/或加强免疫方案。初始剂量方案(其可以在生命的第一年进行)后可以跟随加强剂量方案。初免接种之间(例如4-16周之间)以及初免和加强之间的合适周期可以按照常规来确定。
在一个实施方式中，哺乳动物是人。当疫苗用于预防性用途时，人优选的是儿童(例如初学走路的婴儿)或少年；当疫苗用于治疗性用途时，人优选的是成人。预期用于儿童的疫苗也可给成人施用，例如用于评价安全性，剂量，免疫原性等等。
本发明的疫苗制剂可以用于保护或治疗易受感染的哺乳动物，通过直接给患者施用所述疫苗。直接递送可以通过以下方式实现：肠胃外给药(肌内，腹腔内，皮内，皮下地，静脉内，或向组织的细胞间隙)；或通过直肠，口服，阴道，局部，透皮，鼻内，眼，耳，肺部或其他粘膜施用。在一个实施方案中，通过肌肉注射到大腿或上臂进行施用。注射可以通过针头(例如皮下注射针头)，但可选择地也可使用无针头注射。典型的肌内剂量是0.5mL。
细菌感染影响身体的各个区域，因此本发明的组合物可以被制备成各种形式。例如，所述组合物可以被制备为可注射的，例如液体溶液或悬浮液。所述组合物可以制备用于肺部施用诸如吸入器，利用细粉或喷雾剂。所述组合物可以被制备为栓剂或阴道栓剂。所述组合物可以被制备用于鼻、耳或眼施用，诸如喷雾剂、滴剂、凝胶或粉末(参见例如Almeida & Alpar，1996，J Drug Targeting，3：455；Bergquist等人，1998，APMIS，106：800)。成功的DTP疫苗鼻内施用已经被报道(Ryan等人，1999，Infect.Immun.，67：6270；Nagai等人，2001，Vaccine，19：4824)。
在一个实施方案中，第一和第二(以及合适的情况下第三)容器的疫苗被同时施用到不同位点，而在一个选择性的实施方案中，本发明人设想第一和第二容器的内含物可以混合(任选的临用前)，然后作为单疫苗施用。
本发明可以用于引发全身性和/或粘膜免疫。
一种检测治疗性治疗效果的方法涉及在施用本发明组合物后监测细菌感染。一种检测预防性治疗效果的方法涉及在施用所述组合物后监测抗所述抗原的免疫应答。通过将本发明的组合物给试验受试者(例如12-16月大的儿童，或动物模型-WO 01/30390)施用可以测定它们的免疫原性，然后确定标准免疫参数。通常在施用所述组合物后大约4周测定这些免疫应答，并与施用所述组合物之前测定的值进行比较。不是在患者中评价真正的保护效果，用于评价DTP疫苗效果的标准动物和体外模型以及保护关联是公知的。
在各种情况下，本发明人预期本文术语“包括”、“包含”和“含有”可以任选的分别与术语“由...组成”、“由...构成”和“由...组成的”替换。这不改变这些术语的通常含义，其旨在提供所述替换的基础，而不是使它们含义相同。
所有引用的参考文献和出版物都在此引入作为参考。
实施例
提供的实施例只是用于说明目的，而不是用于限制本发明的范围。
实施例1：对低剂量IPV制剂的测试
对于实施例1的所有制剂，除了IPV(其被添加但没有吸附)以外，在制备前通过添加铝盐使抗原吸附，。
D、T、Pw和HBsAg的吸附方法见图4-图7。
检测了数种不同的制剂：
●白喉类毒素、破伤风类毒素、百日咳全细胞和乙肝表面抗原的组合：DTPwSF-HB作为参照(DTPwSF表示其是不含硫柳汞的制剂)，按照制备方法1(表1)配制。
●GlaxoSmithKline Biologicals S.A.产品
Figure BDA00003345376500281
(IPV是独立不吸附的)作为标准剂量的未吸附参照，按照制备方法2(表1)配制。
●白喉类毒素、破伤风类毒素、百日咳全细胞、乙肝表面抗原和灭活脊髓灰质炎病毒的组合：在Pw前向DTPwSF-HB-IPV中添加IPV，按照制备方法3(表1)配制。
●白喉类毒素、破伤风类毒素、百日咳全细胞、乙肝表面抗原和灭活脊髓灰质炎病毒的组合：刚好在T吸附之后向DTPwSF-HB-IPV中添加IPV。这种添加方法允许IPV吸附到Al(OH)3上。该疫苗按照制备方法4(表1)配制。
安慰剂只包含铝盐、IPV和其它抗原的缓冲液。因为IPV是该安慰剂的唯一抗原，所以不存在吸附竞争。因此，IPV是完全吸附的。该疫苗按照制备方法5(表1)配制。
利用制备方法2、3、4和5配制的疫苗被制备为IPV剂量范围介于40/8/32IU/0.5mL的标准IPV剂量的12.5％和100％。
Figure BDA00003345376500282
Figure BDA00003345376500291
Figure BDA00003345376500292
Figure BDA00003345376500301
表1.每0.5mL剂量的制备方法
对于制备方法1制剂：HBsAg、D和T分别单独地吸附到AlPO4、AlPO4和Al(OH)3上。所述3种抗原被连续添加到包含水、NaCl和游离AlPO4的悬浮液中。将该混合物搅拌60-75分钟。然后在添加吸附的Pw前将pH调节到6.5。
对于制备方法3制剂，将3种吸附的抗原连续添加到包含水、NaCl和游离AlPO4的悬浮液中。在添加IPV前将该混合物搅拌60-75分钟。然后在添加Pw抗原前将pH调节到6.5。
对于制备方法4制剂，T抗原吸附到Al(OH)3上。将预吸附的T抗原添加到包含水和NaCl的悬浮液中，然后是1、2和3型IPV。在添加游离AlPO4前将该混合物搅拌60-75分钟。然后添加预吸附的HBsAg，继之以预吸附的D抗原，随后将该混合物再搅拌60-75分钟。然后在添加Pw抗原前将pH调节到6.5。
最后由于制备的简易而挑选制备方法3，因为该实验步骤只涉及一个搅拌步骤。在制备疫苗的过程中，不使用硫柳汞，其也不被添加到最终的疫苗产品中。
