CN1295481A - 疫苗组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种一般的方法,通过这种方法可以制备临时制备的或者是液体的Hib/DTPa组合疫苗以便避免Hib的干扰,同时又能够使每种抗原最大程度地、稳定地吸附于铝基佐剂上,在上述铝基佐剂上,所有的抗原都具有最高的免疫原性。这样,在本发明的组合疫苗中的百日咳抗原能够以它们效力最高的形式被保持。

Description

疫苗组合物
本发明涉及一种用于减少缀合B型流感嗜血杆菌疫苗(Hib)的荚膜多糖成分干扰的方法，上述疫苗存在于一种含有DTPa的组合疫苗-一种众所周知的“三价”组合疫苗中，该种组合疫苗包含白喉类毒素(DT)、破伤风类毒素(TT)、以及非细胞百日咳成分[典型的是去毒的百日咳类毒素(PT)以及细丝状血细胞凝集素(FHA)，可选的含有pertactin(PRN)和/或凝集素1+2]，这种组合疫苗的一个例子是市售的疫苗INFANRIX-DTPaTM(SmithKline Beecham Biologicals)，它含有DT、TT、PT、FHA、以及PRN抗原。本发明同时还涉及用这种方法制备的组合疫苗。
利用多糖的疫苗在本领域中是已知的。例如一种用于预防B型流感嗜血杆菌感染的Hib疫苗是以缀合了一种载体蛋白的B型流感嗜血杆菌荚膜多糖(PRP)为基础的。上述多糖是核糖、核糖醇以及磷酸盐的多聚体。载体蛋白的例子包括白喉或破伤风类毒素、或者一种脑膜炎奈瑟氏球菌(N.meningitidis)外膜蛋白。例如，见US4，365，170、US 4，673，574、EP 208375、EP 477508以及EP 161188。
将此类缀合疫苗和其它的抗原或者疫苗同时施用是合乎需求的，这样就要进行多次注射。与多次注射相关联的问题包括施用步骤更为复杂以及注射总体积大。在准备给婴儿施用疫苗时，这个问题显得特别的棘手。对于婴儿和医生而言，通过一次正常体积的注射就能注入所有所需的抗原是合乎需求的，这就可以使疫苗接种步骤给婴儿所造成的外伤和疼痛减少，也可以使医生更有效、更容易地进行疫苗接种。
因此，已经有人提议将这类多糖缀合疫苗与其它的疫苗如DTPa相结合以生产更为精细的组合疫苗。另外，也已经有人提议在此类组合疫苗中包含更多的抗原以预防乙肝或骨髓灰质炎(含有抗乙肝抗原和抗白喉、破伤风以及百日咳的抗原(HepB、DTPa)的组合疫苗在WO93/24148中已有描述)。
然而，已经发现将一种组合疫苗的成分简单地混合在一起是很复杂的，因为并不是所有的抗原都可以被有效地混合在一起。抗原和其它的成分相结合所造成的免疫原性的降低(与单独施用特定的抗原相比较)被称为干扰。已知，例如，将DTPa组合疫苗与不加佐剂的Hib毫无准备地混合在一起会导致对Hib多糖成分的抗体滴度降低(WO97/00697)。另外，WO97/00697证实，如果Hib被吸附在氢氧化铝上，它对多糖成分的抗体滴度就会显著降低。这些结果显示在DTPa疫苗的氢氧化铝和Hib之间存在干扰。为了试验并尽量减少这种临时配制的组合疫苗中的这种干扰，将Hib事先吸附在磷酸铝上。
WO 96/37222也提及了这个问题。在这一情形中，通过将Hib和其它的DTPa成分吸附在零点电荷(zero poiht charge)小于7.2的铝基佐剂，例如磷酸铝、或者已经添加了阴离子的氢氧化铝，之上来稳定Hib的抗原性。然而，当使用的是磷酸铝时，这一方法将导致组合疫苗中其它抗原解吸作用增强(它们在吸附于氢氧化铝佐剂上时效果更好)，这在使用氢氧化铝加阴离子时也是一个问题(氢氧化铝的表面基本都被阴离子所覆盖)。
在配制单价和组合疫苗时所遇到的另一个问题是它们的复合抗原随着时间推移的固有稳定性。溶液中的疫苗可能会随着时间的推移发生一些变化，例如抗原发生降解或者抗原从它原先所吸附的佐剂中解吸出来，这会减弱它的抗原成分的免疫原性。虽然通常将目标对准使抗原最大程度地吸附到佐剂上是合乎需求的，但是对于一种可靠的疫苗而言，主要的目标是使疫苗在贮藏期限内能够保持最高水平的吸附。纵使冻干的疫苗可以被临时溶解，但是如果溶解后的疫苗能够保持稳定从而在长时间内保持有效以便能让医生有最大的灵活性并且尽可能少疫苗的浪费，将是有利的。理想的，一种稳定的疫苗可以被制备在溶液中(“液体”疫苗)。一种制备于溶液中的稳定的疫苗不仅生产费用较冻干的同等物低，它也使医生免去了一个另加的处理步骤，从而避免了处理不当的风险。
附图的简要说明
图1：表示百日咳小鼠肺对‘轻氢氧化铝’(批号21750和21751)以及‘全磷酸铝’(批号21752)制剂(含有或不含有Hib)的清除活性，与标准的商品化DTPa疫苗(用正方形符号表示)相比较的曲线图。
发明说明
本发明涉及一种一般的方法，通过这种方法可以制备临时配制的或者液体的Hib/DTPa组合疫苗以便更好地避免Hib干扰的问题，这些问题在现有技术中已有描述，同时还能够使每一种抗原能够最稳定地吸附于铝基佐剂之上，在上述的佐剂上它的免疫原性最高。这样，本发明的组合疫苗中的百日咳抗原将稳定地保持它们最有效的形式。另外，本发明涉及上述方法是如何与另外的方法相互兼容以改善液体组合疫苗的成分稳定地吸附在铝基佐剂上。这样，组合疫苗中的Hib多糖成分的免疫原性可以被一贯地保持并且可以在液体状态下保持更长时间的稳定。从而，如此生产的疫苗在被施用于患者，特别是儿童时可以发挥更大的作用。
