CN111000994A - 一种液体疫苗组合物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种液体疫苗组合物，其中包括：白喉类毒素，破伤风类毒素，百日咳毒素，丝状血凝素，百日咳杆菌黏附素，灭活的I型脊髓灰质炎病毒Sabin毒株，灭活的II型脊髓灰质炎病毒Sabin毒株，灭活的III型脊髓灰质炎病毒Sabin毒株，b型流感嗜血杆菌荚膜多糖‑蛋白结合物。本发明提供的液体疫苗组合物避免了冻干工艺引入的安全性风险及产能的限制，同时避免了冻干疫苗在免疫接种前需进行的繁琐的复溶过程，降低了生产和使用的成本。进一步而言，本发明提供的疫苗组合物可以用于基础免疫或加强免疫，可以在确保安全性的基础上提高被免疫者血清中抗体的滴度。

Description

一种液体疫苗组合物及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及疫苗领域，具体涉及一种能够同时预防百日咳、白喉、破伤风、脊髓灰质炎以及b型流感嗜血杆菌的一种液体疫苗组合物。

背景技术

及时进行疫苗接种是有效的预防保护性措施。百日咳、白喉和破伤风联合疫苗(DTP)作为最早纳入WHO扩大免疫计划(EPI)的疫苗，已经在预防和控制这三种传染病方面发挥了重要作用。20世纪70年代，由于接种全细胞百白破疫苗(DTwP)后出现了严重的不良反应，日本及荷兰等国家出现了抵制疫苗接种及停用的现象，导致接种率下降，致使百日咳的发病率出现反弹。目前，绝大多数发达国家均通过共纯化或层析纯化制成副反应较小的无细胞百白破疫苗(DTaP)，作为基础的联合疫苗和常规免疫用疫苗。无细胞百日咳疫苗从生产工艺来讲可分为共纯化疫苗和层析纯化疫苗。目前中国和日本部分企业采用的是共纯化工艺，即细菌培养后，盐析沉淀PT、FHA及PRN等保护性抗原，然后用蔗糖密度梯度离心去除杂质，同时收集富含PT、FHA和PRN的有效成分。层析纯化是采用柱层析将不同的保护性抗原分别纯化，然后再将各抗原定量配比成疫苗。分离纯化法的成本较高，但优点是成分明确，容易进行质量控制，副作用更小。目前大多数发达国家均采用柱层析分离纯化各组份来生产无细胞百日咳疫苗。

脊髓灰质炎(WPV)是由脊髓灰质炎病毒I、II、III型引起的传播广泛且危害极大的急性传染病,能侵袭任何年龄段人群,但主要是3岁以下的儿童(占所有病例的50％),严重造成肢体不可逆转的麻痹甚至死亡。在疫苗问世前,该病在全世界范围内流行。50年代中后期,美国的两位科学家Salk和Sabin先后研制成功脊髓灰质炎灭活疫苗(InactivatedPoliovirus Vaccine，简称IPV)和口服脊髓灰质炎减毒活疫苗(Oral PoliovirusVaccine，简称OPV)。从此人们有了预防和消灭脊髓灰质炎的有力武器,实践证明这两种疫苗都是有效的。世界卫生组织(World Health Organization，WHO)1988年发起全球范围内消灭脊髓灰质炎的倡议，此后，消灭脊髓灰质炎的活动在降低脊髓灰质炎的发病率和减少脊髓灰质炎病毒的传播范围方面都取得了重大进展。2007年1月～2008年6月，16个国家从AFP病例的粪便标本中检测到野毒株(WPV),只检测到WPVI型和WPVIII型，自1999年以来在全球范围内未检测到WPVII型,这些进步的取得归功于全世界共同实施的消灭脊髓灰质炎策略。在全球消灭脊髓灰质炎(WPV)行动中,口服脊髓灰质炎减毒活疫苗(OPV)得到广泛应用，已大幅度降低全球脊髓灰质炎的发病率。然而，由于疫苗相关麻痹型脊髓灰质炎(Vaccine Associated Paralytic Poliomyelitis，VAPP),和疫苗衍生脊髓灰质炎病毒(Vaccine-derived Poliovirus，VDPV)风险，今后必须停止口服脊髓灰质炎减毒活疫苗OPV的使用，以彻底根除脊髓灰质炎。只有使用脊髓灰质炎灭活疫苗IPV才能避免VAPP和VDPV风险。脊髓灰质炎灭活疫苗可预防脊髓灰质炎IPV爆发,并能产生群体免疫力，是消灭脊髓灰质炎后续阶段的最佳选择。目前全球有生产厂商在生产IPV，但所使用的生产毒种均为野毒株。用野毒株生产IPV需达到生物安全水平3级(BSL-3)的要求,全世界消灭脊髓灰质炎后,甚至BSL-4的条件亦非绝对保证。对于疫苗生产厂家难以达到如此严格的生物安全要求，目前国内批准上市的DTaP-IPV/Hib联合疫苗仅有SanofiPasteur(SP)公司生产的PentaximTM，在该联合疫苗中，IPV疫苗选用的毒株为Salk株，但Salk株属于强野毒株，毒性较强，因而WHO鼓励疫苗生产厂家研发减毒株脊髓灰质炎灭活疫苗Sabin IPV(InactivatedPoliovirus Vaccine，Sabin strain，简称sIPV)。迄今为止，全球已上市的多价次联合疫苗中，IPV选用的毒株大多为Salk株。因此，开发安全性和稳定性更高的含有sIPV的联合疫苗具有重要意义。

流感嗜血杆菌(Haemophilus Influenza，Hi)迄今仍是导致人类侵袭性疾病的主要致病菌，其中绝大部分又b型流感嗜血杆菌(Haemophilus Influenza type b，Hib)引起。Hib脑膜炎居细菌性脑膜炎的首位，具有发病率高、病死率高和致残率高的特点；其另一个特点是发病年龄小，婴幼儿感染率高，发病年龄主要集中在5岁以下，尤其是2岁以下。全世界估计每年至少造成300万例严重疾病，其中约38.6万人死亡，已成为全球性的一大公共卫生问题。在发展中国家，Hib肺炎在儿童感染性疾病中占有重要地位，约占所有儿童肺炎的20％，是发展中国家儿童肺炎的重要死亡原因。上世纪90年代初，西欧、美国等国家将Hib结合疫苗纳入常规儿童免疫规划，Hib侵扰性疫病的发病率迅速降低或消失。目前，世界卫生组织(WHO)正致力于推动将其纳入其他国家的计划免疫程序中。在我国，3～5岁儿童中Hib自然感染抗体水平低，为Hib感染高危人群。我国医院临床研究提示，Hib脑膜炎在小儿化脓性脑膜炎中占51.7％，其中84％为2岁以下儿童；儿童中Hib肺炎占34.3％，因此我国急需解决Hib结合疫苗接种的必要性。

由于流行病分布的差异及研究难度的限制，目前国内外在研制中的相近产品中Hib组分仍采用冻干工艺制备相对应的联合疫苗；面前市售冻干疫苗在免疫接种前均需复溶，复溶过程繁琐；同时基于冻干工艺引入的安全性风险及产能的限制，所以进行吸附无细胞百白破-脊髓灰质炎病毒灭活疫苗-b型流感嗜血杆菌(结合)液体联合疫苗的研究，具有良好的社会价值和经济价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够同时预防百日咳、白喉、破伤风、脊髓灰质炎以及b型流感嗜血杆菌的液体疫苗组合物。

上述5种传染病至今仍是导致婴幼儿死亡的重要原因，而且纳入国家EPI，接种完毕需要注射12次(百白破：3次基础免疫+1次加强免疫；脊髓灰质炎：3次基础免疫+1次加强免疫；b型流感嗜血杆菌：3次基础免疫+1次加强免疫)。为了改进接种次数繁多，避免错接种漏接种，本发明提供的液体疫苗组合物能同时预防上述传染病的液体疫苗组合物，按照接种程序，共接种4次(基础免疫3次，加强免疫1次)。大大降低了接种的工作量和孩童的负担。

具体而言，本发明提了一种液体疫苗组合物，所述组合物为液体，其中包含：白喉类毒素，破伤风类毒素，百日咳毒素，丝状血凝素，百日咳杆菌黏附素，灭活的I型脊髓灰质炎病毒Sabin毒株，灭活的II型脊髓灰质炎病毒Sabin毒株，灭活的III型脊髓灰质炎病毒Sabin毒株，b型流感嗜血杆菌荚膜多糖-蛋白结合物。

本发明还提供了一种液体疫苗组合物，所述组合物为液体，其中的抗原由如下物质组成：白喉类毒素，破伤风类毒素，百日咳毒素，丝状血凝素，百日咳杆菌黏附素，灭活的I型脊髓灰质炎病毒Sabin毒株，灭活的II型脊髓灰质炎病毒Sabin毒株，灭活的III型脊髓灰质炎病毒Sabin毒株以及b型流感嗜血杆菌荚膜多糖-蛋白结合物。

本发明根据Sabin毒株具有安全性高的优势，为保证Sabin毒株的免疫原性，同时尽量避免其与联合疫苗中的其他抗原的干扰作用，本发明所述组合物中，I型、II型和III型Sabin株脊髓灰质炎病毒的抗原比例优选为(4～15)：(11～45)：(11～45)。作为本发明的一种具体优选方案，每0.5mL的所述液体疫苗组合物中包括如下组分：I型Sabin株脊髓灰质炎病毒4～15DU，II型Sabin株脊髓灰质炎病毒11～45DU，III型Sabin株脊髓灰质炎病毒11～45DU。本发明通过实验发现，当液体疫苗组合物中I型、II型和III型Sabin株脊髓灰质炎病毒的抗原比例为1：(2.5～3.5)：(2.5～3.5)时，液体疫苗组合物整体具有最佳的免疫效果。

本发明所述b型流感嗜血杆菌荚膜多糖-蛋白结合物由b型流感嗜血杆菌荚膜多糖与生理学可接受载体蛋白缀合而成。所述生理学可接受的载体蛋白选自白喉类毒素、白喉毒素无毒变异体CRM197、破伤风类毒素、脑膜炎球菌外膜蛋白中的一种或多种。

本发明提供的疫苗组合物在含有上述抗原原液的基础上，还可以包含铝佐剂、可溶性磷酸盐缓冲液、氯化钠、稳定剂中的一种或多种。具体而言，所述疫苗组合物中可以包含佐剂，如含氢氧化铝和/或磷酸铝的佐剂；本发明经实践发现，当铝含量为0.3～1.25mg/ml、优选为0.4～0.8mg/ml时，可以在确保液体疫苗组合物安全性的同时，使各型抗原的效价均在较高的质量标准。所述疫苗组合物中还可以添加一定量的可溶性磷酸盐缓冲液用以维持pH值在合理的范围内(如pH5.8～7.2)，还可以添加一定量的氯化钠或等效的物质用以维持渗透压。所述稳定剂可以选用维生素和/或氨基酸，优选为氨基酸；本发明发现在液体组合物中加入氨基酸，可以明显提高b型流感嗜血杆菌多糖-蛋白结合物在液体制剂中的稳定性，从而提高液体组合物整体的稳定性。所述稳定剂还可以同时选用M199培养基；本发明经实践发现，当所述联合疫苗中添加5％～20％的10X的M199培养基浓缩液时，脊髓灰质炎病毒抗原的稳定性显著提高，从而对液体疫苗组合物整体的稳定性有重要作用。

作为本发明的一种优选方案，所述液体疫苗组合物包含如下组分：

本发明提供的液体疫苗组合物既可用于基础免疫，也可以用于加强免疫。

本发明通过大量实践发现，当对所述组合物中所含有的百日咳毒素、丝状血凝素、百日咳杆菌黏附素的比例和用量进行优化调整时，可以在确保安全性的基础上，使疫苗组合物更进一步地满足基础免疫或加强免疫的需要。

本发明所述液体疫苗组合物用于制备基础免疫疫苗时，所述组合物中所含有的百日咳毒素、丝状血凝素、百日咳杆菌黏附素的质量比优选为(20～25)：(20～25)：(3～8)。作为一种优选方案，每0.5ml单剂量所述组合物中含有百日咳毒素20～25μg，丝状血凝素20～25μg，百日咳杆菌黏附素3～8μg。进一步优选地，每0.5ml单剂量所述组合物中含有百日咳毒素25μg，丝状血凝素25μg，百日咳杆菌黏附素8μg。

作为本发明的一种优选方案，所述液体疫苗组合物可以用于基础免疫，每0.5ml单剂量所述组合物中含有如下组分：

本发明所述液体疫苗组合物用于制备加强免疫疫苗时，所述组合物中所含有的百日咳毒素、丝状血凝素、百日咳杆菌黏附素的质量比优选为(2.5～8)：(5～8)：(2.5～3)。作为一种优选方案，每0.5ml单剂量所述组合物中含有百日咳毒素2.5～8μg，丝状血凝素5～8μg，百日咳杆菌黏附素2.5～3μg。进一步优选地，每0.5ml单剂量所述组合物中含有百日咳毒素8μg，丝状血凝素8μg，百日咳杆菌黏附素2.5μg。

作为本发明的一种优选方案，所述液体疫苗组合物可以用于加强免疫，每0.5ml单剂量所述组合物中含有如下组分：

本发明同时提供了制备所述液体疫苗组合物的方法。

所述方法具体包括如下步骤：将包括百日咳毒素、丝状血凝素、百日咳杆菌黏附素、白喉类毒素原液、破伤风类毒素原液、灭活的I型Sabin株脊髓灰质炎病毒原液、灭活的II型Sabin株脊髓灰质炎病毒原液、灭活的III型Sabin株脊髓灰质炎病毒原液、b型流感嗜血杆菌多糖-蛋白结合物原液在内的液体原料混合。本发明提供的组合物为液体制剂，其中各种原料也以液体的形式制备，然后直接混合。

将所述液体原料混合后，进一步加入佐剂、可溶性磷酸盐缓冲液、氯化钠、稳定剂等物质，可以获得稳定、适于人体使用的液体疫苗组合物。

本发明保护所述液体疫苗组合物在制备基础免疫疫苗中的应用。

本发明保护所述液体疫苗组合物在制备加强免疫疫苗中的应用。

本发明提供一种疫苗试剂盒，包括第一室和第二室；所述第一室中含有由上述液体疫苗组合物制备而成的基础免疫疫苗；所述第二室中含有由上述液体疫苗组合物制备而成的加强免疫疫苗。

本发明提供一种疫苗试剂盒，包括第一室、第二室和第三室；所述第一室和第二室中各自含有由上述液体疫苗组合物制备而成的基础免疫疫苗；所述第三室中含有由上述液体疫苗组合物制备而成的加强免疫疫苗。

本发明提供一种疫苗试剂盒，包括第一室、第二室、第三室和第四室；所述第一室、第二室和第三室中各自含有由上述液体疫苗组合物制备而成的基础免疫疫苗；所述第四室中含有由上述液体疫苗组合物制备而成的加强免疫疫苗。

在实际接种时，采用本发明提供的疫苗试剂盒，可以高效完成疫苗接种，避免错接种或漏接种。例如：使用试剂盒中第一室(或依次使用第一室和第二室，或依次使用第一室、第二室和第三室)内的基础免疫疫苗进行基础免疫，再使用试剂盒中第二室(或第三室，或第四室)内的加强免疫疫苗进行加强免疫。

与现有技术相比，本发明提供的疫苗组合物为液体制剂，在制备、运输、储存、使用的各个环节可维持液体制剂性质的稳定，避免了冻干工艺引入的安全性风险及产能的限制，同时避免了冻干疫苗在免疫接种前需进行的繁琐的复溶过程，降低了生产和使用的成本。进一步而言，本发明提供的疫苗组合物可以用于基础免疫或加强免疫，可以在确保安全性的基础上提高被免疫者血清中抗体的滴度。

附图说明

图1为实施例8所述免疫程序sIPV的I型、II型、III型中和抗体滴度检定结果；

图2为实施例8所述免疫程序百日咳(aP)抗体滴度检定结果；其中，aP-PT代表百日咳毒素，aP-FHA代表丝状血凝素，aP-PRN代表百日咳杆菌黏附素；

图3为实施例8所述免疫程序白喉(DT)、破伤风(TT)抗体滴度检定结果；

图4为实施例8所述免疫程序Hib抗体滴度检定结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1

本实施例提供了一种液体疫苗制剂，每1人次用量包含如下组分：

百日咳毒素8μg，丝状血凝素8μg，百日咳杆菌黏附素2.5μg，白喉类毒素2Lf，破伤风类毒素5Lf，灭活的I型脊髓灰质炎病毒原液7.5DU，灭活的II型脊髓灰质炎病毒原液22.5DU，灭活的III型脊髓灰质炎病毒原液22.5DU，b型流感嗜血杆菌多糖-蛋白结合物10μg，铝含量0.6mg/ml，氯化钠水溶液适量，磷酸盐缓冲液调pH值至5.8～7.2。疫苗中还可以添加适量的稳定剂，如M199培养基和/或氨基酸。

本实施例提供的液体疫苗制剂可以用于加强免疫。

实施例2

本实施例提供了一种液体疫苗制剂，每1人次用量包含如下组分：

百日咳毒素8μg，丝状血凝素8μg，百日咳杆菌黏附素2.5μg，白喉类毒素2Lf，破伤风类毒素5Lf，灭活的I型脊髓灰质炎病毒原液15DU，灭活的II型脊髓灰质炎病毒原液45DU，灭活的III型脊髓灰质炎病毒原液45DU，b型流感嗜血杆菌多糖-蛋白结合物15μg，铝含量0.8mg/ml，氯化钠水溶液适量，磷酸盐缓冲液调pH值至5.8～7.2。疫苗中还可以添加适量的稳定剂，如M199培养基和/或氨基酸。

本实施例提供的液体疫苗制剂可以用于加强免疫。

实施例3

本实施例提供了一种液体疫苗制剂，每1人次用量包含如下组分：

百日咳毒素25μg，丝状血凝素25μg，百日咳杆菌黏附素8μg，白喉类毒素12.5Lf，破伤风类毒素3.5Lf，灭活的I型脊髓灰质炎病毒原液15DU，灭活的II型脊髓灰质炎病毒原液45DU，灭活的III型脊髓灰质炎病毒原液45DU，b型流感嗜血杆菌多糖-蛋白结合物10μg，铝含量0.8mg/ml，氯化钠水溶液适量磷酸盐缓冲液调pH值至5.8～7.2。疫苗中还可以添加适量的稳定剂，如M199培养基和/或氨基酸。

本实施例提供的液体疫苗制剂可以用于基础免疫。

实施例4

本实施例提供了一种液体疫苗制剂，每1人次用量包含如下组分：

百日咳毒素25μg，丝状血凝素25μg，百日咳杆菌黏附素8μg，白喉类毒素12.5Lf，破伤风类毒素3.5Lf，灭活的I型脊髓灰质炎病毒原液7.5DU，灭活的II型脊髓灰质炎病毒原液22.5DU，灭活的III型脊髓灰质炎病毒原液22.5DU，b型流感嗜血杆菌多糖-蛋白结合物15μg，铝含量0.8mg/ml，氯化钠水溶液适量，磷酸盐缓冲液调pH值至5.8～7.2。疫苗中还可以添加适量的稳定剂，如M199培养基和/或氨基酸。

本实施例提供的液体疫苗制剂可以用于基础免疫。

实施例5

本实施例提供了实施例1～4中涉及的各单价疫苗原液的制备方法。

1、白喉类毒素原液

开启白喉杆菌，先在产毒培养基种子管中传1～3代再转至产毒培养基制成生产用种子采用培养罐液体培养,培养基采用麦芽糖综合培养基，34～36℃培养45～52小时，培养结束后加入甲醛杀菌，在培养物中加入硫酸铵沉淀杂蛋白，离心收集上清上清液超滤浓缩后再加入硫酸铵盐析沉淀白喉毒素蛋白，离心收集沉淀，加PB缓冲液进行溶解，超滤去除毒素中的硫酸铵，加入甲醛，置35～37℃，脱毒30天，超滤去除类毒素中的甲醛，除菌过滤即为白喉类毒素原液。

2、破伤风类毒素原液

开启破伤风梭状芽抱杆菌，先在产毒培养基种子管中传1～3代，再转至产毒培养基制成生产用种子采用培养罐液体培养，培养基采用双陈培养基，34～36℃培养62～72小时培养结束后加入甲醛杀菌,培养液经过滤去除菌体,加入硫酸铵沉淀毒素蛋白,离心收集沉淀,超滤去除毒素中的硫酸铵后加入甲醛,置35～37℃，脱毒30天，超滤去除类毒素中的甲醛，除菌过滤即为破伤风类毒素原液。

3、无细胞百日咳疫苗原液

1)开启百日咳杆菌,接种于改良包-姜培养基或活性炭半综合培养基，于35～37℃培养不超过48小时，再接种于CPB培养基中传两代，每代培养时间18～26小时，进行扩增培养以制备足够的生产用种子，然后接种到发酵罐中液体培养，培养基采用CPB培养基，37℃培养两天,培养结束后在培养物中加入硫柳汞或甲醛进行杀菌处理，将收获的培养物离心，离心收获的菌体和上清液2～8℃保存待下一步纯化。

2)百日咳毒素和丝状血凝素的纯化：将上清液超滤浓缩后上清上样于Capto SP层析柱，流动相采用含尿素的磷酸盐缓冲液，以氯化钠梯度洗脱，分别收集含百日咳毒素和丝状血凝素的洗脱组份，将含百日咳毒素的洗脱组份上样于Capto MMC层析柱，缓冲液采用Tris-HCL缓冲液，以氯化钠梯度洗脱，收集百日咳毒素洗脱峰；将含丝状血凝素的洗脱峰上样于羟基磷灰石层析柱纯化，收集洗脱峰。

3)百日咳黏附素的分离纯化：将菌体采用60℃热释放，超滤浓缩后，上样于Captoadhere层析柱，以醋酸缓冲液为流动相，收集含百日咳黏附素的洗脱组份，再上样于CaptoSP层析柱，以醋酸缓冲液为流动相，以氯化钠梯度洗脱，收集洗脱峰，即为分离纯化的百日咳黏附素。

4)制备无细胞百日咳原液：将百日咳毒素采用戊二醛脱毒、丝状血凝素和百日咳黏附素采用甲醛进行处理，除菌过滤后即为无细胞百日咳原液。

4、脊髓灰质炎病毒原液

I型脊髓灰质炎病毒原液：

1)细胞制备：取工作细胞库中的1支或几支细胞管，复苏后至第一级细胞反应器中，于36.5℃±0.5℃培养，直至细胞浓度为1～5×106细胞/ml；将第一级细胞反应器中细胞经胰蛋白酶消化，接种至第二级细胞反应器，于36.5℃±0.5℃培养，直至细胞浓度为2～10×106细胞/ml；将第二级细胞反应器细胞经胰蛋白酶消化，接种至第三级细胞反应器，于36.5℃±0.5℃培养，至细胞浓度为1～5×106细胞/ml时，接种病毒。

2)病毒培养及收获：将第三级细胞反应器内细胞培养液置换为维持液，取I型脊髓灰质炎病毒工作种子批毒种按MOI＝0.002～0.02接种Vero细胞，置32.5℃±0.5℃培养。病毒培养2-4天,收获细胞上清，即为脊髓灰质炎病毒Sabin株单价收获液。

3)病毒收获液澄清及纯化：收获液经离心澄清后用300-500kDa超滤膜包浓缩50-200倍。浓缩完成后采用蔗糖密度梯度离心纯化分离病毒，所用蔗糖梯度具体为蔗糖密度梯度液的第一梯度为30％蔗糖，第二梯度为55％蔗糖，30000rpm离心10小时，收集病毒所在区带。密度梯度离心收集到的病毒液经阴离子交换层析，监测波长为280nm和254nm，收集流穿液，获得病毒层析液。将病毒层析液进行浓缩，即得纯化液。所述阴离子交换层析具体可为DEAE Sepharose Fast Flow、Q Sepharose Fast Flow或其他阴离子交换层析。在本发明的一个实施例中，采用的阴离子交换层析为DEAE Sepharose Fast Flow。

4)病毒灭活：纯化液经0.22μm除菌过滤后加入甲醛溶液，使游离甲醛终浓度为90μg/ml，置37.0℃±1.0℃灭活6天，经除菌过滤后，继续置37.0℃±1.0℃灭活6天，即得单价原液。

II型脊髓灰质炎病毒原液：

1)细胞制备：取工作细胞库中的1支或几支细胞管，复苏后至第一级细胞反应器中，于36.5℃±0.5℃培养，直至细胞浓度为1～5×106细胞/ml；将第一级细胞反应器中细胞经胰蛋白酶消化，接种至第二级细胞反应器，于36.5℃±0.5℃培养，直至细胞浓度为2～10×106细胞/ml；将第二级细胞反应器细胞经胰蛋白酶消化，接种至第三级细胞反应器，于36.5℃±0.5℃培养，至细胞浓度为1～5×106细胞/ml时，接种病毒。

2)病毒培养及收获：将第三级细胞反应器内细胞培养液置换为维持液，取II型脊髓灰质炎病毒工作种子批毒种按MOI＝0.01～0.1接种Vero细胞，置32.5℃±0.5℃培养。病毒培养2-4天,收获细胞上清，即为脊髓灰质炎病毒Sabin株单价收获液。

3)病毒收获液澄清及纯化：收获液经离心澄清后用300-500kDa超滤膜包浓缩50-200倍。浓缩完成后采用蔗糖密度梯度离心纯化分离病毒，所用蔗糖梯度具体为蔗糖密度梯度液的第一梯度为30％蔗糖，第二梯度为55％蔗糖，30000rpm离心10小时，收集病毒所在区带。密度梯度离心收集到的病毒液经阴离子交换层析，监测波长为280nm和254nm，收集流穿液，获得病毒层析液。将病毒层析液进行浓缩，即得纯化液。所述阴离子交换层析具体可为DEAE Sepharose Fast Flow、Q Sepharose Fast Flow或其他阴离子交换层析。在本发明的一个实施例中，采用的阴离子交换层析为DEAE Sepharose Fast Flow。

III型脊髓灰质炎病毒原液：

1)细胞制备：取工作细胞库中的1支或几支细胞管，复苏后至第一级细胞反应器中，于36.5℃±0.5℃培养，直至细胞浓度为1～5×106细胞/ml；将第一级细胞反应器中细胞经胰蛋白酶消化，接种至第二级细胞反应器，于36.5℃±0.5℃培养，直至细胞浓度为2～10×106细胞/ml；将第二级细胞反应器细胞经胰蛋白酶消化，接种至第三级细胞反应器，于36.5℃±0.5℃培养，至细胞浓度为1～5×106细胞/ml时，接种病毒。

2)病毒培养及收获：将第三级细胞反应器内细胞培养液置换为维持液，取III型脊髓灰质炎病毒工作种子批毒种MOI＝0.05～0.5接种Vero细胞，置32.5℃±0.5℃培养。病毒培养2-4天,收获细胞上清，即为脊髓灰质炎病毒Sabin株单价收获液。

3)病毒收获液澄清及纯化：收获液经离心澄清后用300-500kDa超滤膜包浓缩50-200倍。浓缩完成后采用蔗糖密度梯度离心纯化分离病毒，所用蔗糖梯度具体为蔗糖密度梯度液的第一梯度为30％蔗糖，第二梯度为55％蔗糖，30000rpm离心10小时，收集病毒所在区带。密度梯度离心收集到的病毒液经阴离子交换层析，监测波长为280nm和254nm，收集流穿液，获得病毒层析液。将病毒层析液进行浓缩，即得纯化液。所述阴离子交换层析具体可为DEAE Sepharose Fast Flow、Q Sepharose Fast Flow或其他阴离子交换层析。在本发明的一个实施例中，采用的阴离子交换层析为DEAE Sepharose Fast Flow。

5)病毒灭活：纯化液经0.22μm除菌过滤后加入甲醛溶液，使游离甲醛终浓度为90μg/ml，置37.0℃±1.0℃灭活6天，经除菌过滤后，继续置37.0℃±1.0℃灭活6天，即得单价原液。

5、b型流感嗜血杆菌多糖-蛋白结合疫苗原液

1)开启b型流感嗜血杆菌工作种子批菌种，接种至Hib综合培养基，温度35～37℃，5～8％二氧化碳环境中，培养16～24小时，然后经过三代扩增培养，制备生产用种子，接种至发酵罐培养，温度35～37℃，培养时间6～12小时后加入甲醛杀菌；将已杀菌的培养液离心收集上清，然后加入十六烷基三甲基溴化铵至终浓度1.0g/L，充分搅拌后静置过夜，离心收集多糖，沉淀的多糖用氯化钠溶液搅拌3小时使多糖和十六烷基三甲基溴化铵解离，离心收集上清，上清加入乙醇至终浓度25％(v/v)，2～8℃静置过夜，离心收集上清，上清加入乙醇至终浓度为75～80％(v/v)，充分振摇使多糖沉淀，静置过夜，离心收集沉淀，用无水乙醇和丙酮各洗三次，干燥后即为粗制多糖；将粗糖溶解于10％饱和中心醋酸钠溶液中，然后按1:1(v/v)比例加入冷酚溶液，振荡混匀后离心收集上清液，抽提1～3次至上清液澄清，收集上清液，用超滤膜包超滤去除残留的苯酚及核酸，超滤后的多糖溶液中加入4mol/L氯化钠溶液，至氯化钠终浓度0.3mol/L，然后加入95％乙醇至乙醇终浓度为75％(v/v)，充分混匀后2～8℃静置过夜，沉淀精糖，离心收集沉淀，然后依次加入无水乙醇、丙酮各洗涤两次，干燥后即为精糖。

2)将精糖溶于注射用水中，按多糖：溴化氰＝1:0.5(w/w)的比例加入溴化氰溶液，维持温度23±3℃，pH10.8±0.2反应30分钟进行活化，活化完成后，按多糖：乙二酰肼＝1:3.5(w/w)的比例加入2.8％乙二酰肼溶液，维持温度23±3℃，pH8.5±0.2反应15分钟进行衍生，澄清过滤后，用0.05mol/L氯化钠超滤去除溴化氰，即为多糖衍生物；按多糖：蛋白＝1:0.8～1.2(w/w)的比例计算破伤风类毒素用量，加入多糖衍生物溶液中，按多糖：碳二亚胺＝1:10(w/w)的比例加入碳二亚胺，维持反应温度5±3℃、pH5.7±0.2，反应60分钟，然后调节pH至6.9±0.1终止反应，然后将多糖蛋白结合物用Sepharose 4FF凝胶层析柱纯化，以0.15mol/L氯化钠溶液为流动相，监测OD280nm的吸收值，收集V0附近的洗脱峰，合并各次层析收获的洗脱液后即为纯化的结合物，经除菌过滤后，即为b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液。

实施例6

本实施例提供了实施例1～4中液体疫苗组合物的制备方法，包括如下步骤：

1)将实施例5提供的百日咳毒素、丝状血凝素、百日咳黏附素、白喉类毒素原液、破伤风类毒素原液、灭活的I型脊髓灰质炎病毒原液、灭活的II型脊髓灰质炎病毒原液、灭活的III型脊髓灰质炎病毒原液及b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液混合，加入用氯化钠水溶液稀释的铝盐佐剂，再加入磷酸盐缓冲液以及稳定剂，调pH至5.8～7.2，得半成品；

2)将所述半成品分装与西林瓶或者预灌装注射器中，即可。

实施例7

本实施例提供了实施例1～4提供的液体疫苗制剂的成品检验方法。

1鉴别试验

采用酶联免疫法检测PT、FHA、PRN抗原，应含有相应抗原(《中国药典》2015版三部“吸附百白破联合疫苗”中附录)。采用免疫双扩散法(《中国药典》2015版三部)，本品应与白喉类毒素、破伤风类毒素及b型流感嗜血杆菌免疫血清及破伤风类毒素免疫血清形成明显沉淀线。

2物理检查

2.1外观：振摇后应呈均匀乳白色混悬液，无摇不散的凝块或异物

2.2装量：依法检查,应不低于标示量(≥0.5ml)。

3化学检查

3.1pH值：应为5.8～7.2。

3.2铝含量：应不高于0.8mg/剂。

3.3游离甲醛含量：应不高于0.2g/L。

3.4戊二醛含量：应小于0.01g/L。

3.5多糖含量：以D核糖为对照，按核糖含量计算供试品中多糖含量，每1次人用剂量应为10～15μg。

4效价测定

4.1无细胞百日咳疫苗：以适宜的稀释倍数稀释至第一个免疫剂量，再按5倍系列稀释。免疫时间为21天。每1次人用剂量的免疫效价应不低于4.0IU,且95％可信限的低限应不低于2.0IU。如达不到上述要求时可进行复试，但所有的有效试验结果必须以几何平均值(如用概率分析法时，应用加权几何平均)来计算。达到上述要求即判为合格。

4.2白喉疫苗：每1次人用剂量中白喉类毒素的免疫效价应不低于30IU。

4.3破伤风疫苗：每1次人用剂量中破伤风类毒素的免疫效价应不低于40IU。

5效力实验

5.1 b型流感嗜血杆菌结合疫苗

每批疫苗皮下注射体重12～14g NIH(或BALB/c)小鼠10只，另取同批小鼠10只作为对照，注射0.85％氯化钠溶液。于第1天、第14天皮下注射两次，每次注射剂量为含2.5μg多糖的Hib结合疫苗，于第21～28天经眼眶后静脉采血，以ELISA法测定抗Hib IgG抗体，以0.85％氯化钠溶液对照组小鼠血清的吸光度值求出Cutoff值，疫苗组应有80％以上小鼠的血清抗Hib IgG抗体水平高于Cutoff值。

5.2吸附Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗

每批疫苗进行系列梯度倍比稀释后，分别免疫180～220g清洁级以上Wistar大鼠，每组稀释度10只，雌雄各半，每只动物免疫0.5ml供试品。21天采血，分离血清，-20℃保存。分别检测血清中抗Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ型3个型别病毒的中和抗体滴度，计算血清阳转率。同法对内部参比品进行效力试验。供试品的免疫原性应与内部参比品相当，即：供试品ED₅₀值不高于参比品的400％。

6无菌检查：依法检查，应无菌生长。

7热原检查

依法检查，注射剂量按家兔体重每lkg注射1.0μg多糖，在初试的三只家兔中，体温升高均低于0.6℃，并且3只家兔体温升高综合低于1.3℃；或在复试的5只家兔中，体温升高0.6℃或高于0.6℃的家兔不超过1只，并在初试、复试合并8只家兔的体温升高总和为3.5℃或低于3.5℃，均判定供试品的热原检查符合规定。

8特异性毒性检查

8.1无细胞百日咳疫苗：毒性参考品按照每批标示进行稀释。用体重14～16g NIH小鼠(雌性或雌雄各半)，毒性参考品的每一稀释度和供试品各用一组，每组至少10只。每只小鼠腹腔注射0.5ml，分别进行a～b项试验。

a)小鼠白细胞增多试验

于注射后3天分别取小鼠末梢血进行白细胞计数。试验结果经统计学方法处理后，注射供试品的小鼠白细胞增多毒性的活性应不高于0.5LPU/ml。

b)小鼠组胺致敏试验

于注射后4天，每只小鼠腹腔注射0.5ml溶液(含二盐酸组胺4mg或二磷酸组胺2mg)，30分钟后分别测小鼠肛温。试验结果经统计学方法处理后，供试品的小鼠组胺致敏毒性的活性应不高于0.8HSU/ml，且无动物死亡。

8.2白喉、破伤风疫苗

用体重250～350g豚鼠，每批制品不少于4只，每只腹部皮下注射2.5ml，分两侧注射，每侧1.25ml,观察30天。注射部位可有浸润，经5～10天变成硬结，可能30天不完全吸收。在第10天、第20天、第30天称体重，到期体重比注射前增加，局部无化脓、无坏死、无破伤风症状及无晚期麻痹症者为合格。

9毒性逆转实验：每批供试品置37℃放置4周，按规程中8.1b)项进行。

10细菌内毒素检查：依《中国药典》三部通则1143检查，应不高于100EU/剂。

检测结果参考表1所示。

表1：疫苗检测结果

实施例8

本实施例提供了一种利用本发明提供的液体疫苗制剂进行混合免疫的方法。具体为：

以实施例4提供的疫苗液体制剂作为基础免疫剂型疫苗，分别于第1天和第14天皮下注射免疫两次。于第28天经眼眶采血，经间接ELISA法测定小鼠血清中的IgG抗体滴度。于3个月后(即第90天)再次采血检定其血清中的IgG滴度，并经皮下注射免疫实施例1提供的疫苗液体制剂作为加强免疫，于加强免疫后14天(即第104天)采血测定其血清中的IgG滴度。结果如表2及图1～4所示。

表2：抗体滴度检测结果

图1～4中，*代表P＜0.05；**代表P＜0.01；***代表P＜0.001。

实验结果显示，经实施例4提供的疫苗液体制剂作为基础免疫剂免疫两次后，均能诱导小鼠产生显著的针对I/II/III型脊髓灰质炎病毒的中和性抗体、针对百日咳(aP)组份(PT、FHA、PRN)的抗体(IgG)、针对DT的抗体(IgG)、针对TT的抗体(IgG)和针对Hib的抗体(IgG)。在3个月后检测小鼠体内的抗体水平，我们发现I/II/III型脊髓灰质炎病毒的中和性抗体、针对百日咳组份(PT、PRN)的抗体(IgG)、针对DT的抗体(IgG)均出现了显著性的降低。但经实施例1提供的疫苗液体制剂作为加强免疫剂型免疫一次后，能极显著的提高小鼠体内针对I/II/III型脊髓灰质炎病毒的中和性抗体、针对百日咳组份(PT、FHA、PRN)的抗体(IgG)、针对DT的抗体(IgG)、针对TT的抗体(IgG)和针对Hib的抗体(IgG)。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (13)

1.一种液体疫苗组合物，其特征在于，所述组合物为液体，其中包含：白喉类毒素，破伤风类毒素，百日咳毒素，丝状血凝素，百日咳杆菌黏附素，灭活的I型脊髓灰质炎病毒Sabin毒株，灭活的II型脊髓灰质炎病毒Sabin毒株，灭活的III型脊髓灰质炎病毒Sabin毒株，b型流感嗜血杆菌荚膜多糖-蛋白结合物。

2.一种液体疫苗组合物，其特征在于，所述组合物为液体，其中的抗原由如下物质组成：白喉类毒素，破伤风类毒素，百日咳毒素，丝状血凝素，百日咳杆菌黏附素，灭活的I型脊髓灰质炎病毒Sabin毒株，灭活的II型脊髓灰质炎病毒Sabin毒株，灭活的III型脊髓灰质炎病毒Sabin毒株以及b型流感嗜血杆菌荚膜多糖-蛋白结合物。

3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述组合物中，I型、II型和III型Sabin株脊髓灰质炎病毒的抗原比例为(4～15)：(11～45)：(11～45)，优选为1：(2.5～3.5)：(2.5～3.5)。

4.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述b型流感嗜血杆菌荚膜多糖-蛋白结合物由b型流感嗜血杆菌荚膜多糖与生理学可接受载体蛋白缀合而成；

所述生理学可接受的载体蛋白选自白喉类毒素、白喉毒素无毒变异体CRM197、破伤风类毒素、脑膜炎球菌外膜蛋白中的一种或多种。

5.根据权利要求1～4任意一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物中还包含铝佐剂、可溶性磷酸盐缓冲液、氯化钠、稳定剂中的一种或多种；

优选地，所述稳定剂选用维生素、氨基酸、M199培养基中的一种或多种。

6.根据权利要求1～5任意一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物中所含有的百日咳毒素、丝状血凝素、百日咳杆菌黏附素的质量比为(20～25)：(20～25)：(3～8)；

优选地，每0.5ml单剂量所述组合物中含有百日咳毒素20～25μg，丝状血凝素20～25μg，百日咳杆菌黏附素3～8μg。

7.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，每0.5ml单剂量所述组合物中含有如下组分：

8.根据权利要求1～5任意一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物中所含有的百日咳毒素、丝状血凝素、百日咳杆菌黏附素之比为(2.5～8)：(5～8)：(2.5～3)；

优选地，每0.5ml单剂量所述组合物中含有百日咳毒素2.5～8μg，丝状血凝素5～8μg，百日咳杆菌黏附素2.5～3μg。

9.根据权利要求8所述的组合物，其特征在于，每0.5ml单剂量所述组合物中含有如下组分：

10.制备权利要求1～9任意一项所述液体疫苗组合物的方法，其特征在于，包括如下步骤：将包括百日咳毒素、丝状血凝素、百日咳杆菌黏附素、白喉类毒素原液、破伤风类毒素原液、灭活的I型Sabin株脊髓灰质炎病毒原液、灭活的II型Sabin株脊髓灰质炎病毒原液、灭活的III型Sabin株脊髓灰质炎病毒原液、b型流感嗜血杆菌多糖-蛋白结合物原液在内的液体原料混合。

11.权利要求1～7任意一项所述液体疫苗组合物在制备基础免疫疫苗中的应用。

12.权利要求1～5、8、9任意一项所述液体疫苗组合物在制备加强免疫疫苗中的应用。

13.一种疫苗试剂盒，其特征在于，包括第一室和第二室；所述第一室中含有由权利要求1～7任意一项所述液体疫苗组合物制备而成的基础免疫疫苗；所述第二室中含有由权利要求1～5、8、9任意一项所述液体疫苗组合物制备而成的加强免疫疫苗；

或者，包括第一室、第二室和第三室；所述第一室和第二室中各自含有由权利要求1～7任意一项所述液体疫苗组合物制备而成的基础免疫疫苗；所述第三室中含有由权利要求1～5、8、9任意一项所述液体疫苗组合物制备而成的加强免疫疫苗；

或者，包括第一室、第二室、第三室和第四室；所述第一室、第二室和第三室中各自含有由权利要求1～7任意一项所述液体疫苗组合物制备而成的基础免疫疫苗；所述第四室中含有由权利要求1～5、8、9任意一项所述液体疫苗组合物制备而成的加强免疫疫苗。

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