Figure BDA00003345376500321
通过血清中和试验测定大鼠中的Polio效力
在肌内接种大鼠(Sprague-Dawley(OFA)或任何事先验证的品系)后通过血清中和试验测定疫苗的效力。给10只未免疫健康大鼠的组肌内接种(0.5mL)试验样品的稀释物，溶于磷酸盐水缓冲液的参照物质，或稀释剂(磷酸盐水缓冲液)。将接种稀释剂的10只大鼠用作阴性对照。接种后20到22天(免疫期间)，将每只动物深度麻醉，然后通过心脏穿刺收集血液。将血液样品离心(在大约800g)，并分析血清。
血清中和试验：
通过在56℃温育30分钟灭活血清。利用合适的稀释介质在微板中制备血清的3个系列稀释物，每种对应一种脊髓灰质炎类型。对于3种脊髓灰质炎病毒类型，向血清稀释物中添加预定量的病毒。所述3种病毒悬浮液根据它们相应的滴度进行稀释。最终稀释物被称为“工作稀释物”。将每种工作稀释物添加到相应的微板。然后将板密封，在37℃±1℃温育16小时。然后添加Hep-2细胞，微板在37℃±1℃温育7天。在考马斯蓝染色后利用倒置显微镜记录病毒的细胞致病变作用(CPE)。
抗脊髓灰质炎抗体的存在抑制病毒的生长以及相应CPE的出现。抗脊髓灰质炎病毒滴度(1、2和3型)等于没有任何CPE的最终稀释度的倒数。
在每组中，记录具有中和抗体的动物，并测定每个血清样品中针对不同类型脊髓灰质炎病毒的抗体滴度。中和抗体滴度用血清样品最高稀释度(完全抑制脊髓灰质炎病毒对Hep-2细胞的细胞致病作用)的倒数的log2表示。然后测定每组大鼠中每个稀释度和每种病毒类型的几何平均滴度(GMT)。
对于每种类型的病毒，还通过概率单位分析计算在50％大鼠(ED50)中诱导中和抗体的疫苗稀释度及随后的D抗原量。ED50用D抗原单位表示。
为了定量相对于参照疫苗(通常是但也可以是DTPaHBIPV疫苗诸如
Figure BDA00003345376500332
)的效力，在多剂量试验中检测相对效力(RP)，其被定义为两种等效剂量应答的比例。在该方法中，按照Finney在1978年(Statistical Method in Biological Assay(生物分析法中的统计方法)，Charles Griffin & Company Ltd，London，1978)描述的平行线分析法计算试验疫苗的效力。
通过ELISA检测1、2和3型脊髓灰质炎的效力
通过ELISA检测脊髓灰质炎效力采用一步或两步法进行，这取决于是分别对初始未吸附的IPV还是对配制的疫苗进行测量：
1.最终吸附疫苗的解吸(用于检测配制疫苗中的D抗原单位-在检测未吸附的IPV抗原原液中是不需要的)；
2.用于定量解吸和未吸附疫苗和/或脊髓灰质炎原液中D抗原含量的ELISA试验
解吸步骤
将试验中的吸附疫苗离心10分钟后，通过向沉淀物中添加解吸磷酸盐缓冲液、混合并在室温温育，进行3次连续的解吸。第一次和第二次解吸周期为2小时，第三次提取的温育期为室温下过夜。将来自3次提取的收集物汇集，并用不含Ca和Mg但含有牛血清白蛋白(BSA)和Tween20的磷酸盐缓冲液(PBS)稀释。
按照如下所述的ELISA定量3种脊髓灰质炎病毒抗原。
通过ELISA的D抗原定量：
用碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(pH9.6)稀释的特异性兔抗脊髓灰质炎病毒(1、2或3型)IgG包被微量滴定板，并在4℃温育过夜。清洗后，添加饱和溶液(磷酸盐水缓冲液w/o Ca和Mg+1％BSA)。空白(PBS)和疫苗样品的系列稀释物以及自制未吸附标准品按一式两份添加。自制3价标准制品包含标定的1、2和3型抗原。校准品是欧洲药典生物学参照(European Pharmacopoeia Biological reference，EPBRP)。
对于所有后续步骤，微量滴定板在37℃温育1小时30分钟，然后清洗。添加缀合过氧化物酶的兔抗脊髓灰质炎病毒(1、2或3型)IgG，其用包含BSA的磷酸盐缓冲液(w/o Ca和Mg+Tween20)稀释。添加底物溶液，其包含溶于二甲基亚砜(DMSO)的四甲基联苯胺并用包含0.003％H2O2的醋酸缓冲液稀释，然后在暗处温育15-30分钟。然后添加包含H2SO4的阻断溶液。在1小时内，利用设置在450nm并且参照在620nm的分光计读取每孔的光密度(O.D.)。
通过对标准抗原浓度的O.D.值作图得到标准曲线，根据该标准曲线计算试验样品中的D抗原浓度。
作为对ELISA获得的效力的补充，可以通过完备性方法(completeness method)检测任何未吸附的IPV抗原：
通过ELISA检测与佐剂的吸附中未结合的1、2和3型Polio的完备性
进行两次连续离心。然后收集上清，在微板上通过ELISA一式两份检测未稀释物。用碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(pH9.6)稀释的特异性兔抗脊髓灰质炎病毒(1、2或3型)IgG包被微量滴定板，并在4℃温育过夜。清洗后，添加饱和溶液(磷酸盐水缓冲液w/o Ca和Mg+1％BSA)。空白(PBS)、上清和疫苗样品的系列稀释物以及自制未吸附标准品按一式两份添加。
对于所有后续步骤，微量滴定板在37℃温育1小时30分钟，然后清洗。添加缀合过氧化物酶的兔抗脊髓灰质炎病毒(1、2或3型)IgG，其用包含BSA的磷酸盐缓冲液(w/o Ca和Mg+Tween20)稀释。添加底物溶液，其包含溶于二甲基亚砜(DMSO)的四甲基联苯胺并用包含0.003％H2O2的醋酸缓冲液稀释，然后在暗处温育15-30分钟。然后添加包含H2SO4的阻断溶液。在1小时内，利用设置在450nm并且参照在620nm的分光计读取每孔的光密度(O.D.)。
如果样品的平均OD高于空白的平均OD值+3标准偏差并且如果样品的平均OD高于0.1，则完备性被认为是阳性的(上清中的抗原)。
对于阳性的完备性，按照“通过ELISA检测1、2和3型Polio效力”中第二步描述的ELISA方法测量抗原含量。
测量国际不透明度单位(International Opacity Unit，IOU)的方法
可以利用光学IRPO(不透明度的国际参考制品)标准溶液或通过660nm的吸光度测量值确定细胞浓度(IOU)。
然后利用下列“指定的不透明度”等式确定单株悬浮液(Single StrainSuspension)的不透明度：
AO＝LO/Ko×CO；
其中AO＝指定的不透明度，LO＝活收集物的不透明度，KO＝灭活收集物的不透明度，和CO＝浓缩物的不透明度。
结果
按照标准的40∶8∶32剂量通过血清中和试验测定大鼠中的Polio效力
进行实验以确定1、2和3型IPV的效力。结果显示于下面的表3(在本文中，40∶8∶32D抗原单位的1、2和3型IPV分别等于100％IPV剂量)。
Figure BDA00003345376500361
表3.3种不同疫苗制剂种1、2和3型IPV的效力。
DTPwSF-HB-IPV制剂(100％IPV)显示的IPV效力比参照Poliorix更好，并且与参照DTPaHBIPV类似或比其更好。
IPV剂量降低条件下IPV效力的鉴定
通过如上所述的体外和体内方法检测效力。
对于制备方法3和4的两种制剂，在体外检测通过Elisa获得的降低剂量IPV的效力，并与参照DTPaIPVHB进行比较，如表4所示。对于制备方法3检验每种制剂的两个批次。
对于每种制剂，根据取自IPV原液的抗原含量计算回收百分比(例如对于包含100％IPV的制剂为40/8/32；包含50％IPV的制剂为20/8/16；包含25％IPV的制剂为10/4/8；对于包含12.5％IPV的制剂为5/2/4)
Figure BDA00003345376500371
表4显示对于所有IPV剂量吸附完备性是相似的。1型和3型是强解吸的(17％-74％)，而2型是良好吸附的。对于所有的IPV剂量来说，3种类型对于安慰剂都是良好吸附的。所述吸附与对DTPaIPVHB参照疫苗的吸附相仿。
IPV完备性存在变异，因为完备性定量方法不适用于DTPwHB IPV制剂和较低的IPV浓度(＜40/8/32D抗原单位/0.5ml)。
针对制备方法3和4的两种制剂，通过与参照制剂比较，在体内检测降低剂量的IPV的相对效力(以与参照poliorix疫苗的比较来表示)，如图1和2所示。对于制备方法3检验每种制剂的两个批次。
图1显示含有100％IPV的DTPwSF-HB-IPV的效力稍大于DTPaHBIPV中的IPV效力。观察到来自制备方法3制剂的DTPwSF-HB-IPV50％的IPV效力类似于DTPaHBIPV100％。制备方法3的DTPwSF-HB-IPV25％的IPV效力稍低于
Figure BDA00003345376500381
还发现12.5％的IPV剂量不足以获得好的IPV效力。
图2显示对于制备方法3的制剂和制备方法4的制剂来说，IPV效力相仿。还显示安慰剂比DTPwSF-HB-IPV效力更好的趋势。
因此这些数据证实降低剂量的IPV足以在体内获得好的效力。
实施例2：在本发明疫苗中不使用硫柳汞的可行性
防腐效率试验(PET)能够检测试验疫苗的抗微生物活性。该试验包括：
在疫苗制剂的最终容器步骤中，利用合适微生物的指定接种，攻击所述疫苗制剂，
在指定温度保存所述被接种的制剂
在规定的时间间隔从容器中取出样品，并对取出样品中的生物体计数。
PET试验步骤描述于欧洲药典(5.1.3)和USP(<51>)。根据这些指导，通过将活微生物数量的降低与下表(表5)提及的标准进行比较，评价抗微生物活性
表5.EP和USP标准
Nr*：未回收
Ni*：未增加
实施例3：Hib组分对IPV效力及随时间对IPV稳定性的影响
按照实施例1所述检测IPV的相对效力，以确定Hib组分对IPV效力的影响，并评价不同IPV剂量条件下IPV随时间的稳定性。被研究的疫苗是DTPwHBIPV(40-8-32)，含重建的DTPwHBIPV并保存8个月，DTPwHBIPV(20-4-16)，含重建Hib的DTPwHBIPV(20-4-16)并保存8个月，DTPwHBIPV(20-4-16)并保存8个月，DTPwHBIPV(10-2-8)及含重建Hib的DTPwHBIPV(10-2-8)并保存8个月。测量相对于DTPaIPVHB(Pediarix)(图3a)或Poliorix(图3b)的RP值。发现Hib组分对IPV效力没有影响。发现在第8个月IPV的相对效力仍被保持(图3)。
实施例4：AlPO4/Al(OH)3比例对光学方面、D和T的吸附及IPV效力的影响
利用铝组合物的变化进行制备。
制剂DTPwSF-HB-IPV通常包含630μg铝：560μg Al3+(AlPO4形式)，70μg Al3+(Al(OH)3形式)。使用铝盐吸附D、T、Pw和HbsAg。在制备期间添加游离AlPO4的115μg Al3+。
利用下列比例的游离Al3+进行制备：
Figure BDA00003345376500401
表6.AlPO4/Al(OH)3比例
Figure BDA00003345376500402
表7.DTPwHB-IPV的制备方法
观察光学方面，直至69/46的比例仍可获得可接受的聚集物。
利用相同的制备方法和介于常规IPV剂量的0和100％之间的IPV剂量范围进行制备。
通过ELISA测量D和T类毒素吸附的百分比。在37℃处理7天后检测吸附的稳定性。结果显示于表8和9。
Figure BDA00003345376500411
表8.含有IPV剂量范围的DTPwHB-IPV中D类毒素解吸的百分比
Figure BDA00003345376500412
表9.含有IPV剂量范围的DTPwHB-IPV中T类毒素解吸的百分比然后是IPV吸附。在25℃处理21天后检测吸附的稳定性。
Figure BDA00003345376500421
表10.含有IPV剂量范围的DTPwHB-IPV中IPV解吸的百分比
所述制剂中Al(OH)3含量的增加能够促进D、T和IPV的吸附。
利用46/69的Al(OH)3/AlPO4比例获得更好的吸附比例。
在该比例：
■T和D吸附在第0天(T0)完成。在37℃7天的加速稳定性研究后的解吸显示，对于D来说解吸＜20％，对于T来说解吸＜30％。
■每种IPV型都是吸附的。3型的解吸发生在25℃第21天。
在体内检测具有46/69比例的制剂，并与Tetravac、Poliorix和DTPaIPV疫苗进行比较。
Figure BDA00003345376500431
表11.体内效力结果
所述DTPw-HB-IPV制剂没有显著差异(ED50)。DTPaHBIPV、Tetravac和Poliorix得到类似的结果，均劣于DTPw-HB-IPV制剂(除了2型以外的所有制剂都是等同的)。
实施例5：含有降低IPV剂量的研究用DTPw-HBV-IPV/Hib疫苗的临床鉴定
在II期，计划可行性研究以评价GSK Biologicals的研究用DTPw-HBV-IPV/Hib疫苗的3种不同制剂相对商品化DTPw-HBV/Hib及IPV疫苗联用的免疫原性、反应原性和安全性。
●指示/群体
在生命的第一周给健康婴儿初次免疫，抗白喉、破伤风、百日咳、乙肝、脊髓灰质炎和b型流感嗜血杆菌疾病。
研究组：
DTPw-HBV-IPV(标准剂量)/Hib疫苗
DTPw-HBV-IPV(标准剂量的49％)/Hib疫苗
DTPw-HBV-IPV(标准剂量的26％)/Hib疫苗
DTPw-HBV/Hib+IPV疫苗s
●共同的主要目标：
共同的主要目标将以连续方式进行评价：即只有当前一目标得到满足时才评价第二和第三目标。
√为了证明在初次接种过程后一个月，就针对3种脊髓灰质炎病毒类型的抗体应答而言，DTPw-HBV-IPV(标准剂量)/Hib疫苗相对于与DTPw-HBV/Hib疫苗共施用的IPV疫苗的非劣性。
如果就3种脊髓灰质炎病毒类型中每种的血清保护率而言，各组间差异的标准化渐近95％CI的上限(DTPw-HBV/Hib+IPV减去DTPw-HBV-IPV(标准剂量)/Hib)≤10％，则达到非劣性的目标。
√为了证明在初次接种过程后一个月，就针对3种脊髓灰质炎病毒类型的抗体应答而言，DTPw-HBV-IPV(标准剂量的49％)/Hib疫苗相对于与DTPw-HBV/Hib疫苗共施用的IPV疫苗的非劣性。
如果就3种脊髓灰质炎病毒类型中每种的血清保护率而言，各组间差异的标准化渐近95％CI的上限(DTPw-HBV/Hib+IPV减去DTPw-HBV-IPV(标准剂量的49％)/Hib)≤10％，则达到非劣性的目标。
√为了证明在初次接种过程后一个月，就针对3种脊髓灰质炎病毒类型的抗体应答而言，DTPw-HBV-IPV(标准剂量的26％)/Hib疫苗相对于与DTPw-HBV/Hib疫苗共施用的IPV疫苗的非劣性。
如果就3种脊髓灰质炎病毒类型中每种的血清保护率而言，各组间差异的标准化渐近95％CI的上限(DTPw-HBV/Hib+IPV减去DTPw-HBV-IPV(标准剂量的26％)/Hib)≤10％，则达到非劣性的目标。
●次要目标：
免疫原性
就对所有疫苗抗原的应答而言，与共施用的DTPw-HBV/Hib和IPV疫苗相比，评价DTPw-HBV-IPV/Hib候选疫苗的免疫原性。
反应原性
根据诉求的症状、主动诉求的症状和严重不良事件，评价研究疫苗的反应原性和安全性。
●接种方案
6、10和14周龄的3剂量初次接种方案。所有受试者接受乙肝的及时接种(birth dose)。
●国家：
菲律宾
●采血：
接种前和接种后3
●疫苗制剂：
表12.疫苗制剂
抗原的预吸附
DTPw-HBV-IPV制剂组合了白喉类毒素，破伤风类毒素，3种百日咳杆菌株，纯化的乙肝病毒(HBV)主要表面抗原(HBsAg)和灭活的脊髓灰质炎病毒(IPV)。在与铝盐、氯化钠缓冲液和注射用水混合前，首先将这些抗原(除了IPV以外)预吸附到铝盐上。
白喉类毒素的吸附
按照15Lf白喉类毒素/0.15mg Al3+的比例将纯化的白喉浓缩物吸附到磷酸铝上。将这两种组分在室温下搅拌15直至45分钟。将pH调节到pH5.1±0.1，然后搅拌15直至45分钟。将该混合物在37℃保存一周。在室温下搅拌15直至45分钟后，将pH调节到pH6.1±0.1。将吸附的浓缩物在+2℃-+8℃保存至少7天，然后最终制备DTPw-HB-IPV疫苗。图8重点显示预吸附的白喉原液的吸附制备方法。
破伤风类毒素的吸附
按照3.25Lf白喉类毒素/0.07mg Al3+的比例将纯化的白喉浓缩物吸附到氢氧化铝上。将这两种组分在室温下搅拌15直至20分钟。将pH调节到pH6.1±0.1。将该混合物在室温下搅拌16直至24小时。添加标定浓度为1500mM的氯化钠溶液(ad150mM)。在室温下搅拌15直至45分钟后，将pH调节到6.1±0.1。将吸附的浓缩物在+2℃-+8℃保存至少14天，然后最终制备DTPw-HBV-IPV疫苗。破伤风类毒素的吸附流程图见图9。
乙肝抗原的吸附
将无菌的纯化HBsAg原液与无菌的磷酸铝悬浮液混合，以获得在约50μl的终体积中包含每10μg HBsAg、0.2mg Al3+(磷酸铝形式)、150mMNaCl的悬浮液。
