HU206050B - Process for producing hantaan virus vaccine - Google Patents

Process for producing hantaan virus vaccine Download PDF

Info

Publication number
HU206050B
HU206050B HU895956A HU595689A HU206050B HU 206050 B HU206050 B HU 206050B HU 895956 A HU895956 A HU 895956A HU 595689 A HU595689 A HU 595689A HU 206050 B HU206050 B HU 206050B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
virus
hantaan virus
hantaan
mice
vaccine
Prior art date
Application number
HU895956A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT55641A (en
HU895956D0 (en
Inventor
Ho Wang Lee
Sun Ja Riu
Chang Nam An
Original Assignee
Green Cross Korea
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Green Cross Korea filed Critical Green Cross Korea
Publication of HU895956D0 publication Critical patent/HU895956D0/hu
Publication of HUT55641A publication Critical patent/HUT55641A/hu
Publication of HU206050B publication Critical patent/HU206050B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/12011—Bunyaviridae
    • C12N2760/12111—Hantavirus, e.g. Hantaan virus
    • C12N2760/12134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/12011—Bunyaviridae
    • C12N2760/12111—Hantavirus, e.g. Hantaan virus
    • C12N2760/12151—Methods of production or purification of viral material

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

A találmány újfajta Hantaan vírus törzset, a ROK 84/105 törzset tartalmazó vakcinára vonatkozik. A vírus a veseszindrómával járó vérzéses láz kórokozója.
A vírus által okozott járványos vérzéses láznak körülbelül tíz vagy ennél több típusa ismeretes a földön, 5 és ezeket a tünetcsoportokat szúnyogcsípés, kullancs, és állati eredetű csoportokba soroljuk, a koreai típusú járványos vérzéses láz - melyet a jelen találmány tárgyát képező Hantaan vírus törzs okoz - az állati eredetű csoporthoz tartozik. 10
A koreai típusú vérzéses láz kórokozóját még nem izolálták, ezért általánosan feltételezik, hogy összefüggésbe hozható az egérrel, azonban nem azonosították még vírusgazda és kórokozó típusát. Különböző elmélet van a járványos vérzéses láz természetes vírusgaz- 15 dájáról, de még semmit sem bizonyítottak.
Asanuma és munkatársai levezették, hogy a járványos vérzéses lázat Trombicular atka, az Apodemus agrárius coreae parazitája emulziójával történt fertőzés okozza, és feltételezik, hogy az atka lehet a vírusgazda 20 vagy betegségnek a hordozója.
Izoláltuk a betegségek kórokozóját az Apodemus agrárius coreae tüdő és vese szövetéből, Dongduchunban, Koreában, ahol a koreai típusú vérzéses láz gyakori. 25
Az így kapott kórokozót vírusként azonosítottuk, és Hantaan vírusnak neveztük el.
A vírus okozta vérzéses láz-betegek nemcsak Koreában, de a Föld más területein is előfordulnak, más területek betegeinek a tünetei hasonlóak a koreai hete- 30 gekéhez.
Bebizonyítottuk, hogy az orosz vérzéses nephrosonephritis, a finn vesebaj járványok és a japán vérzéses láz betegeinek a szérumában, akiknek a betegségét Hantaan vírus vagy hasonló antigéntulajdonságokat 35 mutató vírus okozta, fluoreszcens antitestek jelentek meg a fenti vírussal szemben. Ezért a WHO ezeket a betegségeket vesetünetekkel járó vérzéses láznak nevezte el.
A Hantaan vírussal ferfőzött beteg szimptómái 40 leggyakrabban a test hőmérsékletének 37-38 °C-ra történő fölemelkedésével, hidegrázással, fejfájással, ideges letörtséggel és izomfájdalmakkal kezdődnek, melyet felsőlégúti fertőzéses tünetek kísérnek, mint például köhögés, garati fájdalom, nátha 3-5 napig, és ezt 45 erős hasmenés, mellkasi fájdalom és vérköpés követ fokozódó súlyosbodással. Nagyon ritkán, jellegzetes vörös színezetű vérzéses rétegek jelennek meg a bőrön vagy a kötőszöveteken, és lehetséges, hogy a beteg halálához vezet ez a légzéses vírusfertőzés. 50
Egy széleskörű kutatást hajtottunk végre azzal a szándékkal, hogy a fent leírt betegséget megszüntessük. Ennek eredményeképpen felfedeztük a kórokozót, mely a fent leírt betegséget okozza, és elkészítettünk egy vakcinát - amelyben az említett vírust használtuk - 55 a betegség megelőzésére vagy megakadályozására.
A találmány tárgya tehát gazdaságos és hatékony módszer Hantaan vírus vakcina tömegtermelésére. A találmány tárgya továbbá egy újfajta Hantaan vírustörzs, mely a fenti módszerben hasznosítható. 60
