RU2504398C2

RU2504398C2 - Комбинированная вакцина с цельноклеточным коклюшем

Info

Publication number: RU2504398C2
Application number: RU2011120309/15A
Authority: RU
Inventors: Раджеш Джаин; Сукхджит Сингх; Лавит ЖДАМБУ
Original assignee: Панацеа Биотек Лтд.
Priority date: 2008-10-24
Filing date: 2009-10-23
Publication date: 2014-01-20
Also published as: BRPI0920629A2; AR073957A1; US20110195087A1; CO6430435A2; JP2012506420A; AP2011005700A0; EP2529750A1; CA2741393A1; MA32821B1; PE20100365A1; RU2011135761A; WO2010046934A1; RU2011120309A; EP2361094A1; EP2361094A4; RU2613295C2; CL2011000913A1; CN102196817A; CN102196817B

Abstract

Группа изобретений относится к комбинированной вакцине, содержащей смесь антигенов для защиты от заболеваний, таких как дифтерия, столбняк, цельноклеточный коклюш. Группа изобретений также относится к включению одного или более антигенов в указанную комбинированную вакцину для защиты от инфекций, вызываемых Haemophilus influenzae, вирус гепатита и другими патогенами, так что введение вакцины может одновременно иммунизировать субъект против более чем одного патогена. Группа изобретений касается жидкой стабильной комбинированной вакцины, содержащей антигены, как указано выше, и способа ее производства. 3 н. и 11 з.п. ф-лы, 5 табл., 4 пр.

Description

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение относится к комбинированной вакцине, содержащей смесь антигенов для защиты от заболеваний, таких как дифтерия, столбняк, коклюш и полиомиелит. Данное изобретение также относится к включению одного или более антигена в указанную комбинированную вакцину для защиты от инфекций, вызываемых Haemophilus influenzae, вирусом гепатита и другими патогенами, так что введение вакцины может одновременно иммунизировать субъект против более чем одного патогена. Данное изобретение, в частности, касается полностью жидкой стабильной комбинированной вакцины, содержащей антигены, как указано выше, и способов ее производства.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Антигены вакцины

Антигены дифтерии и столбняка

Дифтерия и столбняк представляют собой острые инфекции, вызываемые Cornyebacterium diphtheriae и Clostridium tetani, соответственно. Токсины этих бактерий являются главной причиной соответствующих заболеваний. Вакцины, обеспечивающие защиту против этих бактерий, содержат эти токсины, которые являются анатоксинами, теряя свою инфекционность. Токсины обрабатывают, применяя химические реагенты, такие как формальдегид или глутаральдегид, для создания анатоксинов [анатоксин дифтерии (DT) и анатоксин столбняка (TT)]. CRM 197, мутантный токсин дифтерии, также применяются в определенных вакцинах.

Антигены коклюша

Болезнь судорожного кашля или коклюш вызывается Bordetella pertussis. Она представляет собой истощающую и серьезную болезнь, которая даже может привести к смерти. Начальные вакцины против болезни были на основе целых клеток, которые обрабатывали химическими реагентами, такими как формальдегид, чтобы убить клетки и инактивировать токсические материалы. Попытки разработать инактивированную цельноклеточную коклюшную вакцину начались вскоре после того, как В. pertussis был выращен в чистой культуре в 1906 г. В 1920-ые гг. доктор Louis W. Sauer разработал вакцину для судорожного кашля. В 1925 г. датский врач Thorvald Madsen первым испытал цельноклеточную коклюшную вакцину в широком масштабе. В 1942 г.американский ученый Pearl Kendrick скомбинировал цельноклеточную коклюшную вакцину с анатоксинами дифтерии и столбняка для создания первой DTP комбинированной вакцины. Эти вакцины, которые называются 'цельноклеточные (wP) вакцины', были высоко эффективными.

Последняя вакцина, имеющая название 'составная вакцина', включала меньшее количество высокоочищенных антигенов. Многие факторы, связанные с вирулентностью, были предложены для включения в 'ацеллюлярную вакцину', которая является менее определяемой по сравнению с составной вакциной. Вакцины, содержащие только РТ, были частично протективными, тогда как вакцины, содержащие комбинацию PT/FHA, были более эффективными, но все еще имели меньшую иммуногенность, чем wP вакцины.

Антигены полиомиелита

Доступны два различных типа вакцины:

- Живая аттенуированная (ослабленная) пероральная полиомиелитная вакцина (OPV), разработанная доктором Albert Sabin в 1961 г. OPV, содержащую Sabin штаммы, дают перорально.

- Инактивированная (убитая) полиомиелитная вакцина (IPV), разработанная в 1955 г.доктором Jonas Salk. IPV, содержащую Salk штаммы, вводят как инъекцию.

Как живая аттенуированная (OPV), так и инактивированная (IPV) полиомиелитные вакцины являлись эффективными в контроле заболевания полиомиелита во всем мире. Полиомиелитная вакцина может содержать Salk или Sabin штаммы. Mahoney тип 1, MEF тип 2 и Saukett тип 3 являются Salk штаммами, которые использовались в вакцине против заболевания полиомиелита. Sabin штаммы включают штаммы Sabin 1 и Sabin 2.

Антигены Haemophilus influenzae (Hib)

Haemophilus influenzae представляет собой грамотрицательную коккобактерию, которая представляет собой нормальную составляющую флоры верхнего дыхательного пути. Haemophilus influenzae тип b (Hib b) представляет собой главную причину менингитных инвазивных переносимых кровью инфекций у детей младшего возраста и главной причиной менингита в первые 2 года жизни. Иммунизация против Haemophilus influenzae началась в Канаде в 1987 г. полисахар идной вакциной [рибитолфосфат полирибозы (PRP)]. Полирибозилрибитолфосфатная (PRP) капсула Hib представляет собой главный вирулентный фактор для организма. Антитело к PRP является первичным фактором, влияющим на сывороточную бактерицидную активность, и повышение уровней антител связано с пониженным риском инвазивной болезни. PRP представляет собой Т-клеточно независимый антиген и, следовательно, характеризуется а) индукцией слабого ответа антитела у менее чем 18-месячных младенцев и детей, b) изменчивым и количественно меньшим ответом антитела, чем тот, который наблюдается с Т-клеточно зависимыми антигенами, c) продуцированием более высокого соотношения иммуноглобулина М (IgM), и d) неспособностью индуцировать вторичный ответ.

Начальные вакцины на основе только PRP компонента доказали свою неэффективность для младенцев. Дополнительные попытки были направлены на PRP конъюгированную вакцину, где PRP конъюгирован с белками, которые называются белки-носители, такие как наружный белок мембраны Neisseria meningitides, анатоксин дифтерии, анатоксин столбняка и CRM 197.

Антигены гепатита (Hep)

Существуют различные штаммы вируса гепатита. Гепатит В представляет собой болезнь, вызываемую вирусом гепатита В (HBV), который инфицирует печень гоминид, включая людей, и вызывает воспаление, называемое гепатитом. Он варьирует по тяжести от легкого заболевания, которое продолжается несколько недель (острого), до серьезного длительно выраженного (хронического) заболевания, которое может привести к болезни печени или раку печени. Вакцина против болезни содержит один из вирусных оболочечных белков, поверхностный антиген гепатита В (HBsAg). Одобренные FDA (Управление по контролю за продуктами и лекарствами США) вакцины, содержащие Hep В, представляют собой Recombivax НВ^® и Comvax^® от Merck, Engerix-B^® и Pediarix^® от GlaxoSmithKline Biologicals.

Другие антигены

Другие антигены, которые затрагивают человечество, включают Haemophilus influenzae (а, с, d, е, f серотипы и неинкапсулированные штаммы), гепатит (А, С, D, Е, F и G штаммы), менингит А, В или С, грипп, Pneumococci, Streptococci, сибирскую язву, лихорадку денге, малярию, корь, свинку, краснуху, БЦЖ, японский энцефалит, ротавирус, натуральную оспу, желтую лихорадку, брюшной тиф, Singles, вирус ветряной оспы и другие.

Комбинированные вакцины

Несмотря на многие десятилетия исследований в области вакцин, инфекционные заболевания остаются угрозой для человечества. Комбинированные вакцины, которые защищают от различных заболеваний, являются очень необходимыми, так как они снижают количество введений вакцины, что снижает стоимости введения и производства, а также улучшает степень согласия пациента с предписанным режимом. Такие комбинированные вакцины, в общем, лучше переносятся.

