CN106990253A - 一种基于重组S1蛋白检测猪流行性腹泻病毒IgA抗体的ELISA方法 - Google Patents

一种基于重组S1蛋白检测猪流行性腹泻病毒IgA抗体的ELISA方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106990253A
CN106990253A CN201710373314.XA CN201710373314A CN106990253A CN 106990253 A CN106990253 A CN 106990253A CN 201710373314 A CN201710373314 A CN 201710373314A CN 106990253 A CN106990253 A CN 106990253A
Authority
CN
China
Prior art keywords
protein
expression
albumen
restructuring
pedv
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201710373314.XA
Other languages
English (en)
Inventor
李任峰
田香勤
鲁毅
荆焕芳
李晓晗
韩俊伟
王自良
马金友
柳东阳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Henan Institute of Science and Technology
Original Assignee
Henan Institute of Science and Technology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Henan Institute of Science and Technology filed Critical Henan Institute of Science and Technology
Priority to CN201710373314.XA priority Critical patent/CN106990253A/zh
Publication of CN106990253A publication Critical patent/CN106990253A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了一种基于重组S1蛋白检测猪流行性腹泻病毒IgA抗体的ELISA方法，本发明对PEDV流行毒株（CH/HNQX‑3/14）的部分S1基因（包含499‑638 aa,748‑755 aa和756‑771 aa 3个抗原表位区）进行克隆，构建重组表达质粒pET30a(+)‑pS1，转化大肠杆菌BL21后，通过优化表达条件，获得可溶性表达的重组pS1蛋白，该蛋白能够与猪的PEDV阳性血清发生特异性反应。以纯化后的重组pS1蛋白作为包被抗原，建立了PEDV IgA抗体间接ELISA检测方法，该方法具有较好的特异性、敏感性和重复性，可应用于PEDV IgA抗体的临床检测及免疫评价。本发明操作简单，应用范围广。

Description

一种基于重组S1蛋白检测猪流行性腹泻病毒IgA抗体的ELISA 方法
技术领域
本发明涉及检测猪流行性腹泻病毒的方法，特别是一种基于重组S1蛋白检测猪流行性腹泻病毒IgA抗体的ELISA方法。
背景技术
猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的猪的一种以呕吐、腹泻和脱水为主要临床症状的肠道传染病。该病已成为制约我国养猪业健康发展的重要猪病之一。
作为猪的一种肠道病毒，PEDV引起的免疫应答主要以肠道粘膜免疫为主。实践中，血清学检测仍然是PEDV临床诊断及免疫评价的常用方法。遗憾的是，目前的抗体检测技术主要集中在血液中IgG抗体水平的检测，而临床检测发现，尽管疫苗免疫后血清中存在较高水平的抗PEDV IgG抗体，猪群仍发生腹泻的情况时常发生。因此，传统检测血清中的PEDVIgG抗体水平不能真实反映PEDV疫苗的免疫保护状况。对于肠道病毒来说，IgA是病原体感染后肠道粘膜产生最多的抗体类型，也是阻止病原体入侵肠道的重要防线，在机体抗感染免疫中发挥重要作用。因此，对于PEDV来说，猪体内IgA水平更能反应机体被PEDV感染情况及疫苗免疫保护效力。目前对于IgA的检测仍存在一定难度，国内尚缺乏标准的PEDV IgA检测技术和产品。
发明内容
本发明根据流行毒株CH/HNQX-3/14的S1基因序列设计引物，扩增产物编码的蛋白包含了S1蛋白的499-638aa、748-755aa和756-771aa三个中和表位区。将其构建重组表达质粒pET30a(+)-pS1，转化大肠杆菌BL21后，通过优化表达条件，获得了可溶性表达的重组pS1蛋白，采用Ni-NTA亲和层析对其进行纯化，以纯化后的重组pS1蛋白为抗原包被酶标板，建立了PEDV IgA抗体间接ELISA检测方法，该方法具有良好的特异性、敏感性和重复度，可用于PEDV的临床检测及疫苗免疫评价。
本发明的目的是提供一种高通量检测PEDV IgA抗体的ELISA方法，该方法具有特异性强、灵敏度高、结果准确可靠的特点，可用于PEDV的疫苗免疫评价。
本发明的技术方案是，一种基于重组S1蛋白检测猪流行性腹泻病毒IgA抗体的ELISA方法，它包括以下步骤：
步骤1：
重组pS1蛋白可溶性表达体系的建立
构建重组表达质粒pET30a(+)-pS1，转化大肠杆菌BL21后，通过优化表达条件，获得了可溶性表达的重组pS1蛋白，具体为：
(1)pS1重组表达质粒的构建
采用上游引物：5'-GGGGATCCTCTTTTGTTACTTTGCC-3’河下游引物：5’-GCGAATTCAGGCGTGTTGTAAAGC-3’扩增pS1基因，上下游分别引入BamHI和EcoRI酶切位点，将该基因克隆至pET30a(+)载体，构建重组表达质粒pET30a(+)-pS1；
(2)确定诱导前菌液OD600值
诱导前首先测定菌液OD600值，然后加入1.0mM IPTG，置于37℃摇床250rpm诱导表达10h，菌体经8000rpm离心15min后超声破碎；每工作5s，间隔5s，15min，12000rpm离心10min，分别对上清和沉淀进行12﹪SDS-PAGE电泳，根据蛋白表达情况，确定诱导前菌液最佳OD600值为0.6；
(3)重组pS1蛋白诱导表达温度的优化
菌液培养至以上确定的OD600值时加入1.0mM IPTG，分别置于20℃～37℃摇床250rpm培养10h，菌体经离心及超声破碎处理后，12﹪SDS-PAGE电泳，根据沉淀和上清中目的蛋白的表达情况，确定30℃为最佳诱导表达温度；
(4)IPTG工作浓度的优化
按以上确定的最佳诱导温度，向菌液中加入终浓度分别为0.1～1.2mM的IPTG诱导表达10h，超声破碎菌体，12000rpm离心10min，分别收集上清和沉淀，采用12﹪SDS-PAGE电泳观察蛋白表达情况，确定IPTG的最佳诱导工作浓度为0.8mM；
(5)重组pS1蛋白诱导表达时间的优化
根据以上确定的诱导表达条件，从诱导2h开始，每隔2h收样一次，直到诱导20h结束，超声处理诱导后菌液，12000rpm离心10min，12﹪SDS-PAGE电泳观察蛋白表达情况，确定最佳诱导时间为8h；
步骤2：
重组pS1蛋白的Ni-NTA亲和层析纯化
(1)装住：将柱子垂直固定于离心管架子上，取20mL填料加入柱子中，沉积30min；
(2)将镍柱接入explorer 10蛋白纯化仪，打开Biologic DuoFlow程序；
(3)平衡：用至少10倍柱床体积的Bind buffer(300mM NaCl，50mM NaH2PO4，10mMImidazole，pH 8.0)对柱子平衡2次；
(4)上样：将待纯化蛋白循环上样3-5次。注意保存流穿过的蛋白液，比较过柱前后目的蛋白的浓度变化；
(5)洗涤：用Washing Buffer(300mM NaCl，50mM NaH2PO4，50mM Imidazole，pH8.0)反复洗涤杂蛋白，用蛋白指示剂检测蛋白浓度的变化；
(6)洗脱：用Elution Buffer(300mM NaCl，50mM NaH2PO4，200mM Imidazole，pH8.0)洗脱目的蛋白，SDS-PAGE及Western-blot鉴定分析洗脱效果；