Az 1. ábra az 1. példa szerinti eljárásban a felülúszónak az alkalmazott protamin-szulfát mennyisége függvényében kapott EIA (enzim immuno assay) antigén titer eredményeket mutatja.
A 2. ábra az alkalmazott Hantaan vírus függvényében mutatja a halálos adag (LD50) értékeket egér esetén.
A 3. ábra a fertőzési mértéket (ID50) mutatja egér esetén a Hantaan vírus formáimnál végzett kezelésének időtartama szerint.
A 4. ábra az immunfluoreszcens antitest termelését mutatja adjuváns mennyiség függvényében.
Az 5. ábra az immunfluoreszcens antitest termelést mutatja az alumínium-hidroxid mennyiség függvényében patkányoknál, melyeket az alumínium-hidroxid gélre adszorbeált ROK84/105(MB V)-vel oltottuk be.
1984-ben szérumot vettünk egy, a Pajuban szolgáló (Kyungkido, Koreai Köztársaság) katonától, akit három napja vettek betegállományba járványos vérzést okozó lázzal. Izoláltuk a vírust Verő E6 sejtben végzett tenyésztés negyedik generációjából.
A vírust letétbe kívántuk helyezni 1989. november 9-én a koreai letevőhelynél [Koreán Federation of Culture Collections of Microorganisms (KFCC)], a regisztrációt azonban visszautasították azon az alapon, hogy a vírus fertőző.
Ezért a vírust az ATCC-nél 1989 októberében helyeztük letétbe UR 2250 számon.
A vírust „Hantaan vírus ROK 84/105”-nek neveztük el, és Hantaan vírus vakcina kiindulóanyagaként használtuk. Az embernek adagolandó vakcináknak általában olyan törzsekből kell állniuk, amelyek az emberi testből származnak. Az emberi vérből elkülönített Hantaan vírus nem csak jól szaporodik egér és patkány agyszövetben, de nagy mennyiségű olyan antigént tartalmaz, amely vakcina előállításához szükséges, így igen alkalmas arra, hogy egerek vagy patkányok alkalmazásával vakcina előállítására használjuk.
Ha a találmány szerinti eljárásban alkalmazott vírust osztályozni akarjuk, akkor ez a Bunyaviridae család négy Hantaan vírus nemzetségébe sorolható, éspedig Hantaan vírus (prototípus 76-118), Seoul vírus (prototípus 80-39), Prospect hill vírus és Pumala vírus. A vírust olyan betegek véréből különítettük el, akik veseszindrómával társuló hemorrágiás lázban szenvednek, és egér vagy patkány agyszöveten szaporítottuk.
Ennek a vírusnak a növesztését, szaporítását és izolálását először oldottuk meg. A vírus izolálására Verő E6 sejteket használtunk, amelyeket az ATCC-tól (deponálási szám: C 1008 és CRL 1586), illetve az Infectious Disease Research Laboratory of American Military intézettől szereztünk be, és szövettenyésztő közegben szaporítottuk.
Szövettenyésztő közegként 5% borjúembriószérumot (FCS) tartalmazó Eagle közeget használtunk. A vírussal fertőzött beteg vérét a szövettenyészethez adtuk, és 36 °C-on szén-dioxidos inkubátorban tenyésztettük. A vírus szaporodását indirekt immunfluoreszcens vizsgálattal detektáltuk. Az első generációs tenyé2
HU 206 050 Β szetben nem volt megfigyelhető a vírus szaporodása. A negyedik generációs tenyészetben a vírus antigénje fluoreszcens folt formájában azonosítható volt a sejt protoplasztjában. A vírust szopós egér vagy patkány agyá-. ba oltottuk annak megvizsgálására, hogy a vírus szaporodik-e. A vizsgálatok megerősítették, hogy a vírus a szopós egér vagy patkány agyában kiválóan szaporodik.
Úgy találtuk, hogy a Hantaan vírus ROK 84/105 nagy mennyiségben termelhető szopós egerek vagy patkányok agyában, és kidolgoztuk az extrakciós és tisztítási módszerüket. A Hantaan vírus ROK 84/105 törzset 7,2 pH-nál 4 °C-on stabilizáltuk, a stabilizált vírussal egéragyat oltottunk be, az agyszövet szuszpenzióját 20% foszfátpufferrel (pH=7,2) készítettük, az antigén titer 8192 érték fölötti volt ELIS A módszerrel mérve.
A találmány szerinti Hantaan vírus ROK 84/105 törzzsel sokkal jobb kitermelés érhető el, mint más vírusokkal, például a Hantaan vírus 76-118 törzzsel.
A Hantaan vírus szaporítása kapcsán folytatott kísérletek során úgy találtuk, hogy a Hantaan vírus ROK 84/105 megfelelő mennyiségű antigént termel Hantaan vírus vakcina előállításához, és az antitest képződése jelentős.
Ez a vírus tehát sokkal alkalmasabb emberi vakcina előállítására, mint a Hantaan vírus 76-118, amely az Apodemus agrárius coreae-ból származik, mivel ezt a vírust emberi testből izoláltuk.