Однако, документально доказанное явление антигенной конкуренции усложняло и тормозило развитие поливалентных вакцин. Это явление касается наблюдения, что введение множественных антигенов вместе часто приводит к ослабленному ответу на определенные антигены сравнительно с иммунным ответом на эти антигены, когда они вводятся отдельно.

Более раннее исследование было сфокусировано на разработке вакцин с множественными валентностями, направленных на различные заболевания и инфекции. Одна такая хорошо известная комбинация вакцин содержит антигены дифтерии (D), столбняка (Т) и цельноклеточного коклюша (wP), давая DTwP вакцину.

Желательным было добавить другие антигены к такой комбинированной вакцине, которые будут давать защиту против заболеваний, вызываемых вирусом гепатита (Hep), Haemophilus influenzae (Hib) и полиовирусами (IPV). Также было желательным иметь антигены, обеспечивающие защиту против других заболеваний, которые добавлены к вышеуказанным комбинированным вакцинам.

Quintanrix, производимый GlaxoSmithKline Biologicals, представляет собой комбинированную вакцину, содержащую DTwP, Hib и Hep В антигены, содержащую тиомерсал в качестве консерванта. Эта вакцина была изъята до поступления на рынок. Zilbrix™, производимая GlaxoSmithKline Biologicals, содержит DTwP и Hep В. Zilbrix Hib ^ТМ, производимая GlaxoSmithKline Biologicals, содержит DTwP и Hep В и Hib, где Hib продается в отдельной ампуле, не содержащей другие антигенные компоненты.

РСТ заявка WO2002005846 от Green Cross Vaccine обеспечивает четырехвалентную комбинированную вакцину, включающую анатоксин дифтерии, анатоксин столбняка, цельноклеточный коклюш и поверхностный антиген гепатита b. Указанное изобретение относится к составу вакцины, который комбинирует Hep В с DTwP, но не говорит о включении других антигенов, таких как Hib или IPV.

РСТ заявка WO2008028957 от GlaxoSmithKline Biologicals касается способа создания вакцины, содержащей низкую дозу IPV. Однако она не сообщает о приготовлении полностью жидкой вакцины, содержащей D, Т, wP, IPV, Hib и Hep антигены, все вместе в одной ампуле в полностью жидкой форме, где Hib, по сути, не адсорбируют на какой-либо адъювант.

Патент США №6013264 от SmithKline Beecham Biologicals касается поливалентной вакцины, содержащей HBsAg. Указанное изобретение касается комбинированной вакцины, в которой HBsAg адсорбируют на фосфат алюминия. Однако там нет специфического раскрытия комбинированной вакцины, содержащей DTwP-IPV вместе с другими антигенами, как Hib и Hep, в полностью жидкой форме.

РСТ заявка WO1998000167A1 от Connaught Lab обеспечивает поливалентную иммуногенную композицию для обеспечения защиты хозяина от болезни, вызываемой инфекцией Bordetella pertussis, Clostridium tetani, Corynebacterium diphtheriae, полиовируса и/или Haemophilus influenzae. Hib b компонент вакцины, согласно описанию, представляет собой лиофилизированный компонент, который необходимо растворить до смешивания с другими компонентами вакцины. Таким образом, в описании нет сообщения, касающегося полностью жидкой комбинированной вакцины, содержащей все указанные антигены.

Лиофилизация, также имеющая название высушивание вымораживанием, представляет собой дорогостоящий способ, который также вызывает значительный стресс на белки. Когда любой компонент вакцины является лиофилизированным во время введения вакцины, то необходимо смешать лиофилизат с другой жидкостью или жидким компонентом комбинированной вакцины. Это представляет собой дополнительное ограничение для практикующего клинициста и представляет риск того, что это будет проведено плохо. Затем было предложено иметь шприц с многочисленными отсеками, который будет иметь лиофилизированный компонент в одном отсеке и жидкий компонент вакцины в другом. Однако, такой шприц, содержимое которого может быть смешано во время введения вакцины, не показал себя удовлетворительно на уровне снижения стоимостей получения, а также на уровне операций, которые необходимо выполнить практикующему клиницисту.

Следовательно, желательно избежать этапа лиофилизации и обеспечить комбинированную вакцину, которая имеет все компоненты, присутствующие вместе и в полностью жидкой форме. Это облегчило бы введение вакцины, обеспечило соблюдение пациентом режима введения, а также снизило стоимости получения. Таким образом, желательно иметь Hib антиген, добавленный к жидкому компоненту вакцины, и, таким образом, иметь полностью жидкую поливалентную вакцину.

РСТ заявка WO2004110480 от Glaxo SmithKline Biologicals касается вакцины, содержащей Hib b полисахарид. Заявка утверждает, что простое смешивание компонентов комбинированной вакцины затрудняется фактом того, что не все антигены могут быть эффективно смешаны друг с другом. Она утверждает, что существует интерференция между гидр оксидом алюминия DTP вакцины и PRP. Данное изобретение в WO'480 направлено на минимизацию этой интерференции в такой приготовленной для немедленного приема комбинированной вакцине, где PRP предварительно адсорбируют на фосфате алюминия. Данное изобретение дополнительно обеспечивает иммуногенные композиции, вакцины и комбинированные вакцины, содержащие PRP, которая защищена в некоторой степени от иммунной интерференции. Изобретатели обнаружили, что описанное выше может быть достигнуто путем включения полианионного полимерного вспомогательного вещества с вакциной, содержащей PRP.

Однако, применение полианионного полимера в составе вакцины может быть нежелательным, поскольку это может увеличивать стоимость составления вакцины. Также, поскольку вакцина в итоге предназначена для применения у людей, она оптимально должна иметь наименьшее количество возможных компонентов. Применение дополнительных ингредиентов означает добавление веществ к составу, на которые организм может реагировать и производить антитела. Такой ответ организма, вступающего в контакт с компонентами иммунологического препарата, может быть нежелательным.

Патент США №6333036 от Pasteur Merieux Serums касается композиций вакцины, содержащих капсулярный полисахарид Haemophilus influenzae типа b или высокомолекулярный полирибозилрибитол фосфат (PRP), связанный с анатоксином столбняка, а также адъювант на основе алюминия. Адъюванты на основе алюминия, используемые в данном изобретении, имеют точку нулевого заряда менее чем приблизительно 7,2. Патент, однако, конкретно не сообщает о приготовлении комбинированной вакцины, содержащей DTwP-IPV вместе с другими антигенами, как Hib и Hep, в полностью жидкой форме.

Несмотря на то, что продолжаются исследования по созданию поливалентной вакцины, содержащей различные антигены, которая бы обеспечивала защиту от ряда заболеваний, они не направлены на необходимость обеспечения стабильной комбинированной вакцины, содержащей DTwP и IPV антигены вместе с другими антигенами, такими как Hib и Hep, в полностью жидком составе. Существуют противоречивые сообщения относительно ответов антител против конкретных антигенов у детей, иммунизированных отдельным и совместным введением комбинированных вакцин и Hib вакцины. Могут существовать различные причины для таких результатов, включая вакцины, которые не являются идентичными по их антигенному содержанию, способ создания анатоксина, использование адъюванта или используемый консервант.

Известные в настоящее время и доступные комбинированные вакцины могут не содержать подходящие составы подходящих антигенов в подходящих иммуногенных формах для достижения необходимых уровней эффективности и иммуногенности у чувствительной человеческой популяции для нескольких заболеваний в одном введении. Существует необходимость в многокомпонентной вакцине, которая обеспечивает защиту от различных инфекций и находится в жидкой форме, так что обеспечивает простоту введения и комфорт стоимости-эффективности. Было бы желательным обеспечить стабильную и эффективную поливалентную вакцину против заболеваний, вызываемых инфекцией, вызываемых Corynebacterium diphtheriae, Clostridium tetani, Bordetella pertussis, полиовирусами, вирусом гепатита и Haemophilus influenzae. Для такой вакцины, чтобы она была эффективной, необходимо, чтобы соблюдался критерий серопротекции для каждого из антигенов вакцины. Для этого существует необходимость преодолеть препятствия и трудности, обусловленные антигенной конкуренцией и интерференцией. Данное изобретение преодолевает ограничения известного уровня техники и решает связанные проблемы путем обеспечения состава полностью жидкой комбинированной вакцины, защищающего от нескольких заболеваний.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ДАННОГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение направлено на полностью жидкую стабильную комбинированную вакцину, содержащую антигены дифтерии (D), столбняка (Т), цельноклеточный коклюш (wP) и IPV, и факультативно один или более антиген, выбранный из группы Haemophilus influenzae (Hib) и гепатита (Hep), так что введение вакцины может одновременно иммунизировать субъект против более чем одного патогена. Данное изобретение, в частности, касается полностью жидкой стабильной комбинированной вакцины, содержащей антигены, как указано выше, и способов ее производства.

Данное изобретение дополнительно направлено на комбинированную вакцину, которая содержит несколько компонентов вакцины, которые являются подходящими для профилактики, улучшения состояния и лечения множества болезненных состояний, которые соответствуют критерию для серопротекции для каждого из указанных компонентов вакцины.

ДЕТАЛЬНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение направлено на полностью жидкую стабильную комбинированную вакцину, которая содержит несколько компонентов вакцины, которые являются подходящими для профилактики, улучшения состояния и лечения множества болезненных состояний, которые соответствуют критерию для серопротекции для каждого из указанных компонентов вакцины.

Преимущества данного изобретения включают поливалентную вакцину, которая может обеспечивать защиту от широкого спектра заболеваний и инфекций безопасным и эффективным образом. Вакцина данного изобретения обеспечивает иммуногенность к различным заболеваниям и инфекциям без какой-либо интерференции любого из антигенов, которые присутствуют в вакцине. Таким образом, однократное введение будет обеспечивать иммуногенность против различных заболеваний и инфекций, делая вакцину более удобной для соблюдения пациентом схемы приема. Поскольку однократное введение будет обеспечивать иммунитет против ряда инфекций и заболеваний, стоимость вакцинации будет снижена. Вакцина данного изобретения будет предпочтительной в том смысле, что она будет снижать число визитов в центр вакцинации, а также число впрыскиваний, которые необходимо осуществить для ряда различных заболеваний и инфекций. Этот аспект данного изобретения будет делать ее более пригодной и предпочтительной особенно для более молодой группы населения, которая нуждается в вакцинации для обеспечения иммунитета к большому числу инфекций и заболеваний. Таким образом, данное изобретение обеспечивает вакцину, которая является более приемлемой.

Определения

Выражение 'полностью жидкая', как используется в данном документе для описания вакцины данного изобретения, относится к состоянию вакцины, где все компоненты вакцины находятся в жидком состоянии, и нет такого компонента вакцины, который обеспечен в лиофилизированной или любой другой форме, так чтобы его необходимо было смешивать с другими компонентами вакцины до введения ее субъекту.

Выражение 'белок-носитель', как используется в данном документе, описывает белковый компонент, с которым капсулярный полисахарид (Hib), применяемый в вакцине, конъюгирован так, чтобы превращать Т-клеточно независимый полисахарид в Т-клеточно зависимый антиген.

Выражение 'адъювант', как используется в данном документе, описывает неантигенный компонент вакцины, который усиливает иммунный ответ антигенов вакцины путем облегчения контакта между антигеном и иммунной системой путем влияния на тип и качество иммунного ответа, образованного против антигена. Адъювант вызывает пролонгированные иммунные ответы против антигенов, а также может служить для снижения токсичности определенных антигенов или обеспечения растворимости для определенных антигенов.

Выражение 'стабильная', используемое здесь для описания вакцины данного изобретения, означает, что каждый из антигенов композиции вакцины имеет силу/иммуногенность большую, чем та, которая установлена в качестве нормального допустимого предела, после инкубации вакцины при 5±3°С в течение, по меньшей мере, 1, предпочтительно 12 и наиболее предпочтительно 24 месяцев.

Выражение 'по сути', используемое здесь для описания величины адсорбции или присоединения Hib на любой адъювант, в выражении 'Hib, по сути, не адсорбированный на какой-либо адъювант', означает, что адсорбция Hib на любой адъювант является меньше чем 15%, и предпочтительно меньше чем 10%. Hib антиген не подвергается какому-либо из этапов, так чтобы целенаправленно адсорбироваться на любом адъюванте; величина адсорбции может иметь место, возможно, вследствие контакта между антигеном и адъювантом и не является целенаправленной.

Выражение 'приблизительно около', используемое здесь для описания количества каждого из компонентов, присутствующих в вакцине данного изобретения, означает количество указанного компонента вакцины, который присутствует в количествах предпочтительно ±20%, более предпочтительно ±10% и наиболее предпочтительно ±5% установленного количества для этого конкретного компонента.

Выражение 'около', как используется в данном документе, для описания времени перемешивания компонентов смеси в ходе способа получения вакцины данного изобретения составляет предпочтительно ±20%, более предпочтительно ±10% и наиболее предпочтительно±5% установленного значения.

Выражение 'иммунологически активный', используемое здесь в отношении комбинированной вакцины данного изобретения, означает, что вакцина при введении субъекту способна вызывать антитела против каждого антигена указанной комбинации так, чтобы защитить вакцинируемого пациента от соответствующих заболеваний или инфекций.

Выражение 'присоединение или адсорбирование', используемое здесь в отношении антигенов комбинированной вакцины данного изобретения, относится к любой форме физического связывания между антигеном и адъювантом.

Вакцина данного изобретения

Данное изобретение обеспечивает полностью жидкую стабильную комбинированную вакцину, содержащую антигены дифтерии (D), столбняка (Т), цельноклеточного коклюша (wP) и полиовируса (IPV) и факультативно один или более антиген, выбранный из группы Haemophilus influenzae (Hib) и гепатита (Hep).

Один аспект данного изобретения обеспечивает композицию комбинированной вакцины, в которой все компоненты вакцины присутствуют вместе в жидкой форме в одной ампуле.

Один дополнительный аспект данного изобретения касается полностью жидкой стабильной пятивалентной вакцины, содержащей антигены DTwP, Hib и IPV.

Другой аспект данного изобретения обеспечивает полностью жидкую стабильную шестивалентную вакцину, содержащую антигены DTwP, Hib, Hep и IPV.

Данное изобретение дополнительно обеспечивает то, что антигены дифтерии (D) и столбняка (Т) адсорбируют на фосфате алюминия.

Согласно одному другому аспекту данного изобретения IPV штаммы представляют собой один или более Salk штамм, который может быть выбран из группы Mahoney типа 1, MEF типа 2 и Saukett типа 3, или одного или более Sabin штамма, выбранного из группы, включающей Sabin типов 1 и 2.

Согласно дополнительному аспекту данного изобретения Hib антиген конъюгирован с белком-носителем, выбранным из группы, содержащей анатоксин столбняка (ТТ), анатоксин дифтерии (DT), CRM 197 и наружный белок мембраны Neisseria meningitides или любые их эквиваленты, или любые другие известные носители.

Согласно другому аспекту данного изобретения Hib антиген, по сути, не адсорбируют на каком-либо адъюванте.

Согласно другому аспекту данного изобретения Hib антиген в вакцине данного изобретения получают из капсулярного полисахарида Hib b штамма.

Один аспект данного изобретения обеспечивает то, что Hep антиген адсорбируют на фосфате алюминия.

Один дополнительный аспект данного изобретения касается Hep антигена, полученного из поверхностного антигена гепатита В (HBsAg); т.е. поверхностного антигена Hep В штамма.

Другой аспект данного изобретения обеспечивает то, что вакцина данного изобретения содержит 2- феноксиэтанол в качестве консерванта в составе.

Согласно другому аспекту данного изобретения вакцина содержит D, Т, wP, Hib b и Hep В антигены, чтобы обеспечить пятивалентную вакцину, и 2-феноксиэтанол используется в качестве консерванта в составе, с оговоркой, что вакцина не содержит IPV антигены.

Дополнительно, другой аспект данного изобретения относится к способу производства комбинированных вакцин данного изобретения.

Другой аспект данного изобретения касается композиции комбинированных вакцин данного изобретения, так что каждый из антигенов присутствует в количестве в вакцине так, чтобы обеспечить защитный иммунный ответ против указанного антигена.

Антигены вакцины данного изобретения

Дифтерия вызывается Corynebacterium diphtheriae, грамположительной неспороносной аэробной бактерией. Этот организм эксперссирует кодируемый профагом экзотоксин АДФ-рибозилирования ('токсин дифтерии'), который может быть обработан (например, используя формальдегид) для получения анатоксина. Этот анатоксин уже не является токсичным, но все еще остается антигенным и способен стимулировать продукцию специфических антител против токсина после инъекции. Препарат антигена дифтерии, используемый в вакцине данного изобретения, предпочтительно содержит анатоксин дифтерии.

Столбняк вызывается Clostridium tetani, грамположительной, спорообразующей бациллой. Этот организм экспрессирует эндопептидазу ('токсин столбняка'), который может быть обработан для получения анатоксина, который уже не является токсичным. Однако он все еще остается антигенным и способен стимулировать продукцию специфических антител против токсина после инъекции. Препарат антигена столбняка, используемый в вакцине данного изобретения, предпочтительно содержит анатоксин столбняка.

Коклюш или судорожный кашель вызывается Bordetella pertussis. Антиген цельноклеточного коклюша (wP) данного изобретения может быть приготовлен из штаммов Bordetella pertussis, которые способны вызвать инфекции. wP антиген данного изобретения может быть инактивированным различными путями, такими как применение химического реагента. Однако инактивированный В. pertussis (wP), используемый в композиции вакцины данного изобретения, предпочтительно, является инактивированным нагреванием при 56±ГС, 30 минут.Препарат антигена wP, используемый в вакцине данного изобретения, предпочтительно получают из Bordetella pertussis 134, 509 и 10536. Отдельные Harvests штаммы 10536, 509 и 134 предпочтительно смешивают в соотношении 1:1:1 на основании их непрозрачности.

Haemophilus influenzae представляет собой грамотрицательную коккобактерию, которая вызывает инвазивные переносимые кровью инфекции и менингит. Согласно одному варианту осуществления данного изобретения Hib антиген, который получают из капсулярного полисахарида, может быть конъюгирован или связан с белками-носителями. Белки-носители, используемые для конъюгации Hib антигена, могут быть выбраны из группы, содержащей анатоксин столбняка (ТТ), анатоксин дифтерии (DT), CRM 197 и наружный белок мембраны Neisseria meningitides или любые их эквиваленты. Другие подходящие белки-носители включают, но не ограничиваясь, синтетические пептиды, белки теплового шока, коклюшные белки, цитокины, лимфокины, гормоны, факторы роста, искусственные белки, содержащие эпитопы многочисленных CD4+Т-клеток человека от различных полученных из патогенов антигенов, такие как N19, белок D из Н.influenzae, белок PspA поверхности пневмококка, пневмолизин, белки захвата железа, токсин А или В из C.difficile и S.agalactiae белков. Препарат антигена Hib, используемый в вакцине данного изобретения, содержит Hib антиген, предпочтительно конъюгированный или связанный с анатоксином столбняка.

Полисахаридный конъюгат может быть приготовлен любой известной методикой связывания. Например, полисахарид может быть связан посредством тиоэфирной связи. Этот способ конъюгации основан на активации полисахарида с помощью 1-циано-4-диметиламинопиридиния тетрафторбората (CDAP) для образования сложного эфира цианата. Активированный полисахарид может, таким образом, быть соединен напрямую или посредством спейсерной группы с аминогруппой на белке-носителе. Конъюгаты могут также быть приготовлены с помощью способов прямого восстановительного аминирования. Другой способ включает соединение полисахарида, активированного цианистым бромидом (CNBr), дериватизированного с гидразидом адипиновой кислоты (ADH) с белком-носителем с помощью карбодиимидной конденсации. Любой другой известный способ может быть использован для приготовления полисахаридного конъюгата, используемого в вакцине данного изобретения.

Согласно варианту осуществления данного изобретения Hib антиген, по сути, не адсорбируют на какой-либо адъювант; предпочтительно, степень адсорбции Hib антигена на адъюванте составляет не более чем 15%; более предпочтительно, степень адсорбции Hib антигена на адъюванте составляет не более чем 10%).

Согласно другому варианту осуществления данное изобретение касается Hib антигена, который не подвергается целенаправленной или преднамеренной адсорбции на каком-либо адъюванте.

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления данного изобретения Hib антиген получают из капсулярного полисахарида Hib b штамма.

Гепатит вызывают различные штаммы гепатита, такие как А, В, С, D, Е, F или G. Вирус гепатита В (HBV) является одним из главных агентов, которые вызывают вирусный гепатит. Вирион HBV состоит из внутреннего ядра, окруженного внешней белковой оболочкой или капсидом. Главный компонент капсида представляет собой белок, известный как поверхностный антиген HBV или, чаще, 'HBsAg'. Когда этот антиген вводят вакцинируемому пациенту, он стимулирует продукцию анти-HBsAg антител, которые защищают от HBV инфекции. Согласно одному предпочтительному аспекту данного изобретения препарат антигена гепатита (Hep), используемый в вакцине данного изобретения, содержит Hep антигены, полученные из поверхностного антигена штамма гепатита В (HBsAg).

Для производства вакцины HBsAg может быть получен либо очищением антигена в крупнодисперсной форме из плазмы носителей хронического гепатита В, так как большие количества HBsAg синтезируются в печени и высвобождаются в кровоток в ходе HBV инфекции, либо экспрессией белка рекомбинантными ДНК способами. HBsAg для применения в вакцине данного изобретения может быть получен любым способом.

Полиомиелит вызывают вирусы полиомиелита. Вакцина данного изобретения может содержать Sabin (Sabin 1 и/или Sabin 2) или Salk штаммы полиовируса. Согласно одному предпочтительному варианту осуществления данного изобретения вакцина данного изобретения содержит- Salk штаммы. Существует 3 типа Salk штаммов, которые могут вызывать полиомиелит. Три типа являются сходными и вызывают идентичные симптомы, но они антигенно очень отличаются и инфицирование одним типом не защищает от инфицирования другими. Salk полиовирус включает 3 штамма - тип 1 (например, Mahoney штамм), тип 2 полиовируса (например, MEF-I штамм) и тип 3 полиовируса (например, Saukett штамм). Согласно предпочтительному варианту осуществления данного изобретения вакцина данного изобретения может содержать один или более из указанных Salk штаммов.

Полиовирусы могут быть выращены в клеточной культуре. Клеточная линия Vero, которая представляет собой стабильную клеточную линию, полученную из почки обезьяны, может быть использована для выращивания полиовирусов. После выращивания вирионы могут быть очищены использованием уже известных методик. Может быть проведена инактивация вирусов. Количества полиовируса типично выражают в 'DU' единице ("D-антигенная единица"). Препарат антигена IPV, используемый в получении вакцины данного изобретения, предпочтительно получают так, чтобы он содержал один или более штаммов, которые используются в производстве вакцины. Этот основной объем препарата затем используют для составления вакцины данного изобретения.

Неантигенные компоненты вакцины

Наряду с антигенными компонентами вакцина может содержать ряд неантигенных компонентов, которые являются фармацевтически приемлемыми наполнителями. Они включают, но не ограничиваются, рН модификаторы, буферы, адъюванты, консервант, носитель и агенты, модифицирующие тоничность.

Адъюванты

Антигены окончательного состава могут быть или могут не быть адсорбированными на адъюванте. Адъювант функционирует для стимулирования выработки иммунитета против ингредиентов вакцины, делая вакцину более эффективной.

Адъюванты могут служить для:

- Приведения антигена в контакт с иммунной системой и влияния на тип вызываемого иммунитета, а также качество иммунного ответа (величина или длительность);

- Уменьшения токсичности определенных антигенов; и

- Обеспечения растворимости некоторых компонентов вакцин.

Исследования показали, что многие алюминийсодержащие вакцины вызывают более сильные и более длительные ответы антител, чем сопоставимые вакцины без адъюванта. Преимущество адъювантов обычно наблюдалось во время серий первичной иммунизации, нежели с повторными иммунизациями.

Адъюванты на основе алюминия являются наиболее часто используемыми адъювантами. Эти адъюванты были также одобрены FDA (Управление США по надзору за качеством пищевых продуктов и лекарственных средств) для применения в вакцинах. Существует три главных типа алюминийсодержащих адъювантов:

- Гидроксид алюминия

- Фосфат алюминия

- Калий-алюминий сульфат (часто называемый "квасцы")

Один вариант осуществления данного изобретения касается определенных антигенов вакцины, подлежащих адсорбции на фосфате алюминия, и определенных антигенов вакцины, адсорбированных на гидроксиде алюминия. Определенные антигены данного изобретения могут не быть адсорбированы или, по сути, адсорбированными на каком-либо адъюванте. Преимущество адъюванта для адсорбции указанных антигенов дает вакцине данного изобретения свои характеристики. Преимущество адсорбции описано более детально в разделе 'Способ производства вакцины данного изобретения' ниже.

Консерванты

Вакцины подвержены загрязнению бактериями. Таким образом, чтобы избежать потенциально угрожающему жизни загрязнению вредными микробами, которые могут быть введены во внедряемую вакцину во время случайного заражения, консервант может быть включен в композицию вакцины при ее составлении. Консерванты, которые могут быть использованы, включают хлорид бензетония (Phemerol), тиомерсал, фенол и 2-феноксиэтанол (2-РОЕ).

Тимеросал представляет собой ртутьсодержащее органическое соединение (огранортутное), которое используется во многих вакцинах как консервант. Существуют сообщения, касающиеся определенных аллергических реакций на тиомерсал, главным образом, в форме местных реакций гиперчувствительности замедленного типа, включая покраснения и припухлость в месте инъекции. Также существуют противоречивые сообщения о связи аутизма с ртутью.

2-феноксиэтанол (2-РОЕ) также известен как '1-гидрокси-2-феноксиэтан', '2-гидроксиэтил-фениловый эфир', 'фениловый эфир этиленгликоля' и т.д. Профиль безопасности 2-феноксиэтанола лучше, чем у ртутных консервантов (например, тиомерсала). Таким образом, имеется необходимость избегать тиомерсала и использовать 2-феноксиэтанол в вакцинах.

Таким образом, другой предпочтительный вариант осуществления данного изобретения касается применения 2-феноксиэтанола в качестве консерванта в композиции вакцины. Согласно другому предпочтительному варианту осуществления данного изобретения концентрация 2-феноксиэтанола составляет 5 мг/мл вакцины.

Агенты, модифицирующие тоничность

Для контроля тоничности композиции вакцины, предпочтительно агент, модифицирующий тоничность, включают в состав вакцины. Эти агенты включают, но не ограничиваясь, соли (примеры - NaCl, MgCl₂, КС1, СаС1₂), сахара (примеры - декстроза, маннитол, лактоза), аминокислоты (примеры -аргинин, глицин, гистидин) и пол иолы (примеры - сахароза, глицерин, сорбит). В более предпочтительном варианте осуществления физиологическая соль, такая как соль натрия, используется в составе вакцины. Хлорид натрия (NaCl) наиболее предпочтительно включается в композицию вакцины данного изобретения. рН модификаторы и/или буферы

Различные рН модификаторы, известные специалисту в данной области техники, могут быть использованы для регулирования рН композиции вакцины, как это необходимо, такие как гидроксид натрия или соляная кислота. Различные буферы, такие как фосфат натрия, фосфат калия и цитратные буферы могут быть использованы в составе вакцины.

Композиция вакцины данного изобретения

Композиция вакцины данного изобретения является такой, чтобы вакцина данного изобретения оказывалась иммуногенной в силу количеств каждого из антигенов, содержащихся в вакцине. Каждый из антигенов в вакцине данного изобретения находится предпочтительно в таких количествах, что комбинированная вакцина при введении субъекту, вызывает иммунный ответ у субъекта против указанного антигена композиции. Комбинированная вакцина данного изобретения содержит антигены дифтерии (D), столбняка (Т), цельноклеточного коклюша (wP) и полиомиелита (IPV) и, факультативно, другие антигены, выбранные из группы Haemophilus influenzae (Hib) и гепатита (Hep).

Согласно одному варианту осуществления данного изобретения вакцина содержит D, Т, wP, Hib b и IPV (Mahoney тип 1, MEF тип 2 и Saukett тип 3), где D присутствует в количестве около 1-40 Lf (флокуллирующая единица токсина), Т присутствует в количестве около 1-25 Lf, wP присутствует в количестве около 1-30 IOU на 0,5 мл и Hib b присутствует в количестве около 1-20 мкг на 0,5 мл и штаммы Mahoney тип 1, MEF тип 2 и Saukett тип 3 присутствуют в количестве около 1-50 DU (D-антигенные единицы), 1-15 DU и 1-50 DU, соответственно на 0,5 мл, чтобы обеспечить пятивалентную вакцину, которая будет стабильной, иммуногенной и в форме полностью жидкого состава.

Согласно одному предпочтительному варианту осуществления данного изобретения пятивалентная вакцина данного изобретения содержит D, Т, wP, Hib b и IPV, где D присутствует в количестве около 20 Lf, Т присутствует в количестве около 7,5 Lf, wP присутствует в количестве около 16 IOU на 0,5 мл, и Hib b присутствует в количестве около 10 мкг на 0,5 мл и штаммы Mahoney тип 1, MEF тип 2 и Saukett тип 3 присутствуют в количестве около 40 DU, 8 DU и 32 DU, соответственно на 0,5 мл. Такую вакцину составляют, чтобы получить полностью жидкую комбинированную вакцину, которая будет стабильной и иммуногенной при введении субъекту.

Согласно другому варианту осуществления данного изобретения шестивалентная вакцина содержит D, Т, wP, Hib b, Hep В и IPV (Mahoney тип 1, MEF тип 2 и Saukett тип 3), где D присутствует в количестве около 1-40 Lf, Т присутствует в количестве около 1-25 Lf, wP присутствует в количестве около 1-30 IOU на 0,5 мл, Hib b присутствует в количестве около 1-20 мкг и Hep В присутствует в количестве около 1-20 мкг на 0,5 мл и штаммы Mahoney тип 1, MEF тип 2 и Saukett тип 3 присутствуют в количестве около 1-50 DU, 1-15 DU и 1-50 DU, соответственно на 0,5 мл, чтобы обеспечить полностью жидкую стабильную комбинированную вакцину, которая будет иммуногенной при введении субъекту.

Согласно другому предпочтительному варианту осуществления данного изобретения шестивалентная вакцина содержит D, Т, wP, Hib b, Hep В и где D присутствует в количестве около 20 Lf, Т присутствует в количестве около 7,5 Lf, wP присутствует в количестве около 16 IOU на 0,5 мл, Hib b присутствует в количестве около 10 мкг и Hep В присутствует в количестве около 10 мкг на 0,5 мл и штаммы Mahoney тип 1, MEF тип 2 и Saukett тип 3 присутствуют в количестве около 40 DU, 8 DU и 32 DU, соответственно на 0,5 мл. Такая вакцина будет стабильной вакциной, способной обеспечить защитный иммунный ответ против всех антигенов композиции при введении субъекту.

Еще один аспект данного изобретения касается пятивалентной вакцины, содержащей DTwP, Hib b и Hep В, где D присутствует в количестве около 1-40 Lf, Т присутствует в количестве около 1-25 Lf, wP присутствует в количестве около 1-30 IOU, Hib b присутствует в количестве около 2-20 мкг и Нер В присутствует в количестве около 1-20 мкг на 0,5 мл, чтобы обеспечить полностью жидкую стабильную и иммуногенную комбинированную вакцину.

Согласно одному предпочтительному аспекту данного изобретения пятивалентная вакцина содержит DTwP, Hib b и Hep В, где D присутствует в количестве около 20 Lf, Т присутствует в количестве около 7,5 Lf, wP присутствует в количестве около 16 IOU, Hib b присутствует в количестве около 10 мкг и Hep В присутствует в количестве около 10 мкг на 0,5 мл. Такая вакцина является стабильной и находится в форме полностью жидкого состава. Такая вакцина будет стабильной вакциной, способной обеспечить защитный иммунный ответ против всех антигенов композиции при введении субъекту.

Данное изобретение дополнительно касается способа индуцирования иммунологического ответа на любой антиген, выбранный из группы D, Т, Р, Hib, Hep или IPV, включающего введение иммунологически активного количества вакцины данного изобретения.

Согласно другому аспекту данного изобретения содержание алюминия (А1⁺³) в вакцине данного изобретения может и не быть более чем предпочтительно, 2 мг на 0,5 мл, более предпочтительно 1 мг на 0,5 мл и наиболее предпочтительно 0,6 мг на 0,5 мл.

Согласно другому аспекту данного изобретения предпочтительное количество 2-феноксиэтанола в комбинированной вакцине данного изобретения может быть 5 мг/мл.

Способ производства вакцины данного изобретения

Один из аспектов данного изобретения касается способа производства вакцины данного изобретения. Иммуногенность, стабильность и поддержание правильной формы антигенов в иммуногенной композиции может зависеть от способа составления композиции. Это может включать последовательность добавления антигенов, применение специфических адъювантов для определенных антигенов, применение различных параметров, включая помешивание, температуру и рН.

Один из вариантов осуществления данного изобретения касается способа производства полностью жидкой комбинированной вакцины, содержащей антигены дифтерии (D), столбняка (Т), цельноклеточного коклюша (wP) и IPV и, факультативно, один или более антигенов, выбранных из группы Haemophilus influenzae (Hib) и гепатита (Hep), который включает этапы, на которых:

a) готовят компонент I, содержащий смесь антигенов i) дифтерии (D), ii) столбняка (Т) и Hi) цельноклеточного коклюша (wP),

b) факультативно готовят компонент II, содержащий Hep, адсорбированный на солях алюминия,

c) факультативно смешивают компонент II с компонентом I для получения смеси,

d) добавляют вышеупомянутую смесь [полученную в а) или с)] к Hib, с последующим добавлением IPV антигенов.

Согласно одним предпочтительным вариантам осуществления данного изобретения D и Т антигены адсорбируют на фосфате алюминия.

Другие предпочтительные варианты осуществления данного изобретения касаются получения компонента I, которое включает следующие этапы, на которых:

a) переносят гель фосфата алюминия в сосуд,

b) переносят препарат антигена столбняка в вышеупомянутый сосуд,

c) переносят препарат антигена дифтерии при перемешивании в указанный сосуд,

d) переносят 2-феноксиэтанол в указанный сосуд,

e) переносят раствор хлорида натрия в указанный выше сосуд при постоянном перемешивании,

f) проверяют рН и регулируют его в диапазоне 6,0-6,5,

g) переносят препарат антигена wP при перемешивании в тот же сосуд,

h) проверяют рН и регулируют его в диапазоне 6,5-7,5.

Способ дополнительно включает получение компонента II, включающий следующие этапы, на которых:

a) переносят гель фосфата алюминия в сосуд,

b) переносят препарат антигена гепатита при перемешивании в вышеупомянутый сосуд,

c) переносят раствор хлорида натрия при перемешивании в тот же сосуд,

d) переносят препарат 2-феноксиэтанола в указанный выше сосуд,

e) проверяют рН и регулируют его так, чтобы он попадал в диапазон 6,0-7,0.

Способ дополнительно включает смешивание компонента I и компонента II, содержит этап, на котором переносят содержимое компонента II в компонент I для получения смеси.

Способ дополнительно включает смешивание вышеупомянутой смеси с Hib и IPV антигенами, включающее следующие этапы, на которых:

a) переносят вышеупомянутую смесь в препарат антигена Hib при перемешивании для получения другой смеси,

b) переносят вышеупомянутую смесь в IPV антиген с последующим добавлением солевого раствора,

c) проверяют рН и регулируют его в диапазоне 6,5-7,5.

Другой предпочтительный вариант осуществления данного изобретения касается добавления компонента I к Hib и IPV антигенам, включающего следующие этапы, на которых:

a) переносят компонент I в препарат антигена Hib при перемешивании для получения смеси,

b) переносят вышеупомянутую смесь в препарат антигена IPV с последующим добавлением солевого раствора,

Другой предпочтительный аспект данного изобретения касается получения вакцины, включающего следующие этапы, на которых:

a) получают компонент I, содержащий смесь антигенов i) дифтерии (D), ii) столбняка (Т) и iii) цельноклеточного коклюша (wP),

b) получают компонент II, содержащий Hep, адсорбированный на солях алюминия,

c) смешивают компонент II с компонентом I для получения смеси,

d) добавляют вышеупомянутую смесь к Hib антигену.

Способ дополнительно содержит получение компонента I, которое включает следующие этапы, на которых:

a) переносят гель фосфата алюминия в сосуд,

b) переносят препарат антигена столбняка при перемешивании в вышеупомянутый сосуд,

c) переносят препарат антигена дифтерии в указанный сосуд,

e) переносят раствор хлорида натрия в указанный выше сосуд при перемешивании,

g) переносят препарат антигена wP в тот же сосуд,

Способ дополнительно касается приготовления компонента II, включающего следующие этапы, на которых:

a) переносят гель фосфата алюминия в сосуд,

b) переносят препарат антигена гепатита в вышеупомянутый сосуд,

c) переносят раствор хлорида натрия в тот же сосуд,

d) переносят препарат 2-феноксиэтанола при перемешивании в указанный выше сосуд,

Способ дополнительно касается смешивания компонента I й компонента II, содержит этап, на котором переносят содержимое компонента II в компонент I для получения смеси.

Способ дополнительно включает следующие этапы, на которых:

a) переносят вышеупомянутую смесь в препарат антигена Hib,

b) проверяют рН и регулируют его в диапазоне 6,5-7,5.

Согласно одному предпочтительному варианту осуществления данного изобретения перемешивание, как упоминается в любом из указанных выше этапов, проводят при 150 rpm (обороты/минуту) при 25±2°С в течение от около 30 минут до 2 часов.

Следующие примеры используются для дополнительной иллюстрации данного изобретения и его преимуществ. Следующие специфические примеры представлены с пониманием того, что они предназначены для иллюстрации, не выступая в роли ограничения объема данного изобретения.

ПРИМЕР I

Этот пример дает композицию и способ производства шестивалентной вакцины согласно одному аспекту данного изобретения

А] Композиция шестивалентной вакцины согласно данному изобретению является следующей:

Каждые 0,5 мл вакцины содержат следующее:

Таблица 1
КОМПОНЕНТЫ	КОЛИЧЕСТВО
Анатоксин дифтерии (DT)	20 Lf
Анатоксин столбняка (ТТ)	7,5 Lf
Инактивированный В. pertussis антиген (wP)	16 IOU
Haemophilus influenzae (Hib) b (капсулярный полисахарид) антиген	10 мкг
Поверхностный антиген гепатита (Hep) В (HBsAg)	10 мкг
Инактивированный вирус полиомиелита (IPV)
Тип 1	40 D единиц
Тип 2	8 D единиц
Тип 3	32 D единиц
Другие ингредиенты:-
Содержание алюминия (в виде фосфата алюминия)	*NMT 0,6 мг А1⁺³
2-Феноксиэтанол	2,5 мг
*NMT - не более чем.

В] Способ производства шестивалентной вакцины согласно данному изобретению являются следующим:

Процедура составления для компонента I

Гель фосфата алюминия переносили в сосуд с последующим добавлением антигена столбняка и антигена дифтерии при перемешивании для получения смеси. 2-феноксиэтанол затем смешивали с вышеупомянутой смесью в указанном сосуде. Раствор хлорида натрия затем добавляли к указанному выше. рН смеси проверяли и регулировали так, чтобы он попадал в диапазон 6,0-6,5. wP антиген затем переносили в тот же сосуд. рН смеси затем проверяли и регулировали так, чтобы он попадал в диапазон 6,5-7,5.

Процедура составления для компонента II

Гель фосфата алюминия переносили в сосуд с последующим добавлением антигена гепатита В. Раствор хлорида натрия затем переносили в тот же сосуд с последующим добавлением 2-феноксиэтанола. рН смеси проверяли и регулировали так, чтобы он попадал в диапазон 6,0-7,0.

Смешивание компонента I и компонента II

Этот этап проводили путем переноса содержимого компонента II в компонент I для получения смеси.

Добавление основного объема Hib b и IPV

Дополнительно вышеупомянутую смесь компонента I и II смешивали с препаратом Hib b антигена для получения смеси. Это дополнительно добавляли к IPV антигену для получения смеси и солевой раствор добавляли к вышеупомянутой смеси для получения шестивалентной вакцины, рН проверяли и регулировали так, чтобы он попадал в диапазон 6,5-7,5.

ПРИМЕР II

Этот пример дает композицию и способ производства пятивалентной вакцины согласно одному аспекту данного изобретения

А] Композиция пятивалентной вакцины согласно данному изобретению является следующей

Каждые 0,5 мл вакцины содержат следующее:

Таблица 2
КОМПОНЕНТЫ	КОЛИЧЕСТВО
Анатоксин дифтерии (DT)	20 Lf
Анатоксин столбняка (ТТ)	7,5 Lf
Инактивированный В. pertussis антиген (wP)	16 IOU
Haemophilus influenzae (Hib) b (капсулярный полисахарид) антиген	10 мкг
Инактивированный вирус полиомиелита (IPV)
Тип 1	40 D единиц
Тип 2	8 D единиц
Тип 3	32 D единиц
Другие ингредиенты:-
Содержание алюминия (в виде фосфата алюминия)	*NMT 0,6 мг Al⁺³
2-феноксиэтанол	2,5 мг
*NMT - не более чем

В] Способ производства пятивалентной вакцины согласно данному изобретению является следующим:

Процедура составления для компонента I

Добавление основного объема Hib b и IPV

Компонент I добавляли к Hib b антигену для получения смеси, которую затем смешивали с препаратом антигена IPV и солевым раствором для получения пятивалентной вакцины. рН смеси регулировали так, чтобы он попадал в диапазон 6,5-7,5.

ПРИМЕР III

Каждые 0,5 мл вакцины содержат следующее:

Таблица 3
КОМПОНЕНТЫ	КОЛИЧЕСТВО
Анатоксин дифтерии (D)	20 Lf
Анатоксин столбняка (Т)	7,5 Lf
Инактивированный В. pertussis антиген (wP)	16 IOU
Haemophilus influenzae (Hib) b (капсулярный полисахарид) антиген	10 мкг
Поверхностный антиген гепатита (Hep) В (HBsAg)	10 мкг
Другие ингредиенты:-
Содержание алюминия (в виде фосфата алюминия)	*NMT 0,6 мг Al⁺³
2-феноксиэтанол	2,5 мг

*NMT - не более чем.

Процедура составления для компонента I

Процедура составления для компонента II

Гель фосфата алюминия переносили в сосуд с последующим добавлением препарата антигена Hep В. Раствор хлорида натрия затем переносили в тот же сосуд с последующим добавлением препарата 2-феноксиэтанола для получения смеси. рН регулировали так, чтобы он попадал в диапазон 6,0-7,0.

Смешивание компонента I и компонента II

Этот этап включал перенос содержимого компонента II в компонент I для получения смеси.

Добавление основного объема Hib b

Вышеупомянутую смесь компонентов I и II затем смешивали с препаратом антигена Hib b для получения пятивалентной вакцины. рН полученной смеси проверяли и регулировали так, чтобы он попадал в диапазон 6,5-7,5.

ПРИМЕР IV

Этот пример дает краткий обзор испытания эффективности in-vivo, проведенного для антигенов дифтерии, столбняка, цельноклеточного коклюша, Haemophilus influenzae типа (Hib) b, гепатита В и инактивированного полиомиелита и данных стабильности или эффективности для них.

A] In-vivo испытание эффективности, проведенное для антигенов дифтерии, столбняка, цельноклеточного коклюша, Haemophilus influenzae типа (Hib) b, гепатита В и инактивированного полиомиелита

1. Анатоксин дифтерии

Необходимый вид животного:	Морские свинки
Количество животных, необходимых:	116 (48 для испытания, 48
для 1 партии	для эталона и 20 для LD₅₀)
Путь введения вакцины:	Подкожный
Объем инъекции:	1,0 мл
Количество дней, в течение которых:	28

животные находились в клетках

Эффективность анатоксина дифтерии определяли на морских свинках с помощью способов контрольного заражения смертельными дозами. В этом способе три разведения каждой из анализируемой и эталонной вакцины готовили так, что среднее разведение содержит ED₅₀ дозу, которая спасает, по меньшей мере, или более чем 50% анализируемых животных. Шестнадцать морских свинок для каждого разведения анализируемой вакцины и эталонной вакцины инокулировали и через 28 дней анализируемых животных контрольно заражали токсином дифтерии, содержащим 100 LD₅₀- Группу из двадцати морских свинок оставляли неиммунизированными для титрования токсина дифтерии и эту группу морских свинок инокулировали различными разведениями токсина дифтерии, 5 морских свинок для каждого разведения.

Испытание завершали через 33 дня. Дополнительные вычисления были проведены с использованием PROBIT. Образец проходит испытание на эффективность дифтерии, если он содержит ≥30 IU (международных единиц)/отдельная доза для человека.

- Анализируемая вакцина должна соответствовать линейности и параллельности эталонной вакцины.

- Доверительный предел оцененной эффективности должен находиться между 50 и 200%.

- Оцененная эффективность должна быть не менее чем 30 I.U. на отдельную дозу для человека.

- Предел 95% доверительного интервала оценки эффективности должен быть в пределах 50-200%, кроме того, что нижний предел 95% доверительного интервала оцененной эффективности должен быть больше чем 30 I.U. на дозу.

2. Анатоксин столбняка

Необходимый вид животного:	Домовые мыши-альбиносы
Количество животных, необходимых:	116 (48 для испытания, 48
для 1 партии	для эталона и 50 для LD₅₀)
Путь введения вакцины:	Подкожный
Объем инъекции:	0,5 мл

Количество дней, в течение которых: 28

животные находились в клетках

Эффективность анатоксина столбняка определяли на домовых мышах способами контрольного заражения смертельными дозами. В испытании три разведения каждой из анализируемой и эталонной вакцины готовили так, что среднее разведение содержит ED₅₀ дозу, которая спасает, по меньшей мере, или более чем 50% анализируемых животных. Группу из шестнадцати домовых мышей для каждого разведения анализируемой вакцины, а также эталонной вакцины инокулировали и через 28 дней содержания в клетке анализируемых животных контрольно заражали токсином столбняка, содержащим 100 LD₅₀. Группу из двадцати домовых мышей оставляли неиммунизированными для титрования токсина столбняка и инокулировали 5 мышей для 4 разведений LD₅₀ титрования. Испытание завершали через 33 дня. Дополнительно вычисления проводили с использованием PROBIT. Образец для испытания на эффективность проходит испытание эффективности столбняка, если он содержит ≥60 IU/отдельная доза для человека.

- Оцененная эффективность должна быть не менее чем 60 IU. на отдельную дозу для человека.

Предел 95% доверительного интервала оценки эффективности должен быть в пределах 50-200%, кроме того, что нижний предел 95% доверительного интервала оцененной эффективности должен быть больше чем 60 I.U. на дозу.

3. Антиген цельноклеточного коклюша

Необходимый вид животного:	Домовые мыши
Количество животных, необходимых:	194 (72 для испытания, 72
для 1 партии	для эталона и 50 для LD50)
Путь введения вакцины:	Интраперитонеальный
Объем инъекции:	0,5 мл

Количество дней, в течение которых: 14

животные находились в клетках

Испытание эффективности антигена коклюша проводили на домовых мышах с помощью испытания на наличие защитных антител у мышей. В этом способе три разведения каждой из анализируемой и эталонной вакцины готовили в нормальном солевом растворе так, чтобы среднее разведение содержало ED₅₀ дозы, которая спасает, по меньшей мере, или более чем 50% анализируемых животных. Группу из 24 домовых мышей иммунизировали на разведение и затем всех иммунизированных животных интрацеребрально контрольно заражали 0,03 мл дозы контрольного заражения (приблизительно 100000 организмов на 0,03 мл) на 14^ый день. После контрольного заражения анализируемых животных наблюдали в течение 14 дней и смерть и выживание анализируемых животных регистрировали. Смерть, произошедшая в первые три дня после контрольного заражения, считалась неспецифической. Дополнительные вычисления были проведены с использованием PROBIT. Образец проходит испытание эффективности коклюша, если он содержит ≥4 IU/отдельная доза для человека (SHD) и нижний доверительный предел составляет не менее чем 2 IU/SHD.

4. Антиген Hemophilus influenza (Hib) типа b

Необходимый вид животного:

Домовые мыши

Количество животных, необходимых:

для 1 партии	16 (8 для иммунизации, служили в качестве контроля)
Путь введения вакцины:	Подкожный
Объем инъекции:	0,5 мл
Количество дней, в течение которых:	35

животные находились в клетках

Испытание эффективности Hib b антигена проводили на домовых мышах с помощью способа ELISA (ферментный иммуносорбентный анализ). В этом испытании отбирали две группы (анализируемая и контрольная группа), каждая из 8 домовых мышей. Каждой мыши анализируемой группы подкожно вводили инъекцией 0,5 мл разведенной 1:4 вакцины и контрольную группу оставляли неинокулированной. Ревакцинирующую дозу вводили на 10^ый и 20ыи день и конечный забор крови проводили на 35ь,и день. Образцы сыворотки анализировали на антитело против Hib с помощью способа ELISA. Образец проходит испытание эффективности Hib, если ≥50% мышей в анализируемой группе являлись сероконвертированными.

5. Поверхностный антиген гепатита В

Необходимый вид животного:	Balb С мыши
Количество животных, необходимых:	110 (50 для образца, 50 для
для 1 партии	эталона, 10 для плацебо)
Путь введения вакцины:	Интраперитонеальный
Объем инъекции:	1,0 мл
Количество дней, в течение которых:	28

животные находились в клетках

Испытание эффективности поверхностного антигена гепатита В проводили на Balb/C мышах. В этом испытании готовили пять двукратных разведений каждой из эталонной и анализируемой вакцины и десять мышей были интраперитонеально инокулированы на каждое разведение. Десять мышей инокулировали разбавителем и они служили в качестве плацебо. У инокулированных мышей проводили забор крови на 28^ойдень инокуляции и сыворотки отделяли, внимательно отслеживая, чтобы не было гемолиза. Образцы сывороток анализировали на титр антител против гепатита В с помощью ELISA. Образец проходит испытание эффективности гепатита В, если верхний предел его относительной эффективность ≥1.

6. Вакцина инактивированного полиомиелита (IPV)

Необходимый вид животного:	крысы Вистар
Количество животных, необходимых:	100 (50 для анализируемой
для 1 партии	вакцины, 50 для эталонной
	вакцины)
Путь введения вакцины:	Внутримышечный
Объем инъекции:	0,5 мл

Количество дней, в течение которых: 21

животные находились в клетках

Испытание эффективности IPV проводили на PJVM ТОХ крысах. Готовили пять трехкратных разведений каждой из эталонной и анализируемой вакцины и десятерым крысам внутримышечно вводили инъекцию 0,5 мл каждого разведения. У анализируемых животных проводили забор крови через 21 день после иммунизации и образцы сыворотки собирали, аккуратно избегая лизиса эритроцитов. Каждый образец сыворотки анализировали на титр антител против серотипов вируса полиомиелита типа 1, типа 2 и типа 3 с помощью реакции сывороточной нейтрализации.

Испытание является недействительным за исключением тех случаев, когда:

- средняя эффективная доза (ED50) как для анализируемой, так и для эталонной вакцин находится между наименьшей и наибольшей дозами, которые вводят животным;

- статистический анализ не показывает существенного отклонения от линейности и параллельности;

- доверительные пределы оцененной относительной эффективности попадают в диапазон от 25% до 400% оцененной эффективности.

В] Данные стабильности или эффективность антигенов в вакцине данного изобретения

1) Анализы были проведены, как показано в Примере IV А] для всех антигенов шестивалентной вакцины Примера I. Результаты представлены в таблице ниже.

Таблица 4
Компоненты		Допустимые пределы	Длительное исследование (5°С±3°С)
Компоненты		Допустимые пределы	6 месяцев	12 месяцев
Анатоксин дифтерии (DT) (Эффективность)		≥60 IU/мл	157,28	-
Анатоксин столбняка (ТТ) (Эффективность)		≥120 IU/мл	209,57	~
Инактивированный В. pertussis (wP) (Эффективность)		≥8 IU/мл	9,44	9,69
Антиген капсулярного полисахарида (Hib b) (Эффективность)		≥50%	62,5	75
Поверхностный антиген гепатита (Hep) В (HBsAg) (Эффективность)		≥1,0	1,56	1,50
Инактивированный вирус полиомиелита (IPV) (Эффективность)	Тип 1	Эффективность анализируемой вакцины должна быть не менее, чем эталонной вакцины	-	Соответствует
	Тип 2		-	Соответствует
	Тип 3		-	Соответствует

Таким образом, можно увидеть, что даже после длительного хранения вакцины при 5±3°С, антигены вакцины все еще эффективны/имеют иммуногенность выше допустимых пределов.

2) Испытания проводили, как показано в Примере IV А] для всех антигенов пятивалентной вакцины Примера II. Результаты представлены в таблице ниже.

Таблица 5
Компоненты	Допустимые пределы	Длительное исследование (5°С±3°С)
		6 месяцев	12 месяцев

Анатоксин дифтерии (DT) (Эффективность)		≥60 IU/мл	166,22	-
Анатоксин столбняка (ТТ) (Эффективность)		≥120 IU/мл	208,77	-
Инактивированный В. pertussis (wP) (Эффективность)		≥8 IU/мл	9,37	10,5
Антиген капсулярного полисахарида (Hib b) (Эффективность)		≥50%	87,5	75
Инактивированный вирус полиомиелита (IPV) (Эффективность)	Тип 1	Эффективность анализируемой вакцины должна быть не менее чем эталонной вакцины	-	Соответствует
	Тип 2		-	Соответствует
	Тип 3		-	Соответствует

Claims

1. Комбинированная вакцина, содержащая антигены дифтерии (D), столбняка (Т), цельноклеточного коклюша (wP), Hib b и Нер В, и 2-феноксиэтанол в качестве консерванта, причем вакцина не содержит IPV антигены, где Hib конъюгирован с белком-носителем, выбранным из группы, содержащей анатоксин столбняка, анатоксин дифтерии, CRM 197 и наружный белок мембраны Neisseria meningitides, или любые другие известные носители, и где степень адсорбции Hib на адъювант составляет не более 15%, и где все указанные компоненты находятся в жидком состоянии и являются стабильными.

2. Вакцина по п.1, где D и Т антигены адсорбированы на фосфате алюминия.

3. Вакцина по п.1, где Hib антиген получен из капсулярного полисахарида Hib b штамма.

4. Вакцина по п.1, где Нер антиген адсорбирован на фосфате алюминия.

5. Вакцина по п.1, где Нер антиген получен из поверхностного антигена Нер В штамма.

6. Вакцина по п.1, где D присутствует в количестве около 1-40 Lf, T присутствует в количестве около 1-25 Lf, wP присутствует в количестве около 1-30 IOU, Hib b присутствует в количестве около 2-20 мкг и Нер В присутствует в количестве около 1-20 мкг на 0,5 мл.

7. Вакцина по п.6, где D присутствует в количестве около 20 Lf, Т присутствует в количестве около 7,5 Lf, wP присутствует в количестве около 16 IOU, Hib b присутствует в количестве около 10 мкг и Нер В присутствует в количестве около 10 мкг на 0,5 мл.

8. Способ производства комбинированной вакцины по п.1, включающий этапы, на которых:
а) готовят компонент I, содержащий смесь антигенов i) дифтерии (D), ii) столбняка (Т), iii) цельноклеточного коклюша (wP) и iv) 2-феноксиэтанола,
b) готовят компонент II, содержащий Нер В, адсорбированный на солях алюминия, с последующим добавлением 2-феноксиэтанола,
c) смешивают компонент II с компонентом I для получения смеси, и
d) добавляют вышеописанную смесь к Hib антигену.

9. Способ по п.8, где D и Т антигены адсорбируют на фосфате алюминия.

10. Способ по п.8, где приготовление компонента I включает следующие этапы, на которых:
a) переносят гель фосфата алюминия в сосуд,
b) переносят препарат антигена столбняка при перемешивании в вышеупомянутый сосуд,
c) переносят препарат антигена дифтерии в указанный сосуд,
d) переносят 2-феноксиэтанол,
e) переносят раствор хлорида натрия в указанный выше сосуд,
f) проверяют рН и регулируют его в диапазоне 6,0-6,5,
g) переносят препарат антигена wP в тот же сосуд, и h) проверяют рН и регулируют его в диапазоне 6,5-7,5.

11. Способ по п.8, где приготовление компонента II включает следующие этапы, на которых:
a) переносят гель фосфата алюминия в сосуд,
b) переносят препарат антигена Нер В в вышеупомянутый сосуд,
c) переносят раствор хлорида натрия в тот же сосуд,
d) переносят препарат 2-феноксиэтанола в указанный выше сосуд, и
е) проверяют рН и регулируют его так, чтобы он попадал в диапазон 6,0-7,0.

12. Способ по п.8, где смешивание компонента I и компонента II включает этап, на котором переносят содержимое компонента II в компонент I для получения смеси.

13. Способ по п.12, дополнительно включающий следующие этапы, на которых:
a) переносят полученную смесь в препарат антигена Hib, и
b) проверяют рН и регулируют его в диапазоне 6,5-7,5.

14. Применение иммунологически активного количества комбинированной вакцины, указанной в п.1, для индуцирования иммунологического ответа на любой антиген, выбранный из группы D, Т, Р, Hib или Нер, у субъекта.