MXPA05003222A - Particulas revestidas con acido nucleico. - Google Patents

Particulas revestidas con acido nucleico.

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Abstract

Se proporcionan particulas que son adecuadas para la distribucion desde un dispositivo de distribucion mediada por particulas. Las particulas se obtienen al precipitar un acido nucleico en particulas portadoras de metales inertes en la presencia de un agente de condensacion de acido nucleico y un agente quelante de ion metalico. Tambien se describen procesos para preparar las particulas, y metodos terapeuticos que usan las particulas, incluyendo metodos de inmunizacion por acidos nucleicos y terapia genica.

Description

PARTICULAS REVESTIDAS CON ACIDO NUCLEICO Campo de la Invención La presente invención se refiere a partículas revestidas con ácido nucleico que son adecuadas para la distribución mediada por partículas de ácidos nucleicos por un dispositivo sin aguja. En particular, la invención se refiere al uso de las partículas para la distribución in vivo y ex vivo de moléculas de ácido nucleico al tejido de mamífero.
Antecedentes de la Invención La terapia génica y la inmunización con ácidos nucleicos son planteamientos promisorios para el tratamiento y prevención de enfermedades tanto adquiridas como hereditarias. Estas técnicas proporcionan la transferencia de un ácido nucleico deseado en un sujeto con la subsiguiente expresión in vivo. La transferencia se puede lograr al transfectar las células o tejidos del sujeto ex vivo y al re-introducir el material transformado en el hospedero. De manera alternativa, el ácido nucleico se puede administrar in vivo al receptor. Sin embargo, el método de distribución in vivo puede permitir que el ácido nucleico entre a las células del receptor de modo que se pueda expresar el ácido nucleico. REF: 162920 Se han desarrollado varios métodos para la distribución génica en estos contextos. De éstos, la distribución transdérmica de ácidos nucleicos proporciona muchas ventajas con respecto a las técnicas orales o parenterales de distribución. En particular, la distribución transdérmica proporciona una alternativa segura, conveniente y no invasiva a los sistemas tradicionales de administración, evitando de forma conveniente los problemas principales asociados con la distribución oral (por ejemplo, velocidades variables de absorción, degradación gástrica y metabolismo, efecto hepático de primera pasada, irritación gastrointestinal y/o sabores amargos o desagradables de los fármacos) o distribución parenteral (por ejemplo, dolor de la aguja, el riesgo de introducir infección a los individuos tratados, el riesgo de contaminación e infección de los trabajadores de cuidado de la salud, provocado por pinchazos accidentales de las agujas y la eliminación de las agujas usadas) . Sin embargo, la distribución transdérmica de ácidos nucleicos también presenta varios problemas inherentes. La distribución pasiva a través de la piel intacta conlleva el transporte de moléculas a través de varios tejidos estructuralmente diferentes. Estos pueden incluir el extracto córneo (la barrera principal) , la epidermis viable, la dermis papilar o las paredes capilares a fin de obtener acceso a la sangre o sistema linfático. Por lo tanto, los sistemas de distribución transdérmica deben ser capaces de superar las varias resistencias presentadas por cada tipo de tejido. Por lo tanto, se han desarrollado varias alternativas a la distribución transdérmica pasiva. Estas alternativas incluyen el uso de agentes que mejoran la penetración en la piel o "intensificadores de permeación" para incrementar la permeabilidad a la piel, así como modos no químicos tal como el uso de ionoforesis, electroporación o ultrasonido. Sin embargo, estas técnicas alternativas frecuentemente dan sus propios efectos secundarios tal como irritación o sensibilización de la piel. Recientemente, se han desarrollado las técnicas mediadas por partículas, adecuadas para la distribución transdérmica de ácidos nucleicos. Las partículas que tienen el ácido nucleico de interés se aceleran a alta velocidad y se disparan en el tejido objetivo usando un dispositivo de aceleración de partículas. In vivo, las partículas se pueden disparar directamente en las células receptoras, evitando la necesidad de la captación en células del ácido nucleico mensajero. En la técnica se conocen varios dispositivos de aceleración de partículas adecuados para la distribución mediada por partículas. Los dispositivos existentes emplean una descarga explosiva, eléctrica o gaseosa para impulsar las partículas portadoras, revestidas hacia las células objetivo. El dispositivo BiolisticMR, por ejemplo, distribuye cuentas microscópicas de oro, revestidas con ADN, directamente en las células de la epidermis (Yang et al (1990) PNAS USA 87:9568-9572). También se pueden distribuir partículas usando un dispositivo de jeringa sin aguja tal como aquel descrito en la patente de los Estados Unidos No. 5,630,797 de Bellhouse et al ("el dispositivo de jeringa sin aguja PowderJectM " ) . Los dispositivos mediados por partículas se proponen para permitir la distribución segura y fácil de ácidos nucleicos. Sin embargo, las características físicas de las partículas necesitan ser manejadas para cumplir con las demandas de la administración sin agujas, en la cual se disparan típicamente las partículas a velocidades muy altas. Las partículas necesitan tener una integridad estructural tal que puedan sobrevivir a la acción de por ejemplo un chorro de gas de una jeringa o el impacto balístico con la piel o te ido mucoso. También es importante que las partículas tengan una densidad que le permita a las partículas lograr un suficiente momento para penetrar el tejido. Sin embargo, para la distribución de ácidos nucleicos, las partículas deben ser más pequeñas que el tamaño de la célula de modo que puedan penetrar las membranas celulares sin romper las células. Los ácidos nucleicos por sí mismos son susceptibles a la degradación en el almacenamiento. Por lo tanto, el ácido nucleico necesita ser mantenido en condiciones estables cuando se asocia con la partícula. Sin embargo, la asociación del ácido nucleico con la partícula también debe permitir la expresión eficiente del ácido nucleico después de la distribución a la célula objetivo. Donde el ácido nucleico codifica para un antígeno, el medio de asociación de partícula también debe permitir la inmunogenicidad del antígeno en un sujeto. De acuerdo a una técnica, las partículas adecuadas para la distribución mediada por partículas se pueden formar al revestir moléculas de ácido nucleico en partículas portadoras de metales inertes. Las partículas portadoras se seleccionan de materiales que tienen un tamaño y densidad adecuados, tal como tungsteno u oro. Se conocen varios métodos para revestir o precipitar ADN o AR en partículas de oro o tungsteno. Estos métodos combinan en general una cantidad predeterminada de oro o tungsteno con ADN de plásmido, CaCl2 y espermidina. Las solución resultante se somete a vórtice de forma continua durante el procedimiento de revestimiento para asegurar la uniformidad de la mezcla de reacción. Después de la precipitación del ácido nucleico, las partículas revestidas se pueden transferir a membranas adecuadas y dejar secar antes del uso, revestir en superficies de un módulo o cartucho muestra, o cargar en un cartucho de distribución para uso en instrumentos particulares de distribución mediada r partículas.
Breve Descripción de la Invención Se ha desarrollado una nueva formulación para optimizar tanto la estabilidad del ácido nucleico unido a las partículas portadoras, promoviendo de este modo la vida en anaquel de las partículas y la cantidad de ácido nucleico distribuido a las células objetivo, intactas, y también la expresión y actividad fisiológica del ácido nucleico en la distribución a las células objetivo. De manera específica, se ha encontrado que los ácidos nucleicos se pueden unir de forma estable a partículas portadoras de metales inertes en la presencia de un agente de condensación de ácido nucleico y un agente quelante de ión metálico. De esta manera, el ácido nucleico se puede precipitar en las partículas portadoras a pH neutral en lugar de alcalino, ayudando a conservar la integridad del ácido nucleico. Adicionalmente , las partículas se pueden lavar en soluciones acuosas o alcohólicas sin pérdida de ácido nucleico, facilitando la incorporación de los agentes de mejora de estabilidad. La condensación del ácido nucleico, junto con la acción química del agente quelante protegen el ácido nucleico tanto del daño físico como daño químico, por ejemplo, por oxidación por radicales libres o digestión por endonucleasas. Las partículas de la invención se pueden distribuir a células por la distribución eficiente mediada por partículas. A pesar de la estabilidad de la asociación de partículas-ácido nucleico, se ha mostrado que hay una expresión eficiente del ácido nucleico en las células objetivo. Adicionalmente , se ha demostrado la inmunopotencia de los ácidos nucleicos que codifican para antígenos. Por consiguiente, la presente invención proporciona partículas adecuadas para la distribución desde un dispositivo de distribución mediada por partículas, partículas que se pueden obtener al precipitar un ácido nucleico en partículas portadoras de metales inertes, en la presencia de un agente de condensación de ácido nucleico y un agente quelante de ión metálico. La formulación de partículas se puede mejorar adicionalmente al usar uno o más azucares, y/o sal en la preparación de partículas y/o al tratar partículas con un antioxidante tal como etanol o vitamina A, C o E. La invención también proporciona: un proceso para la preparación de partículas adecuadas para la distribución desde un dispositivo de distribución mediada por partículas, que comprende: (i) precipitar un ácido nucleico en partículas portadoras de metales inertes en la presencia de un agente de condensación de ácido nucleico y un agente quelante de ion metálico; y (ii) recolectar las partículas resultantes, un método de inmunización con ácidos nucleicos, que comprende: (a) proporcionar partículas adecuadas para la distribución desde un . dispositivo de distribución mediada por partículas, partículas que se pueden obtener al precipitar un ácido nucleico que codifica para un antígeno en partículas portadoras de metales inertes en la presencia de un agente de condensación de ácido nucleico y un agente quelante de ion metálico; y (b) administrar una cantidad efectiva de las partículas a un sujeto; un método de terapia génica, que comprende: (a) proporcionar partículas adecuadas para la distribución desde un dispositivo de distribución mediada por partículas, partículas que se pueden obtener al precipitar un ácido nucleico que codifica para un polipéptido terapéutico en partículas portadoras de metales inertes · en la presencia de un agente de condensación de ácido nucleico y un agente quelante de ion metálico; y (b) administrar una cantidad efectiva de las partículas a un sujeto; y partículas, adecuadas para la distribución desde un dispositivo de distribución mediada por partículas, que comprende partículas portadoras de metales inertes que tienen en su superficie un ácido nucleico, un agente quelante de ion metálico, y uno o más de: (i) un agente de condensación de ácido nucleico; (ii) uno o más azúcares de disacáridos y/o trisacáridos ; y (iii) una o más sales La invención también proporciona un receptáculo de dosificación para un dispositivo de distribución mediada por partículas, el receptáculo que contiene partículas de la invención. Así como un dispositivo de distribución mediada por partículas, cargado por partículas de la invención. Estos y otros objetos con aspectos, modalidades y ventajas de la presente invención se presentarán fácilmente para aquellos expertos en la técnica en vista de la descripción de la presente.
Descripción Detallada de las Modalidades Preferidas Antes de describir en detalle la presente invención, se va a entender que esta invención no se limita a las moléculas o parámetros de proceso, particularmente ejemplificados, puesto que éstos pueden por supuesto variar. También se va a entender que la terminología usada en la presente es para el propósito de describir modalidades particulares de la invención únicamente y no se propone que sea limitante. Además, la práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique de otra manera, métodos convencionales de virología, microbiología, biología molecular, técnicas de ADN recombinante e inmunología todas las cuales están dentro de la habilidad ordinaria en la técnica. Estas técnicas se explican completamente en la literatura. Ver, por ejemplo Sambrook, et al., Molecular Cloning: A. Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); DNA Cloning: A Practical Approach, vol . I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); y Fundamental Virology, 2nd Edition, vol. I & II (B.N. Fields and D.M. Knipe, eds . ) . Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patentes citadas en la presente, ya sea supra o infra se incorporan de este modo como referencia en su totalidad. Se va a señalar que, como se usa en esta especificación y las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un" , "una" y "el" incluyen referencias plurales a menos que el contenido dicte claramente otra cosa. A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por un experto en la técnica a la cual corresponde la invención.
Aunque se pueden usar varios métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la práctica de la presente invención, los materiales y métodos preferidos se describen en la presente.
A. Definiciones Al describir la presente invención, se emplearán los siguientes términos y se propone que se definan como se indica a continuación. Los términos "moléculas de ácido nucleico" y "polinucleótido" se usan de forma indistinta en la presente y se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sea desoxirrubonucleótidos o ribonucleótidos o análogos de los mismos. Los polinucleótidos pueden tener cualquier estructura tridimensional, y pueden realizar cualquier función, conocida o desconocida. Los ejemplos no limitantes de polinucleótidos incluyen un gen, o un fragmento génico, exones, intrones, AR mensajero (ARNm) , ARN de transferencia, ARN ribosómico, ribozimas, ADNc, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de ácido nucleico y cebadores . Típicamente un polinucleótido se compone de una secuencia específica de cuatro bases de nucleótidos: adenina (A) ; citosina (C) ; guanina (G) ; y timina (T) (uracilo (U) por timina (T) cuando el polinucleótido es AR ) . De esta manera, el término secuencia de ácido nucleico es la representación alfabética de una molécula de polinucleótido. Esta representación alfabética se puede introducir en las bases de datos en una computadora que tiene una unidad central de procesamiento y se usa para aplicaciones de bioinformática tal como genómica funcional y búsqueda de homología . Una secuencia de ácido nucleico que "codifica" para un antígeno seleccionado esa una molécula de ácido nucleico que se transcribe (en el caso de ADN) y se traduce (en el caso del ARNm) en un polipéptido in vivo cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia de codificación se determinan por un codón de inicio en el término 5' (amino) y un codón de paro de paro de traducción en el término 3' (carboxi) para los propósitos de la invención, estas secuencias de ácido nucleico pueden incluir, de manera enunciativa y sin limitación, ADNc de ARNm viral, procariótico o eucariótico, secuencias genómicas de ADN viral o procariótico o ARN, y aún secuencias sintéticas de ADN. Una secuencia de transmisión de trascripción se puede localizar 3' a la secuencia de codificación.
Un "vector" es capaz de transferir secuencias de ácido nucleico a células objetivo (por ejemplo, vectores virales, vectores no virales, portadores en forma de partículas y liposomas) . Típicamente, "construcción de vector" , "vector de expresión" y "vector de transferencia génica" , significan cualquier construcción de ácido nucleico capaz de dirigir la expresión de un gen de interés y que puede transferir secuencias génicas a las células objetivo. De esta manera, el término incluye vehículos de clonación y expresión. Un "plásmido" es un vector en la forma de un elemento genético extracomosómico . Un "promotor" es una secuencia de nucleótidos que inicia y regula la trascripción de un pol inucleótido . Los promotores pueden incluir promotores inducibles (donde la expresión de una secuencia de polinucleotidos enlazada operablemente al promotor se induzca por un analito, co-factor, proteína reguladora, etc.), promotores reprimibles (donde la expresión de una secuencia de polinucleotidos enlazada operablemente al promotor se reprima por un analito, co-factor, proteína reguladora, etc.) y promotores constitutivos. Se propone que el término "promotor" o "elemento de control" incluya regiones promotoras de longitud completa y segmentos funcionales (por ejemplo, controla la trascripción o traducción) de estas regiones. "Operablemente enlazado" se refiere a un arreglo elementos en donde los componentes descritos de este modo se configuran para realizar su función usual. De esta manera, un promotor dado enlazado operablemente a una secuencia de ácido nucleico es capaz de efectuar la expresión de esta secuencia donde estén presentes las enzimas apropiadas. El promotor no necesita estar contiguo con la secuencia, en tanto que funcione para dirigir la expresión de la misma. De esta manera, por ejemplo, las secuencias no traducidas de intervención, aún transcritas, pueden estar presentes entre la secuencia promotora y la secuencia de ácido nucleico y la secuencia promotora puede aún ser considerada "operablemente enlazada" a la secuencia de codificación. "Recombinante" se usa en la presente para describir una molécula de ácido nucleico (polinucleotido) de origen genómico, de ADNc, semi-sintético o sintético que, en virtud de su origen o manipulación no está asociada con todo o una porción del polinucleotido con el cual está asociado a la naturaleza y/o se enlaza a un polinucleotido diferente del cual está enlazado en la naturaleza. Dos secuencias de ácido nucleico que están contenidas dentro de una molécula única recombinante de ácido nucleico son "heterólogas" con relación una a la otra cuando normalmente no están asociadas entre sí en la naturaleza. Un "polipéptido" se usa en el sentido más amplio para referirse a un compuesto de dos o más aminoácidos de sub-unidades , análogos de aminoácido, u otros peptidomiméticos . Las sub-unidades se pueden enlazar por enlaces peptídicos o por otros enlaces, por ejemplo, éster, éter, etc. Como se usa en la presente, el término "aminoácido" se refiere a aminoácidos ya sea naturales y/o no naturales o sintéticos, incluyendo glicina y tanto los isómeros ópticos de D o L, y los análogos de aminoácidos y peptidomiméticos. Un péptido de tres o más aminoácidos se llama comúnmente un oligopéptido si es corta la cadena peptídica. Si la cadena peptídica es larga, el péptido se llama típicamente un polipéptido o una proteina. Un "antígeno" se refiere a cualquier agente, en general una macromolécula, que puede producir una respuesta inmunológica en un individuo. El término se puede usar para referirse a una macromolécula individual o a una población homogénea o heterogénea de macromoleculas antigénicas. Como se usa en la presente, "antígeno" se usa en general para referirse a una molécula de proteína o una porción de la misma que contiene uno o más epítopes. Para el propósito de la presente invención, se pueden obtener antígenos o derivar de cualquier fuente apropiada. Adicionalmente , para los propósitos de la presente invención, un "antígeno" incluye una proteína que tiene modificaciones, tal como supresiones, adiciones o sustituciones (en general de naturaleza conservadora) a la secuencia nativa, en tanto que la proteína mantenga suficiente inmunogenicidad . Estas modificaciones pueden ser deliberadas, por ejemplo, a través de la mutagénesis dirigida al sitio, o pueden ser accidentales, tal como a través de mutaciones de hospederos que producen los antígenos. Una "respuesta inmune" contra un antígeno de interés es el desarrollo en un individuo de una respuesta inmune humoral y/o celular a ese antígeno. Para propósitos de la presente invención, una "respuesta inmune humoral" se refiere a una respuesta inmune mediada por moléculas anticuerpo, en tanto que una "respuesta inmune celular" es una mediada por linfocitos T y/o otras células sanguíneas blancas . El término "inmunización por ácido nucleico" se usa en la presente para referirse a la introducción de una molécula de ácido nucleico que codifica para uno o más antígenos seleccionados en una célula hospedera para la expresión ín vivo del antígeno o antígenos. La molécula de ácido nucleico se puede introducir directamente en el sujeto receptor por distribución transdérmica de partículas. De manera alternativa, la molécula se puede introducir ex vivo en células que se han removido de un sujeto. En este último caso, las células que contienen la molécula de ácido nucleico de interés se vuelven a introducir en el sujeto tal que se pueda montar una respuesta inmune contra el antígeno modificado de la molécula de ácido nucleico. Las moléculas de ácido nucleico usadas en esta inmunización se refieren en general en la presente "vacunas de ácido nucleico" . El término distribución "transdérmica" propone administración intradérmica (por ejemplo en la dermis o epidermis), transdérmica (por ejemplo, "percutánea" ) y transmucosa, es decir, distribución por el paso de un agente en o a través de la piel o tejido mucoso. Ver, por ejemplo Transdermal Drug Delivery: Developmental Issues and Research Initiatives, Hadgraft and Guy (eds.), Marcel Dekker, Inc., (1989) ; Controlled Drug Delivery: Fundamentáis and Applications, Robinson y Lee (eds.), Marcel Dekker Inc., (1987); y Transdermal Delivery of Drugs, Vols. 1-3, Kydonieus and Berner (eds.), CRC Press, (1987). De esta manera, el término abarca distribución desde una jeringa sin agujas como se describe en la patente de los Estados Unidos No. 5,630,796, así como la distribución mediada por partículas como se describe en la patente de los Estados Unidos No. 5, 865, 796. Por "jeringa sin aguja" se quiere decir un instrumento que distribuye una composición de partículas de forma transdérmica sin la ayuda de una aguja convencional para perforar la piel. Las jeringas sin aguja para el uso con la presente invención se analizan a todo lo largo de este documento.
Los términos "individuo" y "sujeto" se usan de forma indistinta en la presente para referirse a cualquier miembro del subphylum cordata, incluyendo, sin limitación, humanos y otros primates, incluyendo otras especies de monos y micos; animales de granja tal como ganado vacuno, ovejas, cerdos, cabras y caballos; mamíferos domésticos tal como perros y gatos, animales de laboratorio incluyendo roedores tal como ratones, ratas y cobayos; aves, incluyendo domésticas, silvestres y de cacería tal como pollos, pavos y otros pájaros gallináceos, patos, gansos y similares. Los términos no denotan una edad particular. De esta manera, se propone que se cubran tanto individuos adultos como recién nacidos. Los métodos descritos en la presente se proponen para el uso en cualquiera de las especies vertebradas anteriores, puesto que los sistemas inmunitarios de todos estos vertebrados operan de forma similar.
B. Métodos Generales La invención está relacionada con la distribución mediada por partículas de ácidos nucleicos. En particular, la invención proporciona partículas que son adecuadas para la distribución desde un dispositivo de distribución mediada por partículas, y que se pueden obtener por un proceso que comprende o que en algunas modalidades consiste esencialmente en depositar un ácido nucleico en partículas portadoras de metales inertes en la presencia de un agente de condensación de ácido nucleico y un agente quelante de ion metálico. Las partículas portadoras se seleccionan de metales que tienen una densidad adecuada y un tamaño adecuado de partícula para la distribución intracelular desde un dispositivo de distribución mediada por partículas. De manera preferente, la densidad de las partículas portadoras es de aproximadamente 15 a 25 g/ml, por ejemplo, de aproximadamente 15 a 23 g/ml o desde aproximadamente 16 a 20 g/ml. Las partículas portadoras pueden tener diámetros de aproximadamente 0.5 a 10 µp?, por ejemplo de aproximadamente 1 a 5 µp?. Se prefiere de forma particular que las partículas portadoras tengan un diámetro de aproximadamente 0.5 a 3 µ?t?, por ejemplo de aproximadamente 1 a 3 µt? o de 0.5 a 2 µp\. Las partículas portadoras de metales son inertes ya que son no reactivas dentro de las células ex vivo o en el cuerpo del sujeto al cual se van administrar las partículas. Típicamente, se usan partículas portadoras de oro, tungsteno, platino o iridio. Se prefieren partículas de oro o tungsteno. Las partículas de oro pueden ser partículas coloidales de oro. Las partículas de oro proporcionan tamaño uniforme (disponibles de Alpha Chemicals en tamaños de partícula de aproximadamente 1 a 3 µp?, o disponibles de Degusta, South Plainfield, NJ en el intervalo de tamaños de partícula que incluyen 0.95 µp?) y toxicidad reducida. El oro microcristalino (por ejemplo, polvo de oro A1570, disponible de Engelhard Copr., East Newark, NJ) proporciona una distribución diversa de tamaños de partícula, típicamente en el intervalo de aproximadamente 0.1 a 5 µt?. Sin embargo, el área superficial y regular del oro microcristalino proporciona un revestimiento altamente eficiente con ácidos nucleicos. Las partículas de tungsteno están fácilmente disponibles en tamaños de partícula de aproximadamente 0.5 a 2 µt? de diámetro. Típicamente, la molécula de ácido nucleico comprende secuencia de nucleótidos terapéuticamente efectivos para la distribución a un sujeto. Se prefiere que las presentes partículas sean adecuadas para el uso en inmunización por ácido nucleico o en terapia génica. El ácido nucleico comprende de esta manera una secuencia capaz de proporcionar inmunidad, por ejemplo, una secuencia inmunogénica que produce una respuesta inmune humoral y/o celular cuando se distribuye a un sujeto. De manera alternativa, el ácido nucleico puede comprender uno o rr.ás genes que codifican para un polipéptido terapéutico, por ejemplo, una proteína efectiva o que está ausente de un genoma de célula objetivo o una proteína no nativa que tiene un efecto terapéutico biológico deseado (por ejemplo, una función antiviral). El ácido nucleico puede comprender una secuencia que codifica para una molécula que tiene una función antisentido o de ribozima. Para el tratamiento de trastornos genéticos, los genes funcionales que corresponden a los genes conocidos que son deficientes en el trastorno particular se pueden administrar a un sujeto. De manera preferente, el ácido nucleico es ADN. Los ácidos nucleicos adecuados para la distribución incluyen aquellos usados para el tratamiento de trastornos inflamatorios, enfermedades autoinmunes, crónicas e infecciosas, incluyendo trastorno tal como SIDA, cáncer, enfermedades neurológicas, enfermedad cardiovascular, hipercolestemia; varios trastornos sanguíneos incluyendo varias anemias, talasemia y hemofilia; defectos genéticos tal como fibrosis cística, Enfermedad de Gaucher, deficiencia de adenosina-desaminasa (ADA), enfisema, etc. Se han descrito en la técnica varios oligonucleótidos antisentido (por ejemplo, polinucleótidos cortos complementarios a las secuencias alrededor del sitio de inicio de traducción (codón AUG) de un AR m) que son útiles en la terapia antisentido para cáncer y para enfermedades virales. Ver, por ejemplo Han et al (1991) Proc . Nati. Acad. Sci USA 88:4313 ; Uhlmann et al (1990) Chem. Rev. 90:543, Helene et al (1990) Biochim. Biophys . Acta. 1049:99; Agarwal et al (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85: 7079; and Heikkila et al (1987) Nature 328:445. También se han descrito varias ribozimas adecuadas para el uso en la presente. Ver, por ejemplo Chec et al (1992) J. Biol . Che . 267; 17479 y patente de los Estados Unidos No. 5,225,347 de Goldberg et al . Por ejemplo, en métodos para el tratamiento de tumores sólidos, se pueden distribuir, para la expresión en o cerca del sitio de tumor, genes que codifican para péptidos tóxicos (es decir, agentes quimioterapéuticos tal como ricina, toxina de difteria y factor de veneno de cobra), genes supresores de tumor tal como p53, genes que codifican para secuencias de ARNm que son antisentido a los oncogenes de transformación, péptidos anti -neoplásticos tal como factor de necrosis de tumor (TNF) y otras citocinas, o imitantes negativos trans-dominantes de oncogenes de transformación . De manera similar, también se pueden administrar ácidos nucleicos que codifican para los polipéptidos conocidos que exhiben actividad antiviral y/o antibacteriana, o estimulan el sistema inmunitario del hospedero. El ácido nucleico puede codificar para una de las varias citosina (o fragmentos funcionales de las mismas), tal como las interleucinas , interferones y factores de estimulación de colonias. El ácido nucleico puede codificar para un antígeno para el tratamiento o prevención de varias condiciones que incluyen de manera enunciativa y sin limitación cáncer, alergias, toxicidad e infección por un patógeno tal como de manera enunciativa y sin limitación, hongos, virus, tal como el virus de papiloma humano (HPV) virus HIV, HSV2/HSV1, virus de influenza (tipos A, B y C) virus de polio, virus SV, Rinovirus, Rotavirus, Virus de Hepatitis A, grupo del virus Nor alk, Enterovirus, Astrovirus, virus de sarampión, virus Par de Influenza, virus de paperas, virus de Varicela-Zoster, Citomegalovirus , Virus de Epstein-Barr, Adenovirus, virus de rubéola, virus del tipo I de linfoma de células T humanas (HTLV-I) , virus de Hepatitis B (HBV) , virus de Hepatitis C (HCV) , virus de Hepatitis D, virus de Viruela, Marburg y Ebola; bacterias que incluyen . tuberculosis, Chlamydia, N. gonorrhoeae, Shigella, Sal onella, Vibrio Cholera, Treponema pallidua, Pseudomonas, Bordetella pertussis, Brucella, Franciscella tulorensis, Helicobacter pylori , Leptospria interrogaus, Legionella pnumophila, Yersinia pestis, Streptococcus (tipos A y B) , Pneumococcus, Meningococcus, He ophilus influenza (tipo b) , Toxoplama gondic, Complybacteriosis, Moraxella catarrhalis, Donovanosis, y Actino ycosis ; patógenos fúngales incluyendo Candidiasis y Aspergilosis ; patógenos parásitos incluyendo Tenias, gusanos, ascárides, amibiasis, giardiasis, critosporidio, esquitosoma, pneumocistis carinii, tricomoniasis y tricquinosis . El ácido nucleico también se puede usar para proporcionar una respuesta inmune adecuada contra numerosas enfermedades veterinarias, tal como enfermedades de patas y boca, Coronavirus, Pasteurella multocida, Helicobacter , Strongylus vulgaris, Actinobacillus pleuropneumonia, virus de diarrea viral bovina (BVDV) , Klebsiella pneumoniae, E. Coll, Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis y Bordetella brochiseptica . De esta manera, en un aspecto, las partículas de la presente invención pueden encontrar uso como una vacuna. La invención también encontrará uso en terapia antisentido, por ejemplo, para la distribución de oligonucleótidos capaces de hibridizar a secuencias complementarias específicas, inhibiendo de este modo la trascripción y/o traducción de estas secuencias. De esta manera, el ADN o ARN que codifica para las proteínas necesarias para el progreso de una enfermedad particular se puede seleccionar como objetivo, interrumpiendo de este modo el proceso de la enfermedad. La terapia antisentido y numerosos oligonucleótidos que son capaces de unirse específica y de forma predecible a ciertas secuencias objetivo de ácido nucleico a fin de inhibir o modular la expresión de los genes que provocan la enfermedad, se conocen y están fácilmente disponibles para un practicante experimentado. Uhlmann et al (1990) Chem Rev. 90: 543, Neckers et al (1992) Int. Rev. Oncogenesis 3, 175; Simons et al (1992) Nature 359, 67; Bayever et al (1992) Antisense Res. Dev. 2: 109; Whitesell et al (1991) Antisense Res. Dev. 1: 343; Cook et al (1991) Anti-cancer Drug Design 6: 585; Eguchi et al (1991) Ann. Rev. Biochem. 60: 631. Por consiguiente, los ol igonucleótidos antisentido capaces de unirse selectivamente a secuencias objetivo en células hospederas se proporcionan en la presente para el uso en productos terapéuticos antisentido. Típicamente, el ácido nucleico se proporciona como un vector de expresión. Estos vectores de expresión se pueden construir de forma rutinaria en la técnica de biología molecular y por ejemplo pueden comprender el uso de ADN de plásmido e iniciadores, promotores, intensificadores y otros elementos apropiados, tal como por ejemplo, señales de poliadenilación que pueden ser necesarias, y que se colocan en la orientación correcta, a fin de permitir la expresión de una secuencia insertada. Los vectores adecuados serán evidentes para un experto en la técnica. Por medio de ejemplo adicional a este respecto, se hace referencia a Sambrook et al. 1989. Un vector adecuado de expresión comprende un polinucleotido para el uso en la presente invención enlazado operablemente a una secuencia de control, típicamente un promotor, que es capaz de proporcionar la expresión del polinucleotido por una célula hospedera. De manera preferente, el vector es adecuado para el uso en un método de terapia génica o inmunización por ácido nucleico. El vector se puede usar ex vivo, por ejemplo para transformar una célula hospedera que entonces se vuelve a introducir en un sujeto. De manera alternativa, el vector se puede usar in vivo para la distribución directa a un sujeto. El vector es típicamente un plásmido provisto con un origen de replicación, un promotor para la expresión del polinucleótido y opcionalmente un regulador del promotor. Los vectores pueden contener uno o más genes marcadores selecciónateles , por ejemplo, un gen de resistencia a ampicilina . Los promotores y otras señales de regulación de expresión se seleccionan para ser compatibles con la célula hospedera para el cual se diseña la expresión. Se pueden usar promotores inducibles, reprimibles o controlables de otra manera. Para la expresión en hospederos mamíferos o células hospederas de mamífero, se pueden usar elementos de control tanto eucarióticos como de fago. Los promotores adecuados de mamífero incluyen el promotor de metalotioneína que se puede inducir en respuesta a metales pesados tal como promotores de ß-actina y cadmio. Se prefieren de forma especial los promotores específicos de tejido. Los promotores virales adecuados incluyen por ejemplo la repetición terminal larga del virus de leucemia murina Moloney ( MLV LTR) , el promotor LTR del virus de Sarcoma de Rous (RSV) , el promotor SV40, el promotor temprano inmediato (IE) de citomegalovirus humano (hCMV) , adenovirus, promotores de HSV (tal como los promotores IE de HSV) , o promotores de HPV, particularmente la región reguladora en la dirección 5' (URR) del HPV. Todos estos promotores están fácilmente disponibles en la técnica. Típicamente, también estarán presentes secuencias de terminación de trascripción y poliadenilación, localizadas 3' a cada codón de paro de traducción. De manera preferente, una secuencia para la optimización del inicio de la traducción localizada en 5' a cada secuencia de codificación también está presente. Los ejemplos de señales de terminación de trascripción/pol iadenilación incluyen aquellas derivadas de SV40, como se describe en Sambrook et al . , así como la secuencia terminadora de secuencia de hormona bovina de crecimiento. Además, se pueden incluir elementos intensificadores para incrementar los niveles de expresión. Los ejemplos de intensificadores adecuados incluyen el intensificador génico temprano de SV40 (Di kema et al (1985) EMBOJ. 4:761), el intensificador/promotor derivado de la repetición terminal larga del virus de Sarcoma de Rous (LTR) (Gorman et al (1982) Proc . Nati. Acada. Sci. USA 79: 6777) y elementos derivados de CMV humano o murino (Boshart et al (1985) Cell 41:521) por ejemplo, elementos incluidos en la secuencia de Intron A de CMV. El agente de condensación de ácido nucleico para el uso en la invención interactúa con un ácido nucleico de una manera tal para condensar el ácido nucleico en una estructura más compacta. El ácido nucleico condensado es típicamente más estable que la forma no condensada, y usualmente cieñe una estructura más ordenada, por ejemplo, una forma toroidal o tipo varilla. Los agentes de condensación son típicamente moléculas básicas, que interactúan de forma electrostática con el ácido nucleico para contrarrestar su carga negativa. Se ha reportado, por ejemplo, que se requiere 88-90% de neutralización de carga para que se presente una condensación eficiente (Deng H. y V.A. Bloomfield (1999) Biophys J 77:1556-61) . Usualmente, el agente de condensación se une al ácido nucleico con una afinidad relativamente alta. Se puede usar cualquier agente adecuado de condensación de ácido nucleico incluyendo ácidos catiónicos y catiónicos multivalentes . En una modalidad, el agente de condensación es un polímero catiónico o una sal fisiológicamente aceptable del mismo. Estas sales farmacéuticamente aceptables incluyen, por ejemplo, sales de ácidos minerales tal como clorhidratos, bromhidratos , fosfatos, sulfatos y similares y sales de ácidos orgánicos tal como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos, y similares. Típicamente, las sales son un clorhidrato o un sulfato . De manera preferente, el polímero catiónico es una poliamida. Las poliamidas que se pueden usar incluyen protaminas, putrescina, espermidina, espermina, bromuro de hexadimetrina (Polybreno" ) , poliargininas y polilisinas, o sales fisiológicamente aceptables de lo anterior. El polímero catiónico puede ser un péptido que contiene una pol iamina . De manera preferente, la poliamina es un polímero catiónico de aminoácidos básicos. Típicamente, los aminoácidos básicos se seleccionan de lisina, arginina e histidina. Estos poliaminoácidos están fácilmente disponibles de Sigma-Aldrich. El poliaminoácido puede ser un homopolímero de un aminoácido básico. Por ejemplo, poliarginina, polilisina o polihistidina . De manera alternativa, el poliaminoácido puede ser un polímero de uno o más aminoácidos básicos, también opcionalmente que incluye uno o más aminoácidos no básicos. De esta manera, el poliaminoácido puede comprender uno o más aminoácidos básicos y opcionalmente uno o más aminoácidos diferentes. Este copolímero comprende típicamente una mayoría de aminoácidos básicos. Por ejemplo, de 50 a 100% de los aminoácidos en el copolímero pueden ser básicos. De manera preferente de 60 a 90% o de 70 a 80% son básicos. En una modalidad, al menos 75%, por ejemplo, al menos 85%, 95%, 98%, o 99% de los aminoácidos en el copolímero son básicos. En general, los aminoácidos básicos comprenden uno o más de lisina, histidina y arginina. Donde el copolímero incluye uno o más aminoácidos no básicos, estos son de manera preferente aminoácidos no ácidos, tal como aspartato o glutamato. El uno o más aminoácidos no básicos pueden incluir aminoácidos con cadenas laterales alifáticas o aromáticas, por ejemplo, treonina, prolina, triptofano, serina o fenilalanina . Los aminoácidos en cualquiera de los poliaminoácidos anteriores pueden ser L- o D-aminoácidos . De manera preferente, se usan L-aminoácidos . En una modalidad preferida, la poliamina es un homopolímero de arginina (Arg)x o lisina (Lys)x. Se prefieren poli -L-arginina o poli-L-lisina, en particular poli-L-arginina . Típicamente, el homopolímero tiene un peso molecular de aproximadamente 500 a 15000, por ejemplo, de 500 a 10000, de 500 a 5000, o de 500 a 1000. En una modalidad, x en la fórmula anterior puede variar de 2 a 100, por ejemplo de 2 a 50, de 2 a 30 o de 2 a 20. Los homopolímeros de péptidos pequeños son particularmente preferidos, por ejemplo, aquellos que tienen un peso molecular en el intervalo de 500 a 1500, tal como de 500 a 1250, o de 700 a 1000. Típicamente, en un péptido pequeño, x tiene un valor de 2 a 10, por ejemplo, de 4 a 8. Son especialmente útiles en la presente invención los homopolímeros en donde x = 4 a 6, por ejemplo (Arg) o (Arg) 6. El agente de condensación puede ser un miembro de la familia de protamina de proteínas por ejemplo sulfato de protamina. Las protaminas son proteínas básicas, que pueden presentarse unidas a ADN de esperma en lugar de las histonas. Por lo tanto, los núcleos de esperma proporcionan una excelente fuente de protaminas, por ejemplo, salmina de esperma de salmón, gluteina de esperma de arenque, iridina de esperma de trucha, esturina de esperma de esturión, y escombrina de esperma de caballa. La protamina, sulfato de protamina, fosfato de protamina y núcleos de esperma están fácilmente disponibles de Sigma-Aldrich. Otras poliaminas adecuadas tal como putrescina, espermidina y espermita, junto con sales fisiológicamente aceptables de los mismos también están fácilmente disponibles, por ejemplo, de Sigma-Aldrich. El agente de condensación también puede comprender cationes multivalentes o sus sales fisiológicamente aceptables. Estos cationes multivalentes incluyen, por ejemplo, cloruro de hexamina-cobalto (III) (Cohex) , cloruro de tris (etilendiaina) cobalto (III) (Coen) y cloruro de cobalto (III) -sepulcrato (Cosep) . Las sales fisiológicas adecuadas incluyen aquellas citadas anteriormente con relación a los polímeros catiónicos. Se conocen varias pruebas en la técnica que se pueden usar para identificar los agentes de condensación de ácido nucleico. Éstas valoran en general un cambio en las propiedades de una molécula de ácido nucleico de prueba donde se asocia la alteración con el proceso de condensación, por ejemplo, compactacion del ácido nucleico a un sólido, neutralización de la carga de la molécula de ácido nucleico, o obstrucción o bloqueo de los sitios de reconocimiento previamente accesibles para agentes tal como endonucleasas y factores de trascripción. Los ensayos, indicativos de condensación de formulaciones líquidas de ácido nucleico, incluyen de manera enunciativa y sin limitación: microscopía por fuerza atómica y electrones, tamaño de partícula, potencial zeta, ensayo espectrofluorométrico , ensayo por exclusión con bromuro de etidio, desplazamiento en gel, dicroísmo circular y resonancia magnética nuclear. Los ejemplos de citas útiles en la literatura son: J. Mol. Biol (1978) 121, 311-326; Biophysical Journal (1996), 70, 2847-2856, Nucleic Acids Res (1999) 27 (8), 1943-1949; J. AMER. Chem. Soc . , (1998) 120 (35), 8903-8909; J. Pharm Sci (1998) 87 (6), 678-683 e Int. J. Pharm (2000) 210 (1-2), 97-107.
El agente quelante para el uso en la presente invención quela iones metálicos de la solución. Los iones metálicos que se presentan de forma común para la quelación incluyen iones de Fe2+, Fe3+, Cr3+, Ca2+ y Na+ . De manera preferente, el agente quela iones de Ca^+ o Na+. De manera alternativa, se prefiere que el agente quele iones de Fe2+ o Fe3+. El agente puede ser mono- o muíti -dentado . Por ejemplo, los agentes adecuados incluyen de manera enunciativa y sin limitación ácido etilendiamina-tetraacético (EDTA) , ácido dietilentriamina-penta-acético (DTPA) , ácido nitrilotriacético (NTA) , hexafosfato de inositol , tripolifosfato , ácido polifosfórico, succinato de sodio, succinato de potasio, succinato de litio, malato de sodio, malato de potasio, malato de litio, desferal y ácido etilendiamina-di - (o-hidroxi - fenilacético) (EDDHA) .
Típicamente, se usa EDTA, DTPA o desferal, en particular EDTA o una sal del mismo, por ejemplo, edetato disódico. También se prefiere, que el ácido nucleico se deposite en las partículas portadoras de metales inertes en la presencia de uno o más azucares de disacáridos y/o trisacáridos . El uno o más azucares ayudan a incrementar la estabilidad de la partícula metálica/ácido nucleico. Los azucares adecuados incluyen de manera enunciativa y sin limitación, sacarosa, monolaurato de sacarosa, trehalosa, lactosa, resinosa y manitol . De manera preferente, el azúcar se selecciona de trehalosa, sacarosa, lactosa y rafinosa. En una modalidad, se usa una mezcla de uno o más azucares de disacárido o trisacárido. Por ejemplo, se puede usar una mezcla de uno o más de los azucares listados anteriormente. Es particularmente preferida una mezcla de sacarosa/rafinosa . Típicamente, la sacarosa/rafinosa se mezcla en una relación de 3:1 peso: peso. Se puede depositar el ácido nucleico en la partícula portadora metálica inerte también en la presencia de una o más sales. Las sales proporcionan aún más estabilidad. La sal es además cualquier sal que se pueda usar de acuerdo con la invención como un agente quelante, por lo tanto, la sal referida es en general una sal no quelante. Por ejemplo, la sal no es típicamente un malato o un succinato. La sal también es además una sal fisiológicamente aceptable que se puede usar de acuerdo con la invención como un agente de condensación de ácido nucleico . En una modalidad preferida, las sales se seleccionan de cloruros, acetatos, citratos, nitratos, fosfatos y sulfatos. Las sales adecuadas incluyen de manera enunciativa y sin limitación acetato de potasio, cloruro de calcio, cloruro de litio, acetato de sodio, nitrato de magnesio, citrato de sodio, fosfato de sodio, cloruro de sodio, sulfato de sodio y sulfato de potasio. De manera preferente, la sal es acetato de potasio. En una modalidad preferida, las partículas que tienen ácido nucleico se ponen en contacto con un antioxidante tal como etanol o vitamina A, vitamina C o vitamina E. Típicamente, el tratamiento de las partículas con el antioxidante incrementa la estabilidad. Un tratamiento típico puede comprender el lavado de las partículas con el antioxidante. En una modalidad, uno o más de los componentes usados en la preparación de partículas llega a ser incorporado en o a estar asociado con la partícula resultante. Por consiguiente, se proporcionan partículas, adecuadas para la distribución desde un dispositivo de distribución mediada por partículas, que comprende o que consiste algunas veces esencialmente de partículas portadoras de metales inertes que tienen en su superficie un ácido nucleico, un agente quelante de ion metálico y uno o más de : (i) un agente de condensación de ácido nucleico; (ii) uno o más azucares de disacárido y/o trisacárido; y (iii) una o más sales. Cada uno de los componentes de partículas es como se describe anteriormente. De manera preferente, las partículas comprenden al menos (i) y/o (ii) . La invención también proporciona un proceso para la preparación de las presentes partículas. El proceso comprende, o en algunas modalidades consiste, esencialmente de (i) precipitar un ácido nucleico en partículas portadoras de metales inertes en la presencia de un agente de condensación de ácido nucleico y un agente quelante de ion metálico; y (ii) recolectar las partículas resultantes. Típicamente, el paso (i) comprende poner en contacto el ácido nucleico con las partículas portadoras de metales inertes en la presencia del agente de condensación de ácido nucleico y el agente quelante de ion metálico por mezclado. Se prefiere someter a vórtice la mezcla continuamente durante el procedimiento de contacto para asegurar la uniformidad de la mezcla de contacto. De manera preferente, el ácido nucleico y el agente de condensación de ácido nucleico se separan uno del otro (por ejemplo, en soluciones separadas) hasta el momento cuando se va a presentar la condensación, por ejemplo, hasta que las partículas portadoras y el agente quelante también estén presentes. Es particularmente preferido adicionar el agente de condensación a una mezcla que comprenda ya las partículas portadoras y el ácido nucleico, para evitar la precipitación prematura del ácido nucleico. El agente quelante de ion metálico entonces puede estar presente en cualquiera o ambos de la preparación de agente de condensación y la mezcla de partículas portadoras y ácido nucleico. El agente de condensación se puede adicionar por pasos, por ejemplo, por gotas . De manera alternativa, se puede mezclar una mezcla del agente de condensación y partículas portadoras con una preparación de ácido nucleico. Las partículas metálicas, el ácido nucleico, el agente de condensación de ácido nucleico y el agente quelante se han descrito anteriormente. La mezcla en el paso de precipitación puede incluir adicionalmente uno o más azucares de disacáridos y/o trisacáridos , por ejemplo, sacarosa, monolaurato de sacarosa, trehalosa, lactosa, rafinosa, manitol, o una combinación de los mismos. De manera preferente, el azúcar se selecciona de trehalosa, sacarosa, lactosa y rafinosa o una combinación de los mismos. Se puede usar una mezcla de dos o más azucares de disacáridos y/o trisacáridos. Por ejemplo, se puede usar una mezcla de uno o más de los azucares anteriores. Una mezcla de sacarosa : rafinosa es particularmente útil, especialmente a una relación de 3:1 peso :peso. La mezcla de precipitación también puede incluir una o más sales. La sal es además cualquier sal que se pueda usar de acuerdo con la invención como un agente quelante. Por lo tanto, la sal referida es en general una sal no quelante. Por ejemplo, la sal no es típicamente un malato o succinato. La sal también es además cualquier sal fisiológicamente aceptable que se pueda usar de acuerdo con la invención como un agente de condensación de ácido nucleico . En una modalidad preferida, la(s) sal (es) se seleccionan de cloruro, acetatos, citratos, nitratos, fosfatos y sulfatos. Las sales adecuadas incluyen de manera enunciativa y sin limitación acetato de potasio, cloruro de calcio, cloruro de litio, acetato de sodio, nitrato de magnesio, citrato de amonio, fosfato de sodio, cloruro de sodio, sulfato de sodio y sulfato de potasio. Típicamente, la sal no es fosfato de aluminio. De manera preferente, la sal es acetato de potasio. El azúcar y/o sal pueden estar presentes en cualquiera o ambos de las preparaciones iniciales que se van a mezclar, por ejemplo, una preparación de agente de condensación o una preparación de película portadora/ácido nucleico . En una modalidad, una solución que comprende cantidades predeterminadas de agente de condensación de ácido nucleico, azúcar y agente quelante de ion metálico se adiciona gota a gota a una solución que comprende cantidades predeterminadas de partículas portadoras de metales, ácido nucleico, azúcar y agente quelante de ion metálico. La sal puede estar presente en cualquiera o ambas soluciones. Las concentraciones de los componentes en el paso (i) se pueden variar sin afectar de manera sustancial la estabilidad del ácido nucleico en las partículas resultantes. Las partículas portadoras de metales pueden estar presentes en cualquier cantidad adecuada, por ejemplo, en una suspensión de 0.1 a 100 mg/ml tal como de 0.1 a 10 mg/ml o de 1 a 10 mg/ml. De manera preferente, la concentración de ácido nucleico es de 0.01 a 10 mg/ml, tal como de 0.1 a 1 mg/ml. Típicamente, el agente de condensación está una concentración de 0.1 a 10 mg/ml, de manera preferente, de 0.1 a 1 mg/ml. De manera preferente, la concentración del agente quelante de ion metálico es de 0.1 mM a 1 M, tal como de 1 mM a 0.1 , por ejemplo de 10 a 50 mM. El azúcar, si está presente puede estar por ejemplo a una concentración de 0.1 mg/ml a 1 g/ml, de manera preferente de 1 mg/ml a 0.1 g/ml, por ejemplo de 10 a 50 mg/ml. La sal, si está presente, está típicamente a una concentración de 0.1 mM a 1 M por ejemplo de 1 mM a 0.1 M, tal como de 10 a 50 mM. El proceso de la invención puede comprender adicionalmente poner en contacto las partículas de ácido nucleico con un antioxidante. En general, este tratamiento comprende lavar las partículas con una solución del antioxidante. Por ejemplo, se puede usar etanol. De manera preferente, el etanol está saturado con sacarosa. Otros antioxidantes adecuados incluyen vitamina A, vitamina C y vitamina E. Adicionalmente , o de manera alternativa, las partículas de ácido nucleico se pueden lavar una o más veces con una solución acuosa o alcohólica tal como agua o isopropanol . Las partículas revestidas, opcionalmente lavadas se pueden transferir a membranas adecuadas y permitir secar antes del uso, revestir en superficies de un módulo o cartucho de muestra, o cargar en un cartucho de distribución para el uso en instrumentos particulares de distribución mediada por partículas. Se puede usar cualquier método adecuado de secado. De manera preferente, el secado se lleva a cabo bajo una corriente de nitrógeno. Las partículas de la invención se pueden empacar en dosis unitarias individuales o recipientes de múltiples dosis. Estos recipientes pueden comprender un recipiente herméticamente sellado que encierra una cantidad adecuada de las partículas. Las partículas se pueden empacar como una formulación estéril, y el recipiente herméticamente sellado de esta manera se puede diseñar para conservar la esterilidad de la formulación hasta el uso en la distribución a un sujeto. Los recipientes se adaptan de manera preferente para el uso directo en un dispositivo de distribución mediada por partículas. Típicamente, estos recipientes toman la forma de cápsulas, bolsitas de pliegues, sobrecitos, cartuchos y similares. Los dispositivos de distribución de partículas también se pueden proporcionar en una condición pre-cargada que contiene una dosis adecuada de las partículas revestidas. El dispositivo pre-cargado entonces también se puede pre-empacar en un recipiente herméticamente sellado. El recipiente en el cual se empacan las partículas se puede etiquetar adicionalmente para identificar la composición y proporcionar información pertinente de la dosis. Además, el recipiente se puede marcar con un aviso en la forma prescrita por una agencia gubernamental, por ejemplo, por la Administración Norteamericana de Fármacos y Alimentos, en donde el aviso indica la aprobación por la agencia bajo la Ley Federal de la fabricación, uso o renta de la preparación de ácido nucleico contenida en el mismo para la administración en humanos. Se conocen en la técnica los dispositivos de aceleración de partículas, adecuados para la distribución mediada por partículas. Los dispositivos actuales de pistolas génicas emplean una descarga explosiva, eléctrica o gaseosa para impulsar partículas portadoras revestidas hacia las células objetivo. Las partículas portadoras revestidas se pueden unir de forma liberable a una hoja portadora móvil, o se unen de forma removible a una superficie a lo largo de la cual pasa una corriente de gas, dejando las partículas en la superficie y acelerándolas hacia el objetivo. Un ejemplo de un dispositivo de descarga gaseosa se describe en la patente de los Estados Unidos No. 5,204,253. En la patente de los Estados Unidos No. 4,945,050 se describe un dispositivo del tipo explosivo. En la patente de los Estados Unidos No. 5,120,657 se describe un ejemplo de un aparato de descarga eléctrica adecuado para el uso en la presente. En la patente de los Estados Unidos No. 5,149,655 se describe otro aparato de descarga eléctrica. La descripción de todas estas patentes se incorpora en la presente como referencia en sus totalidades. Las presentes partículas revestidas también se pueden administrar usando un dispositivo de jeringa sin aguja, tal como aquellos descritos en la patente de los Estados Unidos No. 5,630,796 de Bellhouse et al (el dispositivo de jeringa sin aguja PowderJectMR" ) y las publicaciones internacionales Nos. WO 94/24263, WO 96/04947, WO 96/12513 y WO 96/20022, todas las cuales se incorporan en la presente como referencia. Los dispositivos tal como aquellos descritos en la patente de los Estados Unidos No. 5,630,796 se pueden proporcionar como un instrumento en forma de bolígrafo que tiene, en orden lineal que se mueve de arriba hacia abajo, un cilindro de gas, un cartucho o empaque de partículas, y una boquilla supersónica con un medio silenciador asociado. Las partículas se proporcionan dentro de un recipiente adecuado, por ejemplo, un cartucho formado por dos membranas poliméricas rompibles que se sella térmicamente a un separador en forma de arandela para formar una unidad sellada auto-contenida. Los materiales de membrana se pueden seleccionar para lograr un modo específico de abertura y presión de ráfaga que dicta las condiciones a las cuales se inicia el flujo supersónico. En la operación, el dispositivo se acciona para liberar el gas contenido del cilindro en una cámara de expansión dentro del dispositivo. El gas liberado hace contacto con el cartucho de partículas y cuando se acumula suficiente presión, abre súbitamente las membranas del cartucho abriendo las partículas en la boquilla supersónica para la distribución subsiguiente. La boquilla se diseña para lograr una velocidad específica de gas y un patrón específico de flujo para distribuir una cantidad de partículas a una superficie objetivo de área predefinida. El silenciador se usa para atenuar el ruido producido por el flujo de gas supersónico. El sistema de distribución descrito en la publicación internacional No. WO 96/20022 también usa la energía de una fuente de gas comprimido para acelerar y distribuir composiciones en polvo. Sin embargo, se distingue del sistema de la patente de los Estados Unidos No. 5,630,796 en su uso de una onda de choque en lugar de flujo de gas para acelerar las partículas. De manera más particular, un aumento instantáneo de presión proporcionado por una onda de choque generada detrás de un domo flexible golpea la parte posterior del domo, provocando la eversión del domo flexible en la dirección de una superficie objetivo. Esta eversión súbita catapulta una composición en polvo (que se localiza en el exterior del domo) a una velocidad suficiente, impulsando de esta manera, para penetrar el tejido objetivo, por ejemplo, tejido mucoso oral. La composición en polvo se libera en el punto de máxima eversión del domo. El domo también sirve para contener completamente el flujo de gas de alta presión que por lo tanto no entra en contacto con el tejido. Debido a que el gas no se libera durante esta operación de distribución, el sistema es inherentemente tranquilo. Este diseño se puede usar en otras aplicaciones cerradas o sensibles de otro modo por ejemplo para distribuir partículas a sitios quirúrgicos mínimamente invasores . Las presentes partículas revestidas se pueden distribuir in vivo directamente a un sujeto, o ex vivo a células tomadas de un sujeto, las células transformadas entonces se vuelven a implantar en el sujeto. Para la distribución in vivo, la inyección de partículas es típicamente de forma subcutánea, epidérmica, intradérmica, intramucosal (por ejemplo, de forma nasal, rectal y/o vaginal), de manera intraperitoneal , intravenosa, oral o intramuscular. De manera preferente, la distribución es a células terminalmente diferenciadas; sin embargo, las partículas también se pueden distribuir a células no diferenciadas o parcialmente diferenciadas tal como células madre de sangre y fibroblastos de piel. De manera preferente, la distribución es a células de la epidermis de la piel. Las partículas revestidas se administran a un sujeto de una manera compatible con la formulación de dosis y en una cantidad que será profiláctica y/o terapéuticamente efectiva. Un a "cantidad terapéuticamente efectiva" de las presentes composiciones en forma de partículas será suficiente para dar el tratamiento de prevención de la enfermedad o síntomas de la condición, y cae en un intervalo relativamente amplio que se puede determinar por ensayos de rutina. En general, las partículas se administran en una cantidad desde 0.01 a 1000 ¿g , de manera más preferente desde 0.01 a 10.0 µg de ácido nucleico por dosis. Sin embargo, la cantidad exacta necesaria variará dependiendo de la edad y la condición general del individuo que se trate y la secuencia particular de nucleótidos seleccionada, así como de otros factores. Una cantidad efectiva apropiada se puede determinar de forma fácil a través del ensayo clínico. El "Physicians Desk eference" y "Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics" son útiles para el propósito de determinar la cantidad necesaria .
C. Parte Experimental A continuación están ejemplos de modalidades específicas para llevar a cabo los métodos de la presente invención. Los ejemplos se ofrecen para propósitos únicamente ilustrativos, y no se propone que limiten el alcance de la presente invención de ningún modo. Se han hecho esfuerzos para asegurar la exactitud con respecto a los números usados (por ejemplo, cantidades, temperaturas, etc.) pero por supuesto se permitirá algún error y desviación experimental.
Ejemplo 1 Se llevaron a cabo una serie de experimentos para evaluar los efectos de varios azucares, agentes quelantes y otros excipientes/aditivos en tres formulaciones de ADN/partículas de oro: "DSEP" (Experimento A) , "poli Arg" (experimento B} y "espermidina modificada" (experimento C) . Se evaluaron las varias partículas de acuerdo a uno o más de los siguientes criterios: (i) se midió el rendimiento de ADN en partículas por elución y por espectrofotometría en A260, o fluorometría ,- (ii) se evaluó la estabilidad física de ADN en partículas por análisis en gel o por HPLC; (iii) se evaluó la aglomeración de las partículas por microscopía de luz o por actuación en un gel; (iv) se evaluó la actividad de expresión de ADN en partículas al medir la expresión de un gen indicador de luciferasa en células CHO después de la introducción de las partículas que tienen este gen en las células ; (v) se evaluó la inmunopotencia de las partículas al medir los títulos de anticuerpos en sueros de ratones, los ratones que se han vacunado con partículas que tienen ADN que codifica para un antígeno al cual se une de forma específica al anticuerpo. Para cada formulación, las partículas se ordenaron en orden por los criterios anteriores.
Experimento A: Formulación de DSEP Se prepararon partículas de acuerdo a la siguiente fórmula : Partícula de oro-ADN-Azúcar- Sal -Otro Los azucares probados se seleccionaron de monolaurato de sacarosa, manitol, trehalosa, lactosa, rafinosa y monocaprato de sacarosa. Las sales probadas se seleccionaron de acetato de potasio, cloruro de calcio, cloruro de litio, acetato de sodio, nitrato de magnesio, citrato de sodio, fosfato de sodio, fosfato de aluminio, cloruro de sodio, sulfato de sodio y cloruro de magnesio. Se usaron como se expone posteriormente, varias combinaciones de los azucares y sales. El efecto de un lavado con etanol saturado con sacarosa también se evaluó. Los resultados se muestran posteriormente, con los varios azucares o sales ordenados por clasificación para cada criterio desde el más efectivo o deseable al menos efectivo. Por ejemplo, los azucares de la mayor clasificación para producción de ADN dieron por resultado sedimentos de ADN relativamente altos; los azucares de mayor clasificación para aglomeración dieron por resultado niveles relativamente bajos de aglomeración . ( i ) Rendimiento de ADN en partículas Azúcar: Sacarosa-Monolaurato de Sacarosa-trehalosa-Lactosa-Rafinosa>>> onocaparato de Sacarosa (ningún rendimiento) . Sal: Acetato de Potasio-Cloruro de Calcio-Cloruro de Litio-acetato de Potasio-Nitrato de Magnesio>Citrato de Sodio-fosfato de Potasio>>>Fosfato de Aluminio Otros : Un lavado con etanol saturado con sacarosa no removió ADN del polvo de oro. La ausencia de cualquier sal reduce enormemente el rendimiento . (ii) Estabilidad física de ADN en partículas Azúcar : Sacarosa>Trehalosa>Mannitol~Lactosa~ Rafinosa>Monolaurato de Sucrosa>Monocaprato de Sucrosa. Sal : Acetato de Potasio-Acetato de Sodio-Citrato de Sodio-Fosfato de Sodio>Cloruro de Sodio>Sulfato de SodioCloruro de litio. Otro: Un lavado con etanol saturado por sacarosa contribuye a estabilidad. Fosfato de aluminio impide precipitación. (iii) Aglomeración Azúcar: Monocaprato de Sacarosa<rafinosa -Lactosa- onolaurato de Sucrosa<sucrosa-Trehalosa Sal: Acetato de Potasio-Cloruro de Litio-fosfato de sodio-citrato de sodio-cloruro de sodio-sulfato de sodio<cloruro de calcio-cloruro de magnesio<nitrato de magnesio . (iv) Actividad de expresión de ADN en partículas Sacarosa/Acetato de Sodio-Acetato de Potasio/Rafinosa-Sacarosa/Nitrato de Magnesio-Acetato de Postasio/Monolaurato de Sacarosa. (v) Inmunopotencia en Ratón Para fórmulas envejecidas en tiempo real almacenadas a temperatura ambiente: Sacarosa/Acetato de Sodio-espermidina/CaCl2 , partículas de ácido nucleico a 3 meses. Rafinosa/acetato de potasio-Monolaurato de Sacarosa/acetato de potasio~Espermidina/CaCl2 partícula de ácido nucleico a 1 mes.
Experimento B: La Formulación de poli Arg Se prepararon partículas de acuerdo a la siguiente fórmula: Partícula de Oro-ADN-Azúcar-Agente quelante-Péptido Poliarginina . Los azucares probados se seleccionaron de trehalosa, sacarosa y rafinosa. Los agentes quelantes probados se seleccionaron de EDTA, DTPA y desferal (DFO) . Los péptidos de poliarginina probados se seleccionaron de poliarginina de 13000 Mw (Arg) 6 y (Arg)4. Se probaron varias combinaciones de azúcar, agente quelante y poliarginina. Los resultados se muestran a continuación, nuevamente en orden de clasificación desde el componente más deseable al menos deseable o efectivo. (i) Rendimiento de ADN en partículas Azucares probados: Trehalosa, Sacarosa, Resinosa. Queladores: EDTA, DTPA, desferal (DFO) Otros: péptidos de poli-Arg, ya sea 13,000 Mw, (Arg)s, (Arg) 4 Los rendimientos para todas las combinaciones de lo anterior exceden 50% del rendimiento teórico. ( ii ) Estabilidad física de ADN en partículas Azúcar : Sacarosa>Trehalosa>Rafinosa Queladores: EDTA>DTPA>desferal (DFO) Otro: todos los péptidos de poli-Arg dan estabilidades similares. (iii) Aglomeración No hay problema para esta formulación. ( i ) Actividad de expresión de ADN en partículas Trehalosa/EDTA/ (Arg) 4~Trehalosa/DTÁ/ (Arg) 4. Las partículas preparadas usando ADN, partículas de oro y espermidina, mostraron un nivel similar de actividad de expresión a estas formulaciones. (v) Inmunopotencia en ratón Sacarosa/EDTA/ (Arg) 4>Trehalosa/EDTA/ (Arg) 4~ Trehalosa/DTPA/ (Arg) 4~Sacarosa/DTPA/ (Arg) 4 Las partículas preparadas con ADN, CaCl2, partículas de oro y espermidina dieron por resultado inmunopotencia similar a las partículas de Trehalosa/EDTA/ (Arg) 4.
Experimento C: La formulación modificada de espermidina Se prepararon partículas de acuerdo a la siguiente fórmul : Partícula de oro-ADN-Espermidina-Azúcar-Sal -Otro Los azucares probádos se seleccionaron de sacarosa, trehalosa y rafinosa. Las sales probadas se seleccionaron de cloruro de magnesio, nitrato de magnesio, cloruro de calcio, sulfato de sodio, sulfato de potasio y bromuro de sodio. También se probó el efecto de la concentración de espermidina, y el tratamiento de partículas con soluciones particulares de agua/alcohol . Los resultados se muestran a continuación. (i) Rendimiento de ADN en partículas Azucares: Rafinosa>Trehalosa>Sacarosa Sales: MgCl2~MgN03~CaCl2>Sulfato de Sodio-sulfato de potasio-bromuro de sodio. Otro: La concentración de espermidina y el % de alcohol/agua también afectó el rendimiento. (ii) Estabilidad física de ADN en partículas Azúca : Rafinosa>Trrhalosa>Sacarosa Sales: MgCl2>MgN03>CaCl2>Sulfato de Sodio-sulfato de potasio-bromuro de sodio. (iii) Aglomeración No hay problema para esta formulación.
Ejemplo 2: Estudio de estabilidad de varias partículas revestidas con ADN Se prepararon partículas revestidas usando varias relaciones de sulfato de protamina, EDTA, agua y una de trehalosa, sacarosa o lactosa. Se prepararon partículas de acuerdo a diez diferentes relaciones, como se expone en las diez fórmulas en la Tabla 1. La estabilidad de las partículas preparadas de acuerdo con cada una de las relaciones se probó a 4°C y 60 °C y en puntos de 0 , 7 y 14 días .
Método Para cada relación, se prepararon los tubos A y B de acuerdo a la Tabla 1. Los contenidos en los Tubos A y B se sometieron a vórtice a alta velocidad durante 10 segundos, o hasta que cada solución se mezclara bien. En tanto que se somete a vórtice el tubo A a velocidad media, los contenidos de tubo B se adicionaron gota a gota usando una pipeta de 5 mi. Se sometió a vórtice el tubo A durante 15 segundos adicionales, y los contenidos entonces se dejaron reposar durante 5 minutos. El sobrenadante en el tubo A se removió y el sedimento restante se lavó una vez con 1 mi de isopropanol al 100%. Los contenidos del tubo se sometieron a vórtice y se sedimentaron. Se removió el isopropanol y el sedimento se secó a un polvo con corriente de nitrógeno. Se pesaron 3-5 mg de cada una de las preparaciones de partículas en tubos de microcentrífuga de 1.5 mi para la incubación a 4°C a 60 °C. Se probó la estabilidad del ADN en cada una de las preparaciones de partículas en los puntos de tiempo de 0 , 7 y 14 días, por electroforesis en gel de agarosa y HPLC.
Resultados Las preparaciones de partículas mostraron estabilidad similar a todo lo largo de la prueba. Para el trabajo adicional se eligieron partículas separadas de acuerdo a la "relación 4" (Fórmula 4, Tabla 1).