A Hantaan vírus ROK 84/105 törzs a következő fizikokémiai jellemzőkkel rendelkezik, azaz a Bunyaviridae alábbi jellemzőivel:
1. virion részecske:
kb. 95 nm átmérőjű gömb vagy ellipszoid formájú
RNS.
2. burok:
lipopretein burok 5-10 nm hosszúságú szálakkal.
3. szerkezet:
- egyszálú,
- háromszegmensű,
- negatív irányítottságú RNS genomok,
- teljes molekulatömeg 4,5xl06,
- háromvírusos nukleokapszidok,
- két vírusra specifikus glikoprotein,
4. Vírus szaporodása:
fertőzött sejtek citoplazmájában,
5. jellemzők.
A találmány szerinti eljárásban alkalmazott új Hantaan vírus ROK 84/105 törzs a következő egyedülálló jellemzőket mutatja az ismert Hantaan vírus 76-118 törzshöz képest.
1. Verő E6 sejtekben a vírustiter 107,2/ml.
2. Szopós egér agyszövetében a vírustiter 109,8/ml.
3. Szopós patkány agyszövetében a vírustiter 109’3/ml.
Amint látható, a vírus erősen patogén egérben vagy patkányban, és az egerek vagy patkányok az injektálás után a 7. és 12. nap között elpusztulnak.
4. Ha a vírussal ICR egereket oltunk be, a vírus szaporodása sokkal gyorsabb, mint más vírusoké, és az antitesttermelés a beoltás után az 5. napon megjelenik, és a 10. napra 2000-szeresre növekszik.
5. Ha a vírust SD patkányoknak adagoljuk, az antitest az adagolástól számítva a 7. napon detektálható.
6. Ha. a vírust Verő E6 sejteken szaporítjuk, 0,3 cmes plakkokat kapunk, amelyek sokkal nagyobb méretek, mint más vírusok esetén.
A találmány tárgya tehát eljárás Hantaan vírus vakcina előállítására, amelynek során a vírust tenyésztjük, szaporítjuk, izoláljuk és inaktiváljuk.
A Hantaan vírus vakcinát a találmány értelmében részletesebben a következőképpen készítjük:
Az emberből izolált Hantaan vírus ROK 84/105 törzset egynapos szopós egereknek vagy patkányoknak adagoljuk, az egereket vagy patkányokat kb. 10 napig tenyésztjük, fejüket megbénítás után levágjuk, az agyat kiemeljük és etil-alkohollal és protamin-szulfát-oldattal kezeljük, a terméket tisztítjuk és inaktiváljuk, majd a végtermékhez adjuvánst adunk.
A vakcina előállításához az oltóvírust szaporítani kell. Ehhez az oltóvírust 1,0% borjúalbumint tartalmazó kiegyenlített sóoldattal hígítjuk, és a hígított vírusoldatot 4 °C-on, illetve hosszabb tárolás esetén -60 °Con tároljuk.
Ezt a hígított Hantaan vírus oldatot adagoljuk szopós egerek vagy patkányok agyába. Az egerek agyának tömege 10 napos tenyésztés után 0,272 g, az antigéntiter 8192 a 20%-os agyszuszpenzióban. A patkányok agyának átlagos tömege 10 napi tenyésztés után 0,718 g, az antigéntiter 8192 a 20%-os agyszuszpenzióban. A vírus szaporodása mind egerekben, mind patkányokban elég magas, előnyösebb azonban a szaporítást patkányokban végezni. Ha a vírus szaporítása után az egerek a 10. naptól kezdve elpusztulnak, miután a 8. naptól kezdve megbénultak. A vakcinát úgy készítjük, hogy az agyat közvetlenül az elpusztuláskor összegyűjtjük, tömegét megmérjük, és 20 tömeg/térfogat%-os oldatot készítünk hígítóoldattal (PBS, pH=7,2), amelynek összetétele az alábbi, a komponenseket egy sejtzúzóeszköz segítségével alaposan összezúzzuk, és az oldatot 4 °C-on 20 percig 3000 fordulat/perccel centrifugáljuk, majd a felülúszót elválasztjuk.
A hígítóoldat összetétele:
nátrium-klorid 8,5 g
mononátrium-foszfát x2H2O 0,4 g
dinátrium-foszfát xl2H2O 2,54 g
desztillált víz 1 literig
A kapott felülúszóhoz azonos mennyiségű hideg eta-
nol és PBS elegyét (térfogatarány 6:4) adjuk, és az elegyet 16-20 óra hosszat 4 °C-on állni hagyjuk a protein kicsapódására.
A csapadékot 30 percig 3000 fordulat/perc sebességgel centrifugáljuk, és a kapott csapadékhoz ugyanolyan hígítóoldatot adunk (PBS, pH-7,2). Az elegyet egy keverőben jól elkeverjük, a vírust extraháljuk, 30 percig 5000 fordulat/perc sebességgel centrifugáljuk, 0,ΙΟ,5 ml felülúszót nyerünk, az oldatot 1-2 óra hosszat keverjük, és az oldatot 30 percig 5000 fordulat/perc sebességgel centrifugáljuk, és a teljes felülúszót kinyerjük.
HU 206 050 Β ,A kapott felülúszót szokásos módon inaktiválhatjuk, például formaldehides kezeléssel vagy hókezeléssel, majd alumínium-hidroxidgélt adagolunk 5000 mg/ml mennyiségben, és így a kívánt vakcinát kapjuk.
Az inaktiválási eljárásban formaldehides kezelés esetén 0,01-0,05%-os szuszpenziót kezelünk 15 napig, a hőkezelést pedig 60 °C-on 30 percig végezzük. Formaldehides kezelés esetén a hőmérséklet előnyösen 4 °C alatt.