具体地，本发明教导了一种可靠的方法，通过这种方法氢氧化铝可以被用作DTPa-Hib组合疫苗中的佐剂而并不随着时间的推移在临时制备的或者液体制剂中对Hib成分产生干扰，并且不象在WO96/37222中所述的方法一样没有必要地给制剂添加阴离子。由于阴离子并没有被没有必要地添加到制剂中，所以所有吸附的抗原的稳定性达到最高，而且另外，这一方法与另一种业已公开的优化抗原稳定地吸附于组合疫苗中的铝基佐剂上的方法是相互兼容的，后一种方法具体的是通过使用“额外的清洗的”磷酸铝来优化它们在液体制剂中随着时间的推移在佐剂上的吸附(并且尽量减少它们随后的解吸作用)。
相应地，本发明提供了一种用于减少在含有DTPa的组合疫苗中的缀合B型流感嗜血杆菌疫苗(Hib)的荚膜多糖成分的干扰作用的方法，其中这种方法包括：
(ⅰ)选择要吸附到氢氧化铝佐剂上的一种或多种抗原；
(ⅱ)用所选定的抗原对氢氧化铝佐剂进行预饱和处理；
(ⅲ)选择Hib以及一种或多种另外的要吸附到磷酸铝上的抗原；
(ⅳ)将Hib以及上述的另外的抗原吸附到磷酸铝上；
(ⅴ)组合上述疫苗中的所有抗原。
“预饱和”指的是需要氢氧化铝充当佐剂的抗原被预先吸附于氢氧化铝上，从而使得在最终的组合疫苗中没有足以对Hib(不管是未经吸附的还是吸附到磷酸铝上的)产生显著干扰的过量的氢氧化铝，并且使得在经过氢氧化铝吸附的抗原与疫苗的其它抗原组合之前有时间让吸附进行。优选地应该让吸附到氢氧化铝上的这一过程彻底完成(在室温下至少持续大约10分钟的时间)。这样，氢氧化铝的预饱和使得氢氧化铝佐剂对Hib抗原的任何干扰减到最小的程度。经常，组合疫苗中氢氧化铝佐剂的絮凝(或者聚集)状态可能标示着Hib的干扰-絮凝越厉害，Hib干扰的可能性越大。另外，用抗原对氢氧化铝进行预饱和的进一步的优点在于，每一固定剂量的抗原结合较少的氢氧化铝，这可以潜在地降低与明矾相关联的局部反应原性。
应该理解的是，虽然上述方法是最优选的，但是在实施这一方法时也可以在添加到制剂之前不用佐剂对Hib成分进行处理。
本发明提供的另一方面是一种方法，通过这种方法可以将没有经过佐剂处理的Hib或者吸附于磷酸铝上的Hib临时地、有效地与组合疫苗相结合，同时使其免疫原性最小程度地降低。这种方法包括以下步骤：
(ⅰ)选择要吸附到氢氧化铝佐剂上的一种或多种抗原；
(ⅱ)用所选定的抗原对氢氧化铝佐剂进行预饱和处理；
(ⅲ)选择一种或多种另外的要吸附到磷酸铝上的抗原；
(ⅳ)将上述的另外的抗原吸附到磷酸铝上；
(ⅴ)组合上述疫苗中的所有抗原；
(ⅵ)临时添加没有经过佐剂处理的Hib或者吸附于磷酸铝上的Hib。
’DTPa’的意思如上所定义。DT、TT、PT、FHA以及PRN是本领域中所公知的。PT成分可以通过化学的或遗传学的方法制备成类毒素，例如如EP 515415中所述。请同时参考EP 427462以及WO 91/12020中百日咳抗原的制备。可选地，PT成分可以是重组的(例如如欧洲专利申请EP 306318、EP 322533、EP 396964、EP 322115以及EP275689中所述)。可选地，DT和TT成分也可以是重组的。典型地，PT、FHA、PRN、HBsAg(乙肝表面抗原)、以及Hib成分的含量可以在每0.5毫升批量疫苗中含有8-25μg之间。DT、TT、以及IPV(失活三价骨髓灰质炎病毒疫苗)成分的含量典型的分别大约为每0.5毫升批量疫苗中含15-25Lf(flocculating units，絮凝单位)、10Lf、以及40/8/32(Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ型)DU。
优选地，在Hib缀合物中所使用的载体蛋白是白喉类毒素、破伤风类毒素、白喉Crm197蛋白或者一种来源于细菌(例如N.meningitidis)的外膜蛋白。B型流感嗜血杆菌型荚膜多糖(PRP)破伤风类毒素(TT)缀合物的合成描述于WO 97/00697中。
多糖缀合物可以用任何已知的偶联技术进行制备。例如，可以通过硫醚键来偶联多糖。这种缀合方法依赖于多糖被1-腈基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸盐(CDAP)激活形成一种腈酸酯。这样，经过激活的多糖就可以被直接或者通过一个间隔基团结合到载体蛋白的氨基上。优选地，将腈酸酯与己二胺相结合并通过异体连接化学(涉及硫醚键的形成)将派生的多糖缀合到载体蛋白上。此类缀合物被描述在PCT出版的申请WO 93/15760(Uniformed Services University)中。
缀合物还可以用如US 4365170(Jennings)以及US 4673574(Anderson)中所描述的直接还原氨化方法进行制备。其它的方法描述于EP 161188、EP 208375以及EP 477508中。
另外一种方法涉及用碳化二亚胺浓缩将一种用己二酸酰肼(adipic acid hydrazide，ADH)衍生的经溴化腈激活的多糖与蛋白载体相偶合。这种缀合描述于Chu C.等人，Infec.Immunity，1983245 256。
