KR0123537B1 - 신규의 호왕바이러스 균주, 호왕바이러스 항원의 제조방법, 그 항원을 이용한 백신 및 유행성출혈열 진단시약 - Google Patents

Abstract

본 출원은 유행성출혈열의 신규 바이러스인 호왕바이러스(Howang virus) 항원의 제조방법 및 그 제조방법에 의하여 얻어지는 항원을 함유하는 유행성출혈열 백신 및 진단제를 개시한다. 더 상세히는 호왕바이러스를 마우스의 뇌세포에서 배양하고 마우스의 뇌를 적출하여 믹서와 소니케이터(sonicator)로 대량의 바이러스를 추출한 후, 프로타민 술페이트(protamin sulfate), 에탄올 및 초고속 원심분리기를 사용하여 상층액 중에 있는 순수한 바이러스를 분리한 후 바이러스 항원에 포름알데하이드 용액을 첨가하여 바이러스를 불활화하여 얻어진 바이러스 항원을 정제하거나, 호왕바이러스를 베로(Vero) E6 세포에 배양한 다음, 배양액과 감염된 세포를 소니케이터로 처리하여 세포내의 바이러스를 추출한 후 초고속 원심분리기를 사용하여 순수한 바이러스를 얻은 다음 불활화 용액을 첨가하여 불활화된 호왕바이러스 항원을 정제 제조하는 것과, 상기에서 얻은 바이러스 항원에 불활화제를 첨가하여 얻은 백신, 이상에서 얻어진 바이러스 항원을 항원항체 반응에 필요한 유효량을 함유하는 유행성출혈열의 새로운 진단제를 개시한다.

Description

신규의 호왕바이러스 균주, 호왕바이러스 항원의 제조방법, 그 항원을 이용한 백신 및 유행성출혈열 진단시약

제 1 도는 PCR로 증폭한 33개 한탄바이러스 cDNA 산물을 제한 엔도뉴클레아제 Nco I 및 Alu I로 절단한 패턴을 나타낸다.

제 2 도는 PCR로 증폭한 33개 한탄바이러스 cDNA 산물을 제한 엔도뉴클레아제 Mbo Ⅱ 및 Pst Ⅰ로 절단한 패턴을 나타낸다.

제 3 도는 베로 E6 세포배양에서의 호왕바이러스 플라크를 나타낸다.

제 4 도는 0.05% 포르말린으로 처리한 호왕바이러스의 불활화 곡선을 나타낸다.

제 5 도는 프로타민 술페이트 처리 양에 따른 호왕바이러스 항원의 역가를 나타낸다.

제 6 도는 포르말린으로 처리한 호왕바이러스 백신을 접종한 랫트의 항체반응 곡선을 나타낸다.

본 발명은 유행성출혈열의 신규 바이러스인 호왕바이러스(Howang virus), 이 호왕바이러스 항원의 제조방법, 그 제조방법에 의하여 얻어지는 항원을 함유하는 유행성출혈열 백신 및 그의 진단제에 관한 것이다.

더 상세히는 호왕바이러스를 마우스의 뇌세포에서 배양하고 마우스의 뇌를 적출하여 믹서와 소니케이터(sonicator)로 대량의 바이러스를 추출한 후, 프로타민 술페이트(protamin sulfate), 에탄올 및 초고속 원심분리기를 사용하여 상층액 중에 있는 순수한 바이러스를 분리한 후 바이러스 항원에 포름알데하이드 용액을 첨가하여 바이러스를 불활화하여 얻어진 바이러스 항원을 정제하거나, 호왕바이러스를 베로(Vero) E6 세포에 배양한 다음 배양액과 감염된 세포를 소니케이터로 처리하여 세포내의 바이러스를 추출한 후 초고속 원심분리기를 사용하여 순수한 바이러스를 얻은 다음 불활화 용액을 첨가하여 불활화된 호왕바이러스 항원을 정제 제조하는 것과, 상기에서 얻은 바이러스 항원에 불활화제를 첨가하여 얻은 백신, 이상에서 얻어진 바이러스 항원을 항원항체 반응에 필요한 유효량을 함유하는 유행성출혈열의 새로운 진단제에 관한 것이다.

유행성출혈열은 과거 한국에서는 한국형출혈열, 일본과 중국에서는 유행성출혈열, 러시아에서는 유행성신우신장염 그리고 유럽에서는 유행성신염으로 불리었다. 그러나 1982년 세계보건기구는 이들 질병이 새로운 한탄바이러스 또는 이와 유사한 바이러스에 의하여 발생됨으로 신증후출혈열이라는 새로운 이름으로 통일하였으나, 본 발명에서는 우리나라에서 널리 사용되고 있는 유행성출혈열이라는 용어를 사용하였다.

유행성출혈열(신증후출혈열)은 급성 전염성 질환으로 병원체는 분야비리데과 한탄바이러스 속에 속하는 한탄바이러스, 서울바이러스, 벨그라드바이러스 및 푸우말라바이러스의 4종이 현재까지 알려져 있으나 새로 발견된 호왕바이러스도 병원체임이 증명되었다. 이 병의 사망율은 지역에 따라 차이가 있으나 약 4∼7%에 달하며 한국에서는 제2종 법정 전염병으로 지정되어 있다.