A találmány szerinti eljárást a következő példákkal szemléltetjük a korlátozás szándéka nélkül.
1. példa
Hantaan vírus vakcina (1) Hantaan vírus előállítása
Egynapos szopós egereknek Hantaan vírus ROK 84/105 törzset adagolunk, az állatokat 10 napig tenyésztjük, és az agyukat mebénulás után kiemeljük. Az összegyűjtött agyat foszfát-puffemel (pH=7,2) emulgeáljuk. Az alkalmazott puffermennyiséget az agy tömegére számítva négyszeres. A kapott emulziót 20 percig 3000 fordulat/perc sebességgel centrifugáljuk, a felülúszó a vírusoldat. Ezután megmérjük a vírusoldat LD50 értékét a fertőzőképesség meghatározására, amely 10’9-68/ml értéknek adódott. A mérést a következőképpen végezzük:
1. Egynapos szopós egereket alkalmazunk.
2. A vírusoldatot hígítópufferrel ΙΟ’2—10'9 értékre sorozathígításnak vetjük alá.
3. Az egyes hígítási foknak megfelelő vírusoldatokat 0,02 ml mennyiségben adagoljuk szopós egerek agyába.
4. Az injekció után az egerek tüneteit 20 napig megfigyeljük, és feljegyezzük az elpusztult egerek számát.
5. Meghatározzuk azt a hígítási koncentrációt, ahol az elpusztult egerek száma a kezelt egerek számának a fele.
6. A hígítási koncentrációból az LD50 értéket Read és Muench Method módszerével határozzuk meg.
Az eredményeket az 1. és 2. táblázatban foglaltuk össze.
/. táblázat
Az elpusztult egerek száma az eltelt napok függvényében
A vírusoldat hígítási aránya Beoltott állatok száma Elpusztult állatok száma Háláló- zási arány Túlélési arány
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1! 12 13 14 15 16 17 18 19 20
10’2 9 0 0 0 0 0 0 0 0 9 9/9 0/9
10'3 13 0 0 0 0 0 0 13 13/13 0/13
10'4 18 1 0 0 0 0 0 0 1 0 15 1 17/17 0/17
io·5 16 0 1 0 0 0 0 0 0 2 6 6 1 15/15 0/15
10’6 13 0 0 0 0 0 0 0 0 1 7 2 2 0 0 0 0 0 0 0 0 12/13 1/13
10-7 14 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 2 1 0 0 0 5/13 8/13
10’8 9 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 1 0 1 0 0 0 0 0 0 3/9 6/9
10-9 23 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 1 0 0 0 4/23 19/23
(Az elpusztult állatok száma néhány nappal a beoltás után oltási elhullásnak tekinthető.)
2. táblázat
Az egerek halálozása (LD50)
A vírusoídat hígítása elpusztulás túlélés összesen
teljes pusztulás teljes túlélés halálozási arány
arány %
-2 9 0 78 0 78/78 100
-3 13 0 69 0 69/69 100
-4 17 0 56 0 56/56 100
-5 15 0 39 0 39/39 100
-6 12 1 24 1 24/25 96
-7 5 8 12 9 12/21 57
-8 3 6 7 15 7/22 32
-9 4 19 4 34 4/38 11
HU 206 050 Β
A fenti 2. táblázatból az LDjq érték 10^,68/ml.
A vírus antigéntitere 8192, amelyet a következőképpen határoztunk meg: a mérést EIÁ módszerrel végeztük egy 96 mélyedéses polivinil lapon, pufferek: PBS (Sigma Diagnostics Co.), mosópuffer PBS+0,1% Tween 20, hígítópuffer: PBS+0,1% Tween 20+2,5% szarvasmarhaszérum+0,1% thimerosal.
i) A titrálólapon bevonatot készítünk úgy, hogy minden mélyedésben 100 μΐ, hígítópufferrel 500-szorosra hígított kecske-anti-humán IgM-t adunk, és a lapot +4 °C-on 16-20 óra hosszat reagáltatjuk. A kecske-anti-humán IgM antitest mennyisége (Tago, Inc. gyártmány) 1,15 mg/ml volt.
ii) A lapot háromszor mostuk mosópufferrel, és a pozitív humán szérumot 16 EIA antigéntiter egységig hígítottuk. Ezután a lemez minden mélyedésébe 100 μΐ fenti szérumot adtunk, és 37 °C-on egy óra hosszat inkubáltuk.
iii) Ezután háromszor mostuk mosópufferrel és 100 vl, kétszeresre hígított vírusoldatot mértünk minden mélyedésbe, és a lapot 37 °C-on egy óra hosszat inkubáltuk.
iv) A lapot háromszor mostuk mosópufferrel, majd minden mélyedésbe bemértünk 100 μΐ 3000-szeresen hígított nyúl-anti-Hantaan antitestet, és a lapot 37 °Con egy óra hosszat inkubáltuk. A kapott nyúl-anti-Hantaan antitest EIA antigéntiterét a 4. ábra mutatja.
v) A lapot háromszor mostuk, és minden mélyedésbe bemértünk 100 μΐ 100-szorosan hígított enzimmel kapcsolt anti-nyúl-antitestet, és 37 °C-on egy óra hosszat inkubáltuk. A fenti enzimmel kapcsolt antitest (KPL gyártmány) 0,1 mg proteint tartalmaz, amely peroxidázzal affinitáskromatográfiával tisztított humán IgM kecske antitest.
vi) A lapot háromszor mostuk mosópufferrel, majd minden mélyedésbe bemértünk 100 vl szubsztrátot és °C-on 30 percig inkubáltuk. Az ABTS szubsztrát 2,2-azino-dl-(3-etil-benztiazolil-szulfonát) és hidrogén-peroxid 1:1 arányú elegye.
vii) A lemezt 405 és 415 nm hullámhossznál ELISA detektorral detektáltuk.
viii) A küszöbértéket úgy kaptuk, hogy az ismert negatív szérum referenciaértékek számtani közepét és azok standard deviáció értékének háromszorosát összeadtuk.
A vírus titere 8192 értéknek adódott.
(2) Etanolos kezelés
A fenti vírusoldatokat 15%-os, 20%-os, 30%-os és 40%-os etanollal kezeltük, és 4 °C-on 16-20 óra hosszat állni hagytuk, majd 30 percig 12 000 fordu15 lat/perc sebességgel centrifugáltuk a felülúszó és az üledék EIA antigéntitere meghatározásához. Az eredményeket a 3. táblázatban foglaltuk össze. Az eredményekből meghatároztuk az etanol optimális koncentrációját.
3. táblázat
EIA antigéntiter az egyes etanol koncetrációk esetén
Etanol koncentrációja EIA titer
üledék felülúszó
15% 1,024 16
20% 1,024 8
30% 1,024 4
40% 1,024 4
Etanolos kezelés után a vírusoldatot 60 °C-on 30 percig inaktiváljuk, majd patkányokat oltottunk be vele a relatív antigenitás meghatározására. Az eredményeket a 4. táblázatban foglaltuk össze.
4. táblázat
Antigenitás összevetése a ROK 84/105 patkányoknak történt adagolása után
Oltás Állat Mód Kísérlet száma Immunfluoreszcens antitest
14. nap 21. nap 28. nap
egéragyvírus 3. ROK 84/105 (MBV. 1% B. A.) etanol 15% 60 °C 30 perc SDrat 0,5 ml/IM 1. 2. 3. 4 16 64 64 16 64 64 64 64 32 64 64 64
3. ROK 84/105 (MBV. 1% B. A.) etanol 20% 60 °C 30 perc SDrat 0,5 ml/IM 1. 2. 3. 4 64 256 256 128 256 256 256 256 256 256 256 1024
3. ROK 84/105 (MBV. 1% B. A.) etanol 30% 60 °C 30 perc SDrat 0,5 ml/IM 1. 2. 3. 4 256 1024 256 256 1024 1024 1024 1024 1024 4096 1024 1024
3. ROK 84/105 (MBV. 1% B. A.) etanol 40% 60 °C 30 perc SDrat 0,5 ml/IM 1. 2. 3. 4 512 256 1024 256 1024 1024 1024 512 1024 1024 1024 1024
HU 206 050 Β
5. táblázat
Immunfluoreszcens antitest érték 60 °C-on 30 percig inaktivált vírusoldat patkányoknak történt adagolása után
Etanol koncentrációja Patkány antitest-titer (IFA)
14. nap 21. nap 28.nap
15% 32 64 64
20% 128 256 512
30% 512 1024 2048
40% 512 512 256
Amint a 3., 4. és 5. táblázatból látható, a legjobb antigén és antitest kitermelés 30% etanolkoncentráció- 15 nál érhető el. Ennek megfelelően előnyös, ha a vírusoldatot 30%-os etanollal kezeljük.
(3) Protamin-szulfátos kezelés
A fenti, etanollal kezelt vírusoldatot különböző koncentrációjú protamin-szulfát-oldaítal kezeltük az opti- 20 mális koncentráció meghatározására. Az etanollal kezelt vírusoldatot tehát 0,1 mg/ml, 0,2 mg/ml,
0,3 mg/ml, 0,4 mg/ml, 0,7 mg/ml és 1,0 mg/ml koncentrációjú protamin-szulfáttal kezeltük, és 4 °C-on 2 óra hosszat állni hagytuk. Ezután a vírusoldatot 25 percig 18 000 fordulat/perc sebességgel centrifugáltuk, és meghatároztuk a felülúszó EIA antigéntiterét. Az eredményeket az 1. ábra mutatja.
(4) Inaktiválás
A fenti vírusoldatot 0,05% formáimnál kezeltük, és az oltás után eltelt napok száma függvényében meghatároztuk az LD5o és ID50 értékeket.
A formaiinnal kezelt vírusoldatot a formalinos kezelés utáni 4. napon, 7. napon, 9. napon és 10. napon, tízszeresre hígítva 1 napos szopós egereknek adagoltuk. Az eredményeket a 6. táblázatban foglaltuk össze. Az LD50 értékeket a 3. ábra mutatja.
6. táblázat
Egér halálozási és fertőzési arány az idő függvényében
Nap Hígítás Oltásszám Elhunyt Fertőzött LD5(/0,02 ml LD5O/l,0 ml ID5(/0,02 ml IDJ0/l,0ml
0 ΙΟ'5 18 18 18 10-7,89 ] 0-9.59 ! 0-8.66 10-10,36
10'6 19 19 19
10'7 18 18 18
10’s 8 3 5
10·9 5 1 3
10'10 7 0 0
4 10° 9 0 9 0 10-4,56 10Λ26
10’1 9 0 9 0
10'2 10 0 10
10'3 11 11
w4 10 0 8
10‘5 11 3
7 10° 9 0 9 0 0 10-A.63 10-2.33
10-' 10 0 2
9 10° 20 0 11 0 0 1OA13 10-1,83
10-’ 11 0 1
10 10° 12 0 0
10-‘ 11 0 0
14 10° 9 0 0
10-1 10 0 0
Amint a 2, és 3. ábra mutatja, a 0,05% formaiinnal kezelt Hantaan vírus több, mint 10 nap után sem mutat fertőzést. A 14 napig 0,05%-os formáimnál inaktivált
Hantaan vírus adagolása után megfigyelt antigenitást a
7. táblázatban foglaltuk össze.
7. táblázat
Patkányoknak adagolt ROK 84/105 (MBV) antigenitása
Beoltás ROK 84/105 (MBV) Állat Mód Kísérlet száma ' Immunfluoreszcens antitest
21. nap 28. nap
ROK 84/105 1 256 256
(MBV) formaiin (14 napos kezelés) SD rat 0,5 ml/IM 3 64 128
4 128 256
Amint a 6. és 7. táblázatból látható, a találmány szerinti eljárással formáimnál több, mint 10 napig inaktivált Hantaan vírus ROK 84/105 egerek agyába adagolva nem okozta az egerek pusztulását. 30 nappal az 20 adagolás után az egerek fejét levágtuk, és az agyon vizsgáltuk a vírusfertőzést indirekt immunfluoreszcens vizsgálattal. A vizsgálat során vírusfertőzés nem volt megfigyelhető. Ez megerősítette, hogy a fenti módon a Hantaan vírus ROK 84/105 vírust inaktiváltuk. 25 (5) Adjuvánssal történő kezelés
A formáimnál kezelt Hantaan vírus ROK 84/105höz adjuvánsként alumínium-hidroxid gélt adtunk, és 4 °C-on 15 napig inkubáltuk. A kapott oldatot 0,5 ml/patkány mennyiségben patkányoknak intra- 30 muszkuláris úton adagoltuk az EIA antigéntiter meghatározására. Az eredményeket a 8. és 9. táblázat, valamint a 4. és 5. ábra mutatja.
8. táblázat
EIA antigéntiter adjuváns kezelés után
EIA titer (felülúszó)
3. nap 7. nap 15. nap
Kontroll 2048 2048 2048
alumínium-hidroxid gél (250 mg/ml) 2048 1024 512
alumínium-hidroxid gél (500 mg/ml) 2048 512 16
9. táblázat
Antigenitás alumínium gélre adszorbeált ROK 84/105 adagolása után
Beoltás Állat Mód Kísérlet száma Immunfluoreszcens antitest érték
14. nap 21. nap 35. nap
3. ROK 84/105 (MBV) formalin-alumínium gél 500 mg/ml SDrat 0,5 ml/IM 1 1024 4096 1024
2 1024 8192 1024
3 1024 4096 512
4 1024 4096 1024
3. ROK 84/105 (MBV) alumínium gél 250 mg/ml SDrat 0,5 ml/IM 1 256 1024 128
2 1024 4096 256
3 256 1024 512
4 512 1024 512
3. ROK 84/105 (MBV) formaiin (kontroll) SDrat 0,5 ml/IM 1 256 256 256
2 32 32 32
3 32 32 32
4 256 256 128
A 8. és 9. táblázatból, valamint a 3. és 4. ábráról Hantaan vírus ROK 84/105-höz megfelelő az antitest látható, hogy 500 mg/ml alumínium gél adagolása a 60 termeléshez.
HU 206 050 Β
1. kísérlet
Hantan vírus vakcina vizsgálata állatokon (1) Dózis meghatározása patkányokon
Az 1. példa szerinti módon előállított Hantaan vírus vakcina különböző EIA antigéntiter értékeit adagoljuk patkányoknak az optimális dózis meghatározására.
A Hantaan vírus vakcinával immunizált patkányok esetén meghatározzuk az antitest termelés szintjét az eltelt napok függvényében indirekt immun fluoreszcens vizsgálattal. A Hantaan vírus vakcinát intramuszkulárisan adagoltuk. Az eredményeket a 10. táblázatban foglaltuk össze.
10. táblázat
Hantaan vírus vakcina dózisának meghatározására patkányoknak intramuszkulárisan injektálva
Csoport Antigén- titer CEIA Patkányok száma Patkányok antitest litere vakcinálás után
12. nap 21. nap. 28. nap
1 4096 1 512 2048 2048
2 512 2048 2048
3 512 1024 1024
4 512 2048 2048
2 2048 1 512 512 1024,
2 512 1024 1024
3 512 1024 1024
4 512 2048 2048
3 1024 1 512 1024 1024
2 256 512 1024
3 512 1024 1024
4 512 2048 1024
4 512 1 32 128 128
2 512 1024 1024
3 32 32 32
4 128 256 256
5 256 1 -
2 -
3 -
4 -
6 128 1 -
2 -
3 -
4 -
Amint a 10. táblázatból látható, antitest termelődött, ha több, mint 512 EIA titer értékű vakcinát adagoltunk.
(2) Antitest provokációs kísérlet
Úgy találtuk, hogy ha a találmány szerinti eljárással előállított vakcinát először adagoljuk patkánynak, az antitest termelés egy hónapig fokozódik, majd csökken. A 45. és 60. nap közötti újabb beoltás jelentős antitest termelést okoz. Az eredményeket az 5. ábra mutatja.
(3) A Hantaan vírus vakcina biztonságosságának meghatározása
A találmány szerinti eljárással előállított vakcina biztonságosságának meghatározására 0,2 ml vakcinát adagoltunk szopós egerek agyába és az egerek egészségi állapotát 30 napig megfigyeltük. 30 nap után levágtuk az egerek fejét, és összegyűjtöttük az agyakat, majd -30 °C-on Cryostat-ban 0,4 pm vastagságú szövetmetszetet készítettünk. A szövetmetszetet acetonnal rögzítettük, és először 16 egység/csepp értékű hemorrágiás lázban szenvedő beteg szérumával reagáltattuk, majd 8 egység/csepp értékű FITC-vel konjugált antihumán gamma-globulinnal reagáltattuk a vírus szaporodásának megfigyelésére fluoreszcens mikroszkóp segítségével. Az agyakban szaporodás nem volt megfigyelhető. A fenti egéragyakat 20%-os emulzió formájában szopós egerek agyába visszaoltottuk. A vírus szaporodásának ellenőrzésekor szaporodás nem volt megfigyelhető. Ennek megfelelően a találmány szerinti eljárással előállított Hantaan vírus vakcina teljesen inaktívnak és detoxikáltnak mutatkozott.

Claims (6)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás Hantaan vírus vakcina előállítására, azzal jellemezve, hogy az ATCC-nél VR2250 számon deponált Hantaan vírus ROK 84/105 törzset egereknek vagy patkánoknak adagoljuk, majd az egerek és patkányok agyát 10 napi tenyésztés után összegyűjtjük, etil-alkohollal és protamin-szulfáttal kezeljük, tisztítjuk és inaktiváljuk, majd a termékhez adjuvánst adunk.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kezelést 30-40%-os etil-alkohollal végezzük.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kezelést 0,1-0,5 mg/ml protamin-szulfáttal végezzük.
  4. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az inaktiválást 0,01-0,5% formáimnál 0 °C és 10 °C közötti hőmérsékleten legalább 10 napig végezzük.
  5. 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az inaktiválást 50-70 °C közötti hőmérsékleten 15-45 percig végezzük.
  6. 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vírustörzset egynapos szopós egereknek vagy patkányoknak adagoljuk.
HU895956A 1988-11-18 1989-11-17 Process for producing hantaan virus vaccine HU206050B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1019880015199A KR900007952B1 (ko) 1988-11-18 1988-11-18 신규의 한탄바이러스 rok84/105 균주 및 이를 이용한 한탄바이러스 백신의 제조방법

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU895956D0 HU895956D0 (en) 1990-02-28
HUT55641A HUT55641A (en) 1991-06-28
HU206050B true HU206050B (en) 1992-08-28

Family

ID=19279386

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU895956A HU206050B (en) 1988-11-18 1989-11-17 Process for producing hantaan virus vaccine

Country Status (5)

Country Link
US (1) US5183658A (hu)
JP (1) JPH02242674A (hu)
KR (1) KR900007952B1 (hu)
HU (1) HU206050B (hu)
YU (1) YU219189A (hu)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2527525B2 (ja) * 1992-03-27 1996-08-28 財團法人 牧岩生命工學研究所 新規な新症候出血熱ワクチンおよびその製造方法
WO1995000648A1 (en) * 1993-06-24 1995-01-05 The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Nucleic acids of a novel hantavirus and reagents for detection and prevention of infection
AU1559197A (en) * 1996-01-25 1997-08-20 Cheil Jedang Corporation Vaccine prepared using human-origin hantaan virus nucleocapsid protein expressed from escherichia coli
US20020077276A1 (en) * 1999-04-27 2002-06-20 Fredeking Terry M. Compositions and methods for treating hemorrhagic virus infections and other disorders
SE0100011D0 (sv) * 2001-01-03 2001-01-03 Eurocine Ab Karolinska Inst Sc Virus vaccine formulation
CA2500215C (en) * 2002-09-27 2012-02-28 Powderject Research Limited Nucleic acid coated particles

Also Published As

Publication number Publication date
KR900007436A (ko) 1990-06-01
JPH0553475B2 (hu) 1993-08-10
JPH02242674A (ja) 1990-09-27
KR900007952B1 (ko) 1990-10-23
YU219189A (sh) 1992-12-21
HUT55641A (en) 1991-06-28
HU895956D0 (en) 1990-02-28
US5183658A (en) 1993-02-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5597721A (en) Preparation of antigens of and of vaccines for the virus of mystery disease, antigens and vaccines obtained for the prevention of this disease
Flehmig et al. Immunogenicity of a killed hepatitis A vaccine in seronegative volunteers
JP4056306B2 (ja) Ｃ型肝炎ウイルスアシアロ糖タンパク質
US5419907A (en) Pathogenic porcine respiratory coronavirus
CN1192797C (zh) 抗肺炎链球菌和呼吸道合胞病毒(rsv)的联合疫苗
EP0027347A1 (en) Feline infectious peritonitis virus, its preparation and vaccines containing it
HU206050B (en) Process for producing hantaan virus vaccine
US4571386A (en) Feline infectious peritonitis vaccine
US4220638A (en) Antigenic complex from N. Gonorrhoeae
CN1161376C (zh) 生产分离及纯化的摩拉克氏菌的主要外膜蛋白cd的方法
JP2911603B2 (ja) 新規な弱毒化シュードモナス・エルギノーザ株
US5460815A (en) Feline infectious peritonitis vaccine and method of preparation
JP2007197454A (ja) 魚類用のイリドウイルス感染症ワクチンと診断剤並びにこれ等の製法
JP4440345B2 (ja) 新規なピコルナウイルス、ワクチンおよび診断薬キット
JP4053587B2 (ja) 不活性化レスピラトリーシンシシャルウイルスワクチン
KR900007262B1 (ko) 신(腎)증후성 출혈열 비루스 항원의 제조방법, 및 그 항원을 함유하는 백신 및 신증후성 출혈열 진단제
JPH01279844A (ja) Ａ型肝炎ワクチン
US4288557A (en) Antigenic complex from N. gonorrhoeae
WO2005014803A1 (ja) 西ナイルウイルスワクチン
KR940002012B1 (ko) 신증후군 출혈열 백신의 제조방법
JP2011016845A (ja) 魚類用のイリドウイルス感染症ワクチンと診断剤並びにこれ等の製法
US3886270A (en) Intravenously tolerated anti-distemper and anti-hepatitis vaccine, its preparation and its use for immunization
RU2175657C2 (ru) Асиалогликопротеин вируса гепатита c (нсv), иммуногенная композиция, способ индукции иммунного ответа, способ иммуноанализа
JPH02295934A (ja) イヌコロナウイルスワクチン
JPS59137423A (ja) トキソプラズマ症因子およびその製法

Legal Events

Date Code Title Description
HPC4 Succession in title of patentee

Owner name: GREEN CROSS VACCINE CORPORATION, KR

HPC4 Succession in title of patentee

Owner name: GREEN CROSS CORPORATION, KR

MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees