PL212483B1 - Sposób wytwarzania czasteczek, czasteczki odpowiednie do dostarczania, pojemnik, urzadzenie do dostarczania czasteczek i zastosowanie tych czasteczek - Google Patents
Sposób wytwarzania czasteczek, czasteczki odpowiednie do dostarczania, pojemnik, urzadzenie do dostarczania czasteczek i zastosowanie tych czasteczekInfo
- Publication number
- PL212483B1 PL212483B1 PL375782A PL37578203A PL212483B1 PL 212483 B1 PL212483 B1 PL 212483B1 PL 375782 A PL375782 A PL 375782A PL 37578203 A PL37578203 A PL 37578203A PL 212483 B1 PL212483 B1 PL 212483B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- particles
- nucleic acid
- molecules
- dna
- trehalose
- Prior art date
Links
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 144
- 239000002245 particle Substances 0.000 title claims abstract description 142
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 135
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 135
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 100
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 38
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 claims abstract description 34
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims abstract description 29
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims abstract description 29
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 27
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 claims abstract description 20
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical group CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 111
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 87
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 59
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 53
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 claims description 52
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 48
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 claims description 47
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 46
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 45
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 claims description 45
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 43
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 38
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims description 36
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 claims description 35
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims description 35
- 229960004756 ethanol Drugs 0.000 claims description 31
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 24
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 24
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 24
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 claims description 23
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 23
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 claims description 23
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 claims description 23
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 21
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims description 21
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 21
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 20
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 19
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 claims description 18
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 16
- YIXJRHPUWRPCBB-UHFFFAOYSA-N magnesium nitrate Chemical compound [Mg+2].[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O YIXJRHPUWRPCBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 15
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 claims description 15
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 claims description 12
- 239000008101 lactose Substances 0.000 claims description 12
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 11
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 11
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 10
- UBQYURCVBFRUQT-UHFFFAOYSA-N N-benzoyl-Ferrioxamine B Chemical compound CC(=O)N(O)CCCCCNC(=O)CCC(=O)N(O)CCCCCNC(=O)CCC(=O)N(O)CCCCCN UBQYURCVBFRUQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 claims description 10
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 claims description 10
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 claims description 10
- GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N (±)-α-Tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 claims description 8
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 claims description 8
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 claims description 8
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 8
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 claims description 8
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 8
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 8
- WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N tungsten Chemical compound [W] WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229910052721 tungsten Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 239000010937 tungsten Substances 0.000 claims description 8
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 7
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 claims description 7
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 7
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 claims description 7
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 claims description 7
- 150000004043 trisaccharides Chemical class 0.000 claims description 7
- 229940099217 desferal Drugs 0.000 claims description 6
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 125000000647 trehalose group Chemical group 0.000 claims description 6
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 6
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 5
- FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 13-cis retinol Natural products OCC=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N D-erythro-ascorbic acid Natural products OCC1OC(=O)C(O)=C1O ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- FPIPGXGPPPQFEQ-BOOMUCAASA-N Vitamin A Natural products OC/C=C(/C)\C=C\C=C(\C)/C=C/C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-BOOMUCAASA-N 0.000 claims description 4
- 229930003268 Vitamin C Natural products 0.000 claims description 4
- 229930003427 Vitamin E Natural products 0.000 claims description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Substances CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N all-trans-retinol Chemical compound OC\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N 0.000 claims description 4
- WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N gamma-tocopherol Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC1CCC2C(C)C(O)C(C)C(C)C2O1 WIGCFUFOHFEKBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 4
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L succinate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)CCC([O-])=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 4
- 235000019155 vitamin A Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000011719 vitamin A Substances 0.000 claims description 4
- 235000019154 vitamin C Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000011718 vitamin C Substances 0.000 claims description 4
- 235000019165 vitamin E Nutrition 0.000 claims description 4
- 229940046009 vitamin E Drugs 0.000 claims description 4
- 239000011709 vitamin E Substances 0.000 claims description 4
- 229940045997 vitamin a Drugs 0.000 claims description 4
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims description 3
- IMQLKJBTEOYOSI-GPIVLXJGSA-N Inositol-hexakisphosphate Chemical compound OP(O)(=O)O[C@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H]1OP(O)(O)=O IMQLKJBTEOYOSI-GPIVLXJGSA-N 0.000 claims description 3
- IMQLKJBTEOYOSI-UHFFFAOYSA-N Phytic acid Natural products OP(O)(=O)OC1C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C1OP(O)(O)=O IMQLKJBTEOYOSI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- PMUKAEUGVCXPDF-UAIGNFCESA-L dilithium;(z)-but-2-enedioate Chemical compound [Li+].[Li+].[O-]C(=O)\C=C/C([O-])=O PMUKAEUGVCXPDF-UAIGNFCESA-L 0.000 claims description 3
- SHPKCSFVQGSAJU-UAIGNFCESA-L dipotassium;(z)-but-2-enedioate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C(=O)\C=C/C([O-])=O SHPKCSFVQGSAJU-UAIGNFCESA-L 0.000 claims description 3
- MSJMDZAOKORVFC-UAIGNFCESA-L disodium maleate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)\C=C/C([O-])=O MSJMDZAOKORVFC-UAIGNFCESA-L 0.000 claims description 3
- PZZHMLOHNYWKIK-UHFFFAOYSA-N eddha Chemical compound C=1C=CC=C(O)C=1C(C(=O)O)NCCNC(C(O)=O)C1=CC=CC=C1O PZZHMLOHNYWKIK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910052741 iridium Inorganic materials 0.000 claims description 3
- GKOZUEZYRPOHIO-UHFFFAOYSA-N iridium atom Chemical compound [Ir] GKOZUEZYRPOHIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- WAHQBNXSPALNEA-UHFFFAOYSA-L lithium succinate Chemical compound [Li+].[Li+].[O-]C(=O)CCC([O-])=O WAHQBNXSPALNEA-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 229960004254 lithium succinate Drugs 0.000 claims description 3
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims description 3
- 229940068041 phytic acid Drugs 0.000 claims description 3
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 235000019832 sodium triphosphate Nutrition 0.000 claims description 3
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-I triphosphate(5-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-I 0.000 claims description 3
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 2
- 125000000031 ethylamino group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])N([H])[*] 0.000 claims description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 claims description 2
- MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N nitrilotriacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CC(O)=O MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000011591 potassium Substances 0.000 claims description 2
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 abstract description 8
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 abstract description 5
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 abstract description 3
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 77
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 63
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 59
- 229960004793 sucrose Drugs 0.000 description 43
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 36
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 35
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 30
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 28
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 26
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 25
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 25
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 23
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 23
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 20
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 19
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 17
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 17
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 17
- QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N N,N-bis{2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl}glycine Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(=O)O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O QPCDCPDFJACHGM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 15
- 229960003330 pentetic acid Drugs 0.000 description 15
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 14
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 14
- 239000000463 material Substances 0.000 description 11
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 11
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 10
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 10
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 description 9
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 description 9
- -1 nitro triacetic acid Chemical compound 0.000 description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 9
- 230000037317 transdermal delivery Effects 0.000 description 9
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 8
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 8
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 8
- 229920000724 poly(L-arginine) polymer Polymers 0.000 description 8
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 8
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 7
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 7
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 7
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 7
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 7
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 7
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- 229920006317 cationic polymer Polymers 0.000 description 6
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 6
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 229920000768 polyamine Polymers 0.000 description 6
- JHJLBTNAGRQEKS-UHFFFAOYSA-M sodium bromide Chemical compound [Na+].[Br-] JHJLBTNAGRQEKS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 5
- 238000005054 agglomeration Methods 0.000 description 5
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 5
- OTYBMLCTZGSZBG-UHFFFAOYSA-L potassium sulfate Chemical compound [K+].[K+].[O-]S([O-])(=O)=O OTYBMLCTZGSZBG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 229910052939 potassium sulfate Inorganic materials 0.000 description 5
- 235000011151 potassium sulphates Nutrition 0.000 description 5
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 5
- 229940048914 protamine Drugs 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 229940032085 sucrose monolaurate Drugs 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 4
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 4
- KGUHOFWIXKIURA-VQXBOQCVSA-N [(2r,3s,4s,5r,6r)-6-[(2s,3s,4s,5r)-3,4-dihydroxy-2,5-bis(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxan-2-yl]methyl dodecanoate Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COC(=O)CCCCCCCCCCC)O[C@@H]1O[C@@]1(CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 KGUHOFWIXKIURA-VQXBOQCVSA-N 0.000 description 4
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical group O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 4
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 4
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 229960001484 edetic acid Drugs 0.000 description 4
- 238000003114 enzyme-linked immunosorbent spot assay Methods 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 4
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 4
- 235000011147 magnesium chloride Nutrition 0.000 description 4
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 4
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 4
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 4
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 4
- KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N putrescine Chemical compound NCCCCN KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 4
- PFNFFQXMRSDOHW-UHFFFAOYSA-N spermine Chemical compound NCCCNCCCCNCCCN PFNFFQXMRSDOHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 4
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 3
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 3
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 3
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 3
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000001242 acetic acid derivatives Chemical class 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 235000013681 dietary sucrose Nutrition 0.000 description 3
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 3
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 3
- 108010011110 polyarginine Proteins 0.000 description 3
- 229940070353 protamines Drugs 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 3
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 3
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 3
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 3
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 3
- CCVYRRGZDBSHFU-UHFFFAOYSA-N (2-hydroxyphenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC=C1O CCVYRRGZDBSHFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710169336 5'-deoxyadenosine deaminase Proteins 0.000 description 2
- 101150005709 ARG4 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000055025 Adenosine deaminases Human genes 0.000 description 2
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 description 2
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 2
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 2
- 241000588807 Bordetella Species 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 102100026992 Dermcidin Human genes 0.000 description 2
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 101100373494 Enterobacteria phage T4 y06G gene Proteins 0.000 description 2
- 241000709661 Enterovirus Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 2
- 101000911659 Homo sapiens Dermcidin Proteins 0.000 description 2
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 2
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 241000713869 Moloney murine leukemia virus Species 0.000 description 2
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 2
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 2
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 2
- 239000005700 Putrescine Substances 0.000 description 2
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 101100004044 Vigna radiata var. radiata AUX22B gene Proteins 0.000 description 2
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 2
- 230000001476 alcoholic effect Effects 0.000 description 2
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 2
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 2
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 150000001805 chlorine compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- JAWGVVJVYSANRY-UHFFFAOYSA-N cobalt(3+) Chemical compound [Co+3] JAWGVVJVYSANRY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002716 delivery method Methods 0.000 description 2
- 238000000151 deposition Methods 0.000 description 2
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- CVOQYKPWIVSMDC-UHFFFAOYSA-L dipotassium;butanedioate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C(=O)CCC([O-])=O CVOQYKPWIVSMDC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 2
- 239000002360 explosive Substances 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N maleic acid Chemical compound OC(=O)\C=C/C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UPHRSURJSA-N 0.000 description 2
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 2
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 2
- 150000002823 nitrates Chemical class 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 239000000816 peptidomimetic Substances 0.000 description 2
- 229920001308 poly(aminoacid) Polymers 0.000 description 2
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 2
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 235000011083 sodium citrates Nutrition 0.000 description 2
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 229940063675 spermine Drugs 0.000 description 2
- 229910021653 sulphate ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 2
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 2
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 2
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- JDKYOGLOHFFQID-VGWMRTNUSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-amino-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoic acid Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O JDKYOGLOHFFQID-VGWMRTNUSA-N 0.000 description 1
- UUGRFRITTVBJHJ-UHFFFAOYSA-N 1,3,6,8,10,13,16,19-octazabicyclo[6.6.6]icosane Chemical compound C1NCCNCN2CNCCNCN1CNCCNC2 UUGRFRITTVBJHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WYMDDFRYORANCC-UHFFFAOYSA-N 2-[[3-[bis(carboxymethyl)amino]-2-hydroxypropyl]-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CC(O)CN(CC(O)=O)CC(O)=O WYMDDFRYORANCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 241000881711 Acipenser sturio Species 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000002909 Aspergillosis Diseases 0.000 description 1
- 208000036641 Aspergillus infections Diseases 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000588780 Bordetella parapertussis Species 0.000 description 1
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000589562 Brucella Species 0.000 description 1
- 206010051226 Campylobacter infection Diseases 0.000 description 1
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 1
- 206010007134 Candida infections Diseases 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 241000242722 Cestoda Species 0.000 description 1
- 241000606161 Chlamydia Species 0.000 description 1
- 241000251556 Chordata Species 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- 241000252203 Clupea harengus Species 0.000 description 1
- 101710172562 Cobra venom factor Proteins 0.000 description 1
- 102000007644 Colony-Stimulating Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 208000027205 Congenital disease Diseases 0.000 description 1
- 208000001528 Coronaviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N Disodium Chemical class [Na][Na] QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FVIGODVHAVLZOO-UHFFFAOYSA-N Dixanthogen Chemical compound CCOC(=S)SSC(=S)OCC FVIGODVHAVLZOO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001115402 Ebolavirus Species 0.000 description 1
- 206010014561 Emphysema Diseases 0.000 description 1
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 208000007212 Foot-and-Mouth Disease Diseases 0.000 description 1
- 241000710198 Foot-and-mouth disease virus Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 208000015872 Gaucher disease Diseases 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 241000224466 Giardia Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 201000005569 Gout Diseases 0.000 description 1
- 206010018693 Granuloma inguinale Diseases 0.000 description 1
- 241000590002 Helicobacter pylori Species 0.000 description 1
- 208000031220 Hemophilia Diseases 0.000 description 1
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 description 1
- 208000037262 Hepatitis delta Diseases 0.000 description 1
- 241000724709 Hepatitis delta virus Species 0.000 description 1
- 241000709721 Hepatovirus A Species 0.000 description 1
- 241000224421 Heterolobosea Species 0.000 description 1
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 1
- 102000006947 Histones Human genes 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 241000701074 Human alphaherpesvirus 2 Species 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical group Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N Hydrogen bromide Chemical class Br CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035150 Hypercholesterolemia Diseases 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- LNQCUTNLHUQZLR-VNPYQEQNSA-N Iridin Natural products O(C)c1c(O)c2C(=O)C(c3cc(OC)c(OC)c(O)c3)=COc2cc1O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1 LNQCUTNLHUQZLR-VNPYQEQNSA-N 0.000 description 1
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 241000589248 Legionella Species 0.000 description 1
- 208000007764 Legionnaires' Disease Diseases 0.000 description 1
- 241000589929 Leptospira interrogans Species 0.000 description 1
- 241000316144 Macrodon ancylodon Species 0.000 description 1
- 241001115401 Marburgvirus Species 0.000 description 1
- 241000712079 Measles morbillivirus Species 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 241000588621 Moraxella Species 0.000 description 1
- 241000711386 Mumps virus Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- 241000588652 Neisseria gonorrhoeae Species 0.000 description 1
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 1
- 206010067482 No adverse event Diseases 0.000 description 1
- 241000714209 Norwalk virus Species 0.000 description 1
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 1
- 108700001237 Nucleic Acid-Based Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 1
- 208000002606 Paramyxoviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 241000606856 Pasteurella multocida Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 101710093543 Probable non-specific lipid-transfer protein Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N Propionic acid Chemical class CCC(O)=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108010039491 Ricin Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 241000702670 Rotavirus Species 0.000 description 1
- 241000710799 Rubella virus Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 241000277331 Salmonidae Species 0.000 description 1
- 241000242678 Schistosoma Species 0.000 description 1
- 241000269821 Scombridae Species 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 1
- 241000580858 Simian-Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 206010040880 Skin irritation Diseases 0.000 description 1
- 206010070835 Skin sensitisation Diseases 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 241000122938 Strongylus vulgaris Species 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 108010055044 Tetanus Toxin Proteins 0.000 description 1
- 208000002903 Thalassemia Diseases 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 241000242541 Trematoda Species 0.000 description 1
- 241000589886 Treponema Species 0.000 description 1
- 206010044608 Trichiniasis Diseases 0.000 description 1
- 208000005448 Trichomonas Infections Diseases 0.000 description 1
- 206010044620 Trichomoniasis Diseases 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 1
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000607626 Vibrio cholerae Species 0.000 description 1
- 230000009102 absorption Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 208000037919 acquired disease Diseases 0.000 description 1
- 201000007691 actinomycosis Diseases 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 210000003001 amoeba Anatomy 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000118 anti-neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 229940034982 antineoplastic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 244000309743 astrovirus Species 0.000 description 1
- 238000004630 atomic force microscopy Methods 0.000 description 1
- 150000001558 benzoic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 229910052793 cadmium Inorganic materials 0.000 description 1
- BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N cadmium atom Chemical compound [Cd] BDOSMKKIYDKNTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000004927 campylobacteriosis Diseases 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 201000003984 candidiasis Diseases 0.000 description 1
- 210000001736 capillary Anatomy 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002983 circular dichroism Methods 0.000 description 1
- 150000001860 citric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- ARBMMVJALMYDSF-UHFFFAOYSA-L cobalt(2+) ethane-1,2-diamine dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Co++].NCCN.NCCN.NCCN ARBMMVJALMYDSF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940047120 colony stimulating factors Drugs 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000599 controlled substance Substances 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 1
- 229940079920 digestives acid preparations Drugs 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 210000001339 epidermal cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 150000002170 ethers Chemical class 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000010579 first pass effect Methods 0.000 description 1
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 244000053095 fungal pathogen Species 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N heavy water Substances [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 description 1
- 229940037467 helicobacter pylori Drugs 0.000 description 1
- 208000014951 hematologic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 235000019514 herring Nutrition 0.000 description 1
- 239000004312 hexamethylene tetramine Substances 0.000 description 1
- 235000010299 hexamethylene tetramine Nutrition 0.000 description 1
- VKYKSIONXSXAKP-UHFFFAOYSA-N hexamethylenetetramine Chemical compound C1N(C2)CN3CN1CN2C3 VKYKSIONXSXAKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 150000003840 hydrochlorides Chemical class 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 229940065638 intron a Drugs 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 108010047623 iridine Proteins 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 235000020640 mackerel Nutrition 0.000 description 1
- KGZWVMQNJCQVJB-UHFFFAOYSA-M magnesium potassium acetate nitrate Chemical compound C(C)(=O)[O-].[Mg+2].[N+](=O)([O-])[O-].[K+] KGZWVMQNJCQVJB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 150000002690 malonic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 230000037230 mobility Effects 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 1
- 229940023146 nucleic acid vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 1
- 229940051027 pasteurella multocida Drugs 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 201000006509 pleuropneumonia Diseases 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920005575 poly(amic acid) Polymers 0.000 description 1
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 1
- 229920006254 polymer film Polymers 0.000 description 1
- 229920000137 polyphosphoric acid Polymers 0.000 description 1
- PSBAZVJEUNOIDU-UHFFFAOYSA-L potassium;sodium;diacetate Chemical compound [Na+].[K+].CC([O-])=O.CC([O-])=O PSBAZVJEUNOIDU-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 229950008679 protamine sulfate Drugs 0.000 description 1
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000001718 repressive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000012047 saturated solution Substances 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 210000001626 skin fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 230000036556 skin irritation Effects 0.000 description 1
- 231100000475 skin irritation Toxicity 0.000 description 1
- 231100000245 skin permeability Toxicity 0.000 description 1
- 231100000370 skin sensitisation Toxicity 0.000 description 1
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940074404 sodium succinate Drugs 0.000 description 1
- ZDQYSKICYIVCPN-UHFFFAOYSA-L sodium succinate (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)CCC([O-])=O ZDQYSKICYIVCPN-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 210000000434 stratum corneum Anatomy 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 229940118376 tetanus toxin Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013271 transdermal drug delivery Methods 0.000 description 1
- 208000003982 trichinellosis Diseases 0.000 description 1
- 201000007588 trichinosis Diseases 0.000 description 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 208000019553 vascular disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
- A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/89—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microinjection
- C12N15/895—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microinjection using biolistic methods
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
- A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
- A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
- A61K47/6923—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being an inorganic particle, e.g. ceramic particles, silica particles, ferrite or synsorb
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/0091—Purification or manufacturing processes for gene therapy compositions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
- A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
- A61K9/167—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction with an outer layer or coating comprising drug; with chemically bound drugs or non-active substances on their surface
- A61K9/1676—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction with an outer layer or coating comprising drug; with chemically bound drugs or non-active substances on their surface having a drug-free core with discrete complete coating layer containing drug
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
- A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
- A61K9/1605—Excipients; Inactive ingredients
- A61K9/1611—Inorganic compounds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
- C12N2730/00011—Details
- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Ceramic Engineering (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Manufacturing & Machinery (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
Opis wynalazku
Dziedzina techniki
Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania cząsteczek, cząsteczek odpowiednich do dostarczania, pojemnika, urządzenia do dostarczania cząsteczek i zastosowania tych cząsteczek. Wynalazek dotyczy zwłaszcza cząsteczek opłaszczonych kwasami nukleinowymi, które są wykorzystywane do bezigłowego dostarczania kwasów nukleinowych za pomocą tych cząsteczek. W szczególności, wynalazek dotyczy użycia tych cząsteczek do dostarczania cząsteczek kwasów nukleinowych do tkanek ssaczych in vivo i ex vivo.