TABLA I DOE Experimental usado para optimizar las concentraciones de azúcar y EDTA para preparación de partículas. Los números a través de la parte superior de la Tabla son la concentración final del azúcar y EDTA en cada tubo. Los números dentro de la tabla están en unidades de µ? adicionados a los tubos de cada componente Azúcar final (mg/ml) 50 50 50 50 150 150 150 150 100 100 100 100 25 25 175 175 100 100 100 100 EDTA Final (mg/ml) 1 1 5 . 3 3 3 3 3 3 0 0 6 6 Número de Fórmula 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 tubo tubo tubo tubo tubo tubo tubo tubo tubo tubo tubo tubo tubo tubo tubo tubo tubo tubo lubo tubo a b a b a b a b a b a b a b a b a b a b oro (24R) (mg) 35 35 35 35 35 35 35 35 35 35 1 0 ADN (mg/ml) 1 70 70 70 70 70 70 70 70 70 70 protaminasulfato 210 210 210 210 210 210 210 210 210 210 (mg/ml) 1 Azúcar (mg/ml) 500 35 35 35 35 105 105 105 105 70 70 70 70 17.5 . 17.5 122.5 122.5 70 70 70 70 1 5 edta (m ) 50 7 7 35 35 7 7 35 35 21 21 21 21 21 21 21 21 0 0 42 42 agua 238 238 210 70 168 28 140 0 189 49 189 49 241.5 101.5 136.5 -3.5 210 70 168 28 Volumen total 350 350 350 350 350 350 350 350 350 350 350 350 350 350 350 350 350 350 350 350 Ejemplo 3: Estudios de estabilidad adicionales basados en partículas preparadas de acuerdo a la "relación 4" (Fórmula 11 Se prepararon partículas como en el Ejemplo 2 y de acuerdo a la relación 4 en la Tabla 1, pero con una escala más grande (350 mg de partículas de oro) , y con ya sea (a) sin disacárido (control) ; o (b) trehalosa; o (c) sacarosa; o (d) lactosa. Las partículas se incubaron a 4°C y 60°C, y la estabilidad del ADN en las partículas se evaluó después de 8 semanas por electroforesis en gel de azarosa.
Ejemplo 4: Desarrollo de formulaciones de tetra-arginina Después de enfrentar una nueva fórmula para verificar que las poliargininas de varias longitudes tengan la capacidad de precipitar el ADN en micropartículas de oro, se estableció en el experimento para investigar qué longitud de arginina usar al estudiar los rendimientos y estabilidades. También se investigó la elección del azúcar y el quelador, que se ha mostrado que mejora la estabilidad en las fórmulas previas. Los resultados mostraron que las poliargininas de 4 y 6 monómeros fueron mejores para la estabilidad que el polímero de un peso molecular de 13000 (aproximadamente 80 monómeros) . Los azucares y quemadores estudiados se desempeñaron comparativamente. La trehalosa y la sacarosa fueron ambos buenos azucares. El EDTA y el DTPA fueron ambos buenos queladores. El tetrámero de arginina se eligió debido a su probable más rápida disociación con ADN así como su probabilidad para formar menos productos de degradación que el 6-raero. Las fórmulas resultantes para el estudio adicional se nombraron TA101.1 (ADN, sacarosa, EDTA), TA101.2 (ADN, sacarosa, DTPA), TA101.3 (ADNA, trehalosa, EDTA), TA101.4 (ADN, trehalosa, DTPA). Estas cuatro formulaciones se sometieron a una estabilidad a largo plazo se estudiaron una contra otra y con un control de Espermidina/CaCl2 (en el cual se usó espermidina y cloruro de calcio para precipitar ADN en micropartículas de oro) a 4, 25 y 40 grados Celsius. Sus estabilidades se muestran en la Tabla 2. Estas fórmulas también se probaron para la actividad biológica en un estudio con ratones y en experimentos de expresión de luciferasa (la luciferasa codificada por ADN) .
Tabla 2 Velocidades en 101 Series de Decaimiento (de la banda SC) Estos experimentos de actividad demostraron que las 101 series fueron todas activas, expresivas y aproximadamente iguales a espermidina/CaCl2. Las estabilidades de las fórmulas TA101 y TA101.3 fueron mejores que TA101.2 y TA101.4. Esto indica que el quemador EDTA fue más estabilizador que el DTPA, pero hay poca diferencia entre trehalosa (3 y 4) y sacarosa (1 y 2) como se formula en estos polvos. Las composiciones de las formulas de las 101 series de fórmulas de tetra-arginina se muestran en la Tabla 3.
Tabla 3: Composiciones de 101 Series Luego, se llevaron a cabo dos experimentos en los cuales se usaron niveles de saturación de trehalosa y EDTA como el ambiente de formulación. Junto con estas detecciones estuvieron múltiples niveles de etano. Estas formulaciones utilizaron la idea que las soluciones casi saturadas pueden precipitar más estabilizadores en el oro. Las formulas se pueden hacer a diferentes niveles de agua y diferentes densidades al variar el por ciento de etanol. Las fórmulas hechas en estos ambientes parecieron más estables que las 101 series de las fórmulas. Entonces se inició el experimento diseñado para afrontar la optimización de los niveles de etanol, EDTA, trehalosa y tetra-arginina . Este experimento se realizó bajo un diseño que varió cuatro componentes (tetra-arginina, EtOH, EDTA, trehalosa) a través de de cinco niveles en intervalos específicos. Se utilizó mezcla de ADN que incluyó 10% de ADN que codifica para luciferasa. Esto permitió el estudio tanto de la estabilidad como de la actividad en un experimento. Las fórmulas óptimas se eligieron al considerar los resultados, así como al modelar los datos a ecuaciones cuadráticas empíricas que predicen los resultados de estabilidad y expresión a través del intervalo completo del experimento. Las fórmulas resultantes para el estudio adicional se nombraron TA201.2, TA201.5, TA 201.11 y TA201.15. Las composiciones de estas cuatro fórmulas se muestran en la Tabla 4. Estas composiciones son las composiciones de los ambientes de formulación, es decir, no de los polvos finales. La Tabla 3 muestra que estas fórmulas utilizan etanol como un alto por ciento del solvente. La diferencia final entre 201.5 y 201.11 es el nivel de trehalosa, pero el nivel de tetra-arginina también es tres veces mayor en 201.5. La única diferencia entre 201.2 y 201.15 es la presencia de EDTA en 201.15. La fórmula TA201.5 es la fórmula óptima de acuerdo al programa de optimización cuando se optimizan de forma simultánea los criterios de expresión y estabilidad. La TA201.11 es la fórmula óptima cuando se optimiza solo la estabilidad. Las otras son para comparación. La TA201.2 fue la fórmula más expresiva y se incluye en los estudios adicionales para establecer una alta barra en los experimentos de actividad. La TA201.15 fue el punto central del experimento y se formuló múltiples veces. Por lo tanto esta fórmula tiene los datos más repetidos de estabilidad y actividad, y sirve como un buen punto fijo para ver si las tendencias se repiten por sí mismas cuando se estudiaron adicionalmente las fórmulas.
Tabla 4: Composiciones de 201 Series Las fórmulas TA201.5, TA201.15 y TA201.11 fueron muy estables. En realidad, no se puede obtener una medición a 25°C de la velocidad y decaimiento después de 6 meses de enve ecimiento. Esta temperatura es la más cercana a la condición real que las fórmulas experimentarán durante el almacenamiento. La estabilidad de TA201.5 se estudió a mayores temperaturas. En comparación a las velocidades relativas de decaimiento a mayores temperaturas lo que indica estabilidad relativa a menores temperaturas. La Tabla 5 muestra estabilidades de las fórmulas de varias temperaturas .
Tabla 5: Estabilidades de TA a varias temperaturas Lote No. Fórmula Temp. k Cdias-1) Vida media(d) 2251-136-sp spm/CaC12 4 0.0052 133.3 2251-136-sp spm/CaC12 25 0.0366 18.9 2251-136-sp spm/CaC12 40 0.2264 3.1 2251-136-2 TA201.2 4 0.0071 97.6 2251-136-2 TA201.2 25 0.0229 30.3 2251-136-2 TA201.2 40 0.2247 3.1 2251-110-15 TA201.15 60 0.0437 15.9 2251-110-11 TA201.11 60 0.0161 43.1 2334-18-11 TA201.11 60 0.0235 29.5 2251-110-5 TA201.5 60 0.0362 19.1 2334-80-n TA201.5 60 0.0275 25.3 2334-80-m TA201.5 60 0.0252 27.6 2251-156-5.1 TA201.5 60 0.0528 16.4 2251-156-5.2 TA201.5 60 0.0625 14.8 2251-156-5.3 TA201.5 60 0.0504 13.9 2334-101-1 TA201.5 60 0.0744 9.3 2334-101-2 TA201.5 60 0.726 9.5 2334-101-3 TA201.5 60 0.0781 8.9 2334-101-4 TA201.5 60 0.0645 10.8 2334-101-5 TA201.5 60 0.0530 13.1 2334-101-6 TA201.5 60 0.0735 9.4 2334-101-7 TA201.5 60 0.0514 13.5 2334-101-8 TA201.5 60 0.0719 9.6 2334-101-9 TA201.5 60 0.0241 28.7 2334-101-10 TA201.5 60 0.0163 42.6 2251-136-5 TA201.5 40 0.0027 253.9 2251-183-5 TA201.5 40 0.0029 236.6 Se evaluó la toxicidad física en la piel de las fórmulas TA201.5 y TA201.11. No se observaron reacciones adversas. Las actividades de las proteínas codificadas por el ADN en una fórmula se estudiaron. Se observó la expresión de luciferasa cuando se usó un ADN que codifica para luciferasa. La Tabla 6 muestra los resultados de estudios en animales en el cual se empleó el ADN que codifica para el antígeno central de hepatitis B (Cag) y el antígeno de superficie de hepatitis B (Sag) .
Tabla 6: Resumen de Estudios en Animales * Estos fueron Espermidina/CaCl2 fresca. También hubo Espermidina/CaCl2 envejecido en 110 y M114.
Estos datos indican claramente que la fórmula TA201.5 fue competitiva con Espermidina/CaCl2 en términos de los ensayos de respuesta ELISPOT y ELISA de anticuerpos en animales transfectados con ND5.5 a una dosis de ADN de 2 µg con un 1 mg de carga de partículas portadoras. La fórmula mostró ser consistentemente mayor o igual al desempeño de Espermidina/CaCl2 con respecto a los datos de ELISPOT (o los criterios de Mann-Whitney) . Se midió la composición final de la fórmula TA201.5. La Tabla 7 muestra los intervalos de la composición total que se han medido de los polvos TA201.5.
Tabla 7: Intervalos y Composiciones Totales Finales de TA201.5 * EDTA se midió en su estado 4 ( - ) , y se reporta como una masa de esta especie (sin sodio, con agua o hidrógeno como se ve en F. . en la botella) . La Tabla 8 muestra los materiales que se usaron para la elaboración de las ormulaciones de tetra-arginina .
Tabla 8: Materiales El siguiente procedimiento se usó para formular TA201.5 a una escala de 35 mg de polvo de oro.
Equipo Balanza Aparato de vórtices Aparato de tratamiento con sonido Centrífuga Tubos Eppendorf de 2 mi Pipeta de 1 mi, 200 µ? Corriente de aire.
Preparación de Reactivos 11.3 mg/ml de tetra-arginina (lote 523352): Pesar 0 a 1.0 mg de tetra-arginina. Adicionar 88.5 µ? de H20 por pesado. Esto cambiará para lotes de diferente contenido.
Solución de Trehalosa: Pesar al menos 30 mg de trehalosa (proveedor mostrado en lista de materiales) . Adicionar 120 µ? de ¾0 por 30 mg pesado, o cuatro veces la cantidad del agua que trehalosa (en masa o µ?, puesto que 1 mg/µ?) . Na2EDTA 500 mM : Esto se puede ordenar de Sigma en solución (ver lista de materiales para un número de catalogo) .
Procedimiento Tubo B: Tener el tubo B listo antes de que se adicione etanol y ADN al tubo A. Adicionar la solución de quemador, solución de azúcar, EtOH y solución de tetra-arginina. Someter a vórtice 10 segundos a máximo. Tubo A: Pesar el oro en el tubo. Adicionar la solución de quelador y solución de azúcar. Tratar con sonido 30 segundos, someter a vórtice 1 minuto a máximo. Adicionar el EtOH gota a gota en tanto que está en vórtice. Adicionar la solución de ADN. Después de que se adiciona el ADN, adicionar el tubo B al tubo A como se describe posteriormente. Pasos de Formulación: En tanto que se está sometiendo a vértice el tubo A a media velocidad (asegurándose que el oro se mezcle bien completamente en la solución) adicionar gota a gota los contenidos del tubo B. Después de que se ha adicionado todo el tubo B al tubo A, someter a vórtice el tubo A, que contiene la formulación final de tetra-arginina a máximo durante 1 minuto. Permitir que la formulación se asiente durante 5 minutos. Someter a vórtice. Luego centrifugar durante 10 segundos. Pipetear el sobrenadante y salvarlo para el análisis. Lavar el sedimento con 250 µ? de alcohol etílico. Someter a vórtice durante 30 segundos, tratar con sonido (sornical) durante 3 segundos. Centrifugar el sedimento durante 10 segundos y extraer el alcohol etílico. Lavar el sedimento nuevamente con 250 µ? en alcohol etílico. Someter a vórtice durante 30 segundos, tratar con sonido durante 3 segundos. Centrifugar el sedimento durante 10 segundos y extraer el alcohol etílico. Secar el polvo, usando una corriente de aire a una velocidad de flujo de 0.5 L/min, durante 2 horas.
Tubo A Tubo B Polvo de oro, 35 mg EDTA, 26.25 µ? EDTA, 26.25 µ? Trehalosa, 70 µ? Trehalosa, 70 µ? Tratar con sonido 30 Tetra-arginina, 70 segundos, con vórtice EtOH , 183.75 µ? minuto Vórtice, 10 segundo EtoH, 183.75 µ? en vó gota a gota ADN, 70 µ? Tubo A y Tubo B - Adicionar el tubo B al tubo A gota a gota en tanto que está en vórtice - Someter a vórtice durante 1 minuto - Permitir asentar durante 5 minutos - Centrifugar 10 segundos y remover el sobrenadante - Lavar con alcohol etílico, 250 µ? , someter a vórtice 30 segundos, tratar con sonido 3 segundos, centrifugar 10 segundos , remover - Lavar con alcohol etílico, 250 µ?, someter a vórtice 30 segundos, tratar con sonido 3 segundos, centrifugar 10 segundos, remover - Secar bajo aire o nitrógeno durante 2 horas. A todo lo largo del desarrollo de la fórmula TA201.5, el procedimiento de formulación ha sido el primero en hacer soluciones concentradas individuales de cada componente, luego adicionarlas a los tubos de formulación en un cierto orden. Sin embargo, la elaboración en un cuarto despejado de la fórmula requerirá un paso de filtración estéril. Se inició un experimento de "mezclado principal" para afrontar esta necesidad (NB2334-80) . Esta estrategia utilizó mezclas principales de todos los componentes acuosos en el tubo A (principal A) y en el tubo B (principal B) . Las mezclas entonces se filtraron con jeringa para esterilización, y el material filtrado se dejó en los tubos de formulación. El experimento de mezclado principal comparó polvos hechos por el procedimiento de mezclado principal del procedimiento principal a cada una en términos de estabilidad y composición total Tabla 9: Composiciones Finales en Experimento de Mezcla Principal Tabla 10: Estabilidades de Principal vs. Normal - Vidas medias en Tabla 10 se calcularon al promediar dos cálculos de vidas medias. Una se derivó de la velocidad ng SC de decaimiento (60 con relación a 4) , y la otra se derivó del % de velocidad de SC de decaimiento (60 con relación a 4) . Puesto que los dos procedimientos produjeron el mismo producto final, se puede considerar que la estrategia de mezclado principal no es problemática; y se puede usar para la formulación en polvo de los subsiguientes polvos de TA201.5. Un experimento adicional de proceso se realizó a fin de decidir qué pasos de proceso fueron críticos. Parte Experimental: Las fórmulas 1-9 se elaboraron en una balanza de 70 mg de las mismas soluciones concentradas. Se hizo una mezcla principal para el tubo A al mezclar EDTA, trehalosa y soluciones de ADN en relaciones de formulación y luego se filtró en jeringa. La mezcla principal para el tubo B se logró al mezclar soluciones de EDTA, trehalosa y tetra-arginina en relaciones de formulación, luego se filtró en jeringa. La fórmula 1 entonces se hizo por el siguiente proceso: Preparación de Reactivos (por 10, 70 mg prep) ADN: Soluciones concentradas de plásmido y ADN que codifica para luciferasa se proporcionaron a 1 mg/ml .
Mezclar las dos soluciones de ADN a una relación de volumen de luciferasa 9SC18:1. 1500 µ? de SC18 + 166.7 µ? de ADN de luciferasa. 11.3 mg/ml de tetra-arginina: Pesar aproximadamente 20 mg de tetra-arginina. Adicionar 8.5 µ? de H20 por mg pesado. Solución de Trehalosa: Pesar al menos 700 mg de trehalosa. Adicionar 140 µ? de ?20 por 35 mg pesado, o cuatro veces la cantidad de agua de trehalosa (en masa o µ?, puesto que 1 mg/µ?) . EDTA 500 Mm: Esto se puede ordenar de Sigma en solución (Catálogo E-7889) . Relaciones de Volumen de Principal A: 1500 µ? de trehalosa, 562.5 µ? de EDTA, 1500 µ? de ADN (1 mg/ml) Solución principal A de filtro en jeringa Relaciones de Volumen de Solución Principal B: 1500 µ? de trehalosa, 562.5 µ? de EDTA, 1500 µ? de tetra-arginina . Solución Principal B de Filro de Jeringa Tubo A Tubo B 70 mg de oro 332.5 µ? de mezcla principal A 332.5 µ? de mezcla principal B 367.5 µ? de EtOH gota a gota en 367.5 µ? de EtOH tanto que está en vórtice Tratar con sonido 30 segundos, Vórtice 10 segundos con vórtice 10 segundos Tubo A y Tubo B Adicionar tubo A a tubo A gota a gota en tanto que está en vórtice. Después de que se ha adicionado el tubo B, someter a vórtice durante 1 minuto a máximo. Permitir asentar durante 5 minutos Someter a vórtice durante 5 segundos, luego centrifugar durante 10 segundos, *remover el sobrenadante Lavar con EtOH , 500 µ?, someter a vórtice 30 segundos, someter a sonido 3 segundos, centrifugar 10 segundos, *remover . Repetir el último paso una vez. Secar el sedimento bajo aire durante 1 hora a 0.5 L/min. Este proceso es la formulación de control. La siguiente tabla muestra las variaciones de proceso de los polvos 2-9.
Paso variante Fórmula Variación Control 2 Todo de B a A en una jeringa B a A gota a gota/ Adición de B a A 3 B a A gota a gota pausa 5 seg continuo entre gotas 4 3 minutos vórtice a máximo Vórtice después 1 minuto vórtice de B a A 5 No vórtice, permitir asentar después de a máximo todo B adicionado a A 6 10 minutos asentamiento Tiempo de asentamiento 7 No asentamiento, centrifugar después 5 minutos asentar 1 minuto de vórtice 8 4 Lavados Número de Lavados 9 2 lavados No lavados, secar despupes de remoción de sobrenadante La formulación restante fue una fórmula en la cual se cambió el orden de adición para evaluar la posibilidad de una mezcla principal para esta formulación. El proceso fue similar al control. Relación de Volumen de Mezcla Principal: 400 µ? de trehalosa, 150 µ? de EDTA, y 200 µ? de tetra-arginina . Mezcla Principal de Filtro de Jeringa. Fórmula 10 70 mg de oro 525 µ? de mezcla principal 735 µ? de EtOH gota a gota en tanto que está en vórtice . Tratamiento con sonido 30 segundos, vórtice 10 segundos 140 µ? de ADN gota a gota/lentamente (pausa 5 segundos antes de gota) en tanto que se está en vórtice. Después de que se adiciona el tubo B, someter a vórtice durante 1 minuto a máximo. Permitir asentar durante 5 minutos Someter a vórtice durante 5 segundos, luego centrifugar durante 10 segundos, *remover el sobrenadante. Lavar con EtOH, 500 µ?, someter a vórtice 30 segundos, tratar con sonido 3 segundos, centrifugar 10 segundos , *remover . Repetir el último paso 1 vez.
Secar el sedimento bajo aire durante 1 hora a 0.5 L/min . *Las remociones del líquido del sedimento después de la centrifugación se hicieron con una pipeta de 1000 µ? para remover la mayoría de líquido, seguido por una pipeta de 200 µ? para remover el resto del líquido. Tampoco como sea posible se dejó en el polvo. Todos los polvos se analizaron en términos de las composiciones totales, estabilidad, expresión de luciferasa en células de CHO y disparos en gel.
Tabla 1 1 : Composiciones de Experimento de Fuerza de Proceso Polvo (Arg)4 0ig/mg) Trehalosa ^g/mg) EDTA Oig/mg) . 2334-101-1 0.36 1.56 0.48 2334-101-2 0.32 1.58 0.47 2334-101-3 0.36 1.72 0.46 2334-101-4 0.29 1.64 0.39 2334-101-5 0.22 1.72 0.41 2334-101-6 0.26 1.54 0.41 2334-101-7 0.26 2.13 0.40 2334-101-8 0.26 1.15 0.19 2334-101-9 0.23 4.77 0.99 2334-101-10 0.21 2.25 0.40 Tabla 12: Estabilidades a 60°C de Experimento de Fuerza de Proceso * Los números anteriores se calcularon por cambios en nano-gramos del ADN súper-enrollado de la fecha de formulación a 13 y 20 días. Las velocidades de vidas medias estuvieron muy cercanas entre sí. Esto indica que el proceso de formulación es fuerte en términos .de estabilidad. Las fórmulas 5 y 7 tuvieron ligeramente mejores estabilidades que las otras, pero las fórmulas 9 y 10 tuvieron una distinta ventaja de estabilidad (3X) . La fórmula 9 no se lavó (y no fue factible el proceso) y la fórmula 10 se logró por un cambio en el orden de las adiciones. Los datos de expresión indicaron que las fórmulas fueron muy similares (300-400K cuentas/segundo) . La fórmula fresca de Espermidina/CaCl2 fue más expresiva (o tuvo más material expresado en el momento en que reanalizaron las celdas) pero también midió más en la masa de liberación. Las fórmulas 10 y 7 tuvieron alguna ventaja en la expresión de luciferasa (450-600K cuentas/segundos) con respecto a las otras fórmulas de tetra-arginina . En total, el experimento provó que el proceso es muy fuerte. Otro aspecto de la fortaleza es el efecto de alterar los órdenes de adiciones y los procesos usados para elaborar una fórmula. En este experimento (NB2251-124) se investigaron diferentes maneras para elaborar una forma con los mismos materiales exactos (cantidades y concentraciones) . Este experimento solo buscó en estabilidades de las fórmulas diseñadas para precipitar componentes en diferentes órdenes. Esto puede tener posiblemente efectos mayores puesto que el ADN se puede precipitar directamente al oro antes, simultáneamente o después de los estabilizadores.
Procesos de Formulación: 1. Planteamiento de tubos A y B. Los tubos A y B tienen la misma composición, excepto A tiene ADN y B tiene tetra-arginina. Ambos estuvieron bien mezclados y luego B se adicionó gota a gota a A. 2. Otro planteamiento de tubos A y B. Esta vez, en el tubo A (con oro) , se adicionó etanol antes de la solución de ADN a fin de pre-revestir el oro con una cantidad en exceso de azúcar antes de la adición de ADN. Entonces, se adicionó ADN al tubo A y el tubo B entonces se adicionó inmediatamente al tubo A. 3. Este procedimiento se diseñó para precipitar simultáneamente ADN y estabilizadores. Todos los componentes se adicionaron a un tubo excepto ADN y etanol. Entonces, ADN y el etanol se mezclaron conjuntamente y se adicionaron. 4. Este proceso precipitó ADN antes de la adición de etanol . Todos los componentes se adicionaron a un tubo excepto ADN, tetra-arginina y etanol . El orden de adición de estos últimos componentes fue ADN, tetra-arginina y etanol, respectivamente. 5. Este proceso fue el mismo como el 4 excepto que tetra-arginina se adicionó antes de ADN. Aún estaba el etanol . Estas formulaciones se colocaron en incubadores de 4 y 60 grados y se analizaron 2 semanas después de la formulación. No hubo diferencias ordinarias entre estos polvos por electroforesis en gel de azarosa, aunque los polvos 4 y 5 (etanol final, formación de complejo ADN:ARG4 antes de etanol) fue ligeramente más estable. Por consiguiente, se han descrito las nuevas partículas revestidas con ácido nucleico adecuadas para la distribución desde un dispositivo de distribución mediada por partículas, un proceso para preparar las partículas y métodos de terapia génica e inmunización con ácido nucleico usando las partículas. Aunque se han descrito en algún detalle las modalidades preferidas de la presente invención, se entiende que se pueden hacer variaciones obvias sin apartarse del espíritu y alcance de la invención como se define en las reivindicaciones anexas. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la presente invención, es el que resulta claro a partir de la presente descripción de la invención.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Partículas adecuadas para la distribución desde un dispositivo de distribución mediada por partículas, las partículas están caracterizadas porque se pueden obtener al precipitar un ácido nucleico en partículas portadoras de metales inertes, en la presencia de un agente de condensación de ácido nucleico y un agente quelante de ión metálico . 2. Partículas de conformidad con la reivindicación 1, caracterizadas porque las partículas portadoras de metales inertes se seleccionan del grupo que consiste de partículas de oro, tungsteno, platino e iridio. 3. Partículas de conformidad con la reivindicación 2, caracterizadas porque las partículas portadoras de metales inertes son partículas de oro que tienen un diámetro de aproximadamente 1 a 3 µt?. 4. Partículas de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizadas porque el ácido nucleico codifica para un antígeno. 5. Partículas de conformidad con la reivindicación 4, caracterizadas porque el antígeno se selecciona del grupo que consiste de antígenos virales, antígenos bacterianos y antígenos fúngales. 6. Partículas de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizadas porque el ácido nucleico codifica para un polipéptido terapéutico. 7. Partículas de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizadas porque el ácido nucleico es ADN. 8. Partículas de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizadas porque el agente de condensación de ácido nucleico es un polímero catiónico. 9. Partículas de conformidad con la reivindicación 8, caracterizadas porque el agente de condensación de ácido nucleico es una poliamina. 10. Partículas de conformidad con la reivindicación 9, caracterizadas porque la poliamina se selecciona del grupo que consiste de protaminas, espermidina, espermina, putrescina, y sales fisiológicamente aceptables de las mismas. 11. Partículas de conformidad con la reivindicación 9, caracterizadas porque la poliamina es una poliarginina o una polilisina. 12. Partículas de conformidad con la reivindicación 11, caracterizadas porque la poliarginina es (Arg)4 o (Arg)6. 13. Partículas de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizadas porque el agente quelante de ión metálico se selecciona del grupo que consiste de ácido etilendiamina tetraacético (EDTA) , ácido dietilentriamina-pentaacético (DTPA) , ácido nitrilo triacético (NTA) , hexafosfato de inositol, tripolifosfafo, ácido poli osfórico, succinato sódico, succinato potásico, succinato de litio, malato de sodio, malato de potasio, malato de litio, desferal y ácido etilendiamina-di (o-hidroxi-fenilacético) (EDDHA) . 14. Partículas de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizadas porque la precipitación se lleva a cabo en la presencia de uno o más azúcares de disacáridos y/o trisacáridos. 15. Partículas de conformidad con la reivindicación 14, caracterizadas porque el (los) azúcar (es) se seleccionan del grupo que consiste de trehalosa,' sacarosa, lactosa y rafinosa. 16. Partículas de conformidad con la reivindicación 15, caracterizadas porque el (los) azúcar (es) son una mezcla de sacarosa y rafinosa. 17. Partículas de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizadas porque la precipitación se lleva a cabo en la presencia de una o más sales . 18. Partículas de conformidad con la reivindicación 17, caracterizadas porque la(s) sal (es) se seleccionan del grupo que consiste de acetato de potasio, cloruro de calcio, cloruro de litio, acetato de sodio, nitrato de magnesio, citrato de sodio, fosfato de sodio y cloruro de magnesio. 19. Partículas de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizadas porque las partículas resultantes se ponen en contacto con un antioxidante. 20. Partículas de conformidad con la reivindicación 19, caracterizadas porque el antioxidante se selecciona del grupo que consiste de etanol, vitamina A, vitamina C y vitamina E. 21. Partículas de conformidad con la reivindicación 1, caracterizadas porque se han obtenido al precipitar ADN en partículas portadoras de oro en la presencia de una poliarginina , EDTA y sacarosa. 22. Un receptáculo de dosificación para un dispositivo de distribución mediado por partículas, el receptáculo está caracterizado porque contiene partículas que se pueden obtener al precipitar un ácido nucleico en partículas portadoras de metales inertes en la presencia de un agente de condensación de ácido nucleico y un agente quelante de ión metálico. 23. Un dispositivo de distribución mediado por partículas caracterizado porque está cargado con partículas que se pueden obtener al precipitar un ácido nucleico en partículas portadoras de metales inertes en la presencia de un agente de condensación de ácido nucleico y un agente quelante de ión metálico. 24. Un dispositivo de distribución mediado por partículas de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque es una jeringa sin aguja. 25. Un proceso para la preparación de partículas adecuadas para la distribución de un dispositivo de distribución mediada por partículas, caracterizado porque comprende los pasos de : (i) precipitar un ácido nucleico en partículas portadoras de metales inertes en la presencia de un agente de condensación de ácido nucleico y un agente quelante de ión metálico; y (ii) recolectar las partículas resultantes. 26. Un proceso de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque, en el paso (i) el agente de condensación de ácido nucleico se adiciona a una mezcla que comprende las partículas portadoras de metales inertes y el ácido nucleico. 27. Un proceso de conformidad con la reivindicación 25 o 26, caracterizado porque las partículas portadoras de metales inertes se seleccionan del grupo que consiste de partículas de oro, tungsteno, platino e iridio. 28. Un proceso de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque las partículas portadoras de metales inertes son partículas de oro que tienen un diámetro de aproximadamente 1 a 3 µ??. 29. Un proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 28, caracterizado porque el ácido nucleico codifica para un antígeno. 30. Un proceso de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el antígeno se selecciona del grupo que consiste de antígenos virales, antígenos bacterianos y antígenos fúngales. 31. Un proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 28, caracterizado porque el ácido nucleico codifica para un polipeptido terapéutico. 32. Un proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 31, caracterizado porque el ácido nucleico es ADN. 33. Un proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 32, caracterizado porque el agente de condensación de ácido nucleico es un polímero catiónico. 34. Un proceso de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el agente de condensación de ácido nucleico es una poliamina. 35. Un proceso de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque la poliamina se selecciona del grupo que consiste de protaminas, espermidina, espermina, putrescina, y sales fisiológicamente aceptables de las mismas. 35. Un proceso de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque la poliamina es una poliarginina o una polilisina. 37. Un proceso de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque la poliarginina es (Arg)4 o (Arg)6. 38. Un proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 37, caracterizado porque el agente quelante de ion metálico se selecciona del grupo que consiste de ácido etilendiamina tetraacético (EDTA) , ácido dietilentriamina-pentaacetico (DTPA) , ácido nitrilo triacético (NTA) , hexafosfato de inositol, tripolifosfafo, ácido polifosfórico, succinato sódico, succinato potásico, succinato de litio, malato de sodio, malato de potasio, malato de litio, desferal y ácido etilendiamina-di (o-hidroxi-fenilacético) (EDDHA) . 39. Un proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 38, caracterizado porque el paso (i) se lleva a cabo adicionalmente en la presencia de uno o más azúcares de disacáridos y/o trisacáridos . 40. Un proceso de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque el (los) azúcar (es) se seleccionan del grupo que consiste de trehalosa, sacarosa, lactosa y rafinosa. 41. Un proceso de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque el (los) azúcar (es) es una mezcla de sacarosa o rafinosa. 42. Un proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 41, caracterizado porque el paso (i) se lleva a cabo adicionalmente en la presencia de una o más sales. 43. Un proceso de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque la(s) sal (es) se seleccionan se selecciona del grupo que consiste de acetato de potasio, cloruro de calcio, cloruro de litio, acetato de sodio, nitrato de magnesio, citrato de sodio, fosfato de sodio y cloruro de magnesio. 44. Un proceso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25 a 43, caracterizado porque las partículas resultantes del paso (i) se ponen en contacto con un antioxidante. 45. Un proceso de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque el antioxidante se selecciona del grupo que consiste de etanol, vitamina A, vitamina C y vitamina E. 46. Un proceso de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque comprende los pasos de: (i) precipitar ADN en partículas inertes de oro en la presencia de una poliarginina, EDTA y sacarosa, y (ii) recolectar las partículas resultantes. 47. Un método de inmunización por ácido nucleico, caracterizado porque comprende: (a) proporcionar partículas adecuadas para la distribución desde un dispositivo de distribución mediada por partículas, partículas que se pueden obtener al precipitar un ácido nucleico que codifica para un antígeno en partículas portadoras de metales inertes en la presencia de un agente de condensación de ácido nucleico y un agente quelante de ión metálico; y (b) administrar una cantidad efectiva de las partículas a un sujeto. 48. Un método de terapia' génica, caracterizado porque comprende : (a) proporcionar partículas adecuadas para la distribución desde un dispositivo de distribución mediada por partículas, partículas que se pueden obtener al precipitar un ácido nucleico que codifica para un polipéptido terapéutico en partículas portadoras de metales inertes en la presencia de un agente de condensación de ácido nucleico y un agente quelante de ión metálico; y (b) administrar una cantidad efectiva de las partículas a un sujeto. 49. Un método de conformidad con la reivindicación 47 o 48, caracterizado porque las partículas portadoras de metales inertes se seleccionan del grupo que consiste de partículas de oro, tungsteno, platino e iridio. 50. Un método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque las partículas portadoras de metales inertes son partículas de oro que tienen un diámetro de aproximadamente 1 a 3 µt?. 51. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 47 o 50, caracterizado porque el ácido nucleico es ADN. 52. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 47 o 51, caracterizado porque el agente de condensación de ácido nucleico es un polímero catiónico. 53. Un método de conformidad con la reivindicación 52, caracterizado porque el agente de condensación de ácido nucleico es una poliamina. 54. Un método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque la poliamina se selecciona del grupo que consiste de protaminas, espermidina, espermina, putrescina, y sales fisiológicamente aceptables de las mismas. 55. Un método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque la poliamina es una poliarginina o una polilisina. 56. Un método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizadas porque la poliarginina es (Arg)4 o (Arg)6- 57. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 47 a 56, caracterizado porque el agente quelante de ión metálico se selecciona del grupo que consiste de ácido etilendiamina tetraacético (EDTA) , ácido dietilentriamina-pentaacético (DTPA) , ácido nitrilo triacético (NTA) , hexafosfato de inositol, tripolifosfafo, ácido polifosfórico, succinato sódico, succinato potásico, succinato de litio, malato de sodio, malato de potasio, malato de litio, desferal y ácido etilendiamina-di (o-hidroxi-fenilacético) (EDDHA) . 58. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 47 a 57, caracterizado porque la precipitación se lleva a cabo en la presencia de uno o más azúcares de disacáridos y/o trisacáridos . 59. Un método de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque el (los) azúcar(es) se selecciona del grupo que consiste de trehalosa, sacarosa, lactosa y rafinosa . 60. Un método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque el (los) azúcar (es) se seleccionan de una mezcla de sacarosa y rafinosa. 61. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 47 a 60, caracterizado porque la precipitación se lleva a cabo en la presencia de una o más sales . 62. Un método de conformidad con la reivindicación 61, caracterizado porque la(s) sal (es) se selecciona del grupo que consiste de acetato de potasio, cloruro de calcio, cloruro de litio, acetato de sodio, nitrato de magnesio, citrato de sodio, fosfato de sodio y cloruro de magnesio. 63. Un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 47 a 62, caracterizado porque las partículas resultantes se ponen en contacto con un antioxidante . 64. Un método de conformidad con la reivindicación 63, caracterizado porque el antioxidante se selecciona del grupo que consiste de etanol, vitamina A, vitamina C y vitamina E. 65. Un método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque comprende los pasos de: (a) proporcionar partículas adecuadas para la distribución desde un dispositivo de distribución mediada por partículas, partículas que se han obtenido al precipitar ADN que codifica para un antígeno en partículas de oro en la presencia de una pol iarginina , EDTA y sacarosa, y (b) administrar una ¦ cantidad efectiva de las partículas a un sujeto. 66. Un método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque comprende los pasos de: (a) proporcionar partículas adecuadas para la distribución desde un vehículo de distribución mediada por partículas, partículas que se han obtenido al precipitar ADN que codifica para un polipéptido terapéutico en partículas de oro en la presencia de una poliarginina , EDTA y sacarosa, Y (b) administrar una cantidad efectiva de las partículas a un sujeto. 67. Partículas, adecuadas para la distribución desde un dispositivo de distribución mediada por partículas, caracterizadas porque comprenden partículas portadoras de metales inertes que tienen en su superficie un ácido nucleico, un agente quelante de ión metálico o uno o más de: (i) un agente de condensación de ácido nucleico; (ii) uno o más azúcares de disacáridos y/o trisacáridos ; y (iii) una o más sales.
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Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1585974B1 (en) 2003-01-24 2013-02-27 University of Utah Methods of predicting mortality risk by determining telomere length
JP4793956B2 (ja) * 2005-12-29 2011-10-12 ニチコン株式会社 アルミニウム電解コンデンサの駆動用電解液、およびこれを用いたアルミニウム電解コンデンサ
US9689028B2 (en) 2008-12-22 2017-06-27 University Of Utah Foundation Monochrome multiplex quantitative PCR
GB0918679D0 (en) 2009-10-23 2009-12-09 Iqur Ltd Influenza vaccine
GB0918782D0 (en) 2009-10-26 2009-12-09 St Georges Hosp Medical School A protein as an adjuvant for a vaccine
CA2914555A1 (en) 2013-06-06 2014-12-11 David J Rowlands Single domain antibody display
CN103736090B (zh) * 2014-01-27 2016-03-02 中国医学科学院医学生物学研究所 甲磺酸去铁胺佐剂及含甲磺酸去铁胺佐剂的疫苗
EP3164156A1 (en) * 2014-07-04 2017-05-10 BioNTech AG Stabilised formulations of rna
JP2018501799A (ja) 2014-12-30 2018-01-25 テロメア ダイアグノスティクス インコーポレイテッド マルチプレックス定量的ｐｃｒ
WO2021061192A1 (en) * 2019-09-29 2021-04-01 Wjwu & Lynn Institute For Stem Cell Research Novel trimethylglycylglycerin compositions and their use in developing anti-cancer drugs and rna vaccines

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4945050A (en) * 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US5120657A (en) * 1986-12-05 1992-06-09 Agracetus, Inc. Apparatus for genetic transformation
KR900007952B1 (ko) * 1988-11-18 1990-10-23 주식회사 녹십자 신규의 한탄바이러스 rok84/105 균주 및 이를 이용한 한탄바이러스 백신의 제조방법
US5204253A (en) * 1990-05-29 1993-04-20 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method and apparatus for introducing biological substances into living cells
US5149655A (en) * 1990-06-21 1992-09-22 Agracetus, Inc. Apparatus for genetic transformation
AU650045B2 (en) * 1990-09-12 1994-06-09 Lifecell Corporation Method and apparatus for cryopreparation dry stabilization and rehydration of biological suspensions
WO1992020809A1 (en) * 1991-05-15 1992-11-26 Agracetus, Inc. Method of creating a transformed rice plant
TW360548B (en) * 1993-04-08 1999-06-11 Powderject Res Ltd Products for therapeutic use
GB2284208A (en) * 1993-11-25 1995-05-31 Pna Diagnostics As Nucleic acid analogues with a chelating functionality for metal ions
CN1112943C (zh) * 1994-01-21 2003-07-02 粉剂注射疫苗股份有限公司 气体驱动的基因送递装置
GB9416663D0 (en) 1994-08-17 1994-10-12 Oxford Bioscience Limited Particle delivery
WO1996012513A1 (en) 1994-10-24 1996-05-02 Oxford Biosciences Limited Particle delivery
GB9426379D0 (en) 1994-12-23 1995-03-01 Oxford Biosciences Ltd Particle delivery
FR2730637B1 (fr) * 1995-02-17 1997-03-28 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition pharmaceutique contenant des acides nucleiques, et ses utilisations
EP0906110B1 (en) 1996-04-26 2004-12-22 Merck & Co., Inc. Dna vaccine formulations
IN184589B (es) * 1996-10-16 2000-09-09 Alza Corp
AU4973199A (en) 1998-07-09 2000-02-01 Merck & Co., Inc. Polynucleotide vaccine formulations
IL142980A0 (en) * 1998-11-05 2002-04-21 Powderject Vaccines Inc Nucleic acid constructs for genetic immunization
WO2000072908A1 (en) * 1999-06-02 2000-12-07 Microheart, Inc. Devices and methods for delivering a drug
EP1282640A2 (en) * 2000-05-01 2003-02-12 Powderject Vaccines, Inc. Nucleic acid immunization
AU2001268159B2 (en) * 2000-06-02 2005-09-15 Eisai Inc. Delivery systems for bioactive agents

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