CN106290886A - 一种检测ⅲ型脊髓灰质炎病毒d抗原含量的方法 - Google Patents

一种检测ⅲ型脊髓灰质炎病毒d抗原含量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种检测Ⅲ型脊髓灰质炎病毒D抗原含量的方法，属于抗原检测技术领域。本发明采用Ⅲ型脊髓灰质炎病毒型别特异性多克隆抗体与单克隆抗体相互配对的方式，能够针对性强地检测出Ⅲ型脊灰病毒的D抗原含量，而C抗原则不被检测出，该方法操作简单，结果可真实反映脊髓灰质炎病毒的有效抗原含量，可较好的为后续的脊髓灰质炎疫苗免疫原性试验用量和疫苗产品的终浓度提供依据，最终提高脊髓灰质炎疫苗的质量，具有良好的经济价值和市场应用价值。

Description

一种检测Ⅲ型脊髓灰质炎病毒D抗原含量的方法
技术领域
本发明涉及抗原检测技术领域，具体地，涉及一种检测Ⅲ型脊髓灰质炎病毒D抗原含量的方法。
背景技术
脊髓灰质炎病毒(以下简称脊灰病毒)是一种严重危害儿童健康的急性传染病的RNA病毒。患者多为1～6岁儿童，主要症状是发热，全身不适，严重时肢体疼痛，发生分布不规则和轻重不等的迟缓性瘫痪，俗称小儿麻痹症。目前对于发病症状的儿童没有有效的治疗措施，现通常采用疫苗预防接种的方式对儿童进行疾病防护。在脊灰疫苗中，D抗原是疫苗的主要成分，其具有较强的免疫原性，能有效激发人体的免疫应答，因此，D抗原的制备及检测水平直接影响到疫苗的保护效果。目前通常采用ELISA法对脊灰病毒D抗原含量进行检测，即双抗体夹心法定量测定供试品中脊灰病毒的抗原含量。该方法广泛应用于抗体、试剂盒、病毒疫苗等生物制品的研究开发和工业化生产，是生物制品研究和生产中的常用技术。
但是在脊灰病毒疫苗研究开发过程中病毒有效成分D抗原，即有致病性的完整病毒颗粒并不是唯一存在的，往往伴随着无效成分C抗原，即不完整的或者缺失核酸的病毒颗粒的形成，这种C抗原免疫动物后不能诱导机体产生有效的中和保护抗体。众所周知，现有技术无法明确地分离D抗原和C抗原。根据文献研究，通常采用将脊灰病毒供试品进行56℃水浴30min灭活后称为H抗原，由于H抗原为D抗原加热灭活获得，动物免疫实验证实H抗原不具免疫原性，因此普遍性认为H抗原等效于C抗原。
市场上现有脊灰病毒检测系统一般针对脊灰病毒抗原的线性表位，这种线性表位由于不涉及到病毒的空间构象，因此广泛存在于D抗原和C抗原中，也因此造成现有脊灰病毒检测系统不能够有效区别上述两者。由于D抗原是免疫动物后能产生中和保护性抗体，是脊灰病毒疫苗的有效成分，而C抗原免疫动物后不产生中和保护性抗体，不是脊灰病毒疫苗的有效成分。因此生物制品企业在脊灰病毒疫苗研制过程极力避免D抗原富集过程中C抗原对产品质量的干扰。鉴于C抗原对生物制品的生产成本、生产效率及质量控制均具有一定的影响，为了保证生物制品的有效性，亟待需要一种可以精确检测脊灰病毒D抗原含量的方法，以提高产品的生产效率和质量。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测Ⅲ型脊髓灰质炎病毒D抗原的方法，该方法可以在排除H抗原和C抗原干扰的基础上对Ⅲ型脊髓灰质炎病毒D抗原含量进行检测。
本发明提供的一种检测Ⅲ型脊髓灰质炎病毒D抗原含量的方法，是以Ⅲ型脊髓灰质炎病毒多克隆抗体作为包被抗体，以Ⅲ型脊髓灰质炎病毒特异性单克隆抗体作为检测抗体，采用ELISA方法实现对Ⅲ型脊髓灰质炎病毒D抗原含量的检测。
所述Ⅲ型脊髓灰质炎病毒多克隆抗体为牛多抗，是采用灭活的Ⅲ型脊髓灰质炎病毒免疫牛，采血，分离血清制备而来，其对于Ⅲ型脊髓灰质炎病毒的反应优于对Ⅰ、Ⅱ型脊髓灰质炎病毒的反应。
所述Ⅲ型脊髓灰质炎病毒特异性单克隆抗体是由保藏编号为CGMCC NO.9233的杂交瘤细胞分泌得到。保藏编号为CGMCC NO.9233的杂交瘤细胞已在中国专利CN104371980A中公开。
进一步地，检测Ⅲ型脊髓灰质炎病毒D抗原含量的方法采用的Ⅲ型脊髓灰质炎病毒多克隆抗体为牛多抗，采用灭活的Ⅲ型脊髓灰质炎病毒免疫牛，采血，分离血清制备而来，其对于Ⅲ型脊髓灰质炎病毒的反应优于对Ⅰ、Ⅱ型脊髓灰质炎病毒的反应，Ⅲ型脊髓灰质炎病毒特异性单克隆抗体是由保藏编号为CGMCC NO.9233的杂交瘤细胞分泌得到。
具体地，本发明检测Ⅲ型脊髓灰质炎病毒D抗原含量的方法是将Ⅲ型脊灰病毒多克隆抗体包被于酶标板形成固相抗体；然后加入脊灰病毒供试品，形成固相抗原抗体复合物；洗板，拍干，再加入Ⅲ型脊灰病毒特异性单克隆抗体，孵育后洗板拍干，最后加入酶标记抗种属抗体，当加入底物时出现成色反应，终止液终止反应后用酶标仪在适当波长测定OD值，统计分析结果。或者将Ⅲ型脊灰病毒牛多抗包被于酶标板形成固相抗体；然后加入脊灰病毒供试品，形成固相抗原抗体复合物；洗板，拍干，再加入酶标记的Ⅲ型脊灰病毒特异性单克隆抗体，孵育后洗板拍干，当加入底物时出现成色反应，终止液终止反应后用酶标仪在适当波长测定OD值，统计分析结果。
进一步地，Ⅲ型脊髓灰质炎病毒多克隆抗体按照1:1000-1:10000稀释并混匀后加于酶标板。
进一步地，Ⅲ型脊灰病毒特异性单克隆抗体按照1:1000-1:10000的比例稀释混匀后加于酶标板。
本发明提供了上述方法在制备脊髓灰质炎生物制品及其质量控制中的应用。
本发明提供了上述方法在制备脊髓灰质炎病毒检测试剂或试剂盒中的应用。
本发明提供了Ⅲ型脊髓灰质炎病毒牛多克隆抗体在制备检测Ⅲ型脊髓灰质炎病毒D抗原含量试剂盒中的应用。
由上述技术方案，本发明检测脊髓灰质炎病毒D抗原含量的方法至少具有以下优点及有益效果：
(1)排除H抗原和C抗原的干扰，能够准确定量脊髓灰质炎病毒D抗原；
(2)简化操作步骤，节约生产成本与劳动力成本；
(3)最优的控制产品的质量和有效性能。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；实施例中所用的试剂为市售商品。保藏编号为CGMCC NO.9233的Sabin株脊髓灰质炎Ⅲ型病毒单克隆抗体杂交瘤细胞已在中国专利CN104371980A中公开。
实施例1 Ⅲ型脊髓灰质炎病毒多克隆抗体的制备
将灭活后的Ⅲ型脊髓灰质炎病毒与弗氏佐剂乳化，免疫牛和新西兰大白兔。牛免疫剂量：首免以10ml灭活的Ⅲ型脊髓灰质炎病毒与10ml弗氏完全佐剂等体积混合后乳化免疫，其后采用5ml与等体积弗氏不完全佐剂乳化免疫。兔免疫剂量：首免以2ml灭活Ⅲ型脊髓灰质炎病毒与2ml弗氏完全佐剂等体积混合后乳化免疫，其后采用1ml与等体积弗氏不完全佐剂乳化免疫。免疫部位：颈背部皮下多点。免疫程序：0、2、4、6周。7周时采血，分离血清。
采用间接ELISA法检测多抗血清相对脊髓灰质炎Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ抗体效价，考察特异性。以Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型脊髓灰质炎灭活病毒分别1:400稀释100μl/孔包被酶标板，4℃过夜，洗板后封闭酶标板；将兔血清和牛血清从1:1000，2倍梯度稀释，然后双孔平行加入酶标板。37℃反应1小时，洗板加入1：8000稀释的抗种属酶标记抗体(购自KPL公司)，每孔100μl，37℃孵育60分钟后洗板，加入显色液A、B各50μl(购自北京勤邦生物技术有限公司)，室温孵育10分钟。再每孔加入50μl自制的2M硫酸终止液，酶标仪450nm读数，结果见表1、2。
表1 ELISA间接检测Ⅲ型牛多抗特异性试验OD值
表2 ELISA间接检测Ⅲ型兔多抗特异性试验OD值
结果可见，相同OD值时，如在0.2-0.4时，牛多抗对Ⅲ型脊髓灰质炎病毒稀释为32×104，而对Ⅰ、Ⅱ型稀释倍数为2×104，表明相同反应强度下，牛多抗对Ⅲ型稀释倍数更大反应更强，与Ⅰ、Ⅱ型相差16倍。而兔多抗在相同试验下相差4倍。由于脊髓灰质炎灭活疫苗采用Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型病毒混合制备，抗原检测时为了准确检测Ⅲ型D抗原含量，抗体对其他型别检出越低越好。因此，牛血清比兔血清更有利于区分目标抗原和非目标抗原，更加有效。
实施例2 Ⅲ型脊髓灰质炎病毒D抗原检测方法的建立及线性验证
1、包被：将实施例1制得的Ⅲ型脊灰病毒牛多抗按1:4000稀释混匀后100μl/孔加样于酶标板，4℃孵育过夜；洗板3遍，拍干。
2、封闭：配制含1％脱脂奶粉的PBST-20封闭液，每孔200μl，37℃孵育120分钟。
3、D抗原内部参考品稀释：以国家脊髓灰质炎D抗原标准品标定D抗原参考品D抗原含量，将参考品倍比稀释，使其浓度分别为3、1.5、0.75、0.375、0.1875DU/ml.
4、加样：将稀释后的标准品加入酶标板，每孔100μl，各稀释度加复孔，同时做供试品稀释液对照孔；37℃孵育60分钟，洗板3遍，拍干。
5、加单抗：按照1:8000的比例稀释Ⅲ型脊灰病毒特异性单克隆抗体Ⅲ-3(由保藏编号为CGMCC NO.9233的杂交瘤细胞株分泌得到)，每孔100μl，37℃孵育120分钟，洗板3遍，拍干。
6、加酶标抗体：加入抗种属酶标记抗体(购自KPL公司)，每孔100μl，37℃孵育120分钟，洗板4遍，拍干。
7、显色：显色液A、B(购自北京勤邦生物技术有限公司)各50μl加样于酶标板，室温孵育8分钟。
8、终止：每孔加入50μl自制的2M硫酸终止液，酶标仪450nm读数(630nm参比波长)。
9、结果分析：Excel软件计算结果。以上实验单独操作重复3次，分别统计实验结果，进行线性分析，见表3。
表3线性验证结果OD值
表3结果表明，按照本发明所述的方法，其检测的OD值与样本的D抗原含量呈现较好的线性关系，R2均大于0.991。
实施例3 Ⅲ型脊髓灰质炎病毒D抗原检测系统的精密度验证
本实施例供试品Ⅲ型脊灰病毒原液(北京科兴生物制品有限公司)一式两份，其中一份不作任何处理作为对照(D抗原)，命名为样品A；另外一份用56℃水浴30min(H抗原)，命名为样品B；将样品A与样品B按照体积1:1比例混合，即为D抗原与H抗原等比例混合样品，命名为样品C。本实施例由单人操作，针对供试品样品A，分别进行3次独立操作，进行检测。操作步骤同实施例2。统计检测的OD值，根据标准品的线性方程计算出相应的D抗原含量，计算其平均值、标准偏差和变异系数。
表4精密度与准确性验证结果
表4结果显示，按照本发明实施例2所述的方法，由单人对3个供试品分别进行3次检测，结果显示变异系数CV小于10％，表明本发明所述方法具有较好的精密度。
实施例4 Ⅲ型脊髓灰质炎病毒D抗原检测系统的中间精密度验证
本实施例由双人操作，分别对供试品样品A(同实施例3)进行独立操作，进行3次检测。操作步骤同实施例2。统计检测的OD值，根据标准品的线性方程计算出相应的D抗原含量，计算其平均值、标准偏差和变异系数。
表5中间精密度验证结果
表5结果显示，按照本发明所述的方法，由双人分别对3批供试品进行检测，结果显示变异系数CV均不大于10％，表明本发明所述方法具有较好的中间精密度。
实施例5 Ⅲ型脊髓灰质炎病毒D抗原检测系统的特异性
本实施例对实施例3的供试品样品A(D抗原)随机稀释成三份，称为样品A1，A2和A3，实施例3的供试品样品B(H抗原)随机稀释成三份，称为样品B1，B2和B3，，对加热前后的A、B样品采用实施例2的方法对D抗原和H抗原中的D抗原含量进行检测。统计检测的OD值，根据标准品的线性方程计算出相应的D抗原含量。同时将上述6个样品进行免疫原性试验，考察样品的免疫效果。结果见表6。
表6方法特异性验证结果
*GMT大鼠免疫效力几何平均数
表6结果显示，供试品样品A1，A2和A3采用本发明实施例2的方法检测D和H抗原后，供试品D抗原与H抗原的比值均在15-20倍之间。由于加热前的D抗原和加热后的H抗原来自同一样品，因此A1，A2和A3D抗原和H抗原的蛋白浓度是相同的，在相同蛋白浓度下，对D抗原和H抗原的检测结果的比值15-20倍，说明本发明实施例2建立的检测方法能够较好区分D抗原和H抗原。结果同时显示，D抗原(A样品)具有较好的免疫原性，中和效价在1:421以上，而加热后的H抗原(B样品)免疫原性差，中和效价低于1:10。D抗原是疫苗中的有效成分，其含量决定疫苗的效果。该检测系统对高免疫原性的样品检测结果较高，对低免疫原性样品的检测结果较低，表明，检测结果与免疫原性正相关，因此本发明的检测系统可以有效指导疫苗的有效性，可以用于疫苗质量控制和评价。
实施例6 Ⅲ型脊髓灰质炎病毒D抗原检测系统区分D和H抗原的有效性
本实施例对实施例3的供试品样品A、B、C，分别进行3次独立抗原检测实验。操作步骤同实施例2。统计检测的OD值，根据标准品的线性方程计算出相应的D抗原含量。
表7本发明方法识别D和H抗原能力验证结果
表7结果显示，供试品A(D抗原)中加入等体积的H抗原(B样品)形成供试样品C后，对采用本发明实施例2的方法检测D抗原结果无干扰。进而再次表明本发明方法能够较好的区分D和H抗原。文献表明，D抗原可以产生保护性抗体，H抗原几乎不产生保护性抗体，D抗原是疫苗中的有效成分，它的含量直接决定了疫苗的效果。因此，本发明的检测系统可以有效反映疫苗的免疫效果，准确可靠。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种检测Ⅲ型脊髓灰质炎病毒D抗原含量的方法，其特征在于，以Ⅲ型脊髓灰质炎病毒多克隆抗体作为包被抗体，Ⅲ型脊髓灰质炎病毒特异性单克隆抗体作为检测抗体，采用ELISA方法实现对Ⅲ型脊髓灰质炎病毒D抗原含量的检测。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Ⅲ型脊髓灰质炎病毒多克隆抗体为牛多抗，是采用灭活的Ⅲ型脊髓灰质炎病毒免疫牛制备而来，该牛多抗对于Ⅲ型脊髓灰质炎病毒的反应优于对Ⅰ、Ⅱ型脊髓灰质炎病毒的反应。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Ⅲ型脊髓灰质炎病毒特异性单克隆抗体是由保藏编号为CGMCC NO.9233的杂交瘤细胞分泌得到。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Ⅲ型脊髓灰质炎病毒多克隆抗体为牛多抗，该多抗采用灭活的Ⅲ型脊髓灰质炎病毒免疫牛；所述Ⅲ型脊髓灰质炎病毒特异性单克隆抗体是由保藏编号为CGMCC NO.9233的杂交瘤细胞分泌得到。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，将Ⅲ型脊灰病毒牛多抗包被于酶标板形成固相抗体；然后加入脊灰病毒供试品，形成固相抗原抗体复合物；洗板，拍干，再加入Ⅲ型脊灰病毒特异性单克隆抗体，孵育后洗板拍干，最后加入酶标记抗种属抗体，当加入底物时出现成色反应，终止液终止反应后用酶标仪在适当波长测定OD值，统计分析结果；
或，将Ⅲ型脊灰病毒牛多抗包被于酶标板形成固相抗体；然后加入脊灰病毒供试品，形成固相抗原抗体复合物；洗板，拍干，再加入酶标记的Ⅲ型脊灰病毒特异性单克隆抗体，孵育后洗板拍干，当加入底物时出现成色反应，终止液终止反应后用酶标仪在适当波长测定OD值，统计分析结果。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，Ⅲ型脊髓灰质炎病毒多克隆抗体按照1:1000-1：10000稀释并混匀后加于酶标板。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，Ⅲ型脊髓灰质炎病毒特异性单克隆抗体或酶标记Ⅲ型脊髓灰质炎病毒特异性单克隆抗体按照1:1000-1:10000的比例稀释混匀后加于酶标板。
8.权利要求1-7任一所述的方法在制备脊髓灰质炎生物制品及其质量控制中的应用。
9.权利要求1-7任一所述的方法在制备脊髓灰质炎病毒检测试剂或试剂盒中的应用。
10.Ⅲ型脊髓灰质炎病毒牛多克隆抗体在制备检测Ⅲ型脊髓灰质炎病毒D抗原含量试剂盒中的应用。
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