组合疫苗除了含有DTPa抗原和Hib以外，还可以含有其它的抗原，优选地是选自以下集合的一种或多种抗原：乙肝表面抗原(HBsAg)、灭活的甲肝病毒、脊髓灰质炎病毒抗原(例如灭活的三价骨髓灰质炎病毒-IPV)、A型脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖(及其蛋白缀合物)、C型脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖(及其蛋白缀合物)、肺炎链球菌荚膜多糖(及其蛋白缀合物)、肺炎链球菌蛋白、粘膜炎莫拉菌外膜蛋白、不可分型流感嗜血菌外膜蛋白、B型脑膜炎奈瑟氏球菌外膜蛋白。
优选地，如WO 93/24148中所述的方法将HBsAg吸附于磷酸铝上。另外，将DTPa和Hib抗原吸附于铝佐剂上的方法在本领域中是公知的。见例如WO 93/24148和WO 97/00697。
适合在此类疫苗中使用的成分已经商品化，其细节可以从世界卫生组织获得。例如IPV成分可以是Salk灭活骨髓灰质炎疫苗。乙肝表面疫苗可以含有如在Engerix-BTM(SmithKline BeechamBiologicals)中的’S’抗原。灭活的甲肝病毒可以优选地含有名称为HavrixTM(smithKline Beecham Biologicals)的商品化的疫苗，它是一种来源于甲肝病毒HM-175菌株的灭活的减毒疫苗。
可以临时，或者在疫苗离开生产商之前将冻干的或者液体的Hib(未经佐剂处理的或者是吸附于磷酸铝上的)添加到组合疫苗的其它成分的溶液中。在上述的任何一种情形中，Hib成分的免疫原性将保持稳定、有效，其所受的干扰最小。可以单独添加Hib，或者可以添加其与其它的未经氢氧化铝佐剂处理的成分的混合物。
疫苗的制备被普通地描述于疫苗设计-亚基和佐剂方法，由Powell和Newman编辑，Pellum Press。优选地本发明的组合疫苗是一种儿科疫苗。
选择每一疫苗剂量中缀合抗原的用量，使其可以诱导对典型的疫苗接种人产生没有显著有害副作用的免疫保护反应。这一用量将根据所施用的是哪一种特异性的免疫原而有所不同。通常希望每一剂量将包含1-1000μg的缀合多糖(以多糖的数量表示)，优选的为2-100μg，最为优选的为4-40μg。一种特定疫苗的最佳用量可以通过标准研究来确定，上述的标准研究包括对受检者的抗体滴度以及其它的反应进行观察。在初次接种之后，受检者可以以大约4周或更长的时间间隔接受一次或两次加强注射。
在本发明的一个优选的实施例中，存在于组合疫苗中的磷酸铝和氢氧化铝佐剂(以Al3+的相对量表示)的比例的范围优选为1∶1至20∶1之间，更优选是2∶1至14∶1之间，最优选介于1.5∶1至14∶1之间。优选的是在制剂中将PRN成分吸附于氢氧化铝上，因为本发明者们已经发现虽然抗原在宽的pH值范围内可以充分地吸附于氢氧化铝上，但当其被吸附于磷酸铝上时，在pH大于5.1时其吸附效果很差(效力差)。在pH6.1下吸附24小时之后，使用氢氧化铝的大约有少于10％的未被吸附的PRN，而相比之下使用磷酸铝的有大约50％以上的未被吸附的PRN。由于由WHO所指定的DTP疫苗的最终pH为6到7之间，因此重要的是将PRN吸附到氢氧化铝上以获得最大的效率。已经显示PRN是百日咳疫苗中最重要的成分之一，并且现在已经发现吸收的最小化降低了T-细胞应答以及百日咳疫苗的总体效力。
在本发明的另一个优选实施例中，组合疫苗中的所有抗原均被吸附于磷酸铝上，条件是pertactin被吸附到氢氧化铝上。该组合疫苗使用的是所谓的“全磷酸铝”途径。优选的，吸附到氢氧化铝上的pertactin在与吸附于磷酸铝上的抗原相结合之前先与未经吸附的失活骨髓灰质炎病毒抗原相结合(这样就进一步确保氢氧化铝是预饱和的)。一个这样的例子描述于实施例1中。
在上面所详述的可选的方法中也可以使用“全磷酸铝”方法，在这一方法中临时加入未经佐剂处理的或者吸附于磷酸铝上的Hib。
在本发明的另一个优选实施例中，组合疫苗中的所有抗原被吸附于氢氧化铝上，条件是HBsAg和Hib被吸附到磷酸铝上。该组合疫苗使用了所谓的“轻氢氧化铝”方法。优选的，在加入吸附于磷酸铝上的HBsAg之前，将吸附于氢氧化铝上的抗原组合上去。优选的，在加入吸附于磷酸铝上的Hib之前，将HBsAg与其它抗原相结合。这样的一个例子如实施例2中所述。然而，如果所使用的佐剂(铝盐)的总量不足以产生佐剂的效果时，在不破坏本发明优点同时，可以加入游离的磷酸铝。
“轻氢氧化铝”途径也可以被用于以上所详述可选的方法中，其将Hib临时以未辅助的形式加入，或者吸附到磷酸铝上。在该实施例中，任何加入到组合疫苗中的附加的游离磷酸铝优选的是在Hib加入之前使用。
“杂合的全磷酸铝/轻氢氧化铝”是本发明的又一个优选实施例。在这种杂合的制剂中，所选择的抗原和pertactin被吸附于氢氧化铝上，但没有“轻氢氧化铝”制剂中的多。同样的，用抗原将所用的所有的氢氧化铝进行预饱和处理，以尽量降低Hib干扰的风险。优选的，组合疫苗中的所有抗原被吸附到磷酸铝上，条件是pertactin、白喉类毒素、百日咳类毒素、丝状血细胞凝集素被吸附到氢氧化铝上。同样的，Hib在加入到液体的或临时制备的制剂中时可以是未经佐剂处理的或吸附于磷酸铝上的。优选的，在与吸附于磷酸铝上的抗原相组合之前将吸附于氢氧化铝上的pertactin、白喉类毒素、百日咳类毒素、丝状血细胞凝集素与未经吸附的失活骨髓灰质炎病毒抗原相组合。一个这样的实施例描述于实施例3中。