(7)柱子保存：分别用5-10倍柱体积的Binding buffer和超纯水对柱子进行清洗，再加入20﹪乙醇4℃保存；
步骤3：
pS1-ELISA方法的建立
(1)包被：表达的重组pS1蛋白按1.25μg/mL浓度用0.05M CBS(pH 9.6)包被于96孔板(50μL/孔)，4℃过夜，取出后用PBST洗涤5次；
(2)封闭：每孔加入200μL的1﹪BSA作为封闭液，置于37℃条件下封闭90min，洗涤5次；
(3)加样：样品用PBS稀释后按每孔50μL加入酶标板，并加入阴性和阳性对照，37℃作用30min，洗涤5次；
(4)加入酶标二抗：山羊抗猪IgA酶标二抗(HRP-IgA)按1:4000倍稀释后，按每孔50μL量加入以上酶标孔，37℃反应30min，洗涤5次；
(5)显色与终止：按50μL/孔的量加入TMB显色液，避光条件下显色10min，加入2MH2SO4终止反应，用酶标仪测定OD450值；
(6)结果判定：利用以上方法检测36份PEDV阴性血清，测定OD450值，计算平均值和标准差(SD)，当待检血清且阴性对照OD450nm＜0.12时即可判为阳性，其它判为阴性。最终确定阴、阳性的临界值为0.43。
本发明至少包括以下有益效果：
(1)本装置是一种基于PEDV的重组纤突蛋白(S1蛋白)所建立的ELISA方法。首先根据流行毒株CH/HNQX-3/14的S1基因序列设计引物，扩增产物编码的蛋白包含了S1蛋白的499-638aa、748-755aa和756-771aa三个中和表位区。将其构建重组表达质粒pET30a(+)-pS1，转化大肠杆菌BL21后，通过优化表达条件，获得了可溶性表达的重组pS1蛋白，采用Ni-NTA亲和层析对其进行纯化，以纯化后的重组pS1蛋白为抗原包被酶标板，建立了PEDV IgA抗体间接ELISA检测方法。
(2)本装置检测特异性强，敏感性高。采用该ELISA方法，在同批次条件下对TGEV、CSFV、PRRSV、PRV、FMDV等病毒的阳性血清进行特异性测定，同时设PEDV阴性对照。结果显示，除PEDV阳性血清对照外，其它血清检测结果均呈阴性，表明该方法具有较好的特异性；将3份不同IgA效价的PEDV阳性血清和3份PEDV阳性乳汁(经商品化试剂盒筛选)从1:100开始进行倍比稀释，采用本试验所建立的ELISA方法进行检测，同时设阴性对照，评价该方法的敏感性。结果显示，除3号乳汁样品外，其余样品当稀释度达到1:3200时，测得OD450nm均大于0.43(临界值)，表明该方法具有较好的敏感性。
(3)本装置检测重复性好。取5份血清，用两批重组pS1蛋白包被酶联板各重复检测3次，应用SPSS统计学软件计算标准偏差及变异系数，对该ELISA检测方法的重复性及稳定性进行统计分析。结果显示，5份样品的OD450变异系数(CV)均较小，平均值为4.92﹪，表明该方法具有较好的重复性。
(4)减少投资和检测成本。使用该检测方法，不需另配其它仪器、设备和试剂，节省大量仪器、设备和附加试剂费用；专业和非专业人士均可随时随地进行现场检测，节省检测成本，检测费用低。
(5)应用范围广，便于普遍推广应用。本发明操作简单，而且方便携带和保存，能满足不同层次人员的需要，包括专业化验、海关检疫、卫生防疫、质量监测、畜产品加工、集约化养殖到个体养殖等，具有广阔的市场前景和较好的经济、社会效益。
附图说明
图1是本发明所述的PEDV pS1蛋白的表达、纯化及Western blot分析结果图。
M：预染蛋白Marker(10-180KDa)；1：未纯化的重组pS1蛋白SDS-PAGE；2-6：纯化后的重组pS1蛋白SDS-PAGE；7：Western blot显示pS1蛋白与PEDV阳性血清的反应；8：空载诱导。
具体实施方式
详细描述实施例，
实施例：
步骤1：
重组pS1蛋白可溶性表达体系的建立
构建重组表达质粒pET30a(+)-pS1，转化大肠杆菌BL21后，通过优化表达条件，获得了可溶性表达的重组pS1蛋白，具体为：
(1)pS1重组表达质粒的构建