이 병은 상기한 바이러스의 보균동물인 야서의 폐장과 배설물중에 함유되어 있는데 뇨, 타액 및 대변과 같이 배설된 후 바이러스의 흙, 풀, 고구마, 감자, 콩, 옥수수, 벼등에 묻어있다가 오염된 먼지와 같이 호흡기를 통하여 감염된다. 일본과 미국에서 유행되고 있는 유행성출혈열은 서울바이러스와 이와 유사한 바이러스가 원인균이며, 한국 및 중국에서는 한탄바이러스, 서울바이러스, 호왕바이러스 및 푸우말라바이러스가 원인균이다. 유럽에서 유행하는 유행성출혈열은 주로 푸우말라바이러스에 의하나 한탄바이러스와 벨그라드바이러스에 의한 감염도 있다.

금번 발명자가 한국에서 새로운 호왕바이러스를 발견하였는데 이 바이러스는 이미 알려진 출혈열 바이러스와는 다른 항원성, 병원성 및 분자생물학적 성질을 지니고 있다는 사실이 증명되었다.

전술한 유행성출혈열은 상기 바이러스들의 감염 후 1∼4주간의 잠복기를 거쳐 오한, 두통, 구토, 복통과 같이 40℃의 고열이 나며 전신에 출혈을 일으킨다. 보통 발열기간은 약 1주일이며 이때 요통, 결막출혈, 피하출혈 및 설사 등 여러가지 증상이 나타난다. 그후 저혈압기가 따르며 쇼크 증상이 나타나고, 중증에서는 감뇨기가 나타나 뇨독증과 폐수종으로 사망하기도 한다. 약 1주일의 감뇨기를 거쳐 회복기에 달하나 완전 회복까지는 약 1∼2개월이 소요되며 회복후에 신장기능의 저하가 후유증으로 남는 경우가 많다.

세계적으로 매년 약 20만명의 유행성출혈열 환자가 발생하는데 중국에서 약 15만명, 러시아에서 수천명, 구라파에서 수천명, 한국에서 약 2,000명 그리고 동남아, 미국 및 아프리카에서도 소수의 환자가 발생하고 있다.

유행성출혈열 백신으로는 현재 한국에서 발명된 한탄바이러스 백신(한타박스 : (주)녹십자사 제품)만이 사용되고 있으나, 일본, 중국 및 미국에서도 유행성출혈열 백신에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 한탄바이러스 백신은 한탄바이러스 84/105주를 젖먹이 마우스 뇌내에 접종하여 대량의 한탄바이러스를 얻은 후 일본뇌염백신 제조방법을 응용한 방법으로 제조되고 있다(참고, 특허공고번호 90-7952호).

유행성출혈열을 일으키는 바이러스중 한탄바이러스, 서울바이러스 및 벨그라드바이러스는 생후 1일된 쥐의 뇌내에 접종하였을 때만 1주일 후 뇌염으로 사망하나 생후 20일된 쥐에서는 효력이 없다. 그러나 호왕바이러스는 생후 1일된 쥐 뿐만 아니라 20∼30일된 쥐도 뇌염을 일으키기 때문에 대량생산이 용이하다. 그러나 푸우말라바이러스는 갓난쥐의 뇌내에 접종하여도 전혀 증식되지 않으며, 또한 현재까지 유전공학적 방법으로 얻은 한탄바이러스와 푸우말라바이러스의 RNA나 폴리사카라이드도 항원성이 미약하고 대량생산이 어렵기 때문에 백신용 항원으로 사용되지 못하고 있다.

본 발명의 호왕바이러스에 의하여 발병된 유행성출혈열 환자는 병원균이 한탄바이러스와 성질이 다르기 때문에 한탄바이러스에 의한 예방효과가 미약하고 또한 한탄바이러스 84/105주로 만든 진단시약으로 정확히 진단할 수 없다는 문제가 있다.

이러한 상황하에서, 본 발명자는 상기 호왕바이러스에 의한 질병을 예방 퇴치하기 위한 연구 결과, 이 병원균이 종래의 한탄바이러스와 분자생물학적으로 상이한 병원균임을 확인하고 이 병원균을 대량생산하는데 성공하고 이 병원균을 이용, 이 병원체의 감염을 저지 또는 억제할 수 있는 백신을 제조할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 상기의 호왕바이러스를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 호왕바이러스의 불활화 백신을 미생물학적 및 유전공학적으로 대량생산할 수 있는 효과적인 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 기타 목적, 이점등은 후술하는 바에 의해 상세히 이해될 수 있다. 이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자는 1990년 10월 경기도 포천에서 유행성출혈열 증세로 입원한 남자의 혈액을 발병 4일후에 채취하여 베로 E6 세포에 14일 간격으로 4대 계대배양한 후 새로운 바이러스를 분리하는데 성공하였다. 이 바이러스를 1993년 4월 23일에 한국 종균협회에 기탁하였으나, 본 발명의 균주가 병원성 균주임으로 기탁이 거부되었다(첨부된 기탁거부서 참조). 본 발명의 균주를 호왕바이러스 90/90으로 명명하고, 이를 호왕바이러스 백신 시이드로 사용하였다.

세계보건기구는 인체에 사용되는 백신은 환자에서 분리된 균주를 사용하는 것이 좋다고 하며, 암세포 유래의 바이러스는 안전성과 부작용이 문제되기 때문에 추천하지 않는다. 본 발명의 바이러스는 생후 20∼30일된 마우스나 젖먹이 랫트에서 양호하게 증식될 뿐만 아니라, 베로 E6 세포에서도 유전공학적으로 배양될 수 있기 때문에 상기 목적을 용이하게 달성할 수 있다.

본 발명의 호왕바이러스는 분야비리데(Bunyaviridae)과의 한탄바이러스(Hantavirus)속에 속하나, 이 균주는 현재까지 분리된 유행성출혈열의 병원체인 한탄바이러스, 서울바이러스, 벨그라드바이러스 및 푸우말라바이러스와 혈청학적, 분자생물학적 및 동물에 대한 병원성에도 차이가 있다.

본 발명의 호왕바이러스의 배양, 분리는 베로 E6 세포에서 이루어졌으며 베로 E6 세포는 ATCC(기탁번호 : C1008, CRL 1586)에서 분양받아 사용하였다.

본 발명의 호왕바이러스 90/90은 혈청학적 특성과 물리생화학적 성상이 한탄바이러스속에 속하며, 다음과 같은 특성을 지닌다.

1. 비리온 입자(virion particle)

직경이 약 100∼120nm의 구형 RNA 바이러스

2. 외막(envelope)

인지질을 포함한 2∼10nm 크기의 외막과 돌출부를 갖고 있다.

3. 구조

°단일 나선(single stranded) RNA

°3개의 분절

°분자량은 3.5×10⁶

°3개의 nucleocapsids

°envelope에 2개의 특이 당단백질을 함유.

4. 바이러스 증식

감염세포의 세포질

본 발명의 신규 호왕바이러스 90/90은 분자생물학적으로 다른 한탄바이러스와 다른데 그 차이는 하기 표 1, 제 1 도 및 제 2 도와 같다.

[표 1] PCR 방법으로 제조하는 한탄바이러스 cDNA를 제한효소로 절단한 cDNA 단편의 비교.

본 발명의 호왕바이러스 항원을 성숙한 쥐(생후 20∼30일된 쥐)와 젖먹이(생후 5∼10일된 쥐)의 뇌내에 접종하여 얻은 후 예방백신과 진단용 시약을 제조한다. 호왕바이러스는 생후 20∼30일된 쥐에서 증식하고 뇌염을 일으키기 때문에 현재 개발된 한탄바이러스 백신과는 달리 대량의 백신용 바이러스 항원을 용이하게 경제적으로 제조할 수 있다. 또 얻어진 바이러스 항원은 성숙한 쥐의 뇌조직에서 배양되었기 때문에 기존의 한탄바이러스 84/105 백신제조에 사용한 생후 24시간 이내의 갓난쥐의 미성숙 뇌세포에서 배양된 바이러스보다 항원성이 훨씬 우수하며 중화항체 생산능력도 월등이 좋다.

또한 대량의 백신 및 진단용 호왕바이러스 항원을 조직배양세포에서 얻는다. 호왕바이러스는 한탄바이러스와 달리 베로 세포에서 대량 증식되며 감염후 10일된 세포에서 최고량의 바이러스를 얻을 수 있다. 베로 세포에서 증식되는 호왕바이러스 항원의 양은 TCID₅₀가 10^7.8/ml이다. 현재까지 조직배양세포에서 배양된 한탄바이러스 백신은 없다. 조직배양세포에서 얻은 호왕바이러스 항원은 쥐 뇌에서 제조된 바이러스 항원보다 순수하고 뇌단백질이 없기 때문에 부작용이 없고 안전하다.

호왕바이러스는 환자에게 분리하고 성숙한 마우스를 1주일 이내에 죽이는 병원성이 높은 바이러스이기 때문에 세계보건기구가 요구하는 백신균주에 적합하다. 본 발명에서 불활화한 바이러스 항원은 일본뇌염 백신과 같이 안정성이 확보되며 좋은 면역효과가 기대된다. 호왕바이러스는 한탄바이러스속 중에서 유행성출혈열을 일으키는 한탄바이러스, 서울바이러스, 벨그라드바이러스 및 푸우말라바이러스와 형광항체법으로 교차반응을 나타내기 때문에 이들 바이러스에 대한 항체검사용 진단시약으로도 사용할 수 있으며, 특히 항원성이 다른 바이러스보다 우수하기 때문에 항체양성율이 높은 시약을 제조할 수 있다.

또한 바이러스의 배양은 생후 약 20일된 마우스와 조직배양한 세포를 사용하기 때문에 한탄바이러스 백신과 달리 쉽게 경제적으로 대량의 바이러스 항원을 얻을 수 있다. 구체적으로 생후 7∼20일된 마우스의 뇌에서 바이러스를 생산하는 경우 LD₅₀이 10^8.9/ml이라는 대량의 바이러스를 얻을 수 있다.

본 발명의 백신을 제조하기 위한 포름알데하이드에 의한 바이러스의 불활화는 다른 화학물질을 이용한 불활화법에 비하여 불활화 달성의 신뢰성과 확실성 및 안정성이 이미 증명되어 있어 안전한 제품을 제공할 수 있다. 이 불활화 방법은 대량생산에 적합함으로 인력 및 생산경비가 절약되며 능률적이고 또 이 방법은 수십년간 사용되어온 일본뇌염 바이러스 백신에서 안정성이 세계적으로 인정된 바 있다.