HBsAg的吸附步骤见图10。
Pw抗原的吸附
将AlPO4溶液无菌转移到无菌管。搅拌该溶液5到10分钟，直接在管中用1M HCl或0.5M NaOH将pH调节到6.5+/-0.1。搅拌该溶液15-20分钟。校正pH(6.5+/-0.1)，如果必要进行调节。
吸附之前，将百日咳汇集的收集物(PPH)在使用前混合至少15分钟，然后将PPH添加入包含AlPO4的无菌管。室温下搅拌所述悬浮液至少15分钟，可以在室温下保存过夜。如果该产品在室温下保存过夜，分装之前它必须重悬至少30分钟。取样用于试验。
将Pw吸附原液分装到无菌玻璃瓶，在2-8℃保存。
Pw吸附的流程图见图11。
DTPW-HBV-IPV最终制剂
如下完成步骤：
-将氯化钠溶液和水混合用于注射，以便达到150mM NaCl的终浓度。
-添加AlPO4以获得0.115mg/剂量的游离Al3+浓度
-添加吸附的HEF、白喉和破伤风浓缩物，以获得每0.5ml剂量中10μg HBsAg、7.5Lf白喉类毒素和3.25Lf破伤风类毒素的终浓度。
-添加IPV以获得40/8/32或19.6/3.9/15.7或10.4/2.1/8.3UI/d的终浓度。
-室温下轻轻搅拌60直至120分钟。
-调节pH到6.5+/-0.1
-室温下搅拌15直至20分钟
-校正pH：6.5+/-0.1
-添加吸附的Pw浓缩物以获得每0.5ml剂量中20IOU的终浓度
-室温下搅拌15直至45分钟
-测量pH
-最终原液在+2℃和+8℃之间，直至填充。
DTPw-HBV疫苗的制备流程图见图12。
实施例6：含有降低的Hib和IPV剂量的研究用DTPa-HBV-IPV/Hib疫苗的临床鉴定
在II期，计划探索性研究以评价GSK Biologicals的研究用DTPa-HBV-IPV/Hib疫苗的4种不同制剂相对商品化DTPa-HBV-IPV/Hib疫苗和商品化DTPw-HBV/Hib及IPV疫苗联用的免疫原性、反应原性和安全性。
●指示/群体：
在生命的第一周给健康婴儿初次免疫，抗白喉、破伤风、百日咳、乙肝、脊髓灰质炎和b型流感嗜血杆菌疾病。
●研究组：
DTPa-HBV-IPV(标准剂量的49％)/Hib5μg疫苗
DTPa-HBV-IPV(标准剂量的49％)/Hib2.5μg疫苗
DTPa-HBV-IPV(标准剂量的26％)/Hib5μg疫苗
DTPa-HBV-IPV(标准剂量的26％)/Hib2.5μg疫苗
DTPa-HBV-IPV/Hib疫苗
DTPw-HBV/Hib+IPV疫苗
●主要目标：
根据针对PRP和3种脊髓灰质炎抗原(脊髓灰质炎1、2和3)的应答，评价DTPa-HBV-IPV/Hib候选疫苗的免疫原性。
●次要目标：
免疫原性
根据针对全部疫苗抗原的应答，评价全部研究疫苗的免疫原性。
反应原性
根据诉求的症状、主动诉求的症状和严重不良事件，评价研究疫苗的反应原性和安全性。
●接种方案
6周龄的3剂量初次接种方案。所有受试者接受乙肝的及时接种(birth dose)。
●国家：
TBC
●采血：
接种前和接种后3
●疫苗制剂：
将疫苗构建成两部分：液体部分(DTPa-HB-IPV)和冻干部分(Hib)。
D、T、PT、FHA、PRN和HBsAg进行初步预吸附。将水和NaCl与不同的抗原混合。搅拌所述混合物使其均匀，调节pH。所述疫苗DTPa-HB-IPV部分的最终组成在下表显示。
组分 量
D类毒素 25Lf
T类毒素 10Lf
PT 25μg
FHA 25μg
PRN 8μg
HBsAg 10μg
1型IPV 40或19.6或10.4IU
2型IPV 8或3.9或2.1IU
3型IPV 32或15.7或8.3IU
Al3+ 700到790μg
表13.用于0.5mL人剂量的DTPa-HBV-IPV的组成
Hib是预吸附的。在冷冻干燥前预吸附的Hib与蔗糖或乳糖混合。Hib量将是2.5或5或10μg每人剂量。铝含量将是30到120μg Al3+(AlPO4形式)每人剂量。

Claims (87)

1.一种制备包含灭活1型脊髓灰质炎病毒的疫苗(即联合疫苗)的方法，所述方法包括以下步骤：混合白喉类毒素和破伤风类毒素，然后添加灭活的1型脊髓灰质炎病毒以及任选的IPV2和/或3型(IPV)，所述灭活的1型脊髓灰质炎病毒的剂量大于10D抗原单位并小于20D抗原单位。
2.一种制备包含灭活1型脊髓灰质炎病毒的疫苗(即联合疫苗)的方法，所述方法包括以下步骤：混合白喉类毒素和破伤风类毒素，然后添加灭活的1型脊髓灰质炎病毒以及任选的IPV2和/或3型(IPV)，所述灭活的1型脊髓灰质炎病毒的量为每0.5mL大于10D抗原单位并小于20D抗原单位。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述疫苗包含的灭活1型脊髓灰质炎病毒的量是标准40D抗原单位剂量的26-49％、30-45％、33-40％或35-37％。
4.如权利要求1或2所述的方法，其中所述疫苗包含的灭活1型脊髓灰质炎病毒的量是每0.5mL标准40D抗原单位剂量的26-49％、30-45％、33-40％或35-37％。
5.如权利要求1-4所述的方法，其中所述疫苗还包含灭活的3型脊髓灰质炎病毒，其剂量为8-20D抗原单位，9-19D抗原单位，10-18D抗原单位，11-17D抗原单位，12-16D抗原单位，或13-15D抗原单位；例如大约或精确的14D抗原单位。
6.如权利要求1-4所述的方法，其中所述疫苗还包含灭活的3型脊髓灰质炎病毒，其量为每0.5mL8-20D抗原单位，9-19D抗原单位，10-18D抗原单位，11-17D抗原单位，12-16D抗原单位，或13-15D抗原单位；例如大约或精确的每0.5mL14D抗原单位。
7.如权利要求5或6所述的方法，其中所述疫苗包含灭活的3型脊髓灰质炎病毒，其剂量大于8并小于20D抗原单位。
8.如权利要求5或6所述的方法，其中所述疫苗包含灭活的3型脊髓灰质炎病毒，其量为每0.5mL大于8并小于20D抗原单位。
9.一种制备包含灭活3型脊髓灰质炎病毒的疫苗(即联合疫苗)的方法，所述方法包括以下步骤：混合白喉类毒素和破伤风类毒素，然后添加灭活的3型脊髓灰质炎病毒以及任选的IPV1和/或3型(IPV)，所述灭活的3型脊髓灰质炎病毒的剂量为大于8并小于20D抗原单位，9-19D抗原单位，10-18D抗原单位，11-17D抗原单位，12-16D抗原单位或13-15D抗原单位；例如大约或精确的14D抗原单位。
10.一种制备包含灭活3型脊髓灰质炎病毒的疫苗(即联合疫苗)的方法，所述方法包括以下步骤：混合白喉类毒素和破伤风类毒素，然后添加灭活的3型脊髓灰质炎病毒以及任选的IPV1和/或3型(IPV)，所述灭活的3型脊髓灰质炎病毒的量为每0.5mL大于8并小于20D抗原单位，9-19D抗原单位，10-18D抗原单位，11-17D抗原单位，12-16D抗原单位或13-15D抗原单位；例如每0.5mL大约或精确的14D抗原单位。
11.如权利要求9或10所述的方法，其中所述疫苗还包含灭活的1型脊髓灰质炎病毒，其剂量为10-20D抗原单位，11-19D抗原单位，12-18D抗原单位，13-17D抗原单位，14-16D抗原单位；例如大约或精确的15D抗原单位。
12.如权利要求9或10所述的方法，其中所述疫苗还包含灭活的1型脊髓灰质炎病毒，其量为每0.5mL10-20D抗原单位，11-19D抗原单位，12-18D抗原单位，13-17D抗原单位，14-16D抗原单位；例如每0.5mL大约或精确的15D抗原单位。
13.如权利要求1-12所述的方法，其中所述疫苗还包含灭活的2型脊髓灰质炎病毒，其剂量为2-4D抗原单位。
14.如权利要求1-12所述的方法，其中所述疫苗还包含灭活的2型脊髓灰质炎病毒，其量为每0.5mL2-4D抗原单位。
15.如权利要求13或14所述的方法，其中所述疫苗包含灭活的2型脊髓灰质炎病毒，其剂量大于2D抗原单位并小于4D抗原单位，或其剂量为大约或精确的3D抗原单位。
16.如权利要求13或14所述的方法，其中所述疫苗包含灭活的2型脊髓灰质炎病毒，其量为每0.5mL大于2D抗原单位并小于4D抗原单位，或其量为每0.5mL大约或精确的3D抗原单位。
17.如权利要求1-16所述的方法，其中与包含40D抗原单位的1型IPV的疫苗相比，所述疫苗的相对效力值是至少0.85、0.9、0.95或1。
18.如权利要求1-17所述的方法，其中与包含8D抗原单位的2型IPV的疫苗相比，所述疫苗的相对效力值是至少0.85、0.9、0.95或1。
19.如权利要求1-18所述的方法，其中与包含32D抗原单位的3型IPV的疫苗相比，所述疫苗的相对效力值是至少0.85、0.9、0.95或1。
20.如权利要求1-19所述的方法，所述方法包括将pH调节到6.5±0.5，或pH5.9-7.2，或pH6-7，或pH6.2-6.8，或pH6.4-6.6的后续步骤。
21.如权利要求1-20所述的方法，所述方法包括添加灭活的全细胞或非细胞百日咳组分以及药学上可接受的赋形剂的后续步骤，任选在添加抗原前已存在游离的磷酸铝。
22.如权利要求1-21所述的方法，所述方法还包括在调节pH前或添加IPV前添加乙肝表面抗原的步骤。
23.如权利要求1-22所述的方法，所述方法还包括在调节pH前将一种或多种来自病原体的抗原与白喉类毒素、破伤风类毒素、灭活的1、2和/或3型脊髓灰质炎病毒以及任选的乙肝表面抗原混合的步骤，所述病原体选自：b型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)，A型脑膜炎球菌(Neisseria meningitidis)，C型脑膜炎球菌，W型脑膜炎球菌，Y型脑膜炎球菌，B型脑膜炎球菌，伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)和甲肝。
24.一种制备DTP疫苗的方法，所述DTP疫苗基本上不含硫柳汞，并且包含一种或多种IPV组分，所述IPV组分选自：
a.1型IPV，其剂量为10-36D抗原单位，11-32D抗原单位，12-28D抗原单位，13-24D抗原单位，14-20D抗原单位或15-19D抗原单位；例如大约或精确的18D抗原单位；
b.2型IPV，其剂量为2-7D抗原单位，3-6D抗原单位，或4-5D抗原单位；和
c.3型IPV，其剂量为8-29D抗原单位，9-26D抗原单位，10-23D抗原单位，11-20D抗原单位，12-17D抗原单位，或13-14D抗原单位，
所述方法包括以下步骤：混合白喉类毒素和破伤风类毒素，然后添加灭活的脊髓灰质炎病毒组分。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述疫苗还包含灭活的1型脊髓灰质炎病毒，其剂量为10-36D抗原单位，11-32D抗原单位，12-28D抗原单位，13-24D抗原单位，14-20D抗原单位或15-19D抗原单位，或大约或精确的18D抗原单位。
26.如权利要求24或25所述的方法，其中所述疫苗包含灭活的2型脊髓灰质炎病毒，其剂量为2-7D抗原单位，3-6D抗原单位，或4-5D抗原单位。
27.如权利要求24-26所述的方法，其中所述疫苗还包含灭活的3型脊髓灰质炎病毒，其剂量为8-29D抗原单位，9-26D抗原单位，10-23D抗原单位，11-20D抗原单位，12-17D抗原单位，或13-14D抗原单位。
28.如权利要求1-27所述的方法，其中所述疫苗包含吸附到氢氧化铝或磷酸铝或这两者混合物上的1型脊髓灰质炎病毒(其中吸附发生在与除IPV以外的抗原混合之前，或其中吸附发生在与除IPV以外的抗原混合之后)。
29.如权利要求28所述的方法，其中在权利要求20的pH调节步骤前添加1型IPV。
30.如权利要求1-29所述的方法，其中所述疫苗包含吸附到氢氧化铝或磷酸铝或这两者混合物上的2型脊髓灰质炎病毒(其中吸附发生在与除IPV以外的抗原混合之前，或其中吸附发生在与除IPV以外的抗原混合之后)。
31.如权利要求30所述的方法，其中在权利要求20的pH调节步骤前添加2型IPV。
32.如权利要求1-31所述的方法，其中所述疫苗包含吸附到氢氧化铝或磷酸铝或这两者混合物上的3型脊髓灰质炎病毒(其中吸附发生在与除IPV以外的抗原混合之前，或其中吸附发生在与除IPV以外的抗原混合之后)。
33.如权利要求32所述的方法，其中在权利要求20的pH调节步骤前添加3型IPV。
34.如权利要求1-33所述的方法，其中所述疫苗包含吸附到铝盐上的1、2和3型IPV(其中吸附发生在与除IPV以外的抗原混合之前，或其中吸附发生在与除IPV以外的抗原混合之后)。
35.如权利要求1-34所述的方法，其中所述疫苗包含吸附到氢氧化铝或磷酸铝或这两者混合物上的1、2和3型IPV(其中吸附发生在与除IPV以外的抗原混合之前，或其中吸附发生在与除IPV以外的抗原混合之后)。
36.如权利要求1-35所述的方法，其中所述疫苗包含白喉类毒素，其任选吸附到氢氧化铝或磷酸铝或这两者的混合物上(其中吸附发生在与其他抗原混合之前或之后)。
37.如权利要求36所述的方法，其中在权利要求20的pH调节步骤前添加白喉类毒素。
38.如权利要求1-37所述的方法，其中所述疫苗包含破伤风类毒素，其任选吸附到氢氧化铝或磷酸铝或这两者的混合物上(其中吸附发生在与其他抗原混合之前或之后)。
39.如权利要求38所述的方法，其中在权利要求20的pH调节步骤前添加破伤风类毒素。
40.如权利要求1-39所述的方法，其中所述疫苗包含灭活的全细胞百日咳杆菌(Pw)，其任选吸附到氢氧化铝或磷酸铝或这两者的混合物上(其中吸附发生在与其他抗原混合之前或之后)。
41.如权利要求40所述的方法，其中在权利要求20的pH调节步骤后添加Pw。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述灭活的全细胞百日咳杆菌(Bordetella pertussis)吸附到磷酸铝上(其中吸附发生在与其他抗原混合之前或之后)。
43.如权利要求42所述的方法，其中在权利要求20的pH调节步骤后添加Pw。
44.如权利要求1-43所述的方法，其中所述疫苗包含两种或更多种非细胞百日咳组分(Pa)(例如百日咳类毒素(PT)，丝状血细胞凝集素(FHA)和百日咳杆菌粘附素(PRN))，其任选吸附到氢氧化铝或磷酸铝或这两者的混合物上(其中吸附发生在与除非细胞百日咳抗原以外的抗原混合之前或之后)。
45.如权利要求44所述的方法，其中在权利要求20的pH调节步骤后添加Pa。
46.如权利要求45所述的方法，其中所述两种或更多种非细胞百日咳组分(Pa)吸附到磷酸铝上(其中吸附发生在与除非细胞的百日咳抗原以外的抗原混合之前或之后)。
47.如权利要求46所述的方法，其中在权利要求20的pH调节步骤后添加Pa。
48.如权利要求1-47所述的方法，其中所述疫苗包含乙肝表面抗原，其任选吸附到磷酸铝上(其中吸附发生在与其他抗原混合之前或之后)。
49.如权利要求48所述的方法，其中在权利要求20的pH调节步骤前添加乙肝表面抗原。
50.如权利要求1-49所述的方法，其中所述疫苗包含载体蛋白与B型流感嗜血杆菌(Hib)荚膜糖的缀合物，其任选吸附到磷酸铝上或不吸附到佐剂上(其中吸附发生在与其他抗原混合之前或之后)。
51.如权利要求50所述的方法，其中在权利要求20的pH调节步骤前添加Hib。
52.如权利要求1-51所述的方法，其中所述疫苗包含载体蛋白与细菌荚膜糖的一种或多种缀合物，所述细菌选自A型脑膜炎球菌，C型脑膜炎球菌，W型脑膜炎球菌和Y型脑膜炎球菌，所述缀合物任选吸附到氢氧化铝或磷酸铝或这两者的混合物上或不吸附到佐剂上(其中吸附发生在与除A、C、W或Y型脑膜炎球菌荚膜糖抗原以外的抗原混合之前或之后)。
53.如权利要求52所述的方法，其中在权利要求20的pH调节步骤前添加载体蛋白与细菌荚膜糖的所述一种或多种缀合物，所述细菌选自A型脑膜炎球菌，C型脑膜炎球菌，W型脑膜炎球菌和Y型脑膜炎球菌。
54.如权利要求1-53所述的方法，其中所述疫苗包含B型脑膜炎球菌(MenB)外膜囊泡或LOS或缀合的MenB荚膜糖，或其衍生物，其任选吸附到氢氧化铝或磷酸铝或这两者的混合物上或不吸附到佐剂上(其中吸附发生在与除MenB抗原以外的抗原混合之前或之后)。
55.如权利要求55所述的方法，其中在权利要求20的pH调节步骤前添加所述MenB外膜囊泡或LOS或缀合的MenB荚膜糖。
56.如权利要求1-55所述的方法，其中所述疫苗包含与载体蛋白缀合的伤寒沙门氏菌Vi糖，其任选吸附到氢氧化铝或磷酸铝或这两者的混合物上或不吸附到佐剂上(其中吸附发生在与其他抗原混合之前或之后)。
57.如权利要求56所述的方法，其中在权利要求20的pH调节步骤前添加所述与载体蛋白缀合的伤寒沙门氏菌Vi糖。
58.如权利要求1-57所述的方法，其中所述疫苗包含甲肝抗原，其任选吸附到氢氧化铝或磷酸铝或这两者的混合物上(其中吸附发生在与其他抗原混合之前或之后)。
59.如权利要求58所述的方法，其中在权利要求20的pH调节步骤前添加甲肝抗原。
60.如权利要求1-59所述的方法，其中所述疫苗包含DT，其量为每0.5mL剂量中5-50，7-30Lf或大约或精确的7.5Lf或25Lf。
61.如权利要求1-59所述的方法，其中所述疫苗包含DT，其量为每0.5mL剂量中小于5Lf，或1-4Lf或大约或精确的2Lf。
62.如权利要求1-61所述的方法，其中所述疫苗包含TT，其量为每0.5mL剂量中2.5-30Lf，3-20Lf，5-15Lf或精确的或大约10Lf。
63.如权利要求1-62所述的方法，其中如果所述疫苗中存在Pa，则所述Pa包含每0.5mL剂量中2-50μg、5-40μg、10-30μg或精确的或大约25μg量的PT。
64.如权利要求1-63所述的方法，其中所述疫苗包含Pa，其包含每0.5mL剂量中精确的或大约2.5或8μg量的PT。
65.如权利要求1-64所述的方法，其中所述疫苗包含Pa，其包含每0.5mL剂量中2-50μg、5-40μg、10-30μg或精确的或大约25μg量的FHA。
66.如权利要求1-65所述的方法，其中所述疫苗包含Pa，其包含每0.5mL剂量中精确的或大约2.5或8μg量的FHA。
67.如权利要求1-66所述的方法，其中所述疫苗包含Pa，其包含每0.5mL剂量中0.5-20μg、0.8-15μg、2-10μg或精确的或大约8μg量的PRN。
68.如权利要求1-67所述的方法，其中所述疫苗包含Pa，其包含每0.5mL剂量中精确的或大约0.8或2.5μg量的PRN。
69.如权利要求1-68所述的方法，其中所述疫苗包含Pw，其量为每0.5mL剂量5-50IOU，7-40IOU，9-35IOU，11-30IOU，13-25IOU，15-21IOU或大约或精确的20IOU。
70.如权利要求1-69所述的方法，其中所述疫苗包含HB，其量为每0.5mL5-20μg、8-15μg或大约或精确的10μg。
71.如权利要求1-70所述的方法，其中所述疫苗包含Hib，其量为每0.5mL剂量5-20μg、8-15μg或大约或精确的10μg。
72.如权利要求1-70所述的方法，其中所述疫苗包含Hib，其量为每0.5mL剂量1-6μg，2-4μg，或大约或精确的2.5μg。
73.如权利要求1-72所述的方法，所述方法还包括添加佐剂的步骤。
74.如权利要求1-73所述的方法，其中所述疫苗包含一种或多种佐剂，所述佐剂选自：铝盐诸如氢氧化铝或磷酸铝，钙盐、铁盐或锌盐，酰化酪氨酸或酰化糖的不溶性悬浮液，阳离子或阴离子衍生的糖，聚磷腈，可生物降解的微球，单磷酸类脂A(MPL)，毒性减弱的类脂A衍生物，3-O-脱酰MPL，quil A，皂苷，QS21，生育酚，AS-2，CpG寡核苷酸，生物粘附剂，粘膜粘附剂，微粒，脂质体，聚氧乙烯醚制剂，聚氧乙烯酯制剂，胞壁酰肽，咪唑并喹啉化合物，白介素，巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)，肿瘤坏死因子(TNF)，粒细胞和巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
75.如权利要求73所述的方法，其中所述佐剂是优选的TH1诱导物。
76.如权利要求1-75所述的方法，其中所述疫苗的铝总量是每0.5mL剂量中200-1000μg，300-900μg，400-800μg，500-700μg或大约或精确的630μg Al3+。
77.如权利要求76所述的方法，其中所述疫苗的Al3+内含物全部是氢氧化铝或全部是磷酸铝。
78.如权利要求76所述的方法，其中所述疫苗中Al3+内含物是以下比例的氢氧化铝和磷酸铝的混合物：1∶8-8∶1，1∶4-4∶1，3∶8-8∶3，1∶2-2∶1或1∶1(w∶w Al3+∶Al3+)的磷酸铝∶氢氧化铝。
79.如权利要求76所述的方法，其中所述疫苗中Al3+内含物是以下比例的氢氧化铝和磷酸铝的混合物：12∶1-4∶1，11∶1-5∶1，10∶1-6∶1，9∶1-7∶1或8∶1(w∶w Al3+∶Al3+)的磷酸铝∶氢氧化铝。
80.如权利要求1-79所述的方法，所述方法包括向所述疫苗中添加游离铝盐佐剂的步骤，所述游离铝盐佐剂的量为每0.5mL剂量中0-300μg，50-250μg，75-200μg，100-150μg或大约或精确的115μg的Al3+。
81.如权利要求80所述的方法，其中所述游离铝盐佐剂全部是Al(OH)3或全部是AlPO4。
82.如权利要求80所述的方法，其中所述游离铝盐佐剂是以下比例Al(OH)3和AlPO4的混合物(w∶w Al3+∶Al3+)：1∶1-1∶6，1∶1.1-1∶5，1∶1.2-1∶4，1∶1.3-1∶3，1∶1.4-1∶2，例如23/92或69/46。
83.如权利要求80所述的方法，其中所述游离铝盐佐剂是以下比例Al(OH)3和AlPO4的混合物(w∶w Al3+∶Al3+)：6∶1-1∶1，5∶1-1.1∶1，4∶1-1.2∶1，3∶1-1.3∶1，2∶1-1.4∶1，例如46/69或92/23。
84.如权利要求80-83所述的方法，其中在权利要求20的pH调节步骤前添加游离铝盐佐剂。
85.如权利要求1-84中任一所述的方法，其中如果所述疫苗中存在1型IPV，则所述1型IPV是Mahoney株。
86.如权利要求1-85中任一所述的方法，其中如果所述疫苗中存在2型IPV，则所述2型IPV是MEF-1株。
87.如权利要求1-86中任一所述的方法，其中如果所述疫苗中存在3型IPV，则所述3型IPV是Saukett株。
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