采用上游引物：5'-GGGGATCCTCTTTTGTTACTTTGCC-3’河下游引物：5’-GCGAATTCAGGCGTGTTGTAAAGC-3’扩增pS1基因，上下游分别引入BamHI和EcoRI酶切位点，将该基因克隆至pET30a(+)载体，构建重组表达质粒pET30a(+)-pS1；
(2)确定诱导前菌液OD600值
诱导前首先测定菌液OD600值，然后加入1.0mM IPTG，置于37℃摇床250rpm诱导表达10h，菌体经8000rpm离心15min后超声破碎；每工作5s，间隔5s，15min，12000rpm离心10min，分别对上清和沉淀进行12﹪SDS-PAGE电泳，根据蛋白表达情况，确定诱导前菌液最佳OD600值为0.6；
(3)重组pS1蛋白诱导表达温度的优化
菌液培养至以上确定的OD600值时加入1.0mM IPTG，分别置于20℃～37℃摇床250rpm培养10h，菌体经离心及超声破碎处理后，12﹪SDS-PAGE电泳，根据沉淀和上清中目的蛋白的表达情况，确定30℃为最佳诱导表达温度；
(4)IPTG工作浓度的优化
按以上确定的最佳诱导温度，向菌液中加入终浓度分别为0.1～1.2mM的IPTG诱导表达10h，超声破碎菌体，12000rpm离心10min，分别收集上清和沉淀，采用12﹪SDS-PAGE电泳观察蛋白表达情况，确定IPTG的最佳诱导工作浓度为0.8mM；
(5)重组pS1蛋白诱导表达时间的优化
根据以上确定的诱导表达条件，从诱导2h开始，每隔2h收样一次，直到诱导20h结束，超声处理诱导后菌液，12000rpm离心10min，12﹪SDS-PAGE电泳观察蛋白表达情况，确定最佳诱导时间为8h；
步骤2：
重组pS1蛋白的Ni-NTA亲和层析纯化
(1)装住：将柱子垂直固定于离心管架子上，取20mL填料加入柱子中，沉积30min；
(2)将镍柱接入explorer 10蛋白纯化仪，打开Biologic DuoFlow程序；
(3)平衡：用至少10倍柱床体积的Bind buffer(300mM NaCl，50mM NaH2PO4，10mMImidazole，pH 8.0)对柱子平衡2次；
(4)上样：将待纯化蛋白循环上样3-5次。注意保存流穿过的蛋白液，比较过柱前后目的蛋白的浓度变化；
(5)洗涤：用Washing Buffer(300mM NaCl，50mM NaH2PO4，50mM Imidazole，pH8.0)反复洗涤杂蛋白，用蛋白指示剂检测蛋白浓度的变化；
(6)洗脱：用Elution Buffer(300mM NaCl，50mM NaH2PO4，200mM Imidazole，pH8.0)洗脱目的蛋白，SDS-PAGE及Western-blot鉴定分析洗脱效果；
(7)柱子保存：分别用5-10倍柱体积的Binding buffer和超纯水对柱子进行清洗，再加入20﹪乙醇4℃保存；
步骤3：
pS1-ELISA方法的建立
(1)包被：表达的重组pS1蛋白按1.25μg/mL浓度用0.05M CBS(pH 9.6)包被于96孔板(50μL/孔)，4℃过夜，取出后用PBST洗涤5次；
(2)封闭：每孔加入200μL的1﹪BSA作为封闭液，置于37℃条件下封闭90min，洗涤5次；
(3)加样：样品用PBS稀释后按每孔50μL加入酶标板，并加入阴性和阳性对照，37℃作用30min，洗涤5次；
(4)加入酶标二抗：山羊抗猪IgA酶标二抗(HRP-IgA)按1:4000倍稀释后，按每孔50μL量加入以上酶标孔，37℃反应30min，洗涤5次；
(5)显色与终止：按50μL/孔的量加入TMB显色液，避光条件下显色10min，加入2MH2SO4终止反应，用酶标仪测定OD450值；
(6)结果判定：利用以上方法检测36份PEDV阴性血清，测定OD450值，计算平均值和标准差(SD)，当待检血清且阴性对照OD450nm＜0.12时即可判为阳性，其它判为阴性。最终确定阴、阳性的临界值为0.43。
敏感性试验
将3份不同IgA效价的PEDV阳性血清和3份PEDV阳性乳汁(经商品化试剂盒筛选)从1:100开始进行倍比稀释，采用本发明所建立的ELISA方法进行检测，同时设阴性对照，评价该方法的敏感性。结果如表1，除3号乳汁样品外，其余样品当稀释度达到1:3200时，测得OD450nm均大于0.43(临界值)，表明该方法具有较好的敏感性。
表1敏感性检测结果
特异性试验
用pS1-ELISA方法分别对PEDV、TGEV、CSFV、PRRSV、PRV、FMDV等病毒的阳性血清进行特异性检测，每份血清做3个重复，同时设立阴性对照和阴性血清，观察pS1-ELISA的特异性。结果如表2，除PEDV阳性血清对照外，其它血清检测结果均呈阴性，表明该方法具有较好的特异性。
表2特异性检测结果
重复性试验
取5份血清，用两批重组pS1蛋白包被酶联板各重复检测3次，应用SPSS统计学软件计算标准偏差及变异系数，对该ELISA检测方法的重复性及稳定性进行统计分析。结果如表3所示，5份样品的OD450变异系数(CV)均较小，平均值为4.92﹪(表3-5)，表明该方法具有较好的重复性。
表3 5份血清样品各用两批包被ELISA板3次检测结果分析
疫苗免疫评价
采用本发明建立的ELISA方法，对母猪免疫和未免疫T-P二联苗的两个猪群进行IgA抗体检测。结果如表4所示，无论是母猪免疫猪群还是未免疫猪群，育肥猪和母猪的抗体阳性率总体上均比哺乳仔猪和保育猪高。另外，免疫猪群的血清抗体阳性率在不同年龄阶段均比未免疫猪群偏高，免疫猪群母猪乳汁中的IgA抗体阳性率较未免疫猪群高。
表4免疫评价结果
上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举，而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种基于重组S1蛋白检测猪流行性腹泻病毒IgA抗体的ELISA方法，其特征在于：它包括以下步骤：
步骤1：
重组pS1蛋白可溶性表达体系的建立
构建重组表达质粒pET30a(+)-pS1，转化大肠杆菌BL21后，通过优化表达条件，获得了可溶性表达的重组pS1蛋白，具体为：
（1）pS1重组表达质粒的构建
采用上游引物：5'- GGGGATCCTCTTTTGTTACTTTGCC-3’河下游引物：5’-GCGAATTCAGGCGTGTTGTAAAGC-3’扩增pS1基因，上下游分别引入BamHI和EcoRI酶切位点， 将该基因克隆至pET30a(+)载体，构建重组表达质粒pET30a(+)-pS1；
（2）确定诱导前菌液OD600值
诱导前首先测定菌液OD600值，然后加入1.0 mM IPTG，置于37 ℃摇床250 rpm诱导表达10 h，菌体经8000 rpm离心15 min后超声破碎；每工作5 s，间隔5 s，15 min，12000 rpm离心10min，分别对上清和沉淀进行12 ﹪SDS-PAGE电泳，根据蛋白表达情况，确定诱导前菌液最佳OD600值为0.6；
（3）重组pS1蛋白诱导表达温度的优化
菌液培养至以上确定的OD600值时加入1.0 mM IPTG，分别置于20 ℃～37 ℃摇床250rpm培养10 h，菌体经离心及超声破碎处理后，12 ﹪SDS-PAGE电泳，根据沉淀和上清中目的蛋白的表达情况，确定30 ℃为最佳诱导表达温度；
（4）IPTG工作浓度的优化
按以上确定的最佳诱导温度，向菌液中加入终浓度分别为0.1～1.2 mM的IPTG诱导表达10 h，超声破碎菌体，12000 rpm离心10min，分别收集上清和沉淀，采用12 ﹪SDS-PAGE电泳观察蛋白表达情况，确定IPTG的最佳诱导工作浓度为0.8 mM；
（5）重组pS1蛋白诱导表达时间的优化
根据以上确定的诱导表达条件，从诱导2 h开始，每隔2 h收样一次，直到诱导20 h结束，超声处理诱导后菌液，12000 rpm离心10 min，12 ﹪SDS-PAGE电泳观察蛋白表达情况，确定最佳诱导时间为8 h；
步骤2：
重组pS1蛋白的Ni-NTA亲和层析纯化
（1）装住：将柱子垂直固定于离心管架子上，取20 mL填料加入柱子中，沉积30 min；
（2）将镍柱接入ÄKTA explorer 10蛋白纯化仪，打开Biologic DuoFlow程序；
（3）平衡：用至少10倍柱床体积的Bind buffer：300 mM NaCl，50 mM NaH2PO4，10 mMImidazole，pH 8.0，对柱子平衡2次；