이하 구체적으로 본 발명을 상세히 설명한다.

호왕바이러스 백신용 항원과 유행성출혈열 진단제를 제조하는데 사용한 바이러스는 새로 발견된 호왕바이러스이며 상세한 제조방법은 다음과 같다.

마우스에서 호왕바이러스의 배양, 분리 및 백신의 제조

백신제조용 시이드 바이러스(seed virus)는 생후 7∼10일된 ICR 흰마우스의 뇌에서 얻는다. 바이러스를 쥐 뇌내에 접종한 후 1주일경 뇌염증상을 나타내고, 일부 쥐가 사망하기 시작할 때 뇌를 무균적으로 채취하여 pH 7.6의 인산완충 희석액으로 10% 용액을 만들어 4℃에서 3,000rpm 30분간 원심침전하여 상층액중의 바이러스를 무균시험한 다음 1% 송아지 알부민이 함유된 Eagle 용액(pH 7.6)으로 희석하여 앰플에 분주한 후, -80℃에 보존하면서 사용한다.

보통 시이드 바이러스의 역가는 LD₅₀가 10^8.9/ml이다. 백신제조는 시이드 바이러스의 10배 희석액을 약20일된 흰쥐의 뇌내에 0.03ml씩 접종하고 약 1주일 후 접종한 쥐의 약 50%가 사망 또는 마비되었을 때 무균적으로 뇌를 채취하여 중량을 측정한 후, pH 7.6의 희석액으로 20중량% 용액을 옴니믹서에서 만든 후, 소니케이터(Ultrasonic W-370)로 뇌세포를 10분간 충분히 분쇄한 후, 4℃에서 9,000rpm 30분간 원침하여 상층액을 회수한다. 상층액에 프로타민 술페이트 0.2mg/ml을 가하고 4%에서 1시간 처리한 후 4℃에서 9,000rpm 30분간 원침 후 상층액을 딴다. 백신용 희석액은 염화나트륨, 인산나트륨이 함유된 완충액 pH 7.6이다. 원침한 상층액에 40%의 냉 에탄올을 동량 첨가하여 잘 혼합하여 4℃에서 24시간 방치하여 뇌단백질을 침전한다. 상기 용액을 4℃에서 9,000rpm 30분간 원심분리하여 침전물을 회수하여 처음 사용한 량과 동량의 희석액을 가하여 혼합기에서 잘 혼합하여 순수한 바이러스 용액을 만든 다음 4℃에서 9,000rpm 30분간 원침한 후 상층액을 채취하여 적당히 희석한 후 상층액에 0.02∼0.03mg/ml의 프로타민 술페이트 용액을 가하고 1∼2시간 혼합한 후 다시 4℃에서 9,000rpm 30분간 원심분리하여 상층액을 채취 중간원료로 회수한다. 중간원료중에 함유된 바이러스 항원의 양은 반드시 ELISA법으로 측정하며 5,000unit/0.1ml가 되도록 조절한다.

상기한 중간원료를 포름알데하이드로 처리, 바이러스를 불활화한 다음 어드주반트로 알룸겔 5,000㎍/ml이 되도록 첨가하여 백신을 만든다. 바이러스의 불활화 공정은 포름알데하이드 0.03∼0.05% 최적농도이므로 4℃에서 15일간 처리한다.

조직배양세포를 이용한 백신의 제조

시이드 바이러스는 24시간 배양한 베로 세포(ATCC CRL 1586)에 10,000TCID₅₀의 호왕바이러스를 접종하고 약 10일 후접종한 세포의 약 90% 이상이 감염되었을 때 상층액과 세포를 무균적으로 채취하여 소니케이터로 세포를 10분간 충분히 분쇄한 후 4℃에서 3,000rpm 30분간 원심하여 상층액을 얻는다. 채취한 상층액은 무균시험을 거쳐 5% 송아지 혈청을 가한 후 앰플에 분주하여 -80℃에 보존하면서 사용한다.

백신 제조에는 500ml의 조직배양병에 배양된 베로 세포를 사용하며 완전히 배양된 조직배양세포에 10,000TCID₅₀/1.0ml의 바이러스를 접종한 후 10일경에 접종한 세포의 약 90%가 감염되었을 때 무균적으로 세포와 배양액을 채취하여 소니케이터로 세포를 10분간 충분히 분쇄한 후 4℃에서 9,000rpm 30분간 원심하여 상층액중에 있는 바이러스를 회수한다. 백신용 희석액은 염화나트륨, 인산나트륨이 함유된 pH 7.6의 완충액을 사용하며 30∼40%의 냉에탄올을 동량 첨가하여 4℃에서 16∼20시간 방치하여 단백질을 침전시킨다. 이 40% 냉에탄올의 조성은 완충액 대 에탄올의 비율이 6:4로 한다. 상기 용액을 4℃에서 3,000rpm 30분간 원침하여 침전물을 회수하고 이 침전물에 처음 사용한 양과 동량의 희석액을 가하여 혼합기에서 잘 혼합하여 바이러스를 순수하게 추출한 다음 4℃에서 9,000rpm에서 30분간 원침한 후 상층액을 채취 중간원료로 사용한다. 중간원료는 다시 4℃에서 20,000∼40,000rpm 12시간 초고속 원침하여 순수한 바이러스 항원을 얻는다. 바이러스 항원의 양은 ELISA법으로 5,000unit/0.1ml로 조절하고 0.04∼0.05%의 포름알데하이드를 가하여 바이러스를 4℃에서 15일간 불활화한 다음, 어드주반트로 알룸겔 500㎍/ml이 되도록 첨가하여 백신을 제조한다.