Stan techniki
Terapia genowa i immunizacja kwasami nukleinowymi są obiecującymi technikami w leczeniu i zapobieganiu chorobom nabytym oraz wrodzonym. Techniki te zapewniają transfer pożądanego kwasu nukleinowego do osobnika z późniejszą jego ekspresją in vivo. Transfer może być dokonywany poprzez transfekcję komórek lub tkanek osobnika ex vivo i ponowne wprowadzenie stransformowanego materiału do gospodarza. Alternatywnie, kwas nukleinowy może być podawany in vivo bezpośrednio do odbiorcy. Jednakże, ten sposób dostarczania in vivo musi pozwalać na wejście kwasu nukleinowego do komórek odbiorcy w taki sposób, że kwas nukleinowy ulega ekspresji.
W tym kontekście rozwinięto szereg sposobów dostarczania genów. Spośród tych technik, transdermalne dostarczanie kwasów nukleinowych daje wiele korzyści w porównaniu do technik dostarczania doustnego lub pozajelitowego.
W szczególności, dostarczanie transdermalne stanowi bezpieczną, wygodną i nieinwazyjną opcję w stosunku do konwencjonalnych systemów podawania, co pozwala na uniknięcie głównych problemów związanych z dostarczaniem doustnym (np. zmieniające się rzędy absorpcji, degradacja i metabolizm w żołądku, efekt pierwszego przejścia przez wątrobę, uczulenie pokarmowe i/lub gorzki lub nieprzyjemny smak) lub z dostarczaniem pozajelitowym, (np. ból przy ukłuciu, ryzyko wprowadzenia infekcji do osób leczonych lub personelu medycznego spowodowanej przypadkowym ukłuciem i wyrzucaniem zużytych igieł).
Transdermalne dostarczanie kwasów nukleinowych również dostarcza szeregu problemów. Pasywne dostarczanie przez nienaruszoną skórę obejmuje transport cząsteczek przez szereg strukturalnie rożnych tkanek. Te mogą obejmować warstwę rogową (główna bariera), żywy naskórek, skórę właściwą lub ściany naczyń włosowatych. Systemy dostarczania transdermalnego muszą tym samym być zdolne do pokonania różnych przeszkód stawianych przez każdy typ tkanki.
Z tego powodu opracowano szereg alternatywnych sposobów pasywnego dostarczania transdermalnego. Obejmują one użycie czynników zwiększających penetrację skóry lub „wzmacniaczy przepuszczalności” celem zwiększenia przepuszczalności skóry, jak również sposoby nie chemiczne, takie jak jonoforeza, elektroporacja lub ultradźwięki. Tego rodzaju alternatywne techniki prowadzą jednak do szeregu efektów ubocznych, takich jak podrażnienie i uwrażliwienie skóry.
Ostatnio opracowano techniki trasdermalnego dostarczania kwasów nukleinowych oparte na cząsteczkach. Cząsteczki niosące pożądane kwasy nukleinowe są przyspieszane do dużej prędkości i wstrzeliwane do tkanki docelowej przy użyciu urządzenia przyspieszającego cząsteczki in vivo. Cząsteczki te mogą zostać wystrzelone bezpośrednio do komórek docelowych, unikając konieczności pobrania przez komórkę obcego kwasu nukleinowego.
Fachowcom znane są różne urządzenia służące do przyspieszania cząsteczek. Istniejące urządzenia wykorzystują wyładowanie eksplozyjne, elektryczne lub gazowe do przyspieszania opłaszczonych cząsteczek w kierunku komórek docelowych. Urządzenie Biolistic®, przykładowo, dostarcza mikroskopijnych kulek złota pokrytych DNA bezpośrednio do komórek naskórka (Yang i wsp., (1990) PNAS USA 87:9568-9572). Cząsteczki mogą być również dostarczane przy użyciu bezigłowej strzykawki takiej jak ta opisana w patencie USA nr 5630796 dla Bellhouse i wsp. (bezigłowa strzykawka PowderJect©).
Urządzenia wykorzystujące cząsteczki umożliwiają bezpieczne i łatwe dostarczanie kwasów nukleinowych. Jednak fizyczne cechy cząsteczek muszą zostać dopracowane tak, aby spełniały wymagania bezigłowego podawania, podczas którego cząsteczki są zazwyczaj wystrzeliwane przy bardzo dużej prędkości. Cząsteczki muszą wykazywać taką integralność strukturalną, aby przetrwały działanie, przykładowo, gazu ze strzykawki lub impetu balistycznego w zetknięciu ze skórą lub błonami śluzowymi. Ważne jest również, aby cząsteczki posiadały gęstość pozwalającą im na osiągnięcie wystarczającego momentu pędu, umożliwiającego penetrację tkanki. Jednakże przy dostarczaniu
PL 212 483 B1 kwasów nukleinowych, cząsteczki powinny mieć wielkość mniejszą od komórek tak, aby penetrowały błony komórkowe bez rozbijania tych komórek. Same kwasy nukleinowe są wrażliwe na degradację podczas przechowywania. Tym samym, po związaniu z cząsteczką kwasy nukleinowe muszą być przechowywane w stabilnych warunkach. Związanie kwasu nukleinowego z cząsteczką powinno również pozwalać na wydajną ekspresję kwasu nukleinowego po dostarczeniu do komórki docelowej. Jeśli kwas nukleinowy koduje antygen, sposoby wiązania powinny również zapewniać immunogenność antygenu w podmiocie.
Według jednej z technik, cząsteczki odpowiednie do podawania za pomocą cząsteczek mogą być utworzone poprzez pokrywanie cząsteczkami kwasu nukleinowego nośnikowych cząsteczek z obojętnego metalu. Cząsteczki nośnikowe są wybrane z materiałów o odpowiedniej gęstości i rozmiarze, takich jak złoto lub wolfram. Znanych jest szereg sposobów pokrywania lub precypitacji DNA lub RNA na cząsteczkach złota lub wolframu. Sposoby te ogólnie polegają na połączeniu określonej ilości złota lub wolframu z plazmidowym DNA, CaCl2 i spermidyną. Powstający roztwór jest w sposób ciągły mieszany podczas procedury pokrywania, tak, aby zapewnić jednorodność mieszaniny reakcyjnej. Po precypitacji kwasu nukleinowego, opłaszczone cząsteczki mogą być przenoszone do odpowiednich błon i pozostawiane do wyschnięcia, wykorzystywane do pokrycia powierzchni kasety lub modułu próbki bądź ładowane do kasety dostarczającej, wykorzystywanej w danym urządzeniu do podawania.
Podsumowanie wynalazku
Opracowano nowy preparat mający na celu optymalizację stabilności kwasu nukleinowego przyłączonego do cząsteczki nośnikowej, co umożliwia przedłużenie czasu przechowywania cząsteczek oraz zwiększa ilość nienaruszonego kwasu nukleinowego dostarczanego do tkanek, jak również ekspresję i fizjologiczną aktywność kwasu nukleinowego dostarczonego do tkanek docelowych. W szczególności, stwierdzono, że kwasy nukleinowe mogą być stabilnie przyłączone do cząsteczek nośników z obojętnego metalu w obecności czynnika kondensującego kwas nukleinowy oraz czynnika chelatującego jony metali.
Kwasy nukleinowe mogą tym samym, zostać precypitowane na cząsteczki nośnika przy pH raczej obojętnym, niżeli alkalicznym, co pozwala na zachowanie integralności kwasu nukleinowego. Co więcej, cząsteczki mogą zostać następnie przepłukane w roztworach wodnych lub alkoholowych, bez utraty kwasu nukleinowego, ułatwiając inkorporację czynników zwiększających stabilność. Kondensacja kwasu nukleinowego, wraz z chemicznym działaniem czynnika chelatującego chroni kwas nukleinowy przed zniszczeniem fizycznym i chemicznym, przykładowo przed utlenieniem przez wolne rodniki lub strawieniem przez endonukleazy. Cząsteczki według wynalazku mogą być dostarczane do komórek dzięki efektywnemu dostarczaniu cząsteczek. Pomimo stabilności opłaszczonych cząsteczek kwasu nukleinowego, wykazano, że istnieje wydajna ekspresja kwasu nukleinowego w komórkach docelowych. Co więcej, wykazano immunogenność antygenów kodowanych przez kwasy nukleinowe.
Odpowiednio zatem przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania cząsteczek odpowiednich do dostarczania przez urządzenie, do dostarczania cząsteczek, polegający na tym, że:
(i) dokonuje się precypitacji kwasu nukleinowego na cząsteczkach nośnikowych z obojętnego metalu w obecności czynnika kondensującego kwasy nukleinowe i czynnika chelatującego jony metali, przy czym wspomniany czynnik kondensujący kwasy nukleinowe jest homopolimerem argininy o wzorze (Arg)x gdzie x posiada wartość od 2 do 10, lub jego fizjologicznie akceptowalną solą; i (ii) zbiera się otrzymywane cząsteczki.
Korzystnie na etapie (i) sposobu, czynnik kondensujący kwas nukleinowy jest dodawany do mieszaniny, zawierającej cząsteczki nośnikowe z obojętnego metalu oraz kwas nukleinowy.
Również korzystnie cząsteczki nośnika z obojętnego metalu wybiera się z grupy składającej się z cząsteczek złota, wolframu, platyny i irydu.
Bardziej korzystnie cząsteczki nośnika z obojętnego metalu są cząsteczkami złota o średnicy od 1 do 3 μm.
W innym korzystnym wykonaniu sposobu, kwas nukleinowy koduje antygen, który w bardziej korzystnym rozwiązaniu jest wybrany z grupy składającej się z antygenów wirusowych, bakteryjnych i grzybowych. Także korzystnie kwas nukleinowy koduje polipeptyd terapeutyczny.
Korzystnie kwasem nukleinowym jest DNA.
W następnym korzystnym wykonaniu sposobu według wynalazku homopolimerem argininy jest (Arg)4 lub (Arg)6.
PL 212 483 B1
W sposobie według wynalazku korzystnie, czynnik chelatujący jony metali jest wybrany z grupy składającej się z kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), kwasu dietylenoetriamino pentaoctowego (DTPA), kwasu nitrilotrójoctowego (NTA), heksafosforanu inozytolu, tripolifosforanu, kwasu polifosforowego, bursztynianu sodu, bursztynianu potasu, bursztynianu litu, maleinianu sodu, maleinianu potasu, maleinianu litu, desferalu kwasu etylenodiammo-di-(o-hydroksyfenylooctowego) (EDDHA).
W sposobie według wynalazku etap (i) jest ponadto prowadzony w obecności jednego lub więcej disacharydów (i) lub trisacharydów.
Bardziej korzystnie jeden lub więcej cukrów jest wybranych z grupy składającej się z trehalozy, sacharozy, laktozy i rafinozy.
Bardziej korzystnie jeden lub więcej cukrów jest mieszaniną sacharozy i rafinozy.
W sposobie według wynalazku etap (i) jest ponadto prowadzony w obecności jednej lub więcej soli. Korzystnie jedną lub więcej soli wybiera się z octanu potasu, chlorku wapnia, chlorku litu, octanu sodu, azotanu magnezu, cytrynianu sodu, fosforanu sodu i chlorku magnezu.
W korzystnym wykonaniu sposobu, według wynalazku otrzymywane podczas etapu (i) cząsteczki są doprowadzane do kontaktu z przeciwutleniaczami, przeciwutleniacz bardziej korzystnie jest wybrany z etanolu, witaminy A, witaminy C i witaminy E.
W sposobie według wynalazku, korzystnie (i) dokonuje się precypitacji DNA na obojętnych cząsteczkach złota w obecności wspomnianego homopolimeru argininy lub jego soli, EDTA oraz sacharozy; i (ii) zbiera się otrzymywane cząsteczki.
Bardziej korzystnie homopolimerem argininy jest (Arg)4, wspomnianym czynnikiem chelatującym jony metali jest kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), wspomnianym cukrem jest trehaloza.
Przedmiotem wynalazku są także cząsteczki odpowiednie do dostarczania za pomocą urządzenia dostarczającego cząsteczki, które to cząsteczki otrzymywane są sposobem jak zdefiniowano powyżej.
Przedmiotem wynalazku są także cząsteczki, odpowiednie do dostarczania przez urządzenie do dostarczania cząsteczek, które obejmują cząsteczki nośnikowe z obojętnego metalu mające na swojej powierzchni kwas nukleinowy, homopolimer argininy o wzorze (Arg)x, gdzie x posiada wartość od 2 do 10 lub jego fizjologicznie akceptowalną sól i czynnik chelatujący jony metali.
Korzystnie, cząsteczki według wynalazku zawierają cząsteczki nośnikowe z obojętnego metalu, mające na swojej powierzchni jeden lub więcej disacharydów (i) lub trisacharydów.
W bardziej korzystnej postaci wynalazku wspomnianym cukrem jest trehaloza.
Cząsteczki według wynalazku charakteryzują się ponadto tym, że cząsteczki nośnikowe z obojętnego metalu posiadają ponadto na swojej powierzchni jedną lub więcej soli.
Przedmiotem wynalazku jest także pojemnik na dawkę dla urządzenia do dostarczania cząsteczek, przy czym pojemnik zawiera cząsteczki, jak zdefiniowano powyżej.
Wynalazkiem jest także urządzenie do dostarczania cząsteczek, załadowane cząsteczkami, jak zdefiniowano powyżej.
Korzystnie, urządzenie do dostarczania cząsteczek stanowi bezigłowa strzykawka.
Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie cząsteczek jak zdefiniowano powyżej do wytwarzania urządzenie do dostarczania cząsteczek dla dostarczania tych cząsteczek osobnikowi.
Szczegółowy opis korzystnych wykonań
Praktyczna część niniejszego wynalazku obejmuje, o ile nie zaznaczono inaczej, wykorzystanie konwencjonalnych metod wirusologicznych, mikrobiologicznych, metod biologii molekularnej, technik rekombinowanego DNA oraz technik immunologicznych, znanych fachowcom. Tego rodzaju techniki są wyjaśnione w dostępnej literaturze. Patrz, np., Sambrook i wsp., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (wyd. drugie, 1989); DNA Cloning: A Practical Approach, tom I i II (ed. D. Glover); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, wyd. 1984); A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); oraz Fundamental Virology, wyd. drugie, tom I i II (ed. B.N. Fields i D.M. Knipe).
Jeśli nie zaznaczono inaczej, wszystkie użyte w niniejszym, opisie terminy techniczne i naukowe, mają to samo znaczenie, co terminy powszechnie stosowane przez fachowców.
PL 212 483 B1
A. Definicje
Opisując niniejszy wynalazek, zastosowane zostaną następujące terminy, które zostaną zdefiniowane poniżej.
Stosowane niniejszym zamiennie terminy „cząsteczka kwasu nukleinowego” i „polinukleotyd” odnoszą się do polimerycznych form nukleotydów o każdej długości, rybonukleotydów lub deoksyrybonukleotydów lub ich analogów. Polinukleotydy, mogą przyjąć każdą strukturę trzeciorzędową oraz mogą pełnić jakąkolwiek funkcję, znaną lub nieznaną. Nieograniczające przykłady polinukleotydów obejmują gen, fragment genu, eksony, introny, informacyjny RNA (mRNA), transportujący RNA (tRNA), rybosomalny RNA, rybozymy, cDNA, rekombinowane polinukleotydy, rozgałęzione polinukleotydy, plazmidy, wektory, izolowane DNA o każdej sekwencji, izolowane RNA o każdej sekwencji, sondy kwasów nukleinowych lub starterów.
Polinukleotyd, zazwyczaj składa się ze specyficznej sekwencji czterech zasad azotowych: adeniny (A); cytozyny (C); guaniny (G) oraz tymidyny (T) (uracylu (U) dla tymidyny, jeśli polinukleotyd stanowi RNA). Tymi samym, termin sekwencja kwasu nukleinowego stanowi alfabetyczną reprezentację cząsteczki polinukleotydu. Tego rodzaju alfabetyczna reprezentacja może być wprowadzona do komputerowej bazy danych posiadającej centralną jednostkę procesorową, wykorzystywanej do zastosowań bioinformatycznych, takich jak poszukiwanie homologii i genomika funkcjonalna.
Sekwencja kwasu nukleinowego, która „koduje” wybrany antygen stanowi cząsteczkę kwasu nukleinowego, ulegającego transkrypcji (w przypadku DNA) oraz translacji (w przypadku mRNA) in vivo do polipeptydu, po umieszczeniu pod kontrolą odpowiednich sekwencji regulatorowych. Granice sekwencji kodującej są określane przez kodon start na 5' końcu (N-końcu) oraz kodon stop translacji na 3' końcu (C-końcu). Dla celów wynalazku, tego rodzaju sekwencje kwasów nukleinowych mogą obejmować, cDNA z wirusowego, prokariotycznego lub eukariotycznego mRNA, sekwencje genomowe z wirusowego lub prokariotycznego DNA lub RNA, a nawet syntetycze sekwencje DNA. Sekwencja terminacji transkrypcji może być zlokalizowana 3' w stosunku do sekwencji kodującej.
„Wektor” jest zdolny do transferu sekwencji kwasu nukleinowego do komórek docelowych (np. wektory wirusowe, wektory nie-wirusowe, poszczególne nośniki i liposom). Zazwyczaj, „konstrukt wektorowy”, „wektor ekspresyjny” i „wektor do transferu genów” oznacza jakikolwiek konstrukt kwasu nukleinowego zdolny do kierowania ekspresją pożądanego genu oraz, który może przekazywać sekwencje genów do komórek docelowych. Tym samym, termin ten obejmuje klonowanie i nośniki ekspresji. „Plazmid” stanowi wektor w postaci pozachromosomalnego elementu genetycznego.
„Promotor” stanowi sekwencję nukleotydową, która inicjuje i reguluje transkrypcję polinukleotydu. Promotory mogą obejmować promotory indukowalne (w których ekspresja sekwencji polinukleotydu operacyjnie połączonego z promotorem jest indukowana przez analit, kofaktor, białko regulatorów itp.), promotory, ulegające represji (w których ekspresja sekwencji polinukleotydu operacyjnie połączonego z promotorem jest hamowana przez analit, kofaktor, białko regulatorowe itp.) oraz promotory konstytutywne. Zakłada się, że termin „promotor” lub „element kontrolny” obejmuje region pełnej długości promotora oraz segmenty funkcjonalne tych regionów (np. kontrolujące translację i transkrypcję).
„Operacyjnie połączony” odnosi się do takiego ułożenia elementów, w którym składniki te są skonfigurowane tak, aby spełniały swoje zwykłe funkcje. Tym samym, dany promotor operacyjny połączony z sekwencją kwasu nukleinowego jest zdolny do wpływania na ekspresję tej sekwencji, jeśli obecne są odpowiednie enzymy. Promotor nie musi sąsiadować z sekwencją tak długo, jak długo kieruje jego ekspresją. Tym samym, przykładowo, przeplatanie się sekwencji jeszcze bez translacji, ale już po transkrypcji może zachodzić pomiędzy sekwencją promotora a sekwencją kwasu nukleinowego, i sekwencja promotora może być ciągle uważana za „operacyjnie połączoną” z sekwencją kodującą.
„Rekombinowany”, jak użyto w niniejszym. opisie, opisuje cząsteczkę kwasu nukleinowego (polinukleotydu) pochodzenia genomowego, cDNA, semisyntetycznego lub syntetycznego, która na wskutek pochodzenia lub manipulacji nie jest związana z całością lub częścią polinukleotydu, z którym pozostaje związana w naturze i/lub jest połączona z polinukleotydem innym, niż ten występujący w naturze. Dwie sekwencje kwasów nukleinowych, które są zawarte w pojedynczej cząsteczce rekombinowanego kwasu nukleinowego są „heterologiczne” w stosunku do siebie, jeśli w naturze nie pozostają ze sobą związane.
„Polipeptyd” jest stosowany w najszerszym znaczeniu w odniesieniu do związku dwóch lub więcej podjednostek aminokwasów, analogów aminokwasów lub innych peptydomimetyków. Podjednostki mogą być podłączone wiązaniami peptydowymi lub innymi wiązaniami, przykładowo, estrowymi,
PL 212 483 B1 eterowymi itp. Jak zastosowano w niniejszym opisie, termin „aminokwas odnosi się do naturalnych i/lub nienaturalnych lub syntetycznych aminokwasów, w tym glicyny, zarówno izomerów optycznych D, jak i L oraz analogów aminokwasów i peptydomimetyków. Peptyd składający się z trzech lub więcej aminokwasów jest zwyczajowo nazywany oligopeptydem, jeśli łańcuch peptydowy jest krótki. Jeśli łańcuch peptydowy jest długi, peptyd zwyczajowo nazywa się polipeptydem lub białkiem.
„Antygen” odnosi się do jakiegokolwiek czynnika, ogólnie makrocząsteczki, która może wzbudzać odpowiedź immunologiczną u osobnika. Termin może być stosowany w odniesieniu do pojedynczej makromoIekuły lub homogennej, bądź heterogennej populacji makrocząsteczek antygenów. Jak niniejszym zastosowano, „antygen” ogólnie odnosi się do cząsteczki białka lub jego części, zawierającej jeden lub więcej epitopów. Dla celów niniejszego wynalazku, antygeny mogą być otrzymane 1Ub mogą pochodzić z każdego odpowiedniego źródła. Co więcej, dla celów niniejszego wynalazku, „antygen” obejmuje białko z modyfikacjami, takimi jak delecje, addycje i substytucje (ogólnie o charakterze konserwatywnym) w stosunku do sekwencji natywnej, tak długo, jak długo białko zachowuje wystarczającą immiunogenność. Modyfikacje te mogą być celowe, przykładowo na drodze ukierunkowanej mutagenezy lub mogą być przypadkowe, takie jak mutacje gospodarza produkującego antygen.
„Odpowiedź immunologiczna” przeciwko pożądanemu antygenowi stanowi rozwój w osobniku odpowiedzi komórkowej i/lub humoralnej na dany antygen. Dla celów niniejszego wynalazku, „immunologiczna odpowiedź humoralna, stanowi odpowiedź indukowaną przez limfocyty oraz/lub inne leukocyty krwi.
Termin „immunizacja kwasem nukleinowym” odnosi się w niniejszym opisie do wprowadzania cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej jeden lub więcej wybranych antygenów do komórki gospodarza, celem ekspresji antygenu lub antygenów in vivo. Cząsteczka kwasu nukleinowego może być wprowadzana bezpośrednio do osobnika docelowego za pośrednictwem transdermalnego dostarczania cząsteczek. Alternatywnie, cząsteczka może zostać wprowadzona ex vivo do komórek, które usunięto z danego osobnika. W tym ostatnim przypadku, komórki zawierające pożądaną cząsteczkę kwasu nukleinowego mogą zostać ponownie wprowadzone do osobnika w taki sposób, aby doszło do wzbudzenia odpowiedzi immunologicznej przeciwko antygenowi kodowanemu przez cząsteczkę kwasu nukleinowego. Cząsteczki kwasu nukleinowego stosowane w takiej immunizacji są tutaj ogólnie określane jako „szczepionki z kwasów nukleinowych”.
Termin „dostarczanie trasdermalne” oznacza podawanie śródskórne (np. do skóry właściwej lub naskórka), przezskórne (np. przez nienaruszoną skórę) oraz podawanie przez błony śluzowe, tj. dostarczanie poprzez przemieszczanie czynnika do lub przez skórę lub błonę śluzową. Patrz, np., Transdermal Drug Delivery: Developmental Issues and Research Initiatives, Hadgraft i Guy (ed.), Marcel Dekker, Inc., (1989); Controlled Drug Delivery: Fundamentals and Applications, Robinson i Lee (ed.). Marcel Dekker me., (1987); oraz Transdermal Delivery of Drugs, tomy 1-3, Kydonieus i Berner (ed.), CRC Press, (1987). Tym samymi, termin obejmuje dostarczanie za pomocą bezigłowej strzykawki, jak opisano w patencie USA nr 5360796, jak również za pomocą dostarczania przy użyciu cząsteczek, jak opisano w US. Patent nr 5865796.
„Bezigłowa strzykawka” oznacza urządzenie dostarczające dany preparat transdermalnie bez pomocy konwencjonalnej igły przebijającej skórę. Bezigłowe strzykawki stosowane w niniejszym wynalazku są opisane w niniejszymi dokumencie.
Terminy „jednostka” i „osobnik” są w niniejszym opisie stosowane zamiennie w odniesieniu do jakiegokolwiek przedstawiciela podkrólestwa strunowców, w tym do ludzi i innych naczelnych takich jak szympansy i inne gatunki małp i małpiatek, zwierząt gospodarskich takich jak bydło, owce, świnie, kozy i konie, zwierząt domowych takich jak koty i psy, zwierząt laboratoryjnych, w tym gryzoni takich jak myszy, szczury, świnki morskie, ptaków w tym domowych, dzikich i łownych takich jak kurczaki, indyczki oraz inne kurowate, kaczki, gęsi, i inne. Termin ten nie podaje określonego wieku. Tym samym, obejmuje zarówno osobniki dorosłe, jak i nowonarodzone.
Opisane sposoby mogą być stosowane dla każdego z powyższych gatunków kręgowców, ponieważ systemy immunologiczne wszystkich tych kręgowców pracują podobnie.
B. Metody ogólne
Wynalazek opisuje dostarczanie kwasów nukleinowych za pomocą cząsteczek. W szczególności, wynalazek dotyczy cząsteczek, które są odpowiednie do dostarczania z urządzenia podającego cząsteczki, oraz cząsteczek, które są otrzymywane w sposobie obejmującymi, lub w niektórych wykonaniach składającym się zasadniczo z nakładania kwasu nukleinowego na cząsteczki metalu obojętnego w obecności czynnika kondensującego kwas nukleinowy oraz czynnika chelatującego jony metali.
PL 212 483 B1
Cząsteczki nośnikowe są wybrane spośród metali o odpowiedniej gęstości i odpowiedniej wielkości cząsteczek do podawania wewnątrzkomórkowego za pomocą urządzenia podającego cząsteczki. Korzystnie, gęstość cząsteczek wynosi przykładowo od około 15 do 25g/ml, od około 15 do 23 g/ml lub od około 16 do 20 g/ml. Cząsteczki nośnika mają średnicę od około 0,5 do 10 μm, przykładowo od około 1 do 5 μm. Szczególnie korzystnym jest, aby cząsteczki nośnika miały średnicę od około 0,5 do 3 μm, np. od około 1 do 3 μm lub od 0,5 do 2 μm.
Cząsteczki nośnika metalowego są obojętne chemicznie, to znaczy są nie reaktywne w komórkach ex vivo lub w ciele osobnika, do którego cząsteczki są podawane. Typowo, stosowane są cząsteczki nośnika ze złota, wolframu, platyny lub irydu. Korzystne są cząsteczki złota lub wolframu. Cząsteczki złota mogą stanowić cząsteczki złota koloidalnego. Cząsteczki złota zapewniają jednakową wielkość (dostępne w Alpha Chemicals w postaci cząsteczek o wielkości 1 do 3 μm, lub w Degusssa, South Plainfield, NJ w zakresie cząsteczek obejmującym 0,95 μm) i zredukowaną toksyczność. Złoto mikrokrystaliczne (np. złoty proszek A1570, dostępny w Engelhard Corp., East Newark, NJ) zapewnia zróżnicowaną dystrybucję wielkości cząsteczek, zazwyczaj w zakresie od około 0,1 do 5 μm. Jednakże nieregularna powierzchnia złota mikrokrystalicznego zapewnia wysoce wydajne pokrycie przez kwasy nukleinowe. Cząsteczki wolframu są łatwo dostępne w rozmiarach średnio około 0,5 do 2 μm średnicy.
Zazwyczaj, cząsteczka kwasu nukleinowego zawiera terapeutycznie właściwą sekwencję nukleotydową, dostarczaną do osobnika. Korzystnym jest, aby niniejsze cząsteczki były odpowiednie do stosowania w terapii immunizacji kwasem nukleinowym lub do terapii genowej. Kwas nukleinowy może tym samym zawierać sekwencję zdolną do zapewniania immunizacji, przykładowo sekwencję immunogenną wzbudzającą komórkową i/Iub humoralną odpowiedź immunologiczną, po dostarczeniu do osobnika. AIternatywnie, kwas nukleinowy może zawierać jeden lub więcej genów kodujących terapeutyczny polipeptyd, np. białko defektywne lub którego brak w docelowym genomie bądź nienatywne białko wykazujące pożądane działanie biologiczne lub terapeutyczne (np., funkcję przeciwwirusową). Kwas nukleinowy może zawierać sekwencję kodującą cząsteczkę posiadającą funkcje antysensowe lub rybozymowe. Do leczenia chorób genetycznych, podmiotowi mogą być podawane funkcjonalne geny odpowiadające genom, o którym wiadomo, że ich brak stanowi o danej chorobie.
Korzystnie, kwasem nukleinowym jest DNA.
Kwasy nukleinowe odpowiednie do podawania obejmują kwasy nukleinowe stosowane do leczenia chorób zapalnych, chorób autoimmunologicznych, przewlekłych i zakaźnych, w tym chorób takich jak AIDS, nowotwory, choroby neurologiczne, naczyniowe, hipercholesterolemia, różne choroby krwi w tym różne anemie, talasemie i hemofilie, defekty genetyczne takie jak mukowiscydoza, choroba Gauchera, niedobór deaminazy adenozyny (ADA), odma, itp. Fachowcom znanych jest szereg antysensownych oligonukleotydów (np. krótkich oligonukleotydów komplementarnych do sekwencji w pobliżu miejsca inicjacji translacji (kodon AUG) mRNA), użytecznych w terapii antysensem chorób nowotworowych i wirusowych. Patrz, np. Han i wsp. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci USA 88,4313; Uhlmann i wsp. (1990) Chem. Rev. 90:543, Helene i wsp. (1990) Biochim. Biophys. Acta. 1049:99: Agarwal i wsp. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 7079; oraz Heikkila i wsp. (1987) Nature 328:445. Opisano również szereg rybozymów, odpowiednich do zastosowania. Patrz, np. Chec i wsp. (1992) J. Biol. Chem. 267: 17479 oraz patent U.S. nr 5.225.347 dla Goldberg i wsp.
Przykładowo, w sposobach leczenia guzów litych, geny kodujące peptydy toksyczne (tj. czynniki chemioterapeutyczne takie jak rycyna, toksyna tężca i czynnik jadu kobry), geny supresorowe nowotworów takie jak p53, geny kodujące sekwencje mRNA, które są antysensowne w stosunku do transformujących onkogenów, peptydy antyneoplastyczne, takie jak czynnik martwicy nowotworów (TNF) oraz inne cytokiny lub transdominujące mutanty negatywne dla onkogenów transformujących, mogą być dostarczane w celu ekspresji w miejscu lub w pobliżu nowotworu.
Podobnie, poddawane mogą być również kwasy nukleinowe kodujące polipeptydy, o których wiadomo, że wykazują aktywność przeciwwirusową i/lub przeciwbakteryjną lub stymulujące układ immunologiczny gospodarza. Kwas nukleinowy może kodować jedną z szeregu cytokin (lub ich fragmentów funkcjonalnych), takich jak interleukiny, interferony i czynniki stymulujące wzrost kolonii. Kwas nukleinowy może kodować antygen do leczenia lub zapobiegania szeregu schorzeń, obejmujących nowotwory, alergie, toksyczności i zakażenia patogenami takimi jak: grzyby, wirusy, w tym ludzkie wirusy brodawczaków (HPV), HIV, HSV2/HSV1, wirus grypy (typ A, B i C), poliowirus, rinowirusy, wirus RS, rotawirusy, wirus zapalenia wątroby typu A, grupa wirusów Norwalk, enterowirusy, astrowirusy, wirus odry, wirus parainfluenzy, wirus świnki, wirus ospy wietrznej, cytomegalowirus,
PL 212 483 B1 wirus Epsteina Barr, adenowirusy, wirus różyczki, ludzki wirus T-Iimfotypowy typu I (HTLV-I), wirus zapalenia wątroby typu B (HBV), wirus zapalenia wątroby typu C (HCV), wirus zapalenia wątroby typu D, pokswirus, wirusy Marburg i Ebola; bakterie w tym M. tuberculosis, Chlamydia, N. gonorrhoeae, Shigella, Salmonella, Vibrio Cholera, Treponema pallidua, Pseudomonas, Bordetella pertussis, Brucella, Franciscelia tulorensis, Helicobacter pylori, Leptospira interrogans, Legionella pneumophila, Yersinia pestis, Streptococcus (typy A i B), Pneumococcus, Meningococcus, Hemophilus influenza (typ b), Toxoplama gondii, Campylobacteriosis, Moraxella eatarrhalis, Donovanosis, i Actinomycosis; patogenów grzybiczych w tym Candidiasis i Aspergillosis, patogenów pasożytniczych w tym tasiemce, przywry, glisty, ameby, giardie, cryptosporidia, schistosomy, Pneumoeystis carinii, rzęsistkownica i włośnica. Kwas nukleinowy może być również wykorzystywany do zapewniania właściwej odpowiedzi immunologicznej w szeregu chorób weterynaryjnych, takich jak pryszczyca, zakażenia koronawirusami, Pasteurella multocida, Helicobaeter, Strongylus vulgaris, Actinobaeillus pleuropneumonia, wirus biegunki bydła (BVDV), Klebsiella pneumoniae, E. Coli, Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis oraz Bordetella broehiseptica. Tym samym, w jednym aspekcie, cząsteczki według niniejszego wynalazku mogą mieć zastosowanie, jako szczepionka.
Wynalazek znajduje również zastosowanie w terapii antysensowej, np. do dostarczania oligonukleotydów zdolnych do hybrydyzacji ze specyficznymi sekwencjami komplementarnymi, co powoduje zahamowanie transkrypcji i/lub translacji tych sekwencji. Tym, samym, celem może być DNA lub RNA kodujące białka niezbędne dla postępu danej choroby, przez co przerwaniu ulega postęp choroby. Terapia antysenesem oraz liczne oligonukleotydy zdolne do specyficznego i przewidywalnego wiązania do określonych docelowych sekwencji kwasu nukleinowego i zahamowania lub modulacji ekspresji genów wywołujących choroby są znane fachowcom. Uhlmann i wsp. (1990) Chem Rev. 90; 543, Neckers i wsp (1992) Int. Rev. Oncogenesis 3, 175; Simons i wsp. (1992) Naturę 359, 67; Bayever i wsp. (1992) Antisense Res. Dev. 2: 109; Whitesell i wsp. (1991) Antisense Res. Dev. 1:. 343; Cook i wsp. (1991) Anti-cancer Drug Design 6: 585; Eguchi i wsp. (1991) Ann. Rev. Biochem. 60: 631. Odpowiednio, niniejszym dostarczono antysensownych oligonukleotydów zdolnych do selektywnego wiązania się do sekwencji docelowych w komórkach gospodarza, stosowanych jako terapeutyki antysensowne.
Zazwyczaj, kwas nukleinowy jest dostarczony, jako wektor ekspresyjny. Tego rodzaju wektory ekspresyjne mogą być rutynowo konstruowane przy użyciu technik biologii molekularnej i mogą przykładowo obejmować użycie plazmidowego DNA i odpowiednich inicjatorów, promotorów, wzmacniaczy i innych elementów, takich jak przykładowo, sygnały poliadenylacji, które mogą się okazać niezbędne oraz, które są umieszczone w odpowiedniej orientacji w celu umożliwienia ekspresji wstawianej sekwencji. Dla fachowców odpowiednie wektory będą oczywiste. Na drodze dalszego przykładu, niniejszym podane zostaje odniesienie do Sambrook i wsp. (1989).
Odpowiedni wektor ekspresyjny zawiera polinukleotyd do stosowania w niniejszym wynalazku, operacyjnie połączony z sekwencją kontrolną, zazwyczaj promotorem, która zdolna jest do zapewniania ekspresji polinukleotydu w komórce gospodarza. Korzystnie, wektor jest odpowiedni do użycia w metodzie terapii genowej lub do immunizacji kwasem nukleinowym. Wektor może zostać użyty ex vivo, przykładowo do transformacji komórki gospodarza, która następnie jest ponownie wprowadzana do podmiotu. Alternatywnie, wektor ten może zostać użyty in vivo do kierowania dostarczaniem do podmiotu.
Wektor jest zazwyczaj plazmidem posiadającym miejsce inicjacji replikacji, promotor do ekspresji polinukleotydu, i ewentualnie, regulator promotora. Wektory mogą zawierać jeden lub więcej genów dla markerów selekcyjnych, przykładowo gen odporności na ampicylinę.
Promotory i inne sygnały regulacji ekspresji są wybrane tak, aby były kompatybilne z przeznaczonymi do ekspresji komórkami gospodarza. Mogą zostać zastosowane promotory indukowalne, represyjne lub kontrolowane w inny sposób. Do ekspresji w komórkach lub organizmach ssaków, zastosowane mogą zostać elementy kontrolne zarówno eukariotyczne, jak i fagowe.
Odpowiednie promotory ssacze obejmują promotor metalotioneiny, który może być indukowany w odpowiedzi na metale ciężkie, takie jak kadm oraz promotory β-aktyny. Szczególnie korzystne są promotory tkankowo-specyficzne. Odpowiednie wektory wirusowe obejmują, przykładowo, długie powtórzenia wirusa mysiej białaczki Moloneya (MMLV LTR), promotor wirusa sarkomy Rousa (RSV)LTR, promotor SV40, geny wczesne ulegające natychmiastowej ekspresji (IE) promotor ludzkiego cytomegalowirusa (hCMV), promotory adenowirusów, HSV (takie jak promotory HSV IE) lub promotory HPV, w szczególności region regulatorowy upstream HPV (URR).
PL 212 483 B1
Wszystkie te promotory są z łatwością dostępne fachowcom.
Zazwyczaj, obecne są również sekwencje teminacji i poliadenyacji, zlokalizowane 3' w stosunku do każdego kodonu stop translacji.
Korzystnie, obecna jest również sekwencja do optymalizacji inicjacji translacji zlokalizowana 5' w stosunku do każdej sekwencji kodującej. Przykłady sygnałów terminacji transkrypcji/poliadenylacji obejmują sygnały otrzymane od SV40, jak opisano w Sambrook i wsp., jak również sekwencję terminatora bydlęcego czynnika wzrostu. W celu zwiększenia poziomów ekspresji dołączone mogą zostać elementy wzmacniające. Przykłady odpowiednich wzmacniaczy obejmują wzmacniacz wczesnego genu SV40 ((Dijkema i wsp. (1985) EMBOJ. 4:761), wzmacniacz/promotor otrzymany z długich końcowych powtórzeń wirusa sarkomy Rousa (LTR) (Gorman i wsp. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci USA 79: 6777) oraz elementy otrzymane z ludzkiego lub mysiego CMV (Boshart i wsp. (1985) Cell 41:521) przykładowo, elementy zawarte w sekwencji intronu A CMV.
Czynniki kondensujące kwasy nukleinowe stosowane w wynalazku oddziałują z kwasem nukleinowym, w taki sposób, że kwas nukleinowy kondensuje się, do bardziej zwartej struktury. Skondensowany kwas nukleinowy jest zazwyczaj bardziej stabilny niż forma nieskondensowana i zazwyczaj ma bardziej złożoną strukturę, przykładowo, kształt pierścieniowaty lub pałeczkowaty. Czynniki kondensujące są zazwyczaj podstawowymi cząsteczkami, które oddziałują elektrostatycznie z kwasem nukleinowym, przeciwdziałając ładunkowi ujemnemu kwasu nukleinowego.
Wykazano, przykładowo, że aby zaszła wydajna kondensacja, wymagane jest zneutralizowanie 88-90% ładunku (Deng H. i V.A. Bloomfield (1999) Biophys J 77:1556-61). Zazwyczaj, czynnik kondensujący wiąże się z kwasem nukleinowym z relatywnie wysoką wydajnością.
Użyty może zostać każdy odpowiedni czynnik kondensujący kwasy nukleinowe, w tym polimery kationowe i kationy poliwalencyjne. W jednym z wykonań, czynnik kondensujący stanowi polimer kationowy lub jego fizjologicznie akceptowalna sól. Tego rodzaju farmaceutycznie akceptowalne sole obejmują, przykładowo, sole kwasów mineralnych takie jak chlorowodorki, hydrobromki, fosforany, siarczany i tym podobne oraz sole kwasów organicznych takich jak octany, propioniany, maloniany, benzoesany i tym podobne. Zazwyczaj sól stanowi chlorowodorek lub siarczan.
Korzystnie, polimer kationowy stanowi poliamina. Stosowane poliaminy mogą obejmować protaminy, putrescynę, spermidynę, sperminę, poliargininy bromku heksadimetryny(Polybrene®) i polilizyny lub ich fizjologicznie akceptowalne sole. Kationowy polimer może stanowić peptyd, zawierający poliaminę.
Korzystnie, poliamina ta jest kationowym polimerem aminokwasów zasadowych.
Zazwyczaj, aminokwasy zasadowe są wybrane spośród lizyny, argininy i histydyny. Tego rodzaju kwasy poliaminowe są łatwo dostępne w Sigma-Aldrich.
Kwas poliaminowy może stanowić homopolimer aminokwasu zasadowego. Przykładowo, poliargininy, polilizyny lub polihistydyny. Alternatywnie, kwas poliaminowy może być polimerem jednego lub więcej aminokwasów zasadowych, opcjonalnie zawierającego również jeden lub więcej niezasadowych aminokwasów. Tym samym, kwas poliaminowy może zawierać jeden lub więcej zasadowych aminokwasów i opcjonalnie jeden lub więcej innych aminokwasów. Tego rodzaju kopolimer typowo zawiera większość zasadowych aminokwasów. Przykładowo, 50 do 100% aminokwasów w kopolimerze może mieć zasadowy charakter.
Korzystnie, 60 do 90% lub 70 do 80% aminokwasów jest zasadowa. W jednym z wykonań, co najmniej 75%, przykładowo co najmniej 85%, 95%, 98% lub 99% aminokwasów w kopolimerze może być zasadowa. Ogólnie, zasadowe aminokwasy zawierają jedną lub więcej lizynę, histydynę lub argininę. Jeśli kopolimer zawiera jeden lub więcej aminokwasów niezasadowych, korzystnie nie stanowią one aminokwasów kwaśnych, takich jak asparaginian lub glutaminian. Jeden lub więcej zasadowych aminokwasów może obejmować aminokwasy z alifatycznym lub aromatycznymi łańcuchem bocznym, przykładowo treoninę, prolinę, tryptofan, serynę lub fenyloalaninę.
Aminokwasy każdego z powyższych kwasów poliaminowych mogą stanowić D- lub L-amininokwasy.
Korzystnie, stosowane są L-aminokwasy.
W korzystnym wykonaniu, poliamina jest homopolimerem argininy (Arg)x lub lizyny (Lys)x.
Korzystne są poli-L-arginina lub poli-L-lizyna, w szczególności poli-L-arginina. Typowo, homopolimer ma masę cząsteczkową od około 500 do 15000, przykładowo od 500 do 10000, od 500 do 5000, lub od 500 do 1000. W jednym z wykonań x w powyższym wzorze, może się wahać od 2 do 100, przykładowo, od 2 do 50, od 2 do 30 lub od 2 do 20.
PL 212 483 B1
W szczególności korzystne są małe homopolimery peptydowe, przykładowo, o masie cząsteczkowej w zakresie od 500 do 1500, takie jak 500 lub 1250, lub 700 do 1000. Zazwyczaj, w małymi peptydzie, x ma wartość od 2 do 10, przykładowo od 4 do 8. W niniejszym wynalazku szczególnie użyteczne są homopolimery gdzie x = 4 lub 6, przykładowo (Arg)4 lub (Arg)6.
Czynnik kondensujący może być przedstawicielem protaminowej rodziny białek, przykładowo siarczan protaminy. Protaminy są białkami zasadowymi, które wiążą się do DNA plemnika w miejscu histonów. Jądra plemników stanowią tym samym doskonałe źródło protamin, np., salmina ze spermy łososia, klupeina ze spermy śledzia, irydyna ze spermy pstrąga, sturyna ze spermy jesiotra oraz skombryna ze spermy makreli. Protamina, siarczan protaminy, fosforan protaminy i jądra plemników są łatwo dostępne w Sigma-Aldrich.
Inne odpowiednie poliaminy takie jak putrescyna, sperdimidyna i spermina wraz w ich fizjologicznie akceptowalnymi solami są łatwo dostępne, przykładowo, w Sigma-Mdrich.
Czynnik kondensujący może również zawierać poliwalentne kationy lub ich fizjologicznie akceptowalne sole. Tego rodzaju poliwalencyjne kationy obejmują, przykładowo, chlorek heksamina kobaltu(III) (Cohex), chlorek tris(etylenodiaminy) kobaltu(II) (Coen) oraz chlorek sepulchratu kobaltu(III) (Cosep). Odpowiednie fizjologiczne sole obejmują podane powyżej sole w odniesieniu do polimerów kationowych.
Fachowcy znają szereg testów, które mogą zostać użyte do identyfikacji czynników kondensujących kwasy nukleinowe. Testy te ogólnie badają zmianę właściwości badanej cząsteczki kwasu nukleinowego, gdzie zmiana jest związana z procesem kondensacji np. upakowania kwasu nukleinowego do postaci stałej, neutralizacji ładunku cząsteczki kwasu nukleinowego lub blokowania bądź zasłaniania poprzednio dostępnych miejsc rozpoznania dla czynników takich jak endonukleazy i czynniki transkrypcyjne.
Testy wskaźnikowe dla kondensacji płynnych preparatów kwasów nukleinowych obejmują, mikroskopię elektronową i mikroskopię sił atomowych, wielkość cząsteczki, potencjału zeta, spektrofluorometrię, test wykluczania bromku etydyny, test opóźnienia migracji w żelu, dichroizmu kołowego oraz rezonansu magnetycznego. Przykłady użytecznej literatury obejmują: J. Mol Biol (1978) 121, 311-326; Biophysical Journal (1996), 70, 2847-2856, Nucleic Acids Res (1999) 27 (8), 1943-1949; J. Amer. Chem. Soc., (1998) 120 (35), 8903-8909; J. Pharm. Sci. (1998) 87 (6), 678-683 i Int. J. Pharm. (2000) 210 (1-2), 97-107.
Czynnik chelatujący do stosowania w niniejszym wynalazku chelatuje jony metali w roztworze. Powszechnie występujące chelatowane jony metali obejmują jony Fe2+, Fe3+, Cr3+, Ca2+ i Na+.
Korzystnie, czynnik ten chelatuje jony Ca2+ i Na+.
Alternatywnie, korzystnym jest, aby czynnik ten chelatował jony Fe2+ i Fe3+. Czynnik może być mono lub poliwalentny.
Przykładowo, odpowiednie czynniki obejmują, ale nie są ograniczone do: kwasu wersenowego (EDTA), kwasu dietylenoetriamino penta-octowego (DTPA), kwasu nitrilotrójoctowego (NTA), heksafosforanu inozytolu, tripolifosforanu, kwasu polifosforowego, bursztynianu sodu, bursztynianu potasu, bursztynianu litu, maleinianu sodu, maleinianu potasu, maleinianu litu, desferalu i kwasu etylenodiamino-di-(o-hydroksyfenylooctowego).
Typowo, wykorzystywane są: EDTA, DTPA lub desferal, w szczególności EDTA lub jej sole, przykładowo sól disodowa kwasu wersenowego.
Korzystnym jest również, aby kwas nukleinowy był odkładany na cząsteczkach obojętnego metalu w obecności jednego lub więcej disacharydów i/lub trisacharydów. Jeden lub więcej cukrów pomaga zwiększać stabilność kwasu nukleinowego/cząsteczki metalu.
Odpowiednie cukry obejmują, sacharozę, manolaurynian sacharozy, trehalozę, laktozę, rafinozę i mannitol.
Korzystnie, cukier jest wybrany z trehalozy, sacharozy, laktozy i rafinozy.
W jednym z wykonań, użyta została mieszanina jednego lub więcej cukrów podanych powyżej. Szczególnie korzystna jest mieszanina sacharoza/rafinoza. Typowo, sacharoza/rafinoza jest mieszana w proporcji 3:1 wagowo/wagowo.
Kwasy nukleinowe mogą być odkładane na cząsteczce z obojętnego metalu również w obecności jednej lub więcej soli. Ta jedna lub więcej soli dostarczają większej stabilności. Sól stanowi dodatek do jakiejkolwiek soli, która może być zastosowana według wynalazku, jako czynnik chelatujący. Dlatego sól ta jest solą niechelatującą.
PL 212 483 B1
Przykładowo, sól ta nie jest zazwyczaj ani maleinianem ani bursztynianem. Sól ta jest także dodatkiem do fizjologicznie akceptowalnej soli, która może być wykorzystywana według wynalazku, jako czynnik kondensujący kwasy nukleinowe.
W korzystnym wykonaniu, jedna lub więcej soli jest wybrana spośród chlorków, octanów, cytrynianów, azotanów, fosforanów i siarczanów. Odpowiednie sole obejmują octanu potasu, chlorku wapnia, chlorku litu, octanu sodu, azotanu magnezu, cytrynianu sodu, fosforanu sodu, chlorku sodu, siarczanu sodu i siarczanu potasu. Korzystnie, sól stanowi octan potasu.
W korzystnym wykonaniu, cząsteczki niosące kwas nukleinowy są doprowadzane do kontaktu z przeciwutleniaczem takim jak etanol lub witamina A, C lub witamina E. Zazwyczaj, poddawanie cząsteczek działaniu przeciwutleniacza zwiększa ich stabilność. Typowe działanie może obejmować przemywanie cząsteczek za pomocą przeciwutleniacza.
W jednym z wykonań, jeden lub więcej ze składników wykorzystywanych do przygotowywania cząsteczek pozostaje połączony lub związany z powstającą cząsteczką. Odpowiednio, dostarczane są cząsteczki, odpowiednie do dostarczania z urządzenia dostarczającego cząsteczki, zawierające lub czasami zasadniczo składające się z cząsteczek obojętnego metalu, posiadającego na powierzchni kwas nukleinowy, czynnik chelatujący jony metali oraz jeden lub więcej:
(a) czynnik kondensujący kwasy nukleinowe;
(b) jeden lub więcej disacharyd i/lub trisacharyd oraz (c) jedną lub więcej soli.
Każdy ze składników cząsteczek jest opisany poniżej.
Korzystnie cząsteczki obejmują, co najmniej (a) i/lub (b).
Wynalazek dostarcza również sposób przygotowania niniejszych cząsteczek. Sposób obejmuje lub w niektórych wykonaniach składa się zasadniczo z etapów:
(i) precypitacji kwasu nukleinowego na cząsteczkach nośnikowych obojętnego metalu w obecności czynnika kondensującego kwas nukleinowy oraz czynnika chelatującego jony metali; oraz (ii) zebrania powstających cząsteczek.
Typowo, etap (i) obejmuje kontaktowanie przez wymieszanie kwasu nukleinowego z cząsteczkami nośnikowymi z obojętnego metalu w obecności kondensującego kwasy nukleinowe i czynnika chelatującego jony metali.
Korzystne jest stałe mieszanie podczas procedury dodawania w celu zapewnienia jednorodności mieszaniny reakcyjnej.
Korzystnie, kwas nukleinowy i czynnik kondensujący kwasy nukleinowe są oddzielone od siebie (np. w postaci oddzielnych roztworów) aż do chwili wystąpienia kondensacji, przykładowo aż do chwili, gdy obecne są cząsteczki nośnikowe i czynnik chelatujący.
Szczególnie korzystnym jest dodawanie czynnika kondensującego do mieszaniny, zawierającej już cząsteczki nośnika oraz kwas nukleinowy, tak aby uniknąć przedwczesnej precypitacji kwasu nukleinowego. Czynnik chelatujący jony metali może być wówczas obecny zarówno w preparacie czynnika kondensującego, jak i w mieszaninie cząsteczek nośnika i kwasu nukleinowego. Czynnik kondensujący może być dodawany stopniowo, przykładowo kropla po kropli.
Alternatywnie, mieszanina czynnika kondensującego i cząsteczek nośnika może zostać dodana do preparatu kwasu nukleinowego.
Cząsteczki metalu, kwas nukleinowy, czynnik kondensujący kwas nukleinowy i czynnik chelatujący zostały opisane powyżej.
Mieszanina na etapie precypitacji może dodatkowo zawierać jeden lub więcej cukry disacharydowe i/lub trisacharydowe, przykładowo sacharozę, manolaurynian sacharozy, trehalozę, laktozę, rafinozę lub mannitol, bądź ich kombinację. Korzystnie, cukier ten jest wybrany spośród trehalozy, sacharozy, laktozy i rafinozy lub ich kombinacji. Zastosowana może zostać mieszanina jednego lub więcej disacharydu i/lub trisacharydu. Przykładowo, zastosowana może zostać mieszanina jednego lub więcej z powyższych cukrów.
Szczególnie korzystna jest mieszanina sacharoza:rafinoza, zwłaszcza w stosunku 3:1 wagowo/wagowo.
Mieszanina na etapie precypitacji może dodatkowo zawierać jedną lub więcej soli. Sól ta stanowi dodatek do jakiejkolwiek soli wykorzystywanej według wynalazku, jako czynnik chelatujący. Dlatego sól ta jest ogólnie solą nie chelatującą.
PL 212 483 B1
Przykładowo, sól ta nie jest maleinianem i/lub bursztynianem. Sól ta jest także dodatkiem do fizjologicznie akceptowalnej soli, która może także być wykorzystywana według wynalazku, jako czynnik kondensujący kwasy nukleinowe.
W korzystnym wykonaniu, jedna lub więcej soli jest wybrana spośród chlorków, octanów, azotanów, fosforanów i siarczanów. Odpowiednie sole obejmują octanu potasu, chlorku wapnia, chlorku litu, octanu sodu, azotanu magnezu, cytrynianu sodu, fosforanu sodu, chlorku sodu, siarczanu sodu i siarczanu potasu. Zwykle, sól ta nie jest fosforanem glinu. Korzystnie, sól stanowi octan potasu.
Cukier i/lub sól mogą być obecne w obydwu lub w jednym z preparatów wyjściowych, będąc domieszane przykładowo w preparacie czynnika kondensującego lub w preparacie cząsteczki nośnika/kwasu nukleinowego.
W jednym z wykonań, roztwór zawierający wcześniej określone ilości czynnika kondensującego kwas nukleinowy, cukru i czynnika chelatującego jony metali jest stopniowo dodawany do roztworu zawierającego określone ilości cząsteczek nośników metali, kwasu nukleinowego, cukru i czynnika chelatującego jony metali. Sól może być obecna w jednym lub w obydwu roztworach.
Stężenia składników na etapie (i) mogą być zróżnicowane, co zasadniczo nie wpływa na stabilność kwasu nukleinowego na powstających cząsteczkach. Cząsteczki nośnika metalu mogą być obecne w każdej odpowiedniej ilości, przykładowo w roztworze od 0,1 do 100 mg/ml, tak jak - od 0,1 do 10 mg/ml lub 1 do 10 mg/ml. Korzystnie, stężenie kwasu nukleinowego wynosi od 0,01 do 10 mg/ml
- tak jak od 1 do 10 mg/ml. Typowo, czynnik kondensujący kwasy nukleinowe występuje w stężeniu od 0,1 do 10 mg/ml, przykładowo od 0,1 do 1 mg/ml.
Korzystnie, czynnik chelatujący jony metali występuje w stężeniu od 0,1 mM do 1 M, tak jak od 1 mM do 0,1 M, przykładowo od 10 do 50 mM. Cukier, jeśli obecny, może występować na przykład w stężeniu od 0,1 mg/ml do 1 mg/ml, korzystnie od 1 mg/ml do 0,1 mg/ml, przykładowo 10 do 50 mg/ml. Sól, jeśli obecna, występuje typowo w stężeniu od 0,1 mM do 1 M, przykładowo od 1 mM do 0,1 M,
- tak jak od 10 do 50 mM.
Sposób wynalazku może dodatkowo obejmować doprowadzenie do kontaktu cząsteczek kwasu nukleinowego z przeciwutleniaczem. Ogólnie, traktowanie to obejmuje przemycie cząsteczek roztworem, zawierającym przeciwutleniacz. Przykładowo może być zastosowany etanol. Korzystnie, etanol jest nasycony sacharozą. Inne odpowiednie przeciwutleniacze obejmują witaminę A, witaminę C i witaminę E. Dodatkowo, lub alternatywnie, cząsteczki kwasu nukleinowego mogą być przemywane jeden lub wiele razy wodnym roztworem alkoholowym, takim jak woda lub izopropanol.
Opłaszczone, ewentualnie przemyte, cząsteczki mogą zostać przeniesione do odpowiednich błon i pozostawione do wyschnięcia przed użyciem, powleczone na powierzchnię modułu próbek lub kasetę bądź załadowane do kasety stosowane] w urządzeniu do dostarczania cząsteczek. Zastosowana może zostać każda odpowiednia metoda suszenia.
Korzystnie, suszenie prowadzi się pod strumieniem azotu.
Cząsteczki według wynalazku mogą zostać zapakowane do pojemników z pojedynczą dawką lub z dawką wielokrotną. Tego rodzaju pojemniki mogą się składać z hermetycznie zamkniętego pojemnika, zawierającego odpowiednią ilość cząsteczek. Cząsteczki mogą być zapakowane, jako sterylny preparat, zaś hermetycznie zamknięty pojemnik może zostać zaprojektowany tak, aby zapewniał sterylność postaci, aż do chwili użycia. Pojemniki są korzystnie zaadaptowane do bezpośredniego użycia w urządzeniu do dostarczania cząsteczek. Typowo, takie pojemniki przyjmują postać kapsułek, torebek foliowych, saszetek, kasetek, i tym podobnych. Urządzenia do dostarczania cząsteczek mogą również występować w postaci już napełnionej, zawierając odpowiednią dawkę opłaszczonych cząsteczek. Załadowane urządzenie może zostać również przepakowane do hermetycznie zamkniętego pojemnika.
Pojemnik, w którym są zapakowane cząsteczki może zostać w dalszej kolejności oznakowany w taki sposób, aby można było zidentyfikować kompozycję oraz uzyskać odpowiednie informacje, dotyczące dawkowania. Dodatkowo, pojemnik może zostać oznakowany za pomocą informacji agencji rządowej, przykładowo Food and Drug Administration, wskazującej na akceptację przez prawo federalne sposobu wytwarzania, użycia i sprzedaży zawartego w nim preparatu kwasu nukleinowego do podawania ludziom.
Urządzenia przyspieszające cząsteczki, odpowiednie do podawania cząsteczek są znane fachowcom. Obecne urządzenia typu strzelby genowej obejmują wyładowanie eksplozyjne, elektryczne lub gazowe przyspieszające opłaszczone cząsteczki nośnikowe w kierunku komórek docelowych. Opłaszczone cząsteczki nośnikowe mogą być swobodnie przyczepione do ruchomej płaszczyzny
PL 212 483 B1 nośnikowej lub swobodnie przyczepione do powierzchni, wzdłuż której przepływa strumień gazu, unosząc cząsteczki z powierzchni i przyspieszając je w kierunku celu. Przykładowo, urządzenie do wyładowania gazowego jest opisane w patencie U.S. nr 5204253. Urządzenie, wykorzystujące eksplozję jest opisane z patencie U.S. nr 4945050. Jeden przykład aparatu do wyładowania elektrycznego odpowiedniego do niniejszego użycia opisano w patencie U.S. nr 5120657. Kolejny aparat do wyładowań elektrycznych opisano w patencie U.S. nr 5149 655. Opisy wszystkich tych patentów są niniejszym włączone poprzez odniesienie.
Niniejsze opłaszczone cząsteczki mogą być również podawane przy użyciu bezigłowej strzykawki, takiej jak ta opisana w patencie U.S. nr 5630796 dla Bellhouse i wsp. (bezigłowe urządzenie PowderJet®) oraz w Publikacjach
Międzynarodowych nr WO 94/24263, WO 96/04947, WO 96/12513 oraz WO 96/20022, które są niniejszym włączone w całości poprzez odniesienie.
Urządzenia takie jak to opisane w patencie U.S. nr 5630796 mogą być dostarczane, jako urządzenie w kształcie pióra, zawierające, w kolejności od szczytu do spodu, cylinder z gazem, pojemnik lub kasetę z cząsteczkami, dyszę ultradźwiękową wraz z dołączonym tłumikiem. Cząsteczki są podawane w odpowiednim pojemniku, np. kasetce uformowanej przez dwie podatne na zerwanie błony polimerowe, które na gorąco połączono z odstępnikiem w postaci uszczelki, tworząc zwartą, szczelną jednostkę. Materiały błon mogą zostać dobrane tak, aby osiągnąć odpowiedni sposób otwierania i ciśnienie wybuchu, które decydują o warunkach, w których inicjowany jest przepływ ultradźwięków.
Podczas działania, urządzenie jest uruchamiane tak, aby uwalniało sprężony gaz z cylindra do pojemnika ekspansji w obrębie urządzenia. Uwolniony gaz wchodzi w kontakt z kasetką, zawierającą cząsteczki i jeśli powstanie odpowiednie ciśnienie, dochodzi do naruszenia błon Kasetki i uniesienia cząsteczek do dyszy ultradźwiękowej, umożliwiającej dalsze dostarczanie. Dysza została zaprojektowana tak, aby możliwe było osiągnięcie odpowiedniej prędkości gazu oraz sposobu przepływu umożliwiających dostarczenie porcji cząsteczek na docelową powierzchnię zdefiniowanego obszaru. Tłumik ma za zadanie tłumić hałas, powstający w wyniku ultradźwiękowego przepływu gazu.
System dostarczania, opisany w Publikacji Międzynarodowej nr WO 96/20022 również wykorzystuje energię sprężonego gazu do przyspieszania i dostarczania sproszkowanych kompozycji.
Jednak różni się on od systemu z patentu US nr 5630796 poprzez użycie fali szokowej, zamiast przepływu gazu przyspieszającego cząsteczki. Bardziej szczegółowo, natychmiastowy wzrost ciśnienia spowodowany falą szokową wytworzoną za elastyczną kopułą powoduje uderzenie tylnej części kopuły i gwałtowne wywrócenie elastycznej kopuły w kierunku powierzchni docelowej. To nagłe wywrócenie wystrzela sproszkowaną kompozycję (zlokalizowaną na zewnątrz kopuły) przy odpowiedniej prędkości i pędzie w kierunku penetrowanej tkanki docelowej, np. tkanki śluzówkowej ust. Sproszkowana kompozycja jest uwalniana w chwili pełnego wywrócenia kopuły. Kopuła całkowicie zatrzymuje gaz o wysokim ciśnieniu, który nie wchodzi w ten sposób w kontakt z tkanką. Ponieważ nie dochodzi do uwolnienia gazu podczas operacji dostarczania, system jest całkowicie cichy. Tego rodzaju rozwiązanie może być wykorzystywane do innych zamkniętych i wrażliwych zastosowań, przykładowo do dostarczania cząsteczek do minimalnie inwazyjnych miejsc chirurgicznych.
Niniejsze powlekane cząsteczki mogą być dostarczane in vivo bezpośrednio do osobnika lub ex vivo do komórek pobranych od osobnika, zaś stransformowane komórki zostają ponownie wprowadzone do pacjenta. Przy dostarczaniu in vivo, cząsteczki wstrzykuje się zazwyczaj podskórnie, naskórkowo, śródskórnie, do błony śluzowej (np. donosowo, doodbytniczo i/lub dopochwowo), dootrzewnowo, dożylnie, doustnie lub domięśniowo.
Korzystnie, dostarczenie następuje do końcowo zróżnicowanych komórek, jednak cząsteczki mogą również zostać dostarczone do komórek niezróżnicowanych, częściowo zróżnicowanych takich jak komórki macierzyste krwi oraz fibroblasty skóry. Najkorzystniej, dostarczane są do komórek nabłonkowych.
Opłaszczone cząsteczki są podawane pacjentowi w sposób kompatybilny z postacią dawkowania oraz w ilości, która jest efektywna profilaktycznie i/lub terapeutycznie.
„Terapeutycznie efektywna ilość” niniejszych kompozycji cząsteczek jest wystarczająca do zapewnienia leczenia lub zapobiegania chorobie lub objawom choroby i mieści się we względnie szerokim zakresie wyznaczanym przez rutynowe badania. Ogólnie, cząsteczki są dostarczane w ilości od 0,001 do 1000 μg, korzystniej od 0,01 do 10,0 μg kwasu nukleinowego na dawkę. Jednak dokładna ilość będzie się wahać w zależności od wieku i stanu ogólnego osobnika poddawanego leczeniu, a w szczególności w zależności od wybranej sekwencji kwasu nukleinowego oraz innych czynników.
PL 212 483 B1
Odpowiednia efektywna ilość może zostać łatwo określona dzięki badaniu klinicznemu. W określaniu niezbędnej ilości użyteczne są „Physicians Desk Reference” oraz „Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics”.
C. Doświadczenia
Poniżej podano przykłady konkretnych wykonań dla sposobów według niniejszego wynalazku.
P r z y k ł a d 1
W celu oceny efektów różnorodnych cukrów, środków chelatujących i substancji dodatkowych/pomocniczych w trzech preparatach DNA/cząsteczki złota wykonano serię eksperymentów: „DSEP” (eksperyment A) „poli Arg” (eksperyment B) i „zmodyfikowana spermidyna” (eksperyment C).
Różnorodne cząsteczki oceniano według jednego lub większej liczby następujących kryteriów:
(i) ilość DNA opłaszczającego cząsteczki oceniano poprzez elucję oraz spektrofotometrycznie przy długości fali 260 nm lub fluorometrycznie, (ii) fizyczną stabilność DNA, pokrywającego cząsteczki oceniano przeprowadzając analizę elektroforetyczną w żelu lub za pomocą HPLC, (iii) zagęszczenie cząsteczek oceniano przy użyciu mikroskopu świetlnego lub poprzez ruchliwość w żelu, (iv) aktywność ekspresyjną DNA na cząsteczkach mierzono poprzez pomiar ekspresji genu reporterowego kodującego lucyferazę w komórkach CHO, po wprowadzeniu cząsteczek niosących gen do komórek, (v) właściwości immunogenne cząsteczek mierzono oznaczając miano przeciwciał w surowicach myszy, myszy szczepiono cząsteczkami opłaszczonymi DNA, który koduje antygen rozpoznawany przez specyficzne przeciwciało.
Dla każdego preparatu, cząsteczki grupowano wg w/w kryteriów:
Eksperyment A: Skład DSEP
Cząsteczki przygotowano według następującgo wzorca:
Cząsteczki złota-DNA-Cukier-Sól-Inne
Badane cukry wybrano z: monolaurynianu sacharozy, mannitolu, trehalozy, laktozy, rafinozy i monokaprynianu sacharozy. Badane sole wybrano z: octanu potasu, chlorku wapnia, chlorku litu, octanu sodu, azotanu magnezu, cytrynianu sodu, fosforanu sodu, fosforanu glinu, chlorku sodu, siarczanu sodu chlorku magnezu.
Zastosowano różne kombinacje cukrów i soli, które przedstawiono poniżej. Oceniano również wpływ płukania sacharozą nasyconą etanolem.
Wyniki pokazane poniżej są przedstawione dla kombinacji różnych cukrów lub soli, ranking uporządkowano dla wszystkich kryteriów od najbardziej skutecznych lub pożądanych do najmniej efektywnych. Przykładowo, najwyższe w tym rankingu cukry dla wydajności, co do DNA skutkują we względnie wysokich wydajnościach, co do DNA; cukry najwyżej w rankingu dla aglomeracji skutkują względnie niskimi poziomami aglomeracji:
(i) wydajność w odniesieniu do ilości DNA na cząsteczkach:
Cukier: sacharoza ~ sacharoza ~ monolaurynian ~ trehaloza ~ laktoza ~ rafinoza >>> monokaprynian sacharozy (brak DNA);
Sól: octan potasu ~ chlorek wapnia ~ chlorek litu ~ octan sodu ~ azotan magnezu ~ cytrynian sodu > fosforan sodu >>> fosforan glinu;
Inne: przemycie sacharozą wysyconą etanolem nie usuwa DNA z proszku złożonego z cząsteczek złota.
Nieobecność jakiejkolwiek soli znacznie obniża zawartość DNA:
(ii) fizyczna stabilność DNA na cząsteczkach:
Cukier: sacharoza > trehaloza > mannitol ~ laktoza ~ rafinoza > monolaurynian sacharozy > monokaprynian sacharozy;
Sól: octan potasu ~ octan sodu ~ cytrynian sodu ~ fosforan sodu > chlorek sodu > siarczan sodu > chlorek litu
Inne: przemycie sacharozą wysyconą etanolem przyczynia się do stabilności fosforanu glinu, który zapobiega wytrącaniu;
(iii) aglomeracja:
Cukier: monokaprynian sacharozy < rafinoza < laktoza ~ monolaurynian sacharozy < sacharoza ~ trenaloza;
PL 212 483 B1
Sól: octan potasu ~ chlorek litu ~ fosforan sodu ~ cytrynian sodu ~ chlorek sodu ~ siarczan sodu ~ chlorek wapnia ~ chlorek magnezu ~ azotan magnezu;
(iv) aktywność ekspresji DNA na cząsteczkach:
Sacharoza/octan sodu ~ octan potasu/rafinoza ~ sacharoza/azotan magnezu ~ octan potasu/monolaurynian sacharozy;
(v) immunopotencja u myszy.
Dla rzeczywistych czasów starzenia się preparatów przechowywanych w temperaturze pokojowej: sacharoza/octan sodu ~ spermidyna/CaCl2 cząsteczki kwasu nukleinowego przez 3 miesiące. Rafinoza/octan potasu ~ monolaurynian sacharozy/octan potasu ~ spermidyna/CaCl2 cząsteczki kwasu nukleinowego przez 1 miesiąc.
Eksperyment B: Preparat poli Arg
Cząsteczki przygotowano według następującego wzorca:
Cząsteczka złota-DNA-Cukier-Czynnik chelatujący-Peptyd argininowy.
Badane cukry wybrano spośród trehalozy, sacharozy i rafinozy. Badane czynniki chelatujące wybrano z EDTA, DTPA i desferalu (DFO). Badane peptydy poliargininowe wybrano z poliarginin o masie cząsteczkowej 13000, (Arg)6 i (Arg)4.
Przebadano różne kombinacje cukrów, czynników chelatujących i poliarginin.
Wyniki przedstawiono poniżej, i tak porządek w rankingu jest od najbardziej pożądanych do najmniej pożądanych lub efektywnych.
(i) wydajność w odniesieniu do ilości DNA na cząsteczkach:
Badane cukry: trehaloza, sacharoza, rafinoza
Chelatory: EDTA, DTPA, desferal (DFO)
Inne: peptydy poli-Arg, każdy 13,000 Mw, (Arg)6, (Arg)4.
Wydajności dla powyższych kombinacji przekraczają 50% wydajności teoretycznej.
(ii) fizyczna stabilność DNA na cząsteczkach:
Cukier: sacharoza > trehaloza > rafinoza
Chelatory: EDTA>DTPA>desferal (DFO)
Inne: wszystkie peptydy Poli-Arg dawały zbliżoną stabilność (iii) aglomeracja.
Nie stanowi problemu w odniesieniu do tego preparatu.
(iv) aktywność ekspresji DNA na cząsteczkach
Trehaloza/EDTA/(Arg)4, ~ Trehaloza/DTPA/(Arg)4.
Przygotowane cząsteczki z użyciem DNA, cząsteczek złota i spermidyny, wykazały podobny poziom aktywności ekspresji dla tych preparatów.
(v) immunopotencja myszy:
Sacharoza/EDTA/(Arg)4, > Trehaloza/EDTA/(Arg)4 > Trehaloza/DTPA/(Arg)4, > Sacharoza/DTPA/ (Arg)4.
Przygotowane cząsteczki z użyciem DNA, CaCl2 cząsteczek złota i spermidyny, wykazały podobną immunopotencję, co cząsteczki trehaloza/EDTA/(Arg)4.
Eksperyment C: Preparat ze zmodyfikowaną spermidyną
Cząsteczki przygotowano według następującego wzorca:
Cząsteczka złota-DNA-Spermidyna-Cukier-Sól-Inne.
Badane cukry wybrano spośród sacharozy, trehalozy, i rafinozy. Badane sole wybrano spośród chlorku magnezu, azotanu magnezu, chlorku wapnia, siarczanu sodu, siarczanu potasu i bromku sodu.
Zbadano również wpływ stężenia spermidyny i oddziaływania na cząsteczki za pomocą roztworów, zwłaszcza roztworu - woda/alkohol.
(i) zawartość DNA na cząsteczkach:
Cukry: rafinoza > trehaloza > sacharoza
Sole: MgCl2 ~ MgNO3 ~ CaCl2 > siarczan sodu ~ siarczan potasu ~ bromek sodu;
Inne: stężenie spermidyny i zawartość % alkoholu/wody mają wpływ na wydajność.
(ii) fizyczna stabilność DNA na cząsteczkach:
Cukier: rafinoza > trehaloza > sacharoza
Sól: MgCl2 > MgNO3 > CaCl2 > siarczan sodu ~ siarczan potasu ~ bromek sodu (iii) aglomeracja
Nie stanowi problemu w odniesieniu do tego preparatu.
PL 212 483 B1
P r z y k ł a d 2
Badanie stabilności różnorodnych cząsteczek opłaszczonych DNA
Cząsteczki opłaszczone przygotowano używając różnych proporcji siarczanu protaminy, EDTA, wody i jednego z cukrów: trehalozy, sacharozy czy laktozy. Cząsteczki przygotowano według dziesięciu różnych proporcji, jak zestawiono w dziesięciu preparatach w tabeli 1. Stabilność cząsteczek przygotowanych według każdej z tych proporcji była badana w 4°C i 60°C w punktach czasowych - 0, 7 i 14 dniu.
Sposób
Dla każdej proporcji Probówka A i B była przygotowana według tabeli 1. Zawartość probówki A i B zwirowano przy dużej szybkości przez 10 s, do momentu, kiedy każdy roztwór był dobrze wymieszany. Podczas mieszania przy średniej prędkości probówki A, zawartość probówki B dodano kroplami używając 5ml pipety (typu pipetman). Probówkę A mieszano przez następne 15s i pozostawiono na 5 min. Z probówki A usunięto supernatant, a pozostały osad przemyto 1 ml 100% izopropanolu. Zawartość probówki wymieszano i osadzono osad. Izopropanol usunięto a osad wysuszono na proszek w strumieniu azotu.
3-5mg cząsteczek każdego z preparatów ważono w 1,5 ml probówkach wirówkowych i inkubowano w 4°C i 60°C. Stabilność DNA w każdym z preparatów cząsteczek badano w punktach czasowych - 0, 7 i 14 dniu przy pomocy elektroforezy w żelu agarozowym i HPLC.
Wyniki
Przygotowane preparaty cząsteczek wykazywały podczas testowania podobną stabilność. Do dalszych badań wybrano cząsteczki sporządzone według „proporcji 4” (Preparat 4, tabela 1).
P r z y k ł a d 3
Dalsze badania stabilności w oparciu o cząsteczki przygotowanych według „proporcji 4” (Preparat 4)
Cząsteczki przygotowano tak samo, jak w przykładzie 2 według proporcji 4 w tabeli 1, ale na większą skalę (350 mg złotych cząsteczek) oraz z dodatkiem:
a) bez dwucukrów (kontrola), lub
b) trehaloza; lub
c) sacharozy; lub
d) laktoza.
Cząsteczki inkubowano w 4°C i w 60°C, a stabilność DNA oceniano po 8 tygodniach elektroforetycznie na żelu agarozowym.
P r z y k ł a d 4
Opracowanie preparatu tetraargininowego
Po wypróbowaniu kilku preparatów w celu weryfikacji czy poliargininy rożnej długości posiadają zdolność do precypitacji DNA na złotych mikrocząsteczkach, przygotowano eksperyment do zbadania długości poliargininy do użycia w badaniu wydajności i stabilności. Przebadano również dobór cukrów i chelatora, które zwiększają stabilność w poprzednich praparatach.
Wyniki pokazały, że poliargininy o 4 i 6 monomerach były lepszymi dla stabilności niż polimery o masie cząsteczkowej 13000 (około 80 monomerów). Przebadane cukry i chelatory działały porównywalnie. Za dobre cukry uznano trehalozę i sacharozę. Za dobre chelatory EDTA i DTPA. Tetramer argininowy wybrano ze względu na jego szybsze oddysocjowywanie od DNA, jak również na prawdopodobieństwo tworzenia form mniej zdegradowanych produktów niż 6-merowe.
Otrzymane preparaty do dalszych badań nazwano TA101.1 (DNA, sacharoza, EDTA), TA101.2 (DNA, sacharoza, DTPA), TA101.3 (DNA, trehaloza, EDTA), TA101.4 (DNA, trehaloza, DTPA).
Powyższe cztery preparaty przeznaczano do długoterminowego przechowywania i badano pomiędzy sobą oraz w stosunku do kontroli spermidyna/CaCl2 (w której spermidynę i chlorek wapnia wykorzystano do strącenia DNA na mikrocząsteczkach złota) w 4, 25 i 40 stopniach Celsjusza. Ich stabilność pokazano w Tabeli 2. Preparaty te testowano również pod kątem ich biologicznej aktywności w badaniach nad myszami i w badaniach nad ekspresją lucyferazy (DNA kodowało lucyferazę).
PL 212 483 B1
Doświadczalna DOE użyta do optymalizacji stężeń cukrów i EDTA przy przygotowywaniu cząsteczek. Liczby na górze tabeli oznaczają stężenia cukru i EDTA w każdej próbce.
PL 212 483 B1
T a b e l a 2
Szybkość rozpadu serii TA101 (pasmo SC)
Preparat | Seria nr | Temp (°C) | k (dni 1) | Okres półtrwania (d) |
spm/CaCl2 | 2251-45 | 25 | 0,0121 | 57 |
TA101.1 | 2251-28-I | 25 | 0,0043 | 161 |
TA101.2 | 2251-28-III | 25 | 0,0 0 92 | 75 |
TA101.3 | 2251-28-III | 25 | 0,0045 | 154 |
TA101.4 | 2251-28-IV | 25 | 0,0113 | 61 |
spm/CaCI2 | 2251-45 | 40 | 0,0373 | 19 |
TA101.1 | 2251-28-I | 40 | 0,0107 | 65 |
TA101.2 | 2251-28-II | 40 | 0,0261 | 27 |
TA101.3 | 2251-28-III | 40 | 0,0117 | 59 |
TA101.4 | 2251-28-IV | 40 | 0,0421 | 16 |
Eksperymenty nad aktywnością pokazały, że wszystkie serie 101 były aktywne, wykazywały ekspresję i były niemal podobne do spermidyny/CaCl2. Stabilność preparatów TA101.1 i TA101.3 była wyższa niż TA101.2 i TA101.4, co wskazuje, że chelator EDTA był bardziej stabilizujący niż DTPA, ale niewielkie różnice zanotowano pomiędzy trehalozą (3 i 4) a sacharozą (1 i 2), użytych do utworzenia tych proszków.
Skład kompozycji serii 101 tetrargin przedstawiono w Tabeli 3.
T a b e l a 3 Preparaty serii 101
Preparat | Cukier (30% v/v) | Chelator 5 mM | Etanol % | (Arg)4 mg/ml |
TA101.1 | Sacharoza | EDTA | 0 | 0,3 |
TA101.2 | Sacharoza | DTPA | 0 | 0,3 |
TA101.3 | Trehaloza | EDTA | 0 | 0,3 |
TA101.4 | Trehaloza | DPTA | 0 | 0,3 |
Następnie, przeprowadzono dwa eksperymenty, w których zastosowano poziomy nasycenia trehalozy i EDTA jako środowisko preparatu. Wraz z tym zastosowano wielokrotne poziomy etanolu. Preparaty te wykorzystywały zasadę, że niemal nasycone roztwory mogą precypitować na złocie więcej stabilizatorów. Preparaty przygotowano dla różnych poziomów wody i gęstości, dzięki użyciu etanolu o różnym stężeniu procentowym. Preparaty sporządzone w danych środowiskach były bardziej stabilne niż seria preparatów 101.
Zapoczątkowano następnie doświadczenia przeznaczone do zbadania optymalizacji poziomów etanolu, EDTA, trehalozy i tetraargininy. Doświadczenie to przeprowadzono przy zmiennych stężeniach składników (tetraargininy, EtOH, EDTA, trehalozy) w pięciu specyficznych zakresach zmienności. Wykorzystano mieszaninę DNA, zawierającą 10% DNA kodującego lucyferazę. Umożliwiło to zbadanie stabilności i aktywności w jednym doświadczeniu.
Optymalne preparaty wybrano po przeanalizowaniu wyników, jak również modelując dane przy pomocy równań kwadratowych w celu przewidywania stabilności i ekspresji w całym zakresie eksperymentu. Otrzymane do dalszych badań preparaty nazwano TA201.2, TA201.5, TA201.11 i TA201.15.
Skład tych czterech preparatów pokazano w Tabeli 4. Preparaty te są kompozycjami środowiskowymi, czyli nie ostatecznymi proszkami. Tabela 3 pokazuje, że w preparatach tych wykorzystano etanol, jako wysokoprocentowy rozpuszczalnik. Główną różnicę pomiędzy 201.5 a 201.11 stanowi poziom trehalozy ale poziom tetraargininy jest również trzy razy wyższy w 201.5. Jedyną różnicę pomiędzy 201.2 a 201.15 stanowi obecność EDTA w 201.15.
PL 212 483 B1
Preparat TA201.5 jest optymalnym preparatem według programów optymalizacji przy jednoczesnej optymalizacji kryteriów ekspresji i stabilności. Pozostałe umieszczono dla porównania. TA201.2 był preparatem o największej ekspresji i w daIszych badaniach posłużył do ustawienia największej wartości ekspresji.
Preparat TA201.5 był centralnym punktem eksperymentu i był tworzony wielokrotnie. Preparat ten zatem dostarczył danych o największej powtarzalnej stabilności i aktywności i posłużył jako dobry punkt wyjścia do sprawdzenia czy trendy były powtarzalne przy dalszym badaniu preparatu.
T a b e l a 4 Kompozycje serii 201
Preparat | Trehaloza mg/ml | EDTA mM | Etanol % | (Arg)4 mg/ml |
TA201.5 | 40,05 | 37,5 | 52,5 | 1,13 |
TA201.15 | 80,1 | 25 | 35 | 0,75 |
TA201.11 | 120,15 | 37,5 | 52,5 | 0,38 |
TA201.2 | 80,1 | 0 | 35 | 0,75 |
Preparaty TA201.5, ΤA201.15 i TA201.11 były bardzo stabilne. Właściwe pomiarów szybkości rozpadu w temperaturze 25°C po 6 miesiącach nie dało się otrzymać. Temperatura ta jest najbliższa warunkom rzeczywistym, jakim podlega preparat podczas przechowywania. Stabilność preparatu TA201.5 testowano w wyższych temperaturach. Porównanie względnej szybkości rozkładu w wyższych temperaturach wskazuje na względną stabilność w niższych temperaturach. Tabela 5 pokazuje stabilność preparatów w rożnych temperaturach.
T a b e l a 5
Stabilności preparatów „TA” w różnych temperaturach
Seria nr | Preparat | Temperatura | k (dni _1) | Okres półtrwania (d) |
1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
2251-136-sp | spm/CaCl2 | 4 | 0,0052 | 133,3 |
2251-136-sp | spm/CaCl2 | 25 | 0,0366 | 13,9 |
2251-136-sp | spm/CaCl2 | 40 | 0,2264 | 3,1 |
2251-136-2 | TA201.2 | 4 | 0,0071 | 97,6 |
2251-136-2 | TA201.2 | 25 | 0,0229 | 30,3 |
2251-136-2 | TA201.2 | 40 | 0,2247 | 3,1 |
2251-110-15 | TA201.15 | 60 | 0,0437 | 15,9 |
2251-110-11 | TA201.11 | 60 | 0,0161 | 43,1 |
2334-18-11 | TA201.11 | 60 | 0,0235 | 29,5 |
2251-110-5 | TA201.5 | 60 | 0,0362 | 19,1 |
2334-80-n | TA201.5 | 60 | 0,0275 | 25,3 |
2334-30-m | TA201.5 | 60 | 0,0252 | 27,6 |
2251-156-5.1 | TA201.5 | 60 | 0,0528 | 16,4 |
2251-156-5.2 | TA201.5 | 60 | 0,0625 | 14,8 |
2251-156-5.3 | TA201,5 | 60 | 0,0504 | 13,9 |
2334-101-1 | TA201.5 | 60 | 0,0744 | 9,3 |
2334-101-2 | TA201.5 | 60 | 0,726 | 9,5 |
2334-101-3 | TA201.5 | 60 | 0,0781 | 8,9 |
PL 212 483 B1 cd. Tabeli 5
1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
2334-101-4 | TA201.5 | 60 | 0,0645 | 10,8 |
2334-101-5 | TA201.5 | 60 | 0,0530 | 13,1 |
2334-101-6 | TA201.5 | 60 | 0,0735 | 9,4 |
2334-101-7 | TA201.5 | 60 | 0,0514 | 13,5 |
2334-101-8 | TA201.5 | 60 | 0,0719 | 9,6 |
2334-101-9 | TA201.5 | 60 | 0,0241 | 28,7 |
2334-101-10 | TA201.5 | 60 | 0,0163 | 42,6 |
2251-136-5 | TA201.5 | 40 | 0,0027 | 253,9 |
2251-183-5 | TA201.5 | 40 | 0,0029 | 236,6 |
Oceniono fizyczną toksyczność preparatów TA201.5 i TA201.11 dla skóry. Nie zaobserwowano reakcji niekorzystnych. Zbadano aktywności białek kodowanych przez DNA znajdujące się w preparacie. Zaobserwowano ekspresję lucyferazy kodowanej przez wykorzystywany DNA. Tabela 6 pokazuje wyniki badań nad zwierzętami, w których wykorzystano DNA kodujący rdzeniowy antygen wirusa zapalenia wątroby typu B (Cag) i powierzchniowy antygen wirusa zapalenia wątroby typu B (Sag).
T a b e l a 6
Podsumowanie wyników badań nad zwierzętami
Badania na zwierzętach (myszy oraz czas i temperatura, w której przechowywano proszki, jeśli należało) | Sag ELISA | Cag ELISA | Sag ELISPOT | Cag ELISPOT |
M103 | 201,5 > Spm | 201,5 > Spm | 201,5 < Spm | n.b. |
M103 | 201,5 < Spm | 201,5 > Spm | 201,5 > Spm | 201,5 > Spm |
M110, czas 0 | 201,5 < Spm* | 201,5 > Spm* | 201,5 > Spm* | 201,5 > Spm* |
M110, 1 miesiąc w 25°C | 201,5 > Spm* | 201,5 = Spm* | 201,5 = Spm* | 2 01,3 > S pm* |
M110, 3 miesiące w 25°C | 201,5 > Spm* | 201,5 = Spm* | 201,5 > Spm* | 2 01,5 > Spm* |
G014 | 201,5 > Spm | 201.5 = Spm | n.b. | n.b. |
M114, 3 miesiące w 25°C | 201,5 < Spm* | 201,5 < Spm* | 201,5.5 > Spm* | 201,5 > Spm* |
M114, 4 miesiące w 40°C | 201,5 < Spm* | 201,5 > Spm* | 2 01,5 > Spm* | 201,5 > Spm* |
M114, 6 miesięcy w 40°C | 201,5 < Spm* | 201,5 > Spm* | 201,5 > Spm* | 201,5 > Spm* |
M116, 2 tygodnie w 60°C | 201,5 < Spm | 201,5 < Spm | 201,5 = Spm | 201,5 = Spm |
świeża spermidyna/CaCl2. Zastosowano również starą spermidynę/CaCl2 w M110 i M114
Dane te w oczywisty sposób pokazują, że preparat TA201.5 był konkurencyjny wobec preparatu spermidyny/CaCl2 w odniesieniu do testów produkcji przeciwciał ELISA i ELISPOT w zwierzętach
ND5.5 transfekowanych dawką 2 μg DNA dla 1 mg cząsteczek nośnika. Preparat ten wykazywał równą lub większą wydajność w stosunku do spermidyny/CaCl2; w odniesieniu do danych ELISPOT (kryteria wg Mann-Whitney). Zmierzono końcowy skład preparatu TA201.5.
Tabela 7 ukazuje zakresy pełnego składu zmierzonego dla proszków TA201.5.
PL 212 483 B1
T a b e l a 7
Końcowe pełne składy i zakresy dla TA201.5
Składnik | μg/mg proszku | Wzór chemiczny, masa cząsteczkowa. |
Preparat cząsteczek złota | ~1 mg | Średnica Aun ~ 2 μιτι |
p DNA | ~2 | około 5-10K par zasad |
H-Arg-Arg-Arg-Arg-OH | 0,2-0,8 | C24H50N16O5, 642,8 g/mol |
*EDTA 4(-) | 0,2-1,2 | C10H12N2O8, 290 g/mol |
D (+)Trehaloza | 1,0-4,0 | C12H22O11 *2H2O 378,3 g/mol |
* EDTA mierzono w stanie 4(-), i podano jako masa tego rodzaju związku (bez sodu, wody lub wodoru, jak widać w F.W. masa na opakowaniu).
Tabela 8 pokazuje materiały które zostały wykorzystane do wyrobu preparatów tetraargininowych.
T a b e l a 8 Materiały
Materiał | Dostawca | Numer katalogowy |
1 | 2 | 3 |
p DNA | GSK, Aldevron, PJV, etc. | N/A |
Tetraarginina | BaChem | H-4464 |
Na2EDTA | Sigma | E-7889 |
Trehaloza | Sigma | T-9531 |
Etanol | Spectrum | ET107 |
H2O (do roztworów) | R.O.D.I. | N/A |
Cząsteczki złota 10 k | Degussa | RDAU010KM |
W celu utworzenia TA201,5 przy skali 35 mg złotego proszku zastosowano następującą procedurę:
Sprzęt • Skala, • Wytrząsarka, • Sonikator, • Wirówka, • Probówki Eppendorfa na 2ml, • Pipety na 1 ml, 200 μ|, • Strumień powietrza.
Przygotowanie odczynników
11,3 mg/ml tetraargininy (seria 523352): odważano 0,8 do 1 mg tetraargininy. Dodawano 88,5 μl H2O na mg odważki. Zmienne dla serii z różną zawartością.
Roztwór trehalozy: odważano przynajmniej 30 mg trehalozy (wg listy materiałów dostawcy). Dodawano 120 μl H2O na 30 mg odważki, lub cztery części wody na jedną część trehalozy (w masie lub μ( od 1 mg^l).
500 mM Na2EDTA: zalecany roztwór firmy Sigma (patrz numer katalogowy na liście materiałów). Procedura
Probówka B: probówka B była przygotowana przed dodaniem etanolu i DNA do probówki A. Dodawano roztwór chelatujący, roztwór cukru, roztwór EtOH i tetraargininy. Mocno mieszano przez 10 sekund.
Probówka A: odważano złote kulki do probówki i dodawano roztwory chelatora i cukru. Sonikowano 30 sekund, mocno mieszając przez 1 minutę. Nakraplano EtOH podczas mieszania. Dodawano roztwór DNA. Po dodaniu roztworu DNA łączono zawartość probówki A i B jak opisano poniżej.
Etapy przygotowania preparatu: podczas mieszania przy średniej prędkości probówki A (upewniano się czy złoto miesza się z roztworem) dodawano kroplami zawartość probówki B.
PL 212 483 B1
Po całkowitym dodaniu probówki B do probówki A mocno mieszano przez 1 minutę probówkę A, zawierającą końcowy preparat tetraargininowy. Pozostawiano preparat na 5 minut. Mieszano i wirowano przez 10 sekund. Usuwano pipetą supernatant i zachowywano do analizy. Osad przepłukiwano 250 μl alkoholu etylowego. Mieszano przez 30 sekund i sonikowano przez 3 sekundy. Zwirowywano osad przez 10 sekund i odciągano alkohol etylowy. Ponownie przepłukiwano osad 250 μl alkoholu etylowego. Mieszano przez 30 sekund i sonikowano przez 3 sekundy. Zwirowywano osad przez 10 sekund i odciągano alkohol etylowy. Osad suszono na proszek w strumieniu powietrza o szybkości przepływu 0,5 l/min, przez 2 godziny.
Probówka A • proszek zawierający cząsteczki złota, 35 mg, • EDTA, 26,25 pi, • Trehaloza 70 pi, • Sonikować 30 sek, mieszać 1 min, • EtOH, dodawać kroplami 183,75 pl, mieszając, • DNA 70 pl.
Probówka B • EDTA, 26,25 pl, • Trehaloza 70 pl, • Tetraarginina, 70 pl, • EtOH, 183,75 pl, • Mieszać 10 sek.
Probówka A i B • Dodawano kroplami zawartość probówki B do probówki A mieszając, • Mieszano 1 min, • Pozostawiano na 5 min (aby składniki preparatu się odstały), • Wirowano przez 10 s i usuwano supernatant, • Przepłukiwano alkoholem etylowym, 250 pl, mieszano 30 s, sonikowano 3 s, wirowano 10 s, usuwano alkohol, • Przepłukiwano alkoholem etylowym, 250 pl, mieszano 30 s, sonikowano 3 s, wirowano 10 s, usuwano alkohol, • Suszono pod strumieniem powietrza lub azotu przez 2 godziny.
Podczas opracowywania preparatu TA201.5 procedura polegała w pierwszej kolejności na wykonaniu roztworów wyjściowych dla każdego składnika, a następnie na dodawaniu ich do probówek preparatów w odpowiedniej kolejności. Wytwarzanie w czystym pokoju danego preparatu wymaga jednak etapu filtracji. Aby zbadać tę konieczność (NB2334-80), rozpoczęto doświadczenie „mieszaniny wzorcowej. Strategia ta wykorzystuje mieszaniny wzorcowe wszystkich składników wodnych w probówce A (mieszanina wzorcowa A) oraz w probówce B (mieszanina wzorcowa B). Mieszaniny te są następnie sterylizowane za pomocą filtrów strzykawkowych, a przefiltrowany materiał wędruje do probówek, w których przygotowuje się preparat. Doświadczenie mieszanin wzorcowych porównywało proszki wytworzone za pomocą procedury mieszanin wzorcowych oraz procedur standardowych w odniesieniu do stabilności i pełnego s kładu.
T a b e l a 9
Końcowe kompozycje w eksperymencie z mieszaniną wzorcową
Proszek | Wydajność DNA (%) | Trehaloza (gg/mg) | EDTA (gg/mg) | ARG4 (gg/mg) |
Standardowy-2334-N | 96,2 | 3,2 | 1,05 | 0,48 |
Wzorcowy-2334-M | 96,3 | 3,2 | 0,97 | 0,45 |
PL 212 483 B1
T a b e l a 10
Stabilności wzorców w porównaniu ze standardami
5-21-02, t = 18 dni | |||||||
Preparat | ng OC | ng L | ng SC | Całkowita | % SC | % SC 60/% SC 4 | t 1/2 |
Standardowy, 4 | 6,1 | 0,7 | 43,5 | 50,3 | 86,5 | ||
Standardowy, 60 | 14,5 | 0,5 | 23,1 | 38,1 | 60,7 | 0,70 | 25,3 |
Wzorcowy, 4 | 6,3 | 0,8 | 49,2 | 56,2 | 87,5 | ||
Wzorcowy, 60 | 24,6 | 1,0 | 31,5 | 57,1 | 55,2 | 0,63 | 27,6 |
Czasy półtrwania w Tabeli 10 zostały wyliczone poprzez uśrednienie wyliczeń dla dwóch czasów półtrwania. Jeden otrzymano na podstawie szybkości rozpadu ng SC (60 w odniesieniu do 4), zaś drugi otrzymano z szybkości rozpadu % SC60 w stosunku do 4).
Ponieważ te dwie procedury dały ten sam produkt końcowy, strategia z użyciem mieszaniny wzorcowej może być uważana, jako nieproblematyczna i może być stosowana do preparatów proszkowych następnych proszków TA201.5. Przeprowadzono dalsze doświadczenia w celu rozstrzygnięcia który etap tego sposobu był krytyczny:
Tok eksperymentu
Preparaty 1-9 wykonano na skalę 70 mg z tych samych roztworów wyjściowych. Mieszaninę wzorcową dla probówki A wykonano poprzez zmieszanie EDTA, trehalozy i roztworów DNA w proporcjach preparatu i przefiltrowano przez strzykawkę. Mieszaninę wzorcową dla probówki B osiągnięto poprzez zmieszanie EDTA, trehalozy i roztworów tetraarginin w proporcjach preparatu i przefiltrowano strzykawką. Preparat 1 otrzymano zgodnie z następującym sposobem:
Przygotowanie odczynników (dla 10, 70 mg prep)
DNA: Roztwory wyjściowe plazmidu i DNA kodującego lucyferazę dostarczono w stężeniu 1 mg/ml. Zmieszano te dwa roztwory DNA przy stosunku objętościowym SC18 do DNA kodującego lucyferazę jak 9:1.
1500 μl SC18 + 166,7 μl DNA kodującego lucyferazę.
11,3 mg/ml tetraargininy: Zważono 20 mg tetraargininy. Dodawano 88,5 μl H2O na mg odważki.
Roztwór trehalozy: Odważano przynajmniej 700mg trehalozy. Dodawano 140 μl H2O na 35 mg odważki, lub cztery części wody na jedną część trehalozy (wagowo lub objętościowo) 500 mM EDTA: Może być użyty roztwór z firmy Sigma (kat. E- 7889).
Stosunki objętościowe w roztworze wzorcowym A: 1500 μl trehalozy, 562,5 μl EDTA, 1500 μl DNA (1 mg/ml)
Filtr strzykawkowy wzornik A
Stosunki objętościowe w roztworze wzorcowym B: 1500 μl trehalozy, 562,5 μl EDTA, 1500 μl tetraargininy
Filtr strzykawkowy wzornik B
Probówka A • 70 mg złoto, • 332.5 μl mieszaniny wzorcowej A, • 367.5 μl EtOH dodawano kroplami mieszając, • Sonikowano 30 s, mieszanie 10 s.
Probówka B • 332,5 μl mieszaniny wzorcowej B, • 367.5 μl EtOH mieszanie 10 s.
Probówka A i Probówka B
Dodawano zawartość probówki B do probówki A kroplami mieszając.
Po całkowitym dodaniu B, mocno mieszano przez 1 minutę Pozostawiano na 5 minut, w celu osadzenia. Mieszano 5 s, następnie zwirowywano przez 10 s, *usuwano supernatant.
Przemywano 500 μl EtOH, mieszano 30 s, sonikowano 3 s, zwirowywano 10 s, *usuwano supernatant i powtarzano ostatni krok jeden raz.
Suszono osad powietrzem przez 1 godz. Przy 0,5 l/min.
PL 212 483 B1
Sposób ten jest kontrolnym tworzeniem preparatu. Poniższa tabela ukazuje różne warianty sposobów dla proszków 2-9.
Osad suszono pod strumieniem | Preparat | Wariant | Kontro!a |
Dodawano B do A | 2 | Całość B do A jednym strumieniem | B do A krop!ami ciągle |
3 | B do A krop!ami/przerwa 5 s miedzy krop!ami | ||
Mieszano po dodaniu B do A | 4 | 3 minuty mocno mieszano | 1 minutę mocno mieszano |
5 | Nie mieszano, pozwa!ano na osadzanie po dodaniu całości B do A | ||
Czas osadzania | 6 | 10 minut osadzano | Osadzano 5 minut |
7 | Nie osadzano, zwirowywano po minucie mieszania | ||
Liczba płukań | 8 | 4 płukania | Przepłukiwano 2 dwa razy |
9 | Nie płukano, suszono po usunięciu supernatantu |
Pozostały preparat stanowił kompozycję, w której zmieniano porządek dodawania komponentów w celu oceny możliwości mieszaniny wzorcowej 1 w tym preparacie. Sposób był podobny do kontrolnego.
Stosunki objętościowe użytych składników w roztworze wzorcowym • 400 μΐ trehalozy, • 150 μΐ EDTA, • 200 μΐ tetraargininy, • Filtr strzykawkowy mieszaniny wzorcowej.
Preparat 10 • 70 mg złota, • 525 μΐ mieszaniny wzorcowej, • 735 μΐ EtOH dodawano kroplami mieszając, • Sonikowano 30 s, mieszano 10 s, • 140 μl DNA nakraplano/powoli (nakraplano w odstępach 5-cio sekundowych), mieszając, • Po całkowitym dodaniu B, mocno mieszano przez 1 minutę, • Pozostawiano na 5 minut, w celu osadzenia, • Mieszano 5 s, zwirowywano przez 10 s i *usuwano supernatant, • Przemywano 500 μΐ EtOH, mieszano 30 s, sonikowano 3 s, zwirowywano 10 s, *usuwano supernatant ostatni krok powtarzano jeden raz, • Suszono osad pod strumieniem powietrza 0,5 l/min przez 1 godzinę.
Usuwanie płynu z nad osadu po wirowaniu dokonano pipetą na 1000 μΐ w celu usunięcia większości płynu, a pozostałą resztę usuwano za pomocą pipety 200 μΐ. Jak najmniej płynu powinno pozostać na proszku.
* Wszystkie proszki były analizowane pod kątem całkowitej kompozycji, stabilności i ekspresji lucyferazy w komórkach CHO oraz zdjęć żeli.
PL 212 483 B1
T a b e l a 11
Preparaty w eksperymencie odporności procesu
Proszek | (Arg)4 (Hg/mg) | Trehaloza (Hg/mg) | EDTA (Hg/mg) |
2334-101-1 | 0,36 | 1,56 | 0,43 |
2334-101-2 | 0,32 | 1,53 | 0,47 |
2334-101-3 | 0,36 | 1,72 | 0,46 |
2334-101-4 | 0,29 | 1,64 | 0,39 |
2334-101-5 | 0,22 | 1,72 | 0,41 |
2334-101-6 | 0,26 | 1,54 | 0,41 |
2334-101-7 | 0,26 | 2,13 | 0,40 |
2334-101-8 | 0,26 | 1,15 | 0,19 |
2334-101-9 | 0,23 | 4,77 | 0,99 |
2334-101-10 | 0,21 | 2,25 | 0,40 |
T a b e l a 12
Stabilność w 60°C w eksperymencie odporności procesu
Preparat | K | t 1Z (dni) |
1 | 0,0744 | 9,31 |
2 | 0,0726 | 9,55 |
3 | 0,0781 | 8,88 |
4 | 0,0645 | 10,75 |
5 | 0,0530 | 13,07 |
6 | 0,0735 | 9,43 |
7 | 0,0514 | 13,50 |
8 | 0,0719 | 9,64 |
9 | 0,0241 | 28,75 |
10 | 0,0163 | 42,61 |
Powyższe liczby wyliczono za pomocą zmian w nanogramach super zwiniętego DNA od daty preparatu do dnia 13 i dnia 20
Współczynniki i czasy półtrwania były do siebie bardzo zbliżone. Wskazuje to, że proces tworzenia preparatu jest odporny w odniesieniu do stabilności. Preparaty 5 i 7 wykazywały nieco lepsze stabilności niż inne, jednak preparaty 9 i 10 miały zdecydowanie lepszą stabilność (3X). Preparatu 9 nie przemywano (niewykonalne), zaś preparat 10 otrzymano poprzez zmianę kolejności dodawania.
Dane dotyczące ekspresji wskazywały na podobieństwo preparatów (300-400K zliczeń/sekundę). Preparat świeża spermidyna/CaCl2 był bardziej ekspresywny (albo materiał uległ większej ekspresji w czasie analizy komórek), ale był również wyższy jeśli chodzi o uwolnioną masę. Preparaty 10 i 7 wykazywały pewne korzyści w odniesieniu do ekspresji lucyferazy (450-600K zliczeń/sekundę) w stosunku do innych preparatów tetraargininy. Ogólnie, eksperyment udowodnił, że procesy tworzenia preparatów są bardzo odporne.
Innym przejawem odporności jest efekt zmiany kolejności dodawania oraz procesów wykorzystywanych do otrzymania preparatu. W jednym z eksperymentów (NB2251-124) zbadano różne sposoby tworzenia preparatu z dokładnie takich samych materiałów (ilości i stężenia). Eksperyment ten dotyczył jedynie stabilności preparatów, w których zaplanowano wytrącanie składników w różnej kolejności. Prawdopodobnie to mogłoby dawać duże efekty, ponieważ DNA mogłoby być precypitowane bezpośrednio na złoto, przed, jednocześnie lub po stabilizatorach.
PL 212 483 B1
Sposoby tworzenia preparatu
1. Połączenie zawartości probówek A i B. Probówki A i B mają ten sam skład z wyjątkiem tego, że probówka A zawiera DNA, a probówka B zawiera tetraargininę. Obydwie probówki zostały dobrze wymieszane i zawartość probówki B dodano kroplami do probówki A.
2. Połączenie innych probówek A i B. Tym razem do probówki A (ze złotem) dodano etanol wcześniej niż roztwór DNA tak, aby na kulkach złota powstała powłoka wstępna (podkładowa) z nadmiarowych ilości cukru dodanego przed dodaniem DNA. Następnie, DNA dodano do probówki A i natychmiast zawartość probówki B dodano do probówki A.
3. Połączenie to zaprojektowano w celu równoczesnego wytrącania DNA i stabilizatorów. Wszystkie składniki dodano do jednej probówki, z wyjątkiem DNA i etanolu. Następnie, DNA i etanol zmieszano ze sobą i dodawano.
4. Proces strącania DNA przed uprzednim dodaniem etanolu. Wszystkie składniki dodano do jednej probówki z wyjątkiem DNA, tetraargininy i etanolu. Kolejność dodawania składników była następująca: DNA, tetraarginina i etanol
5. Proces był taki sam jak w punkcie 4 z tą różnicą, że tetraarginina była dodana przed DNA. Etanol był dodany na końcu. Preparaty umieszczano w 4 i 60°C inkubatorze i analizowano po 2 tygodniach. Nie uzyskano żadnej różnicy pomiędzy proszkami analizowanymi elektroforetycznie na żelu agarozowym pomimo, że proszki 4 i 5 (etanol dodawany na końcu, kompleksowanie DNA:ARG4 przed dodaniem etanolu) wykazywały nieznacznie większą stabilność.
Opisano nowe cząsteczki opłaszczone kwasem nukleinowym, odpowiednie do dostarczania za pomocą urządzenia do dostarczania cząsteczek, sposób przygotowywania cząsteczek oraz sposoby terapii genowej i immunizacji za pomocą kwasów nukleinowych przy użyciu tych cząsteczek.
Claims (28)
1. Sposób wytwarzania cząsteczek odpowiednich do dostarczania przez urządzenie do dostarczania cząsteczek, znamienny tym, że:
(i) dokonuje się precypitacji kwasu nukleinowego na cząsteczkach nośnikowych z obojętnego metalu w obecności czynnika kondensującego kwasy nukleinowe i czynnika chelatującego jony metali, przy czym wspomniany czynnik kondensujący kwasy nukleinowe jest homopolimerem argininy o wzorze (Arg)x gdzie x posiada wartość od 2 do 10, lub jego fizjologicznie akceptowalną sól; i (ii) zbiera się otrzymywane cząsteczki.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że na etapie (i) czynnik kondensujący kwas nukleinowy jest dodawany do mieszaniny, zawierającej cząsteczki nośnikowe z obojętnego metalu oraz kwas nukleinowy.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że cząsteczki nośnika z obojętnego metalu są wybrane z grupy składającej się z cząsteczek złota, wolframu, platyny i irydu.
4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że cząsteczki nośnika z obojętnego metalu są cząsteczkami złota o średnicy od 1 do 3 pm.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że kwas nukleinowy koduje antygen.
6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że antygen jest wybrany z grupy składającej się z antygenów wirusowych, bakteryjnych i grzybowych.
7. Sposób według zastrz. 1 do 4, znamienny tym, że kwas nukleinowy koduje polipeptyd terapeutyczny.
8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że kwasem nukleinowym jest DNA.
9. Sposób według zastrz. 1 do 8, znamienny tym, że homopolimerem argininy jest (Arg)4 lub (Arg)6.
10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że czynnik chelatujący jony metali jest wybrany z grupy składającej się z kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), kwasu dietylenoetriamino penta-octowego (DTPA), kwasu nitrilotrójoctowego (NTA), heksafosforanu inozytolu, tripolifosforanu, kwasu polifosforowego, bursztynianu sodu, bursztynianu potasu, bursztynianu litu, maleinianu sodu, maleinianu potasu, maleinianu litu, desferalu i kwasu etylenodiamino-di-(o-hydroksyfenylooctowego) (EDDHA).
11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że etap (i) jest ponadto prowadzony w obecności jednego lub więcej disacharydów (i) lub trisacharydów.
PL 212 483 B1
12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że jeden lub więcej cukrów jest wybranych z grupy składającej się z trehalozy, sacharozy, laktozy i rafinozy.
13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że jeden lub więcej cukrów jest mieszaniną sacharozy i rafinozy.
14. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że etap (i) jest ponadto prowadzony w obecności jednej lub więcej soli.
15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że jedna lub więcej soli jest wybrana z octanu potasu, chlorku wapnia, chlorku litu, octanu sodu, azotanu magnezu, cytrynianu sodu, fosforanu sodu i chlorku magnezu.
16. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że otrzymywane podczas etapu (i) cząsteczki są doprowadzane do kontaktu z przeciwutleniaczami.
17. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, przeciwutleniacz jest wybrany z etanolu, witaminy A, witaminy C i witaminy E.
18. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że:
(i) dokonuje się precypitacji DNA na obojętnych cząsteczkach złota w obecności wspomnianego homopolimeru argininy lub jego soli, EDTA oraz sacharozy; i (ii) zbiera się otrzymywane cząsteczki.
19. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że homopolimerem argininy jest (Arg)4, wspomnianym czynnikiem chelatującym jony metali jest kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), wspomnianym cukrem jest trehaloza.
20. Cząsteczki odpowiednie do dostarczania za pomocą urządzenia dostarczającego cząsteczki, które to cząsteczki otrzymywane są sposobem, jak zdefiniowano w zastrz. 1 do 19.
21. Cząsteczki, odpowiednie do dostarczania przez urządzenie do dostarczania cząsteczek, które obejmują cząsteczki nośnikowe z obojętnego metalu mające na swojej powierzchni kwas nukleinowy, homopolimer argininy o wzorze (Arg)x, gdzie x posiada wartość od 2 do 10 lub jego fizjologicznie akceptowalną sól i czynnik chelatujący jony metali.
22. Cząsteczki według zastrz. 21, znamienne tym, że zawierają cząsteczki nośnikowe z obojętnego metalu, mające na swojej powierzchni jeden lub więcej disacharydów (i) lub trisacharydów.
23. Cząsteczki według zastrz. 22, znamienne tym, że wspomnianym cukrem jest trehaloza.
24. Cząsteczki według zastrz. 21 do 23, znamienne tym, że cząsteczki nośnikowe z obojętnego metalu posiadają ponadto na swojej powierzchni jedną lub więcej soli.
25. Pojemnik na dawkę dla urządzenia do dostarczania cząsteczek, przy czym pojemnik zawiera cząsteczki jak zdefiniowano w jednym z zastrz. 21 do 24.
26. Urządzenie do dostarczania cząsteczek załadowane cząsteczkami, jak zdefiniowano w zastrz. 21 do 24.
27. Urządzenie do dostarczania cząsteczek według zastrz. 26, które stanowi bezigłowa strzykawka.
28. Zastosowanie cząsteczek jak zdefiniowano w zastrz. 21 do 24 do wytwarzania urządzenia do dostarczania cząsteczek dla dostarczania tych cząsteczek osobnikowi.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US41409702P | 2002-09-27 | 2002-09-27 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
PL375782A1 PL375782A1 (pl) | 2005-12-12 |
PL212483B1 true PL212483B1 (pl) | 2012-10-31 |
Family
ID=32043345
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PL375782A PL212483B1 (pl) | 2002-09-27 | 2003-09-29 | Sposób wytwarzania czasteczek, czasteczki odpowiednie do dostarczania, pojemnik, urzadzenie do dostarczania czasteczek i zastosowanie tych czasteczek |
Country Status (17)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US8349364B2 (pl) |
EP (1) | EP1545593A1 (pl) |
JP (1) | JP4791730B2 (pl) |
KR (1) | KR101152561B1 (pl) |
CN (1) | CN100542605C (pl) |
AU (1) | AU2003269213B2 (pl) |
BR (1) | BR0314751A (pl) |
CA (1) | CA2500215C (pl) |
EA (1) | EA010881B1 (pl) |
GB (1) | GB2410497B (pl) |
HK (1) | HK1073797A1 (pl) |
IL (1) | IL167635A (pl) |
MX (1) | MXPA05003222A (pl) |
NZ (1) | NZ539107A (pl) |
PL (1) | PL212483B1 (pl) |
WO (1) | WO2004028560A1 (pl) |
ZA (1) | ZA200503380B (pl) |
Families Citing this family (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1585974B1 (en) | 2003-01-24 | 2013-02-27 | University of Utah | Methods of predicting mortality risk by determining telomere length |
JP4793956B2 (ja) * | 2005-12-29 | 2011-10-12 | ニチコン株式会社 | アルミニウム電解コンデンサの駆動用電解液、およびこれを用いたアルミニウム電解コンデンサ |
US9689028B2 (en) | 2008-12-22 | 2017-06-27 | University Of Utah Foundation | Monochrome multiplex quantitative PCR |
GB0918679D0 (en) | 2009-10-23 | 2009-12-09 | Iqur Ltd | Influenza vaccine |
GB0918782D0 (en) | 2009-10-26 | 2009-12-09 | St Georges Hosp Medical School | A protein as an adjuvant for a vaccine |
CA2914555A1 (en) | 2013-06-06 | 2014-12-11 | David J Rowlands | Single domain antibody display |
CN103736090B (zh) * | 2014-01-27 | 2016-03-02 | 中国医学科学院医学生物学研究所 | 甲磺酸去铁胺佐剂及含甲磺酸去铁胺佐剂的疫苗 |
EP3164156A1 (en) * | 2014-07-04 | 2017-05-10 | BioNTech AG | Stabilised formulations of rna |
JP2018501799A (ja) | 2014-12-30 | 2018-01-25 | テロメア ダイアグノスティクス インコーポレイテッド | マルチプレックス定量的pcr |
WO2021061192A1 (en) * | 2019-09-29 | 2021-04-01 | Wjwu & Lynn Institute For Stem Cell Research | Novel trimethylglycylglycerin compositions and their use in developing anti-cancer drugs and rna vaccines |
Family Cites Families (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4945050A (en) * | 1984-11-13 | 1990-07-31 | Cornell Research Foundation, Inc. | Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor |
US5120657A (en) * | 1986-12-05 | 1992-06-09 | Agracetus, Inc. | Apparatus for genetic transformation |
KR900007952B1 (ko) * | 1988-11-18 | 1990-10-23 | 주식회사 녹십자 | 신규의 한탄바이러스 rok84/105 균주 및 이를 이용한 한탄바이러스 백신의 제조방법 |
US5204253A (en) * | 1990-05-29 | 1993-04-20 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Method and apparatus for introducing biological substances into living cells |
US5149655A (en) * | 1990-06-21 | 1992-09-22 | Agracetus, Inc. | Apparatus for genetic transformation |
AU650045B2 (en) * | 1990-09-12 | 1994-06-09 | Lifecell Corporation | Method and apparatus for cryopreparation dry stabilization and rehydration of biological suspensions |
WO1992020809A1 (en) * | 1991-05-15 | 1992-11-26 | Agracetus, Inc. | Method of creating a transformed rice plant |
TW360548B (en) * | 1993-04-08 | 1999-06-11 | Powderject Res Ltd | Products for therapeutic use |
GB2284208A (en) * | 1993-11-25 | 1995-05-31 | Pna Diagnostics As | Nucleic acid analogues with a chelating functionality for metal ions |
CN1112943C (zh) * | 1994-01-21 | 2003-07-02 | 粉剂注射疫苗股份有限公司 | 气体驱动的基因送递装置 |
GB9416663D0 (en) | 1994-08-17 | 1994-10-12 | Oxford Bioscience Limited | Particle delivery |
WO1996012513A1 (en) | 1994-10-24 | 1996-05-02 | Oxford Biosciences Limited | Particle delivery |
GB9426379D0 (en) | 1994-12-23 | 1995-03-01 | Oxford Biosciences Ltd | Particle delivery |
FR2730637B1 (fr) * | 1995-02-17 | 1997-03-28 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Composition pharmaceutique contenant des acides nucleiques, et ses utilisations |
EP0906110B1 (en) | 1996-04-26 | 2004-12-22 | Merck & Co., Inc. | Dna vaccine formulations |
IN184589B (pl) * | 1996-10-16 | 2000-09-09 | Alza Corp | |
AU4973199A (en) | 1998-07-09 | 2000-02-01 | Merck & Co., Inc. | Polynucleotide vaccine formulations |
IL142980A0 (en) * | 1998-11-05 | 2002-04-21 | Powderject Vaccines Inc | Nucleic acid constructs for genetic immunization |
WO2000072908A1 (en) * | 1999-06-02 | 2000-12-07 | Microheart, Inc. | Devices and methods for delivering a drug |
EP1282640A2 (en) * | 2000-05-01 | 2003-02-12 | Powderject Vaccines, Inc. | Nucleic acid immunization |
AU2001268159B2 (en) * | 2000-06-02 | 2005-09-15 | Eisai Inc. | Delivery systems for bioactive agents |
-
2003
- 2003-09-29 KR KR1020057005212A patent/KR101152561B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2003-09-29 AU AU2003269213A patent/AU2003269213B2/en not_active Ceased
- 2003-09-29 NZ NZ539107A patent/NZ539107A/en not_active IP Right Cessation
- 2003-09-29 US US10/529,010 patent/US8349364B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2003-09-29 CN CNB038251353A patent/CN100542605C/zh not_active Expired - Fee Related
- 2003-09-29 EA EA200500546A patent/EA010881B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2003-09-29 EP EP03750990A patent/EP1545593A1/en not_active Withdrawn
- 2003-09-29 GB GB0508549A patent/GB2410497B/en not_active Expired - Fee Related
- 2003-09-29 JP JP2004539249A patent/JP4791730B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2003-09-29 MX MXPA05003222A patent/MXPA05003222A/es active IP Right Grant
- 2003-09-29 CA CA2500215A patent/CA2500215C/en not_active Expired - Fee Related
- 2003-09-29 WO PCT/GB2003/004202 patent/WO2004028560A1/en active Application Filing
- 2003-09-29 BR BR0314751-7A patent/BR0314751A/pt not_active Application Discontinuation
- 2003-09-29 PL PL375782A patent/PL212483B1/pl unknown
-
2005
- 2005-03-24 IL IL167635A patent/IL167635A/en active IP Right Grant
- 2005-04-26 ZA ZA200503380A patent/ZA200503380B/en unknown
- 2005-08-10 HK HK05106899A patent/HK1073797A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR101152561B1 (ko) | 2012-06-01 |
CN1694721A (zh) | 2005-11-09 |
EA200500546A1 (ru) | 2005-10-27 |
CA2500215A1 (en) | 2004-04-08 |
NZ539107A (en) | 2008-11-28 |
ZA200503380B (en) | 2007-11-28 |
EP1545593A1 (en) | 2005-06-29 |
HK1073797A1 (en) | 2005-10-21 |
JP2006503063A (ja) | 2006-01-26 |
JP4791730B2 (ja) | 2011-10-12 |
WO2004028560A1 (en) | 2004-04-08 |
CN100542605C (zh) | 2009-09-23 |
IL167635A (en) | 2011-07-31 |
AU2003269213A1 (en) | 2004-04-19 |
CA2500215C (en) | 2012-02-28 |
BR0314751A (pt) | 2005-07-26 |
GB0508549D0 (en) | 2005-06-01 |
AU2003269213B2 (en) | 2008-11-13 |
GB2410497B (en) | 2006-11-22 |
US20060153804A1 (en) | 2006-07-13 |
US8349364B2 (en) | 2013-01-08 |
PL375782A1 (pl) | 2005-12-12 |
EA010881B1 (ru) | 2008-12-30 |
KR20050070008A (ko) | 2005-07-05 |
MXPA05003222A (es) | 2005-07-26 |
GB2410497A (en) | 2005-08-03 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ZA200503380B (en) | Nucleic acid coated particles | |
US6262034B1 (en) | Polymeric gene delivery system | |
JP5560244B2 (ja) | 医薬組成物 | |
EP1335661B1 (en) | Production of microspheres | |
TW555569B (en) | Biodegradable microparticles for the sustained delivery of therapeutic drugs | |
US20040038865A1 (en) | Cell transport compositions and uses thereof | |
EP2409686A1 (en) | Cell transport compositions and uses thereof | |
AU2002220002A1 (en) | Methods and compositions for enhanced delivery of bioactive molecules | |
EP1353701A2 (en) | Methods and compositions for enhanced delivery of bioactive molecules | |
AU2008302035A1 (en) | Nanotherapeutic colloidal metal compositions and methods | |
JP2007523067A (ja) | 官能化コロイド金属組成物および方法 | |
AU2007200363A1 (en) | Colloidal metal compositions and methods | |
JP2001500858A (ja) | 核酸粒子の送達 | |
CZ20021357A3 (cs) | Prostředek schopný reagovat na magnetické pole | |
JP2002538195A (ja) | 生物活性化合物の持続放出用の無針注射器を使用する微粒子製剤の送達 | |
US20220370488A1 (en) | Mucus penetrating particle compositions and methods of use thereof enhancing immune response | |
CN108743568B (zh) | 用于降低气道高反应性的抗ngf抗体缓释微球及制备方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
RECP | Rectifications of patent specification |