（4）上样：将待纯化蛋白循环上样3-5次。注意保存流穿过的蛋白液，比较过柱前后目的蛋白的浓度变化；
（5）洗涤：用Washing Buffer：300 mM NaCl，50 mM NaH2PO4，50 mM Imidazole，pH 8.0，反复洗涤杂蛋白，用蛋白指示剂检测蛋白浓度的变化；
（6）洗脱：用Elution Buffer：300 mM NaCl，50 mM NaH2PO4，200 mM Imidazole，pH8.0，洗脱目的蛋白，SDS-PAGE及Western-blot鉴定分析洗脱效果；
（7）柱子保存：分别用5-10倍柱体积的Binding buffer和超纯水对柱子进行清洗，再加入20 ﹪乙醇4 ℃保存；
步骤3：
pS1-ELISA方法的建立
（1）包被：表达的重组pS1蛋白按1.25 µg/mL浓度用0.05 M CBS，pH 9.6包被于96孔板，50 µL/孔，4 ℃过夜，取出后用PBST洗涤5次；
（2）封闭：每孔加入200 µL的1 ﹪BSA作为封闭液，置于37 ℃条件下封闭90 min，洗涤5次；
（3）加样：样品用PBS稀释后按每孔50 µL加入酶标板，并加入阴性和阳性对照，37 ℃作用30 min，洗涤5次；
（4）加入酶标二抗：山羊抗猪IgA酶标二抗按1:4000倍稀释后，按每孔50 µL量加入以上酶标孔，37 ℃反应30 min，洗涤5次；
（5）显色与终止：按50 µL/孔的量加入TMB显色液，避光条件下显色10 min，加入2 MH2SO4终止反应，用酶标仪测定OD450值；
（6）结果判定：利用以上方法检测36份PEDV阴性血清，测定OD450值，计算平均值：和标准差：SD，当待检血清OD450nm ≥＋3SD，且阴性对照OD450nm＜0.12时即可判为阳性，其它判为阴性，最终确定阴、阳性的临界值为0.43。
CN201710373314.XA 2017-05-24 2017-05-24 一种基于重组S1蛋白检测猪流行性腹泻病毒IgA抗体的ELISA方法 Pending CN106990253A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710373314.XA CN106990253A (zh) 2017-05-24 2017-05-24 一种基于重组S1蛋白检测猪流行性腹泻病毒IgA抗体的ELISA方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710373314.XA CN106990253A (zh) 2017-05-24 2017-05-24 一种基于重组S1蛋白检测猪流行性腹泻病毒IgA抗体的ELISA方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106990253A true CN106990253A (zh) 2017-07-28

Family

ID=59420872

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710373314.XA Pending CN106990253A (zh) 2017-05-24 2017-05-24 一种基于重组S1蛋白检测猪流行性腹泻病毒IgA抗体的ELISA方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106990253A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108761076A (zh) * 2018-05-24 2018-11-06 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心 乳汁中pedv免疫检测层析试纸条及其制备方法和应用
CN109856387A (zh) * 2019-01-23 2019-06-07 南京农业大学 猪流行性腹泻特异性SIgA抗体ELISA检测试剂盒及其应用
CN110967480A (zh) * 2018-09-28 2020-04-07 洛阳普泰生物技术有限公司 一种猪流行性腹泻病毒IgA抗体ELISA试剂盒的制备及应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
李任峰: "河南省猪流行性腹泻病毒遗传进化分析及免疫学检测方法的建立", 《中国博士学位论文全文数据库（电子期刊）农业科技辑》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108761076A (zh) * 2018-05-24 2018-11-06 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心 乳汁中pedv免疫检测层析试纸条及其制备方法和应用
CN110967480A (zh) * 2018-09-28 2020-04-07 洛阳普泰生物技术有限公司 一种猪流行性腹泻病毒IgA抗体ELISA试剂盒的制备及应用
CN109856387A (zh) * 2019-01-23 2019-06-07 南京农业大学 猪流行性腹泻特异性SIgA抗体ELISA检测试剂盒及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113009154B (zh) 一步法新型冠状病毒中和抗体磁性微球检测试剂盒及其应用
CN107894508A (zh) 一种用于塞内卡病毒抗体检测的固相竞争elisa试剂盒及其应用
CN102323428B (zh) 鸭疫里默氏杆菌抗体间接elisa方法检测试剂盒及其应用
CN103344770B (zh) 牛布鲁氏菌间接elisa检测试剂盒
CN101968490A (zh) 检测副猪嗜血杆菌抗体的间接elisa方法以及试剂盒
CN107741495A (zh) 一种用于塞内卡病毒抗原检测的双抗夹心elisa试剂盒及其应用
CN110927390A (zh) 一种检测非洲猪瘟CD2v蛋白抗体的ELISA方法、试剂盒及应用
CN109655621A (zh) 猪丁型冠状病毒n蛋白间接elisa抗体检测方法及其试剂盒
CN105906714A (zh) 一种布鲁氏菌病特异性融合蛋白抗原的制备及应用
CN106990253A (zh) 一种基于重组S1蛋白检测猪流行性腹泻病毒IgA抗体的ELISA方法
CN106556701B (zh) 羊布鲁氏菌间接elisa抗体检测试剂盒
CN107831319A (zh) 一种羊棘球蚴Eg95蛋白抗体间接ELISA检测试剂盒
CN105061602B (zh) 用于检测抗猪产肠毒素性大肠杆菌抗体的融合蛋白、制备方法及应用
CN105866407A (zh) 一种曲霉菌半乳甘露聚糖抗原免疫检测试剂盒及其制备方法与应用
CN101581726A (zh) 新一代布鲁氏菌病抗体竞争酶联免疫吸附试验检测试剂盒
CN107727854A (zh) 一种鸡传染性支气管炎病毒蛋白芯片抗体检测试剂盒及其应用
CN106518989B (zh) 用于检测猪Delta冠状病毒抗体的多肽、制备方法及其应用
CN103698514B (zh) 检测猪胞内劳森氏菌抗体的elisa试剂盒
CN101362801A (zh) 一种用于检测空肠弯曲菌特异性抗原的快速检测试纸条
CN104764887A (zh) 一种1型鸭甲肝病毒抗体竞争elisa检测方法
CN103063838B (zh) 一种鉴别进境动物口蹄疫感染与免疫的试剂盒
CN104155443A (zh) 一种基于弓形虫基质蛋白1的间接elisa检测试剂盒
CN104833804A (zh) 一种幽门螺杆菌IgG抗体ELISA半定量检测试剂盒及其应用
CN110095607A (zh) 用于检测1型和3型鸭甲型肝炎病毒血清抗体的通用型间接elisa试剂盒及其应用
CN104777312A (zh) 一种检测猪传染性胃肠炎病毒抗体的elisa试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20170728

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication