JPH02242674A - 新規ハンタンウイルス ｒｏｋ ８４／１０５菌株、そのウイルスワクチン及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は腎症候群出血熱の病原体である新規ハンタンウ
ィルス菌株及び腎症候群出血熱の予防に卓越した効果を
有するハンタンウィルスワクチンに関する。

［従来の技術］ 現在地球上にウィルスに因る流行性出血熱の種類は１０
余種が存在し、その伝播経路に従ってモスキードボン（
ｍｏｓｑｕｔｔｏｂｏｒｎｅ　）、チックボン（ｔｉｃ
ｋｂｏｒｎｅ　）及びチュノチック（ｚｏｏｎｏｔｉｃ
　）に分類しているが、本発明のハンタンウィルス菌株
から起因する韓国型流行性出血熱はチュノチックに属す
る。

この韓国型流行性出血熱の病原体は未だ分離されていな
いが、鼠のどの種が宿主であり、どこにどんな病原体を
有するかは証明されてはいないものの、鼠と関連あると
のことは知られている。　流行性出血熱の自然系宿主に
対しては多くの予測等があったが証明されたものはなか
った。しかし、日本の浅沼等は背筋鼠に寄生する毛ダニ
（Ｔｒｏｍｂｉｃｕｌａｒｍｉｔ）の乳液を人体に接種
して疾病を引き起こすことから、毛ダニが宿主及び媒介
であると推定した。

本発明者等は、韓国型流行性出血熱の流行地域である東
豆用（韓国京畿道北部地名）で採集した背筋鼠（江皿聾
■区田ｕｓ　ｃｏｒｅａｅ　）の肺及び腎臓組織から病
原体を分離することに成功・した。そして、得られた病
原体がウィルスであることを確認し、これをハンタンウ
ィルス（Ｈａｎｔａａｎ　Ｖｉｒｕｓ）と命名した。

ウィルスに起因する出血熱患者は韓国ばかりでなく世界
各地において多発しており、その症状もまた韓国型流行
性出血熱と類似していることが明らかにされた。

本発明者らはソ連の出血熱賛症性腎炎 （Ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ　ｎｅｐｈｒｏｓｏｎｅｐｈ
ｒｉｔｉｓ　）　、フィンランドの流行性腎臓炎（Ｎｅ
ｐｈｒｏｐａｔｊ、ａｅｐｉｄｅｍｉｃａ　）及び日本
の流行性出血熱（Ｅｐｉｄｅａ＋ｉｃ　ｈｅｍｏｒｒｈ
ａｇｊｃ　ｆｅｖｅｒ）患者の血清に上記ビールスに対
する蛍光抗体があることを証明し、これら疾病がハンタ
ンウィルス又はこれと抗原的に類似のウィルスに依り発
生されることが証明された。従って、１９８２年世界保
健機Ｆｉｌ（ＷＨＯ）はこれら疾病の名称を腎症候出血
熱（Ｈｅａ＋ｏｒｒｈａｇｉｃ　ｆｅｖｅｒ　ｗｉｔｈ
ｒｅｎａｌ　５ｙｎｄｒｏａ＋ｅ）と統一して称するこ
とに決定した。

［発明が解決しようとする課題］ 前記ハンタンウィルスに感染した患者の大部分は、３〜
５日間の、上部呼吸系の感染症、例えば咳、咽喉痛及び
鼻症を伴なった３８〜４０℃の発熱、俄な悪汗、頭痛、
神経衰弱及び筋肉痛の症状を呈し、次いで、病状の進行
に伴ない、甚だしい呼吸困難、胸部疼痛及び血痰の症状
を呈する。　稀ではあるが甚だしい場合には特異の顔面
出血斑が皮膚又は結膜にあられれて呼吸感染ウィルス疾
病のため死亡に至ることもある。

一方、前記のように韓国型流行性出血熱等の疾病ウィル
スは発見されたが、その予防及び治療薬としては満足す
べき結果は得られていない。その上、ワクチンの製造に
あたり、ウィルスの毒性の問題のため、人体に安全なワ
クチンの製造が非常に困難であるという問題がある。

従って、腎症候群出血熱のウィルス感染を防ぐ薬剤を提
供し、腎症候群出血熱の感染防御及び治療のための技術
を開発することが望まれていた。

［課題を解決するための手段］ 本発明者は、このような現状において、上記ウィルス疾
病を根絶すべく、鋭意研究を重ねた結果、上記疾病を誘
発する新規病原体を見出し、更に、この病原体からの感
染を阻止若しくは抑制するための予防ワクチンを発明す
るに至った。

従って、本発明の目的は、ハンタンウィルス菌株を利用
したハンタンウィルスワクチンの大量生産に適切な、経
済的かつ効率的な方法を提供するものである。

本発明のまた他の目的は、上記方法において実質的に利
用される新規のハンタンウィルス菌株を提供するもので
ある。

本発明者は１９８４年流行性出血熱症状で入院した患者
（韓国京畿道波州で服務する軍人）の血清を発病３日目
に採取し、これをＶｅｒＯＥｅ細胞で４回継代培養して
ウィルスを分離することに成功した。

このウィルスを韓国種菌協会（ＫＦＣＣ）に１９８８年
１１月９日付で寄託した所、本発明の菌株が病原性菌株
であるので寄託が拒否された（本発明の菌株をハンタン
ウィルスＲＯＫ　　８４／１０５と命名し、これをハン
タンウィルスワクチンのシード（ｓｅｅｄ）として使用
した）。なお、工業技術院微生物工業研究所（微工研、
ＦＥＲＭ）においても本ウィルスは病原性であるとして
受託を拒否することは明確であるので、微工研に対して
も寄託は行なっていない。　しかしながら、特許法施行
規則２７条の３の条件を満たす場合は、出願人において
本発明のウィルスを分譲する用意がある。

−Ｓ的に人体に適用されるワクチンは、人体由来の菌株
を使用することが望ましく、かつ人体より採取された血
液中のハンタンウィルスはマウスかラットの脳でよく増
殖されるばかりでなく、ワクチンの製造に必要な抗原を
多量に保有するためにマウスかラットを利用して上記目
的を達成するのに適合している。

本発明のウィルス菌株は分類学上からはブンヤウイリタ
ｘ　（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）科のハンタウイルス
属（）ｌａｎｔａ　ｖｉｒｕｓ　ｇｅｎｕｓ）の４種の
形、即ちハンタンウィルス（Ｉｌａｎｔａａｎ　Ｖｌｒ
ｕｓ）（原型７６−１１８）、ソウルウィルス（Ｓｅｏ
ｕｌ　Ｖｉｒｕｓ）　　（原型８Ｏ−３９）、プロスペ
クトヒルウィルス（Ｐｒｏｓｐｅｃｔ　　ＨｉｌｌＶｉ
ｒｕｓ）　、ブマラウイルス（Ｐｕｍａｌａ　Ｖｉｒｕ
ｓ）中よりハンタンウィルスに属し、腎症候出血熱患者
の血液から採取してマウスかラットの脳で増殖されるよ
う適用させたものである。

本発明者らに依って本ウィルスの成長、増殖および分離
が最初になされたのであるが、該ウィルスの分離のため
に使用された細胞はＶｅｒｏ　　Ｅ６であって、ＡＴＣ
Ｃ（寄託番号：Ｃ１００８，ＣＲＬ１５８６）とアメリ
カ陸軍伝染病研究所で分譲を受けて組織培養培地で増殖
して使用した。

組織培養培地はイーグル（Ｅａｇｌｅ）培地９５％およ
びウシ胎児血清（Ｆｅ２）５％であり、組織培養細胞に
ウィルスで感染された患者の血液を加えた後、３６℃の
Ｃｏ２インキュベーターで培養させ、ウィルス増殖を間
接蛍光抗体法で確認した。　−次代代においてはウィル
スの増殖はなく、４次代代においては、ウィルス抗原が
細胞の円形質（Ｐｔ’０ｔＯ−ｐｌａｓｔ）内で蛍光斑
点を示すことを確認した。

該ウィルスを哺乳マウスと哺乳ラットの脳に接種しウィ
ルスの増殖の有無を検査した。

この結果、該ウィルスは噴孔マウスと哺乳ラットの脳に
おいてのみ特異的に増殖することを確認した。

本発明者によって、本発明のハンタンウイルスＲＯＫ８
４／１０５菌株を哺乳マウスと哺乳ラットの脳で大量生
産される方法が確立され、またその抽出、精製法が最初
に確立された。　本発明によれば、ハンタンウィルスＲ
ＯＫ８４／１０５菌株を４℃（７）温度、ｐＨ７６２の
条件下で安定化させ、安定化されたウィルスを鼠の脳に
接種、培養し、ｐＨ ７，２，２０％燐酸塩緩衝液で脳乳剤を製造すれば、酵
素結合免疫分析法（ＥＬＩＳＡ法）による抗原の力価と
して８，１９２Ｕｎｉｔ以上との結果を得た。

本発明のハンタンウィルスＲＯＫ　　８４／１０５菌株
の収車は、他のハンタウイルス菌株、例えば、パンタン
ウィルスフ６−１１８菌株より遥かに高かった。

前述した条件で本発明者はハンタンウィルス増殖に対し
て広範囲な研究をした結果、本発明のハンタンウィルス
ＲＯＫ　　８４／１０５菌株がハンタンウィルスワクチ
ンの製造に必要な十分な量の抗原を提供し得るシードで
あり、抗体の形成が卓越であることを発見した。

本発明に依るウィルス菌株は、背筋鼠から分離されたハ
ンタンウィルス原型（ｐｒｏｔ。

ｔｙｐｅ）７６−１１８よりは人体から分離されたとの
点番こおいて人体に適用されるワクチンを製造するのに
より適合している。

本発明のハンタンウィルスＲＯＫ８４／１０５菌株は下
記の物理化学的性状即ちブンヤビリタｘ　（８ｕｎｎｙ
ａｖｉｒｉｄａｅ）の特性を有する。

Ａ、ピッオン粒子 球形又は楕円形、直径約９５ｎｍ、ＲＮＡＢ、エンベロ
ープ リポ蛋白のエンベロープで囲まれており、５〜１０ｎｍ
の大きさの多数の繊維状物（ｆｉｂｅｒ　）が突出（ｐ
ｒｏｊｅｃｔｉｎｇ　）　している。

Ｃ，Ｗｌ造 ■単一螺旋 ■３分節（ｔｈｒｅｅ−ｓｅｇｍｅｎｔ　）■陰性反応
ＲＮＡゲノム（Ｎｅｇａｔｉｖｅ−ｓｅｎｃｅ　ＲＮＡ
　Ｇｅｎｏｍｅｓ　）■総分子ｆｆｉ：４．５Ｘ１０６ ■３個のウィラルニュクレオカブシド （ｔｈｒｅｅ　ｖｉｒａｌ　ｎｕｃｌｅｏ　ｃａｐｓｉ
ｄ）０２個のウィルス特異糖蛋白（ｔｗｏ　ｖｉｒｕｓ
ｓｐｅｃｉｆｉｅｄ　　ｇｌｙｃｏ　　ｐｒｏｔｅｉｎ
）Ｄ、ウィルス増殖 感染細胞の細胞質（ｃｙｔｏｐｌａｓｍ　）Ｅ、特性 本発明の新規ウィルスであるハンタンウイルスＲＯＫ８
４／１０５ｍ株は公知のパンタンウィルスフ６−１１８
菌株との下記のような相異なる特性を示す。

■ウィルスの力価がＶｅｒｏ　　Ｅｅｓ細胞で１０　＝
　・２／　ｍ　１である。

■ウィルスの力価が哺乳マウス脳で １０９・”　／　ｍ　１である。

■ウィルスの力価が哺乳ラットの脳で １０””／ｍｌである。

以上のとおり該ウィルスは鼠での病原性が強くウィルス
接種佳７〜１２日間に鼠が死亡する。

■前記ウィルスはＩＣＲｆｆｉｌｉ乳マウスに接種すれ
ばウィルスの増殖が他のウィル スより早く起こり、抗体がウィルス接 種？＆５日月よりあられれ１０日頃には２．０００以上
に達する。

■該つィルスをＳＤラットに接種すればウィルス接種７
日後に抗体が検出し得 る。

■該つィルスをＶｅｒｏ　　Ｅｅ細胞で培養すれば他の
ウィルスに比べて大きなサ イズである０　、　３　ｃ＋ａ内外のプラークを観察し
得る。

本発明は新規ウィルスを培養、増殖、分離、および不活
化して製造したハンタンウィルスワクチンを提供する。

即ち、本発明のハンタンウィルスワクチンは、好ましく
は１日齢の哺乳マウス又はラットに人体より分離したハ
ンタンウィルスＲＯＫ　　８４／１０５菌株をシードと
して接種し、約１０日間飼育した徨、完全に麻痺をおこ
したマウスの頭部を切開して脳を採取しこれをエチルア
ルコールとプロタミンスルフエイト溶液で処理した後、
更にＮ製、不活化し補助剤を添加して製造される。

本発明のワクチンを製造するためにシードウィルスの増
殖が必要である。　このような目的のため、シードウィ
ルスは、好ましくは１．０％ウシ血清アルブミン（ＢＳ
Ａ）を含有したＢＳＳ　　（ＢａｌａｎｃｅｄＳａｌｔ
Ｓｏｌｔｉｏｎ）溶液（ｐＨ７，６）で希釈して使用さ
れる。　希釈されたウィルス液は４℃で保存使用しうる
が、長期間保存時には一６０℃で保存して使用すること
が望ましい。

前記ハンタンウィルス希釈液を哺乳マウス又は哺乳ラッ
トの脳に接種させた。　１０日間飼育したマウスの平均
脳重量は０．２６２ｇであり、２０％脳懸濁液の抗原の
力価は、８．１９２であった。　１０日間飼育されたラ
ットの平均脳重量は０．７１８ｇであったし、脳懸濁液
の抗原の力価は８，１９２であった。

本発明においてシードウィルスの増殖はマウスだけでな
く、ラットにおいても良好であるが、ラットで増殖され
る方がより曹ましい。

ウィルスが増殖されたマウスは８日目から麻痺を引き起
こし、１０日頃には死亡するに至るが、ワクチンは死亡
直前の脳を採取して重量を計った後、下記組成の希釈液
（ＰＢＳ、ｐＨ７，２）で２０％（Ｗ／ｖ）溶液とし、
細胞粉砕機で十分に粉砕し、４℃、３０００ｒｐｍで２
０分間遠沈して上層液を回収することにより製造される
。

（組成） 塩化ナトリウム　　　　　　　　８．５ｇ燐酸ナトリウ
ム（１塩基）・２　Ｈ２Ｏ０，４ｇ 燐酸ナトリウム（２塩基）・１２Ｈ２０２，５４ｇ 蒸留水　　　　　　　　　　１７にとなる量（ｐＨ＝７
．２） 回収された上層液に３０〜４０％の冷エタノールを同量
添加し、４０℃で１６〜２０時間放置して蛋白質を沈澱
させた。　前記４０％冷エタノールの組成はＰＢＳ：エ
タノールが６：４である。

前記溶液を３００Ｏｒｐｍで３０分間遠心分離して沈澱
物を回収し、該沈澱物に上記において最初使用した量と
同量の希釈液［ＰＢＳ　（ｐＨ７，２）］を加えて希釈
した。次いで、混合機で混合してウィルスを抽出した陵
、５０００ｐｐｍで３０分間遠心分離させて上層液を回
収し、上層液に０．１〜０．５ｍｇ／ｍ１となるようプ
ロタミンスルフエイト水溶液を加えて１〜２時間【こ亘
って撹拌させ、５０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して
上層液を中間原料として回収する。

上記中間原料を通常の方法、例えば、ホルムアルデヒド
で処理するか又は熱処理して不活化させ、水酸化アルミ
ニウムゲルを５００ｍ　ｇ　／　ｍ　１となるよう添加
して所望のワクチンを得た。

上記不活化工程において、ホルムアルデヒドを使用する
場合には０．０１〜０．０５％の懸濁液の濃度で１５日
間処理することが望ましく、熱処理する場合には６０℃
で３０分間処理することが望ましい。　前者の工程では
４℃以下の温度を維持させることが望ましい。

［実施例］ 以下に、実施例を挙げ、本発明をさらに詳しく説明する
が、本発明はなんらこれら実施例に制約されるものでは
ない。

実施例　１ ハンタンウィルスワクチン： （１）ハンタンウィルスの製造 １日齢の哺乳マウスにハンタンウィルスＲＯＫ　　８４
／１０４菌株を接種し、約１０日間飼育した徨、完全に
麻痺を引き起したマウスの頭部を切開し脳を採取した。

採取した脳の重量に対して４倍量の燐酸塩１ｉｙｊ、養
液（ｐＨ７，２）を添加して乳化させ、３０００ｒｐｍ
で２０分間遠心分離し、上層液をウィルス液として取得
した。該ウィルス液の感染性を知るために致死率を測定
した。　この結果、該ウィルスの致死率（ＬＤｓｏ）は
１０−９・６　Ｂ　、　、、、　ｌであった。なお、測
定方法は次の通りであった。

■　１日齢の哺乳マウスを選択した。

■ウィルス液を緩衝希釈液で１０−２乃至１０−９に段
階希釈する。

■各段階のウィルス希釈液を、適当数の哺乳マウスに各
々０．０２　ｍ　ｌづつ接種する。

■接種後２０日間観察し、症状が現われてへい死するマ
ウスの数を記録する。

■へい死したマウスの数が接種したマウスの１／２とな
る希釈液温度を求める。

■希釈液の濃度を求めてリードアンドミュンヒ法（Ｒｅ
ａｄ　ａｎｄ　Ｍｕｅｎｃｈ）に依りＬＤ、。を求める
。

その結果を下記第１表及び第２表に示した。

（以下余白） 第　　２　　表 マウスの致死率（ＬＤｓａ） Ｉｎ対数 （匹） （匹） 総致死数　４生存数　　致　死　車 （匹）　　　（匹）　　比率 ％ −２９０７８０７８／７８１００ −３　　　　　１３　　　　０　　　　６９　　　　　
０　　　６９／６９１００−５　　　　１５　　　　０
　　　　３９　　　　　０　　　３９／３９１００−６
　　　　１２　　　　１　　　　２４　　　　　１　　
　２４／２５　　　９６−７　　　　　５　　　　８　
　　　１２　　　　　９　　　１２／２１　　　５７−
８　　　　　３　　　　６　　　　　７　　　　１５　
　　　７／２２　　　３２−９　　　　　４　　　１９
　　　　　４　　　　３４　　　　４／３８　　　１１
＊ウィルス希釈倍数は、１０を底とする対数の指数で示
した。従って、−２及び−３は各々ウィルスを１００倍
及び１０００倍に希釈したことをＮ味する。

第２表から、Ｌ　Ｉ）５ｏ＝　１０−”・口ｅ／　ｍ　
１である。

前記ウィルス抗原の力価は、８，１９２ｕ　ｎ　ｉ　ｔ
　７０　、１ｍ　ｌであった。なお、その力価は次の方
法で測定した。

測定は、プレートとしてポリビニルボトム９６を、４Ｉ
ｉｌ希釈液としてシグマ・ダイアゴノステックス社製の
コーティング緩衝液（ＰＢＳ）を、緩衝液として洗浄緩
衛液（ＰＢＳ＋０．１％ＴＷＥＥＮ　２０）　、希釈緩
衝液（Ｆ’ＢＳ＋０．１％ＴＷＥＥＮ　２０　＋　２　
、５％Ｒａｖｉｎｅ　５ｅｒｕ＠＋　０　、１％ｔｈｉ
ｍｅｒｏｓａｌ　）を各々使用するＥ、ＩＡ法により行
なった。

■プレートのコーティングは緬羊由来抗ヒト免疫グロブ
リンＭ　（Ｇｏａｔ　Ａｎｔｉｈｕｌａｎ　ＩｇＭ）を
希釈緩衝液で５００倍希釈してプレートウェル当９１０
０μｍづつ加え、４０℃で１６〜２０時間反応させた。

　緬羊由来抗ヒト免疫グロブリンＭ抗体はＴａｇｏ社製
で、総蛋白量は、１．１５ｍｇ／ｍｌであった。

■前記プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し、人体から分
離された陽性血清を最終ＥＩＡ力価１６ｕｎｉｔとなる
ように希釈してプレートウェル当９１００μｍづつ加え
た復、３７℃のインキュベーターで１時間反応させた。

■プレートを洗浄緩衝液で３回洗浄した後、ウィルス液
を２倍段階希釈してプレートウェル当９１００μｌづつ
加えた後、３７℃のインキュベーターで１時間反応させ
る。

■上記■のプレートを洗浄１ｉ！１ｇＢ液で３回洗浄し
、ラビットのアンチーハンタンウィルス抗体を希釈緩衝
液で３０００倍希釈して、プレートウェル当９１００μ
ｌづつ加えた復、３７℃のインキュベーターで１時間反
応させた。　この時のラビットアンチーハンタンウィル
ス抗体のＥＩＡ力価は４であった。

■■のプレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し、酵素コンジ
ュゲートアンチ−ラビットを希釈緩衝液で１０００倍希
釈してプレートウェル当９１００μｍづつ加えた（麦、
３７℃のインキュベーターで１時間反応させる。　この
酵素コンジュゲートとしては、ＫＰＬ社製で、蛋白含量
が０．１ｍｇであり、ペルオキシダーゼで標識され、ア
フィニティで精製された緬羊由来ヒトエｇＭ抗体　（ｐ
ｅｒｏｘｉｄａｓｅｌａｂｅｌｅｄ　ａｆｆｉｎｉｔｙ
　　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　ａｎｔｉｂｏｄｙ　　ｔ。

ｈｕｏ＋ａｎ　ｒｇＭ　ｇｏａｔ）を使用した。

■前記プレートを洗浄緩衝液で洗浄し、基質をプレート
ウェル当９１００μｍづつ加えた後、３７℃のインキュ
ベーターで３０分間反応させる。使用した基質はＡＢＴ
Ｓであって、過酸化酵素基質溶液Ａ　（２，２−ａｚｉ
ｎｏ−ｄｌ−３−ｅｔｈｙｌ−ｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｌ
ｅ　５ｕｌｆｏｎａｔｅ）と過酸化酵素基質溶液Ｂ（過
酸化水素）を１＝１で混合して得たものである。

■上記■で得たプレートを肉眼または ＥＬＩＳＡ判読機を使用して４０５〜４１５ｎｍで判読
した。

■限界値（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ　ｖａｌｕｅ　）は、公
知の対照陰性血清値の算術平均値に標準偏差の３倍値を
合算したものである。

その結果、ウィルスの力価は８，１９２であった。

（２）エタノール処理 前記ウィルス液を各種エタノール濃度で処理して最適濃
度を選択した。すなわち、各々１５％、２０％、３０％
、４０％の濃度エタノールで処理し、４℃で１６〜２０
時間放置した徨、１２．００Ｏｒｐｍで３０分間遠心分
離して上層液と沈澱物のＥＩＡ力価を算出してその結果
を第３表に示した。

各種エタノール濃度におけるＥＩＡ力価濃度 沈澱物 上層液 １５％ ２０％ ３０％ ４０％ １．０２４ １．０２４ １．０２４ １．０２４ エタノール処理後、６０℃で３０分間不活化させ、ラッ
トに接種し抗原性を比較検査して第４表に示した。

第　　５　　表 エタノール処理後、６０℃で３０分間熱処理して不活化
後、ラットに接種したときの免疫蛍光抗体価 濃度 １４日 ２１日　　２８日 １５％　　　　　　　３２　　　　６４　　　　　６４
２０％　　　　　　１２８　　　２５６　　　　５１２
３０％　　　　　５１２　　１０２４　　２０４８４０
％　　　　　５１２　　　５１２　　　　２５６上記第
３〜５表より、３０％エタノール潰度が抗原の回収率と
抗体型成立とが最も優秀であった。従って、ウィルス液
は３０％エタノール濃度で処理することが望ましい。

（３）プロタミンスルフェート処理 上記エタノール処理ウィルス液を種々のプロタミンスル
フェート濃度で処理して最適濃度を選択した。　すなわ
ち、エタノール処理が絆わったウィルス液を、各々０．
１ｍｇ／ｍ１．０　、２　ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌ、０　、
３　ｍ　ｇ　／　ｍ　１．０　、４　ｍ　ｇ　／　ｍ　
１．０．７ｍｇ／ｍｌ、１．０ｍ　ｇ　／　ｍ　１　濃
度のプロタミンスルフェートで処理した後、４℃で２時
間放置し、３０分間１８、ＯＯＯｒｐｍで遠心分離し、
上層液のＥＩＡ力価を検査した。　その結果を第１図に
示した。

（４）不活化工程 上記ウィルス液を０．０５％ホルマリン溶液で処理して
、処理期間に伴なう致死率（ＬＤｌａｏ＞の変化と感染
率（ＩＤａｏ）を観察した。

１日齢の哺乳マウスを使用してホルマリン処理直後およ
び４日経過後、７日経過後、９日経過後、１０日経過後
のウィルス液を１０倍段階希釈してマウスに接種した。

これに伴なうマウス致死率は次の第６表の濃度希釈倍数
を使用し、その結果、マウスの致死率は第２図に、感染
率は第３図に示した。

第２図及び第３図より、本発明のハンタンウイルスを０
．０５％のホルマリンで１０日以上不活化させた時感染
がなかった。また、本発明のハンタンウィルスを０．０
５％のホルマリンで１４日間不活化させ、ラットに接種
した時の抗原性を比較検討し、その結果を第７表に示し
た。

第　　７　　表 ＲＯＫ　８４／１０５　（ＭＢＶｌ　株をラットにｔｉ
ｆｆ１１７）ｔｆｔｆｆ性ｔ１　　　種 実験動物　　投与経路　実験番号　　免疫蛍光抗体２１
日　　２８日 １０Ｋ　８４７１０５（ＩＩＢＹ）　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　１　　２５６　　２５６ホル
マリン　　　　ＳＤラット　　０．５■ｌ／Ｉｌｌ　　
　　　３　　　６４　　１２８１４日間処理　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　４　　１２８　　２５
６上記第６〜７表から知りえるように、本発明のハンタ
ンウィルスＲＯＫ　　８４／１０５をホルマリンで１０
日以上不活化させ、マウスの脳に接種したとき、へい死
したマウスは１匹もなかった。また、投与３０日８にそ
のマウスの脳組織のウィルス感染の有無を間接免疫蛍光
法でｉ＝した結果、ウィルスの感染は確認しえなかった
。

従って、本発明のハンタンウィルスＲＯＫ８４／１０５
は完全に不活化したことをＷ１認した。

（５）補助剤処理工程 ホルマリンで不活化した本発明のハンタンウイルスＲＯ
Ｋ　　８４／１０５に、補助剤として水酸化アルミニウ
ムゲルを添加し、４℃で１５日間静置した。これをラッ
トに０．５ｍｌ／匹を筋肉接種してＥＩＡ力価を測定し
た。

その結果を次の第８表、第９表及び第４図、第５図に示
した。

（以下余白） 補助剤処理後のＥＩＡ力価 水酸化アルミニウムゲル （２５０ｍｇ／ｍｌ） 水酸化アルミニウムゲル （５０［１ｍｇ／ｍ１） ２．０４８ ２．０４８ １．０２４ 以 上記第８〜９表及び第３〜４図とから、抗体の生成のた
めには本発明のハンタンウィルスＲＯＫ　　８４／１０
５を補助剤としてアルミニウムゲル５００ｍｇ／ｍｌで
処理することが最も満足の行く方法であることを知りえ
る。

第　　　１０　　　　表 試験例　１゜ ハンタンウィルスワクチンの動物実験：（１）ラットに
おける投与量決定実験 上記実施例１において製造されたハンタンウイルスワク
チンを各種の力価（ＥＩＡＡｎｔｉｇｅｎ　Ｔｉｔｅｒ
）でラットに接種して最適量を決定した。

ラットを本発明のハンタンウィルスワクチンで免疫した
後、一定期量刑抗体生成程度を間接免疫蛍光抗体法によ
りＷ１認した。　ハンタンウィルスワクチンをＳＤラッ
トに筋肉注射した。　抗体反応の結果を第１０表に示し
た。

上記第１０表から、本発明のワクチンを５１２　　ＥＩ
Ａ力価以上接種した場合に抗体が生成されることを確認
した。

（２）抗体の増幅（Ｂｏｏｓｔｅｒ　）実験本発明ワク
チンはラットに一次接種後、ケ月程度まで抗体の生成が
増加し、その後抗体の生成が減少することを見出した。

　約４５〜６０日の間に二次接種すれば抗体の生成が顕
著に増加する。　その結果を第５図に示した。

（３）ハンタンウィルスワクチンの安全性試験 本発明のワクチンの安全性を検査するために、哺乳マウ
スの脳に本発明のワクチンを０．２ｍｌづつ接種し、マ
ウスの健康状態を３０日間観察した。４　接種３０日後
にマウスの頭部を切開して脳を採取し、これを−３０℃
のクリオスタット（Ｃｒｙｏｓｔａｔ　）で０．４μｍ
に切断して組織切片を作る。

アセトンで固定した後、１６ユニツト／滴の出血熱意者
の血清を一次反応させ、次いでＦＩＴＣ結合抗ヒトガン
マグロブリン　８ユニット／滴を加えて二次反応させ、
ウィルスの増殖を蛍光顕微鏡で観察した。　その結果、
脳内におけるウィルス増殖が確認されなかった。このマ
ウスの脳を更に乳化して２０％溶液にした徨、哺乳マウ
スの脳に接種し、上記と同様な方法で検査した。

その結果、ウィルスの増殖は確認されず、マウス麻痺も
惹き起こさなかった。

従って、本発明のハンタンウィルスワクチンは完全に不
活化されたことを確認し、無毒が証明された。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明の実施例１中、プロタミンスルフェー
ト処理量による上層液のＥＩＡ力価を示す図面である。 第２図は、ハンタンウィルスのホルマリン処理期間によ
るマウスの致死率（ＬＤ５゜）を示す図面である。 第３図は、ハンタンウィルスのホルマリン処理期間によ
るマウスの感染率（ＩＤ５０）を示す図面である。 第４図は、補助剤量による免疫蛍光体（１Ｆ）の生成曲
線を示す図面である。 第５図は、水酸化アルミニウムゲルで吸着させたＲＯＫ ８４／１０ （ＭＢＶ） を接 種したラッ トの水酸化アルミニウムの量によ る免疫蛍光抗体生成曲線を示す図面である。 以 上 出 願 人 株式会社 緑 十 字 第 図 （０，０５％ ホルマリンと混合したハンタンワイルスワクナンノ第 図 プロタミンスルフェート量 第 図 手続補 （自発） 平成２年２月７日 ６、補正の対象 明細書の「発明の詳細な説明」の掴

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記の特性を有するハンタンウィルスＲＯＫ８４
   ／１０５菌株 Ａ、ビリオン粒子 球形又は楕円形、直径約９５ｎｍ、 ＲＮＡ Ｂ、エンベロープ リポ蛋白のエンベロープで囲まれてお り、５〜１０ｎｍの大きさの多数の繊 維状物が突出されている。 Ｃ、構造 ［１］単一螺旋 ［２］３個の分節 ［３］陰性反応ＲＮＡゲノム ［４］全分子量：４．５×１０＾６ ［５］３個のウィラルニュクレオカプシド ［６］２個のウィルス特異糖蛋白 Ｄ、ウィルス増殖 感染細胞の細胞質 Ｅ、特性 本発明の新規ウィルスであるハンタン ウィルスＲＯＫ８４／１０５株は公 知のハンタンウィルス７６−１１８ 株とは下記のような相異なる特性を示 す。 ［１］ウィルスの力価がＶｅｒｏＥ＿６細 胞で１０＾７＾．＾２／ｍｌである。 ［２］ウィルスの力価が哺乳マウス脳で １００＾９＾．＾８／ｍｌである。 ［３］ウィルスの力価が哺乳ラットの脳で １００＾９＾．＾３／ｍｌである。 以上のようにこのウィルスは鼠に対 する病原性が強くウィルス接種後７〜 １２日の間に鼠が死亡する。 ［４］このウィルスはＩＣＲ哺乳マウスに 接種すればウィルスの増殖が他のウィ ルスより速く起こり、抗体がウィルス 接種後５日目よりあらわれ、１０日頃 には２，０００以上に達する。 ［５］このウィルスをＳＤラットに接種す ればウィルス接種後７日に抗体が検出 される。 ［６］このウィルスをＶｅｒｏＥ＿６細胞 で培養すれば他のウィルスに比べて大 きいサイズである０．３ｃｍ内外のプラ ークを観察し得る。
2. （２）ハンタンウィルスＲＯＫ８４／ １０５菌株をマウスあるいはラットに接 種して増殖させた後、マウスあるいはラ ットの組織を採取し、この組織をエチル アルコールとプロタミンスルフェート溶 液で処理して精製、不活化させ、更に補 助剤を添加することにより製造されるハ ンタンウィルスワクチン。
3. （３）エチルアルコール処理が３０〜４０％濃度のエチ
   ルアルコール溶液でおこなわ れる請求項第２項記載のハンタンウィル スワクチン。
4. （４）プロタミンスルフェート処理が０．１〜０．５ｍ
   ｇ／ｍｌ濃度のプロタミンスルフェートの溶液でおこな
   われる請求項第２項 記載のワクチン。
5. （５）不活化が、０．０１〜０．０５％となるようなホ
   ルマリンの添加および４℃での １０日以上の放置によりおこなわれる請 求項第２項記載のワクチン。
6. （６）不活化が、６０℃での３０分間の熱処理によりお
   こなわれる請求項第２項記載 のワクチン。
7. （７）マウスあるいはラットとして１日齢の哺乳マウス
   あるいは哺乳ラットを使用す る請求項第２項記載のワクチン。
8. （８）ハンタンウィルスＲＯＫ８４／ １０５菌株をマウスあるいはラットに接 種して増殖させ、次いでマウスあるいは ラットの組織を採取し、この組織をエチ ルアルコールとプロタミンスルフェート 溶液で処理して精製し、更に不活化させ ることを特徴とするハンタンウィルスワ クチンの製造法。
9. （９）不活化後、更に補助剤を添加することを特徴とす
   る請求項第８項記載のハンタ ンウィルスワクチンの製造法。