호왕바이러스 항원의 정제

상기에서 불활화 처리를 하지 않은 중간원료 중의 바이러스 항원은 흡착제나 침전제를 사용하는 방법과 초고속원심침전, 여과, 전기영동, 크롬크로마토그리패등 정제용 장치를 사용하여 항원을 정제하는데 이중에서 가장 호왕바이러스 정제에 적절하다고 생각되는 방법을 선택하며 이들 방법을 교합하여 사용할 수 있다. 그 구체적 예로는 접착제로 단백질을 제거한 후 초원심법과 여과법을 교합하여 사용하는 방법을 들 수 있다. 즉, 프로타민 술페이트로 뇌단백질을 1차적으로 제거한 후 연속 또는 불연속 고원심분리에 의한 바이러스 항원의 분액채취 또는 항원의 투석과 농축에 의한 정제를 행한다. 원심분리의 밀도컬럼과 밀도구별컬럼을 제조하는 물질로서는 세슘클로라이드, 브롬화칼륨, 설탕용액, 글리세린, 피콜 등 공기의 밀도 컬럼 작용성 물질을 사용할 수 있다. 설탕용액(당)을 사용하는 경우, 당의 농도가 약 50∼60용적%의 범위가 되도록 조제한다. 이와 같은 원심분리를 2회 이상 반복 실시함으로써 고도의 순수한 호왕바이러스 항원을 얻을 수 있다. 초고속원심침전은 보통 약 20,000∼40,000rpm에서 약 12∼15시간 행한다. 이상의 방법으로 분획하고 농축하여 얻은 바이러스 향원의 정제 농축액을 호왕바이러스 백신원액, 고밀도입자응집반응용 항원 및 ELISA용 항원으로 사용한다.

본 발명의 호왕바이러스 항원은 진단시약으로 바이알 병내에 액체 또는 냉동건조된 분말상태에서 밀봉하여 사용할 수 있다. 이와 같은 항원은 ELISA법 적혈구응집저지 항원 및 고밀도입자응집반응용 항원으로 사용된다. 항원의 역가는 샌드위치 ELISA 방법으로 측정하며 유행성출혈열 환자 혈청중에 함유된 한탄바이러스, 서울바이러스, 호왕바이러스, 푸우말라바이러스에 대한 항체를 측정하는데 이용하며 이에 필요한 항원의 양은 ELISA법에서는 4∼8unit/0.01ml 그리고 고농도입자응집반응에서는 2∼4unit/0.1ml이다. 중간원료의 처리과정과 얻어지는 바이러스 항원의 역가는 하기 표 2에 표시하였다. 또 이와 같이 만든 호왕바이러스 항원은 한탄바이러스, 서울바이러스 및 푸우말라바이러스의 단일 클론항체의 제작 수반에 따라 사용할 수 있으며 얻어지는 단일 클론항체는 다시 고도로 정제하여 유행성출혈열 환자 치료용 면역글로불린을 제작하는데도 사용할 수 있다.

표 2. 중간원료 처리과정과 바이러스항원의 양

호왕바이러스의 동정

1. 베로 E6 세포에서 배양한 바이러스

바이러스 접종 후 10일된 세포를 채취하여 세포중에 함유된 호왕바이러스 항원을 간접면역형광항체법으로 검사한다. 항원검사용 감염된 세포는 세포배양용 초자에 24시간 배양한 다음 완전히 세척 후 호왕바이러스의 면역혈청과 다른 한탄바이러스의 면역혈청 및 단크론 항체로 반응한 다음 다시 세척한 후 F1TC항 사람 감마글로블린을 가한 후 형광현미경하에서 바이러스 유무와 항체가를 비교 검사하여 호왕바이러스를 동정하며 최종적인 동정은 중화항체검사와 PCR 검사로 한다. 이때 Reo 바이러스 type 1,2,3에 대한 항혈청도 가하여 Reo 바이러스 오염유무를 검사하며 필요에 따라 마이코푸라즈마 검사도 한다.

2. 흰쥐에서 배양한 바이러스

쥐에서 잘 증식되도록 적응한 시이드 바이러스를 20일된 쥐 뇌내에 접종하여 얻은 뇌 조직과 폐장조직을 채취하여 호왕바이러스 유무를 검사하는데 국제 표준주인 한탄바이러스 76∼118주를 흰쥐의 뇌내에 접종하였을 때와 유사한 병리조직학적 소견을 얻을 수 있다. 항상 국제표준주인 한탄바이러스를 접종한 동물을 대조로 사용하여 호왕바이러스를 접종한 동물이나 감염된 세포를 동시에 비교하며 이들 바이러스에 대한 특이 항 혈청중에 함유된 항체가를 측정하여 혈청학적 차이점을 비교하고 동정한다. 한국에서 발생한 10명의 환자혈청을 조사한 결과 호왕바이러스에 대한 항체가는 모두 4,000∼16,000이었고 한탄바이러스에 대한 항체가는 2,000∼8,000이었다. 실험에는 무균 ICR 마우스를 일본 SLC사에서 구입하여 사용하였으며 항상 동물안전 캐비넷 내에서 사육하였고 바이러스 접종 후에도 완전 캐비넷 내에서 사망시까지 보관하였다.

호왕바이러스의 감염가 측정

베로 E6 세포에서는 바이러스 접종 후 바이러스의 특이 형광반점을 기준으로 TCID₅₀를 통상의 방법으로 계산하였으며 또 기술된 바와 같은 방법으로 24 챔버 플레이트(24 chamber plate)에서 플라크 형성을 관찰하여 PFU를 결정하였다. 호왕바이러스의 플라크는 하기 제 3 도에 나타난 바와 같이 직경이 0.5cm이며 특이한 도우너츠 모양을 하고 있다. 흰쥐에서의 호왕바이러스의 감염가는 생후 1일 및 20일된 ICR 마우스 뇌내에 10배의 희석한 바이러스의 0.01ml와 0.03ml를 접종하여 LD₅₀을 리드 앤드 뮌히(Reed Munch)의 방법으로 계산하였으며 보통 바이러스를 접종한 마우스는 일주일경에 뇌염으로 사망한다.

[실시예]

(1) 호왕바이러스의 생산

생후 3∼20일의 마우스 뇌에 호왕바이러스 90/90주를 접종하고 약 7일 후 뇌염과 마비를 일으킨 마우스의 두부를 절개하고 뇌를 채취하여 여기에 뇌중량 5배량의 인산 완충액(pH 7.2)을 첨가하여 유화한 후 4℃에서 5,000rpm 30분간 원심분리하여 수득되는 상층액을 바이러스의 원액으로 하였다. 바이러스 원액의 감염성(infectivity)은 ID₅₀으로 표시하였는데 다음과 같이 측정하였다.

ⅰ) 생후 3∼20일된 ICR 마우스를 선택하였다.

ⅱ) 바이러스액을 완충 희석액으로 10^-2내지 10^-9로 10배 희석한다.

ⅲ) 각 단계의 바이러스 희석액을 각각 0.01∼0.03ml 마우스의 뇌내에 적당수 접종한다.

ⅳ) 접종 후, 21일간 관찰하며, 증상이 나타난 후 사망하는 마우스의 수를 기록한다.

ⅴ) 폐사한 마우스의 수가 접종한 마우스의 1/2로 되는 바이러스 희석액 농도를 구한다.

ⅵ) LD₅₀은 리드 앤드 뮌히 법(Read and Muench Method)에 따라 계산한다.

그 결과는 다음 표 3 및 표 4에 나타내었다.

표 3. 날짜별 마우수의 폐사수

(접종 후 수일내의 폐사는 접종사로 취급하여 산출비율에서 제외한다. )

표 4. 마우스의 치사율(LD₅₀)

상기 표 4의 LD₅₀는 10^-91/ml이다.

상기 원액중의 바이러스의 항원의 역가는 12,800unit/ml로서 다음과 같이 측정하였다.

측정방법은 ELISA 방법을 사용하였으며, 플레이트(plate)는 폴리비닐 bottom 96well을, 완충 희석액(buffer)은 Sigma diagnostics사 제품으로 코팅 완충액(PBS), 세척 완충액(PBS+0.1% tween 20), 희석 완충액(PBS+0.1% tween 20+25% bovine serum + 0.1% thimerosal)를 각각 사용하였다.

ⅰ) 플레이트의 코팅은 면양 유래 항 인체 면역글로블린 M(goat antihuman IgM)을 희석완충액으로 500배 희석하여 플레이트 웰당 100μl씩 가하고, 4℃에서 16 내지 20시간 반응시킨다. 면양 유래 항 인체 면역 글로블린 M(goat antihuman IgM) 항체는 Tago사 제품으로 총 단백량은 1.15mg/ml이었다.

ⅱ) 상기의 플레이트를 세척완충액으로 3회 세척하고, 인체에서 분리된 양성혈청을 최종 ELISA 역가가 16이 되도록 희석하여 플레이트 웰당 100μl씩 가한 후, 37℃에서 인큐베이터에서 1시간 반응시킨다.

ⅲ) 플레이트를 세척 완충액으로 3회 세척한 후, 바이러스 항원액을 2배 계단 희석하여 플레이트 웰당 100μl씩 가한 후, 37℃ 인큐베이터에서 1시간 동안 반응시킨다.

ⅳ) 이 플레이트를 세척 완충액으로 3회 세척하고, 토끼 호왕바이러스 항 혈청을 희석 완충액으로 3,000배 희석하여 플레이트 웰당 100μl 가한 후, 37℃ 인큐베이터에서 1시간 반응시킨다. 이때의 토끼 항 호왕바이러스 항체의 ELISA 역가는 4이었다.

ⅴ) 플레이트를 세척 완충액으로 3회 세척하고, 효소콘쥬게이트 안티 래비트를 희석 완충액으로 1,000배 희석하여 플레이트 웰당 100μl씩 가한 후, 37℃ 인큐베이터 에서 1시간 반응시킨다. 이 효소 콘쥬게이트는 KPL사 제품으로 단백함량이 0.1mg이며, 사람 IgM에 대해 과산화 효소로 표시된 친화성을 갖는 정제항체(peroxidase labeled affinity purified antibody to human IgM)를 사용하였다.

ⅵ) 상기 플레이트를 세척 완충액으로 3회 세척하고, 기질(substarate)을 플레이트 웰당 100μl씩 가한 후, 37℃ 인큐베이터에서 30분간 반응시킨다. 사용된 기질은 ABTS로서 과산화효소 기질용액 A(2.2'-axino-dl-[3-ethyl-benzthiazoline]sulfonate)와 과산화효소 기질용액 B(hydrogen peroxide)를 1 : 1로 혼합하여 사용하였다.

ⅶ) 상기 플레이트를 육안 또는 ELISA 판독기를 사용하여 405∼415nm에서 판독한다.

ⅷ) 문턱값(threshold value)은 기지의 대조음성 혈청(reference negative serum)값의 산술평균치의 표준 편차의 3배 값을 합산한 것이다. 결과 바이러스 항원의 역가는 12,800unit/0.1ml이었다.

상기의 바이러스액을 여러가지 에탄올의 농도로 처리하여 최적농도를 선택하였다. 에탄올의 농도를 각각 15%, 20%, 30%, 40%의 농도로 처리하고, 4℃에서 16 내지 20시간 방치한 후 12,000rpm 30분간 원심분리하여 상층액과 침전물 중의 바이러스 항원의 역가를 산출하여 그 결과를 표 5에 나타내었다.

표 5. 에탄올 농도처리후의 항원 역가

에탄올을 처리한 후, 60℃에서 30분간 불활화시켜 랫트에 접종, 항원성을 비교검사하여 표 6에 나타내었다.

표 6. 에탄올 처리 호왕바이러스 접종한 랫트의 항체가

상기 표 5,6에 나타난 바와 같이 30% 에탄올의 농도가 항원의 회수율과 항체형성율에서 가장 우수한 성적을 나타내었다. 따라서, 바이러스액은 30% 에탄올 농도로 처리하는 것이 바람직하다.

(3) 프로타민 설페이트(protamine sulfate)처리

상기의 에탄올로 처리된 바이러스 용액을 여러가지 프로타민 술페이트 농도로 처리하여 최적농도를 선택하였다. 에탄올 처리가 끝난 바이러스 용액을 프로타민 술페이트를 0.1mg/ml, 0.2mg/ml, 0.3mg/ml, 0.4mg/ml, 0.7mg/ml, 1.0mg/ml로 각각 처리한 후, 4℃에서 2시간 방치한 후, 18,000rpm 30분간 원심분리하여 상층액 중의 항원의 역가를 검사하여 그 결과를 제 3 도에 나타냈다.

(4) 불활화 공정

상기 바이러스액을 0.05% 포르말린 용액으로 처리한 후 4℃에 보관하면서 마우스의 치사율(LD₅₀)과 감염율(ID₅₀)을 조사하였다.

생후 1일된 젖빨이 마우스에 포르말린 처리한 바이러스 용액을 처리 직후와 4일째, 7일째, 9일째, 10일후에 바이러스액을 10배 계단 희석하여 마우스 뇌에 접종하고 바이러스의 불활화와 감염유무를 뇌조직을 검사하여 확인하였으며 그 결과는 표 7에 나타내었다.

표 7. 포르말린 처리에 따른 마우스의 치사율(LD₅₀)과 감염율(ID₅₀)

제 4 도에 나타난 바와 같이, 본 발명의 호왕바이러스를 0.05% 포르말린으로 7일간 불활화시켰을 때 감염현상이 없었다. 또한 본 발명의 호왕바이러스를 0.05% 포르말린으로 4℃에서 14일간 불활화한 후 랫트에 접종하여 항원성을 비교 검사하였으며, 그 결과를 표 8에 나타내었다.

표 8. 포르말린 처리 호왕바이러스를 접종한 랫트에 항체반응

상기 표 7 및 제 4, 5 도에서 보는 바와 같이, 본 발명의 호왕바이러스 90/90주를 포르말린으로 7일 이상 불활화시켜 마우스의 뇌에 접종하였을 때 폐사되는 마우스는 1마리도 없었으며, 30일후, 그 마우스의 뇌를 절개하여 간접면역형광항체법으로 뇌조직중의 바이러스 항원 유무를 조사한 결과, 바이러스의 감염은 확인되지 않았다. 따라서, 본 발명의 호왕바이러스는 포르말린 처리로 완전히 불활화된 것이다.

(5) 면역촉진제 흡착시험

본 발명의 호왕바이러스를 포르말린으로 불활화시킨 후, 면역촉진제로 수산화알루미늄겔을 첨가하고, 4℃에서 15일간 흡착시킨후 이 백신의 0.5ml(5,000 ELISA unit)를 랫트의 근육에 접종한 후 항체가를 측정하였다. 그 결과는 표 9에 나타난 바와 같이 알룸겔 500mg/ml를 4℃에서 15일간 흡착시키는 것이 좋은 효과를 나타내었다.

표 9. 면역촉진제 처리후의 항원의 역가

(6) 항체반응 실험

제 6 도에 본 발명의 포르말린 처리 후 알룸겔을 흡착시킨 호왕바이러스 백신 5,000 항원 unit를 랫트의 근육에 제0 및 제70일 2회 접종한 후 호왕바이러스, 한탄바이러스, 서울바이러스 및 푸우말라바이러스에 대한 형광항체가를 측정한 결과를 나타낸 것이다. 호왕바이러스에 대한 항체는 백신접종 7일부터 상승하고 30일 후에 8,192라는 높은 항체가를 나타내었다. 제70일에 2차 접종을 한 결과, 기왕성항체반응을 나타내어 15일 후에는 항체가가 16,384까지 상승하였다.

(7) 호왕바이러스 백신의 안전성 실험

본 발명의 백신의 안전성을 검사하기 위하여 젖빨이 마우스의 뇌에 본 발명의 백신을 0.02ml씩 접종하고, 30일간 관찰하여 마우스의 건강상태를 조사하였다. 접종 30일 후에 마우스의 두부를 절개하여 뇌를 채취하고, 이를 -30℃ 크리오스태트(cryostat)에서 0.4μm로 절단하여 조직절편을 만든다. 아세톤으로 고정한 후, 16units/drop의 출혈열 환자혈청을 1차 반응시킨 후, 2차로 FITC-결합 안티-휴먼 감마글로블린 8unit/drop을 가하여 형광현미경으로 관찰하였다. 이 결과 뇌내에서의 바이러스 증식은 확인되지 않았다. 이 마우스 뇌를 다시 유화시켜 20% 용액으로 만든 후, 젖빨이 마우스의 뇌에 접종하고, 위와 동일한 방법으로 바이러스의 유무를 검사하였다. 이 결과 바이러스의 증식은 확인되지 않았으며, 마우스 마비도 일어나지 않았다. 또 백신용액 0.5ml를 베로 세포에 10일 간격으로 3대 계대배양 후 바이러스의 증식을 검사하고 이 용액을 다시 마우스 뇌에 접종한 후 항체형성과 병원성을 검사하여 음성결과를 얻었다.

본 발명의 호왕바이러스 백신은 완전히 불활화되었고 안전함이 증명되었다.

(8) 호왕바이러스 배양

호왕바이러스는 베로 E6 세포와 A549 세포에서 배양되며 A549 세포에서의 바이러스 역가는 10^6.4/ml이고, 베로 E6 세포에서의 바이러스 역가는 10^7.2/ml이다. 이 바이러스는 젖먹이 마우스와 20∼30일된 마우스의 뇌내에서도 증식되며 바이러스의 역가는 10^7.3-8.3/ml 이상이다. 이 바이러스만이 20∼30일된 흰쥐를 1주일 이내에 뇌염으로 사망시킬 수 있다.

(9) 호왕바이러스 백신의 구성성분은 표 10과 같다.

표 10. 호왕바이러스 백신

(10) 호왕바이러스 혈청진단용 항원의 제조방법은 호왕바이러스 백신의 제조방법과 동일하나 알룸겔이 포함되어 있지 않다.

Claims (6)

1. 한탄바이러스속에 속하며, 다음과 같은 특성을 갖는 호왕바이러스 균주;

   1. 비리온 입자(virion particle)

   직경이 약 100∼120nm의 구성 RNA 바이러스

   2. 외막(envelope)

   인지질을 포함한 2∼10nm 크기의 외막과 돌출부를 갖고 있다.

   3. 구조

   °단일 나선(single stranded) RNA

   °3개의 분절

   °분자량은 3.5×10⁶

   °3개의 nucleocapsids

   °envelope에 2개의 특이 당단백질을 함유.

   4. 바이러스 증식

   감염세포의 세포질
2. 호왕바이러스를 생후 24시간된 마우스와 20∼30일된 마우스의 뇌세포에서 배양한 다음, 쥐의 뇌를 채취하여 믹서와 소니케이터로 대량의 바이러스를 추출한 후 프로타민 술페이트, 에탄올 및 초고속 원심분리기를 사용하여 바이러스 항원을 정제하고, 포름알데하이드 용액을 첨가하여 바이러스를 불활화함을 특징으로 하는 호왕바이러스의 제조방법.
3. 호왕바이러스를 베로 E6 세포에 배양한 다음 배양액과 감염된 세포를 소니케이터로 파괴하여 바이러스를 추출한 후, 초고속 원심분리기를 사용하여 순수한 바이러스를 얻은 다음, 불활화 용액을 첨가하여 불활화된 바이러스 항원을 정제하는 것을 특징으로 하는 호왕바이러스의 제조방법.
4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 불활화제로서 포름알데하이드를 사용하는 것이 특징인 제조방법.
5. 호왕바이러스를 쥐 뇌세포에서 배양하여 얻은 바이러스의 상층액과 베로 E6 세포에서 배양하여 얻은 바이러스 용액을 정제한 후, 불활화한 바이러스 항원을 인공면역용으로 알룸겔을 첨가한 것을 특징으로 하는 유행성출혈열 백신.
6. 호왕바이러스를 마우스 및 생후 1주일 이내의 랫트 뇌에 배양하여 얻은 바이러스의 유제와 베로 E6 세포에서 배양한 바이러스 용액을 전술한 1 또는 2항의 방법에 따라 처리한 후 고속원심침전하여 얻은 정제 바이러스를 불활화하여 얻어진 비루스 항원을 항원항체반응용으로 검출할 수 있는 양으로 함유되도록 한 유행성출혈열 진단제.