另外应该理解的是被选择用以对氢氧化铝佐剂进行预饱和处理的一种或多种抗原可以是已经被吸附到另一种佐剂，优选的是磷酸铝，上的。这样的制剂被称为“改良的全磷酸铝/轻氢氧化铝”制剂，这些制剂提供了本发明的又一个优选实施例。另外，将所有的所用的氢氧化铝用抗原进行预饱和处理以便尽量减少Hib干扰的风险。在此类制剂中，Hib应该被临时添加到制剂中，此时它可以是未经佐剂处理的，也可以是吸附于磷酸铝上的。优选地，组合疫苗中的所有的抗原被吸附于磷酸铝上，条件是pertactin、百日咳类毒素、丝状血细胞凝集素被吸附到氢氧化铝上，而白喉类毒素(它已经事先吸附于磷酸铝上)也在与其它的抗原组合之前与游离的氢氧化铝相组合。这样的一个实施例描述于实施例4中。
优选地，将在实施本发明方法中所使用的磷酸铝在吸附抗原之前进行‘额外的清洗’以使游离磷酸根离子的浓度降低到10mM以下，优选的降到3mM或更低，或者更为优选的降到2.5mM或更低。经过额外清洗的磷酸铝在吸附抗原之前应经过灭菌处理(优选的经高压灭菌)。本发明者已经证实使用额外清洗的磷酸铝可以改善Hib和HBsAg吸附于磷酸铝上的水平，并且可以帮助防止DTPa-Hib组合疫苗中所有抗原的解吸(从而改善抗原的稳定性)。清洗磷酸铝佐剂的一种方法描述于实施例中。
由于本发明者所证实的磷酸根离子在溶液中的不利影响，在组合疫苗中所使用的任何一种用于稳定pH的缓冲液优选的应该是阳离子型的。最优选的应该使用L-组氨酸一水合物/一氯化物。
根据本发明的另一个方面，提供了用本发明上面所描述的方法所获得的组合疫苗。
另外，本发明提供了一种含有一种B型流感嗜血杆菌(Hib)缀合荚膜多糖和DTPa的组合疫苗，其特征在于：Hib被吸附于磷酸铝上，而且任何游离的氢氧化铝并不对Hib产生显著的干扰。
也可以单独使用经过额外清洗的磷酸铝方法以增强抗原在磷酸铝上的吸附并减少它们随后从含有DTPa的组合疫苗中解吸出来，其中上述的方法包括以下步骤：
(ⅰ)清洗磷酸铝佐剂以使游离磷酸根离子的浓度降低到3mM或者更低(优选的低于1mM)；
(ⅱ)对(ⅰ)中的经过清洗的磷酸铝进行灭菌处理；
(ⅲ)选择要吸附到磷酸铝佐剂上的抗原；
(ⅳ)将上述的抗原吸附于经过清洗的磷酸铝上；
(ⅴ)如果需要，将组合疫苗的各种抗原组合起来；
优选的，磷酸根离子用重复离心和稀释步骤除去(见实施例8)，或者用进一步的透析过滤步骤除去(而不是象磷酸铝的生产商现在那样用超滤装置除去)。优选的，步骤(ⅱ)中经过额外清洗的佐剂的灭菌是通过高压灭菌来进行的。
另外，本发明提供了一种含有DTPa和磷酸铝佐剂的组合疫苗，其特征在于上述的磷酸铝佐剂已经经过清洗使得其中的游离磷酸根离子的浓度降低到3mM或更低。
同时本发明还提供了一种含有磷酸铝佐剂和一种抗原的具有免疫原性的组合物，其特征在于上述的磷酸铝佐剂已经经过清洗以使其中的游离磷酸根离子的浓度降低到3mM或更低。
下面的实施例对本发明进行了举例说明，但它们并不是本发明范围的局限。
实施例实施例1：使用‘全磷酸铝’方法制备疫苗制剂
制备DTPa-Hib-HBsAg-IPV液体组合疫苗的方法如下(其数量是根据比例确定的，代表了一个剂量的疫苗)：
1)将预先吸附于0.05mg Superfos氢氧化铝上的8μg的PRN与40/8/32DU未经佐剂处理的IPV(分别指1/2/3型)相混合，在室温下搅拌1小时以上。IPV抗原的涂覆使氢氧化铝佐剂在最终的组合疫苗中稳定地保持抗原饱和的状态。
2)预先将17Lf DT、10Lf TT、25μg PT、25μg FHA以及10μg HBsAg分别吸附于0.17、0.1、0.05、0.05以及0.2mg经过额外清洗的Superfos磷酸铝(以Al3+的数量表示)上，然后在室温下与步骤1)中的PRN一起混合1小时以上。
3)将预先吸附于0.12mg经过额外清洗的Superfos磷酸铝上的10μg Hib(PRP与破伤风类毒素缀合)加入到步骤2)的产物中，在室温下将混合物搅拌15分钟以上。
4)调整混合物使其中的阳离子缓冲物L-组氨酸一水化物/一氯化物的浓度达10mM，并将pH值调整为6.1±0.1。组氨酸的pKa值与所需的最终pH值6.1是很接近的，而且因为它的阳离子特性，它并不激发抗原的解吸。
5)将5mg/mL 2-苯氧基乙醇加入到混合物中并在室温下将其搅拌60分钟以上。
6)检查混合物的pH值是否为6.1±0.1(介于6和7之间，如国际卫生组织对DT和DTP疫苗所规定的)。最终的混合物体积为0.5mL，含有140mM的NaCl。
7)在室温下将组合疫苗贮存至少2周的时间，然后再将其用于免疫原性效力的试验。组合疫苗中磷酸铝和氢氧化铝佐剂的比例(以Al3+的相对数量表示)为14∶1。
DT、TT、PT、FHA、PRN、HbsAg、以及Hib分别在pH值5.1±0.1、5.7±0.1、5.1±0.1、5.1±0.1、6.1±0.1、5.5±0.1、以及5.1±0.1下吸附到它们各自的佐剂上。实施例2：使用‘轻氢氧化铝’方法制备疫苗制剂
制备DTPa-Hib-HBsAg-IPV液体组合疫苗的方法如下(其数量是根据比例确定的，代表了一个剂量的疫苗)：
1)预先将25Lf DT、10Lf TT、25μg PT、25μg FHA、8μgPRN以及40/8/32 DU IPV(分别指1/2/3型)分别吸附于0.1、0.025、0.005、0.005、0.05以及0.01mg Superfos氢氧化铝(以Al3+的数量表示)上，然后在室温下混合1小时以上。含有这一数量的氢氧化铝，佐剂被抗原稳定地饱和了。
2)将预先吸附于0.2mg未经清洗的Superfos磷酸铝上的10μgHBsAg与步骤1)中的产物相混合，在室温下将混合物搅拌1小时以上。
3)将预先吸附于0.12mg经过额外清洗的Superfos磷酸铝上的10μg Hib(PRP与破伤风类毒素缀合)加入到步骤2)的产物中，在室温下将混合物搅拌15分钟以上。
4)调整混合物使其中的阳离子缓冲物L-组氨酸一水化物/一氯化物的浓度达10mM，并将pH值调整为6.1±0.1。组氨酸的pKa值与所需的最终pH值6.1是很接近的，而且因为它的阳离子特性，它并不激发抗原的解吸。
5)将5mg/mL 2-苯氧基乙醇加入到混合物中并在室温下将其搅拌60分钟以上。
6)检查混合物的pH值是否为6.1±0.1(介于6和7之间，如国际卫生组织对DT和DTP疫苗所规定的)。最终的混合物体积为0.5mL，含有140mM的NaCl。
7)在4℃下将组合疫苗贮存至少2周的时间，然后再将其用于免疫原性效力的试验。组合疫苗中磷酸铝和氢氧化铝佐剂的比率(以Al3+的相对数量表示)为1.7∶1。
DT、TT、PT、FHA、PRN、HbsAg、IPV、以及Hib分别在pH值6.1±0.1、6.1±0.1、6.1±0.1、6.1±0.1、6.1±0.1、5.5±0.1、6.1±0.1、以及5.1±0.1下吸附到它们各自的佐剂上。
实施例3：用‘杂合的(hybrid)全磷酸铝/轻磷酸铝’方法制备疫苗制剂
制备DTPa-Hib-HBsAg-IPV组合疫苗的方法如下(其数量是根据比例确定的，代表了一个剂量的疫苗)：
1)预先将25Lf DT、25μg PT、25μg FHA以及8μg PRN分别吸附于0.1、0.05、0.05、以及0.05mg Superfos氢氧化铝上，然后与40/8/32 DU的未经佐剂处理的IPV(分别指1/2/3型)相混合。
2)预先将10Lf TT以及10μg HBsAg分别吸附于0.25以及0.2mg未经清洗的Superfos磷酸铝(以Al3+的数量表示)上，然后与步骤1)的混合物相混合，在室温下搅拌15分钟以上。
3)调整混合物使其中的阳离子缓冲物L-组氨酸一水化物/一氯化物的浓度达10mM。在室温下搅拌15分钟以上，然后将pH值调整为6.1±0.1。组氨酸的pKa值与所需的最终pH值6.1是很接近的，而且因为它的阳离子特性，它并不激发抗原的解吸。
4)将5mg/mL 2-苯氧基乙醇加入到混合物中并在室温下将其搅拌60分钟以上。
5)检查混合物的pH值是否为6.1±0.1(介于6和7之间，如国际卫生组织对DT和DTP疫苗所规定的)。最终的混合物体积为0.5mL，含有140mM的NaCl。
6)在4℃下将组合疫苗贮存至少3周的时间，然后再将其用于免疫原性效力的试验。
7)将10μg Hib(PRP与破伤风类毒素缀合)临时加入到步骤6)的产物中。
DT、TT、PT、FHA、PRN以及HbsAg分别在pH值6.1±0.1、5.7±0.1、6.1±0.1、6.1±0.1、6.1±0.1以及5.5±0.1下吸附到它们各自的佐剂上。实施例4：使用‘改良的(adapted)全磷酸铝/轻度氢氧化铝’方法制备疫苗制剂
制备DTPa-Hib-HBsAg-IPV组合疫苗的方法如下(其数量是根据比例确定的，代表了单一剂量的疫苗)：
1)将25Lf DT吸附于0.15mg未经清洗的(正常的)Superfos磷酸铝(以Al3+的数量表示)上。将上述产物加入到0.1mg Superfos氢氧化铝中，在室温下搅拌30分钟以上。将pH值调整到6.1±0.1。
2)预先将25μg PT、25μg FHA以及8μg PRN分别吸附于0.05、0.05、以及0.05mg Superfos氢氧化铝上，然后与步骤1)中的DT以及40/8/32 DU的未经佐剂处理的IPV(分别指1/2/3型)相混合。
3)预先将10Lf TT以及10μg HBsAg分别吸附于0.1以及0.2mg未经清洗的(正常的)Superfos磷酸铝(以A13+的数量表示)上，然后与步骤2)的混合物相混合，在室温下搅拌15分钟以上。
4)调整混合物使其中的阳离子缓冲物L-组氨酸一水化物/一氯化物的浓度达10mM，将pH值调整为6.1±0.1。组氨酸的pKa值与所需的最终pH值6.1是很接近的，而且因为它的阳离子特性，它并不激发抗原的解吸。
5)将5mg/mL 2-苯氧基乙醇加入到混合物中并在室温下将其搅拌60分钟以上。
6)检查混合物的pH值是否为6.1±0.1(介于6和7之间，如国际卫生组织对DT和DTP疫苗所规定的)。最终的混合物体积为0.5mL，含有140mM的NaCl。
7)在4℃下将组合疫苗贮存至少3周的时间，然后再将其用于免疫原性效力的试验。
8)将10μg Hib(PRP与破伤风类毒素缀合)临时加入到步骤7)的产物中。
DT、TT、PT、FHA、PRN以及HbsAg分别在pH值5.4±0.1、5.7±0.1、6.1±0.1、6.1±0.1、6.1±0.1以及5.3±0.1下吸附到它们各自的佐剂上。实施例5：组合疫苗临床试验中干扰的测量
下面的临床试验证实了含有DTPa(常规地吸附于过量的氢氧化铝上)以及Hib的组合疫苗在抗-PRP抗体滴度上所遇到的问题。
最初，用3剂量的组合疫苗对血清学反应阴性的健康婴儿自愿者进行免疫，免疫的时间表如下所示。应答被定义为受治对象的抗体滴度显著高于背景水平。滴度以mIU/mL表示。
以下的结果被表示为几何平均滴度(GMT)，单位为mIU/mL。对于抗-PRP而言，括号中的数字表示其GMT高于1.0的个体的％。结果显示可以用‘全磷酸铝’方法来减轻Hib干扰问题同时又不影响组合疫苗中其它抗原的效力。
表1：
组合 PT  FHA  PRN  DT  TT  HBsAg  Hib的PRP
DTPa+Hib* 47.7(100) 182.5(100) 130.8(100) 1.32(100) 1.21(100) NA 6.09(94.4)
DTPaHepB/Hib** 27.0(100) 137.7(100) 101.7(100) 0.98(100) 1.45(100) 141.4(94.4) 0.95(50.0)
DTPaHepB/Hib*** 78.3(100) 247.5(100) 112.2(100) 1.73(100) 1.74(100) 74.6(90.0) 5.01(95.0)
DTPaHepB/Hib+ 47.2(100) 210.8(100) 152.6(100) 1.82(100) 1.64(100) 454.5(96.2) 3.1(80.8)
DTPaHepB/Hib++ 96(100) 176.1(100) 281.5(100) 2.97(100) 3.1(100) 590.5(92.3) 9.67(96.2)
*-PRP(Hib)抗体滴度的参考值-一方面为DTPa，另一方面为HiberixTM(未经佐剂处理的PRP与破伤风类毒素)(Smith Kline Beecham Biologicals)。将DTPa吸附于500μg/mL的氢氧化铝上。
**-DTPaHepB与HiberixTM组合。将冻干的Hib临时与DTPa-HepB疫苗重构。将DTPa吸附到1000μg/mL氢氧化铝上。HepB-将HBsAg吸附于磷酸铝上然后与DTPa相结合，如WO 93/24148中所述。
***-将‘全磷酸铝’方法用于未经佐剂处理的Hib。使用实施例1中的方法(除没有加入Hib以外)将DTPa-HepB吸附在磷酸铝上(除pertactin吸附在氢氧化铝上以外)。将冻干的未经佐剂处理的Hib(HiberixTM)临时与上面所得的DTPa-HepB疫苗进行重构。
以上的三组实验是对一组18个人进行。个体在3个月大、4个月大、以及5个月大时分别接种0.5mL剂量的疫苗。+-DTPaHepB与HiberixTM相结合。将冻干的Hib与DTPa-HepB疫苗临时进行重构。将DTPa吸附于500μg/mL的氢氧化铝上。HepB-将HbsAg吸附于磷酸铝上然后再与DTPa相结合，如WO 93/24148中所描述的。++-将‘全磷酸铝’方法用于未经佐剂处理的Hib。使用实施例1的方法(除没有加入Hib以外)将DTPa-HepB吸附于磷酸铝上(除pertactin是吸附于氢氧化铝上的以外)。将冻干的未经佐剂处理的Hib(HiberixTM)与如上所获得的DTPa-HepB疫苗临时进行重构。
以上的两组实验是在土耳其对一组30个人进行。个体在3个月大、4个月大、以及5个月大时分别接种0.5mL剂量的疫苗。
实施例6：‘轻氢氧化铝’和‘全氢氧化铝’制剂的小鼠百日咳肺清除活性
对没有Hib的‘轻氢氧化铝’和‘全氢氧化铝’制剂在配制之后马上进行测定以检测它们与商品化的DTPa疫苗制剂(INFANRIXTM-SmithKline Beecham Biologicals)相比的百日咳小鼠肺清除活性。评估未经佐剂处理的Hib加入到配方中后对活性的影响。
化验是按照二剂量免疫接种计划进行的(使用四分之一人剂量)。用百日咳杆菌感染已经经过免疫的小鼠，在攻击后随着时间测定细菌的CFU/肺。
结果如图1所示。百日咳动物感染数据显示，与以前的传统的DTPa制剂相比，使用“轻氢氧化铝”和“全磷酸铝”制剂(含有或不合有未经佐剂处理的Hib)时百日咳肺清除活性是等同的。实施例7：用“轻氢氧化铝”和“全磷酸铝”制剂对幼年大鼠Hib免疫原性进行研究
用一个幼年大鼠模型来评估“轻氢氧化铝”和“全磷酸铝”疫苗制剂中的Hib成分的免疫原性。实验采用1/10人剂量的(50μL注射液)，按照0-14-28天计划(出生7天以后开始)进行皮下注射，在第42天采集血样。评估每组中的24-30只动物。吸附于磷酸铝上的Hib在实验的两周前加入，或者临时加入到制剂(实施例1和2中的“液体”制剂)之中。测定抗PRP的几何平均数抗体值(GMT)。
结果显示“轻氢氧化铝”和“全磷酸铝”制剂(以“液体”制剂的形式或者以临时配制的制剂的形式)的PRP滴度，与施用了吸附于磷酸铝上的单价Hib之后所测定的滴度相比，是等同的或者至多是最低限度地受到干扰。实施例8：“额外清洗的磷酸铝佐剂”的制备
为了清洗磷酸铝，采取以下步骤：在3500rpm离心磷酸铝溶液10分钟，收集上清液。将沉淀用150mM NaCl重悬。重复以上步骤至少3-4次。将所得到的沉淀通过100微米过滤器过滤(以除去潜在的聚集物)。通过高压灭菌对磷酸铝进行消毒。将无菌的佐剂储存于4℃备用。经过额外清洗并高压灭菌的磷酸铝在室温下可以保持至少45天的稳定。
在这一步骤中使用了Superfos磷酸铝。由厂商提供的产品含有总共5mM磷酸根离子。当彻底清洗时，游离磷酸根浓度可以降至低于0.5mM，如果清洗过的溶液在37℃下保存7天，该值则上升到1mM。如果对清洗过的磷酸铝随后又进行高压灭菌，游离磷酸盐的浓度可以上升到2.0-3.0mM。
结果；
磷酸铝的清洗对抗原吸附的影响如表Ⅱ所示。(H=小时，RT=室温)
表Ⅱ
    抗原(吸附的)     剂量(单位/mg铝) 吸附时间 佐剂状态 上清中液的[PO4]   吸附％
    DT  25Lf/0.25 室温48小时pH5.1 未经清洗     4.5mM     70
    DT  25Lf/0.25 室温24小时pH5.1     清洗     0.5mM     93
    DT  25Lf/0.25 室温24小时pH5.1     清洗并高压灭菌     1.8mM     90
    TT  10Lf/0.10 室温48小时pH5.7 未经清洗     4.5mM     84
    TT  10Lf/0.10 室温24小时pH5.7     清洗并高压灭菌     1.8mM     99
    Hib[于TT上] 10μg/0.12 室温16小时pH5.1 没有清洗     4.5mM     92
    Hib[于TT上] 10μg/0.12 室温16小时pH5.1     清洗并高压灭菌     1.8mM     100
    HBsAg  10μg/0.02 室温48小时pH5.5     清洗     0.33mM    97.4
    HBsAg  10μg/0.02 室温48小时PH5.5     清洗并高压灭菌     0.85mM    96.7
    HBsAg  10μg/0.02 室温48小时pH5.5 未经清洗     1.73mM    95.6
    HBsAg  10μg/0.02 室温48小时pH5.5.     加入PO4     6.66mM    85.3
从以上结果可以看到，使用经过额外清洗的磷酸铝改善了所有抗原，特别是DT和TT，的吸附。同时还可以看出，在吸附过程中加入游离的磷酸根离子可导致HBsAg的吸附显著减少。实施例9：未经吸附的抗原和游离的磷酸根对PRN解吸的影响
如以上所描述的，为了在pH6.1下稳定地吸附抗原(并保持其效力)，PRN应该被吸附于氢氧化铝上。当处理小剂量的佐剂时(以用抗原对其进行预饱和处理)，重要的是检测组合疫苗中抗原的稳定性，以确定氢氧化铝在该组合物的情形中是否是过饱和的。以下表格表示将预吸附于氢氧化铝上的PRN(每10微克或50微克Al3+有8微克)与一剂量的非预吸附的抗原(或磷酸铝)在4℃或37℃，pH6.1下混合7天的结果。最终抗原的浓度与它们在典型组合疫苗中的浓度是相当的。使用ELISA测定PRN在上清液中的百分含量；测定上清液和沉淀中的PRN(使用500mM的磷酸根阴离子去吸附PRN并测定释放下来的PRN的量)。然后计算百分含量。
表Ⅲ
继发抗原(未经吸附的) 上清液中PRN％10μg铝-4℃ 上清液中PRN％10μg铝-37℃ 上清液中PRN％50μg铝-4℃ 上清液中PRN％50μg铝-37℃
    PRN     ＜0.1     /     /     /
    PT     ＜0.1     ＜0.1     /     /
    FHA     ＜0.1     ＜0.1     /     /
    HBsAg     3.8     0.2     /     /
    Hib     4.4     62     0.4     0.3
    IPV     7.5     56     ＜0.1     1.6
    TT     5.2     62     /     /
    DT     28     80     /     /
 1mg/mL未经清洗的AlPO4     /     44     /     /
如表中所示，在组合疫苗的情形中，当用8μg PRN对10μg的氢氧化铝进行处理时，氢氧化铝过度饱和，当使用50μg的佐剂时，氢氧化铝是稳定的。
同时，游离磷酸铝的影响也显示导致了一些PRN的解吸。使用额外清洗的磷酸铝可以限制这种影响。

Claims (27)

1．一种用于减少在含有DTPa的组合疫苗中的缀合B型流感嗜血杆菌疫苗(Hib)的荚膜多糖成分的干扰作用的方法，其中上述的方法包括：
(ⅰ)选择要吸附到氢氧化铝佐剂上的一种或多种抗原；
(ⅱ)用所选定的抗原对氢氧化铝佐剂进行预饱和处理；
(ⅲ)选择Hib以及一种或多种另外的要吸附到磷酸铝上的抗原；
(ⅳ)将Hib以及上述的另外的抗原吸附到磷酸铝上；
(ⅴ)组合上述疫苗中的所有抗原。
2．如权利要求1中所述的方法，其中吸附于磷酸铝上的Hib是临时与组合疫苗中的其它抗原相混合的。
3．如权利要求1至2中所述的方法，其中组合疫苗另外还包含一种或多种选自以下集合的抗原：乙肝表面抗原(HBsAg)、灭活的甲肝病毒、灭活的骨髓灰质炎病毒、A型脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖、C型脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖、肺炎链球菌荚膜多糖、肺炎链球菌蛋白、粘膜炎莫拉菌外膜蛋白、不可分型的流感嗜血菌外膜蛋白、B型脑膜炎奈瑟氏球菌外膜蛋白。
4．如权利要求3中所述的方法，其中组合疫苗包括吸附于磷酸铝上的乙肝表面抗原。
5．如权利要求1至4中任一所述的方法，其中组合疫苗中磷酸铝与氢氧化铝佐剂的比率介于1∶1至20∶1之间。
6．如权利要求1至5中任一所述的方法，其中组合疫苗中所有的抗原被吸附于磷酸铝上，其条件是pertactin被吸附于氢氧化铝上。
7．如权利要求6中所述的方法，其中吸附于氢氧化铝上的pertactin被与未经吸附的灭活骨髓灰质炎病毒抗原相混合，然后再与吸附于磷酸铝上的抗原相结合。
8．如权利要求1至5中任一所述的方法，其中组合疫苗中所有的抗原被吸附于氢氧化铝上，其条件是HBsAg和Hib被吸附于磷酸铝上。
9．如权利要求8中所述的方法，其中吸附到氢氧化铝上的抗原是在吸附到磷酸铝上的HBsAg抗原加入之前结合的，吸附于磷酸铝上的Hib是在HBsAg抗原加入之后再结合的。
10．如权利要求8至9任一所述的方法，其中在组合疫苗中加入了另加的游离磷酸铝。
11．一种用于减少在含有DTPa的组合疫苗中的缀合B型流感嗜血杆菌疫苗(Hib)的荚膜多糖成分的干扰作用的方法，其中上述的方法包括：
(ⅰ)选择要吸附到氢氧化铝佐剂上的一种或多种抗原；
(ⅱ)用所选定的抗原对氢氧化铝佐剂进行预饱和处理；
(ⅲ)选择一种或多种另外的要吸附到磷酸铝上的抗原；
(ⅳ)将上述的另外的抗原吸附到磷酸铝上；
(ⅵ)将上述疫苗中的所有抗原与未经佐剂处理的Hib相结合。
12．一种用于减少在含有DTPa的组合疫苗中的缀合B型流感嗜血菌疫苗(Hib)的荚膜多糖成分的干扰作用的方法，其中上述的方法包括：
(ⅰ)选择要吸附到氢氧化铝佐剂上的一种或多种抗原；
(ⅱ)用所选定的抗原对氢氧化铝佐剂进行预饱和处理；
(ⅲ)选择一种或多种另外的要吸附到磷酸铝上的抗原；
(ⅳ)将上述的另外的抗原吸附到磷酸铝上；
(ⅴ)结合上述疫苗中的所有抗原；
(ⅵ)临时加入未经佐剂处理的Hib或者吸附于磷酸铝上的Hib。
13．如权利要求12中所述的方法，其中组合疫苗另外还包含一种或多种选自以下集合的抗原：乙肝表面抗原(HBsAg)、灭活的甲肝病毒、灭活的骨髓灰质炎病毒、A型脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖、C型脑膜炎奈瑟氏球菌荚膜多糖、肺炎链球菌荚膜多糖、肺炎链球菌蛋白、粘膜炎莫拉菌外膜蛋白、不可分型流感嗜血菌外膜蛋白、B型脑膜炎奈瑟氏球菌外膜蛋白。
14．如权利要求13中所述的方法，其中组合疫苗包括吸附于磷酸铝上的乙肝表面抗原。
15．如权利要求12至14中任一所述的方法，其中组合疫苗中磷酸铝与氢氧化铝佐剂的比率介于1∶1至20∶1之间。
16．如权利要求12至15中任一所述的方法，其中组合疫苗中所有的抗原被吸附于磷酸铝上，其条件是pertactin被吸附于氢氧化铝上，而且Hib是以未经佐剂处理的形式或者是以吸附于磷酸铝上的形式加入的。
17．如权利要求16中所述的方法，其中吸附于氢氧化铝上的pertactin与未经吸附的灭活的骨髓灰质炎病毒抗原相混合，然后再与吸附于磷酸铝上的抗原相结合。
18．如权利要求12至15中任一所述的方法，其中组合疫苗中所有的抗原被吸附于磷酸铝上，其条件是pertactin、白喉类毒素、百日咳类毒素、和细丝状血细胞凝集素被吸附于氢氧化铝上，而且Hib是以未经佐剂处理的形式或者是以吸附于磷酸铝上的形式加入的。
19．如权利要求18中所述的方法，其中吸附到氢氧化铝上的pertactin、白喉类毒素、百日咳类毒素、和细丝状血细胞凝集素是在与吸附于磷酸铝上的抗原相结合之前与未经吸附的灭活的骨髓灰质炎病毒相结合的。
20．如权利要求12至15中任一所述的方法，其中组合疫苗中的所有抗原都是被吸附于氢氧化铝上的，其条件是HBsAg被吸附于磷酸铝上，而且Hib是以未经佐剂处理的形式或者是以吸附于磷酸铝上的形式加入的。
21．如权利要求20中所述的方法，其中吸附于氢氧化铝上的抗原是在吸附于磷酸铝上的HBsAG抗原加入之前结合在一起的。
22．如权利要求20至21中任一所述的方法，其中另外的游离磷酸铝是在临时加入未经佐剂处理的Hib之前加入到组合疫苗中的。
23．如权利要求12至22中任一所述的方法，其中被选择用于对氢氧化铝进行预饱和处理的一种或多种抗原已经事先被吸附于磷酸铝上。
24．如权利要求23中所述的方法，其中吸附于磷酸铝上的白喉类毒素是被选择用于对氢氧化铝进行预饱和处理的抗原之一。
25．如权利要求1至24中任一所述的方法，其中组合疫苗是用L-组氨酸缓冲的。
26．用权利要求1至25中任一权利要求的方法获得的组合疫苗。
27．一种对白喉、破伤风、百日咳、以及B型流感嗜血杆菌型进行免疫接种的方法，包括施用药理学上有效量的如权利要求26中所述的组合疫苗。
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