JP5560244B2 - 医薬組成物 - Google Patents
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Description
b)沈殿は、懸濁液中ですでに増加しつつある量の結晶を含む懸濁液中に行われる。このことは、すでに形成された結晶上に新たに形成する結晶が融合する可能性を増すことになる。
c)大規模なバッチを必要とする場合、過剰な剪断力なしに撹拌型バッチ反応器で高効率な攪拌を得ることは困難である。高効率な攪拌には、一般的に、結晶サイズを最小限に抑え、結晶が凝集塊中に接合するのを防ぐことが必要とされる。しかしながら、高剪断力は、タンパク質変性または核酸のニッキングなどの生物活性分子に対する損傷を惹起することがある。極めて小さな液滴を提供するために水性流入物を噴霧することなどの急速混合への代替アプローチも、剪断力および界面変性プロセスに起因する潜在的な問題を有している。
本発明の第1の態様によれば、粒子を形成する連続法であって、
(a)共沈剤分子および生物活性分子を含む水溶液であり、各共沈剤分子は実質的に4kDa未満の分子量を有し、共沈剤および生物活性分子を含み、融点が約90℃を超える共沈物を形成することができる水溶液を提供するステップと、
(b)共沈剤および生物活性分子が溶液から共沈して上記粒子を形成するように、生物活性分子/共沈剤分子の溶液をより大量の実質的に水混和性の有機溶媒と急速に混合するステップと、
(c)必要に応じて、粒子を有機溶媒から単離するステップとを含む方法を提供する。
生物活性分子は、固体、例えば、共沈剤の水溶液中で溶解する粉末として提供することができる。あるいは、生物活性分子は、共沈剤の水溶液と混合する前に溶液または懸濁液中にあってもよい。通常、共沈剤は、実質的に飽和された、または高度に濃縮された溶液として調製することができる。生物活性分子と混合した後、共沈剤は通常、その水飽和溶解度の5〜100%である。飽和溶解度の20〜80%であることが好ましい。
(a)共沈剤分子を含む実質的に非吸湿性の内部結晶コアであり、上記共沈剤分子は4kDa未満の分子量を有する結晶コア、および
(b)1種または複数の生物活性分子を含む外部コーティング
を含み、粒子は上記のコア形成共沈剤分子および上記の1種または複数の生物活性分子を共沈させることによって単一ステップで形成され、粒子は約90℃以上の融点を有する医薬製剤が提供される。
d(0.5)(μm)=粒子の50%は、この粒径より大きく、またそれより小さい
d(0.9)(μm)=粒子の90%は、この粒径より小さい
スパン=d(0.9)−d(0.1)/d(0.5)
粒子は、約80μm未満、好ましくは50μm未満、より好ましくは20μm未満の最大断面寸法を有することができる。最大断面寸法とは、直径の対点間で測定可能な最大距離を意味する。
(注目すべきは、以下の実施例においてコーティングされた粒子をPCMCと見なすが、粒子は、必ずしもタンパク質でコーティングされている必要はなく、任意の生物活性コーティングを有していてもよいことである)
結晶は、Durapore薄膜フィルター(0.4ミクロン)で濾過することによって単離し、次いで、換気フード中で空気乾燥した。
タンパク質装填量は、Bioradタンパク質アッセイを用いて測定した。細粒分画(FPF)の百分率は、多段液体含有インピンジャーを用いて測定した。
レーザー回折粒径分析は、マスターサイザー2000を用い、生物活性分子でコーティングされた粒子に対して行った。つまり、10〜20%のレーザーオブスキュレーション(obscuration)を確保するため、2−プロパノール60mlが入っているマスターサイザー2000の試料ホルダーに十分なPCMCを加えた。次いで、以前に設定した標準操作手順を用い、測定を行った。
d(0.5)(μm)=粒子の50%は、この粒径より大きく、またそれより小さい
d(0.9)(μm)=粒子の90%は、この粒径より小さい
スパン=d(0.9)−d(0.1)/d(0.5)
スパンは、母集団均一性の良い指標を与える。したがって、5以下のスパン値が好ましく、2以下のスパン値が特に好ましい。
乾燥粉末吸入器からの用量放出は、Astra Draco多段液体含有インピンジャー(MSLI)を用いて測定した。用量のうち有用な部分は、細粒分画(FPF)と呼ばれる。一般的に、細粒分画(FPF)は、以下の表6に示されるようにMSLIの低部段で捕集される。表6を用い、重要な各段のカットオフ寸法を決めた。
(a)市販の硫酸サルブタモール製剤(例えば、ベントリン)についての初期研究には、受け入れたままの製剤を使用した。
(b)PCMC製剤については、サイズ3のカプセルを、一般的に10〜20mgの量の乾燥粉末PCMCで満たした。
(c)第1〜4段のクランピングに先立って、MSLIの第5段に濾紙を加える。第1〜4段の各々に水20mlを添加する。第1段の最上部にネック部を接続した後、アダプターピースをネックの末端部に接続する。ディスクへラーの場合はブリスター包装に、あるいはエアロへラー(aerohaler)の場合はサイズ3のカプセルに穴を開けることによって、乾燥粉末吸入器の使用を開始する。続いて、乾燥粉末吸入器をアダプター内に格納し、ポンプのスイッチを4秒間入れ、吸入器からMSLIまで製剤を送る。吸入器内の各ブリスターまたはカプセルについて作動を行った。
どの場合においても、PCMC製剤の用量放出は、エアロへラーを用いてMSLIに送った。
(a)装置をアダプターから取り外してカプセルを取り出してペトリ皿に入れ、水20mlを添加した。
(b)アダプターをMSLIのネックから取り外し、ペトリ皿に入れ、水10mlを添加した。
(c)ネックをMSLIから取り外し、水20mlでペトリ皿に洗い出した。
(d)第1〜4段をフィルターステージから外し、第1段の開口部を水20mlで洗浄した。これを攪拌してすべての粉末を溶かした。
(e)MSLIからフィルターを取り外してペトリ皿に入れ、水10mlを添加した。
(f)各段から分量5mlを取り出し、HPLCによってアッセイし、硫酸サルブタモール濃度を測定した。Bio Radタンパク質微量検定法を用い、PCMCタンパク質濃度を測定した。
(キモトリプシン製剤)
キモトリプシンPCMCは、以下の技法を用いて製造した。
キモトリプシンを飽和アミノ酸溶液に溶かし、濃度10mg/mlの水溶液を得た。この水溶液を、予め適切なアミノ酸(例えば、L−グリシン、L−アラニン、D,L−バリン、DL−セリン、L−ロイシンおよびDL−イソロイシン)で飽和され、水溶液の容量の15倍に相当する容量の2−プロパノール中で沈殿させた。
ポリ乳酸(PLA)でコーティングされたアルブミン/L−グルタミンPCMCを制御放出実験で使用した。
以下の方法を行い、アルブミン/L−グルタミンPCMCをPLAでコーティングした。アルブミン/L−グルタミンPCMCは、アルブミン31mgを50%飽和L−グルタミン溶液6.2mlに溶かして調製した。次いで、L−グルタミンで飽和された2−プロパノール40ml中で水溶液を沈殿させた。粒子は、ミリポア濾過システムを用いて乾燥した。アルブミン/L−グルタミンPCMCを以下の通りコーティングした。
実験B:アルブミン/L−グルタミンPCMC 20mgをアセトン/PLA溶液(50mg/ml)2mlに懸濁し、激しい撹拌下、2−プロパノール20ml中で沈殿させた。得られる製剤は、大きな不溶性ペレットを形成した。
実験C:アルブミン/L−グルタミンPCMC 10mgを2−プロパノール10mlに懸濁し、続いてアセトン/PLA溶液(50mg/ml)0.4mlを激しい撹拌下で添加した。
制御された加湿環境下での、本発明の共沈プロセスによって製造された生物活性分子でコーティングされた粒子による、および単独で沈殿させたコア材料の水の取り込みは、Dynamic Vapour Sorption1000(Surface Measurement Systems)を用い、動的蒸気吸着(DVS)によって行った。
DVSは、相対湿度(RH)0%の初期乾燥ステージが含まれる2回のフルサイクル実験のSpecial Automatic Operation(SAO)プロトコルを用いた。これに、各ステージにおけるRHが、90%RHまで10%ずつ漸増し、95%RHへ最後に急上昇する吸着ステージを続けた。この後に、0%RHに至る同一の脱着サイクルを続けた。このサイクルを繰り返した。以下の基準、すなわち、質量増加の変化率、すなわちdm/dtが0.002まで降下するか、あるいは最大ステージ時間が2000分となるように、DVSステージ変化を制御した。
図16は、全体として10で表される連続流型沈殿機器を示している。フロー式沈殿機器10は、溶媒A12(例えば、濃縮された共沈剤および生物活性分子を含有する水溶液)および溶媒B14(例えば、共沈剤飽和溶媒相)の供給源を含む。溶媒12、14は、ポンプ(図示せず)により、生体適合性チューブ16に沿って混合装置18まで送られる。混合装置18に入る溶媒12、14および出口ならびに放出パイプ20を示す混合装置18の断面も示す。懸濁液捕集容器22を用い、形成されたPCMCを捕集する。
(連続流型共沈殿装置)
連続共沈システムは、2台のHPLCポンプおよび再設計した動的溶媒混合室を用いて作り上げた。使用したポンプは、0.01〜9.99ml/minの可変流速が可能なGilson303HPLCポンプとした。従来はGilson811 C動的混合器であった再設計した混合室を改変し、急速混合および共沈剤の結晶化を可能にした。設計の目的は、生成物結晶の急速放出が可能な内部滞留容量(dwell volume)の小さなフローセルを作製することであった。
対象となる材料の飽和溶液は、必要に応じて若干の水混和性溶媒を含有していてもよい主に水溶液で調製した。同じ材料の飽和溶液を、主に水混和性溶媒または溶媒の混合物で調製した。主に水溶液を、一方のポンプによって動的混合器に送り、主に溶媒溶液を別のポンプによって送る。2台のポンプの流速を調整し、沈殿が生じるのに最も適した条件を得ることができる。一般的に、一方のポンプの流速は、混合室内で沈殿が生じ始める溶媒条件の変化が十分に迅速であるように、他方のポンプの少なくとも4倍を超えるものとする。言い換えれば、核生成は、微結晶(すなわちPCMC)が形成するためには急速である必要がある。
基本手順は、2種の選択された溶媒をD,L−バリンで飽和させることによって開始する。この特定の実施例では、2種の溶媒は、水およびイソプロパノールである。水は、ミリポア水精製システムから社内で得た。イソプロパノール(プロパン−2−オール/GPR)製品番号296942D、ロット番号K30897546 227は、BDHより供給され、D,L−バリン、製品番号94640、ロット番号410496/1は、Fluka Chemikより供給された。両溶液は、過剰のD,L−バリンを一定量の溶媒中に入れることによって飽和させた。次いで、自動振盪機で一夜振盪させた。室温で約12時間振盪した後、溶媒を、Whatman Durapore(0.45μm)薄膜フィルターで濾過した。
基本手順は、2種の選択された溶媒をL−グルタミンで飽和させることによって開始する。この特定の実施例では、2種の溶媒は、水およびイソプロパノールである。水は、ミリポア水精製システムから社内で得た。イソプロパノール(プロパン−2−オール/GPR)製品番号296942D、ロット番号K30897546 227は、BDHより供給され、D,L−バリン、製品番号94640、ロット番号410496/1は、Fluka Chemikより供給された。両溶液は、過剰のL−グルタミンを一定量の溶媒中に入れることによって飽和させた。次いで、自動振盪機で一夜振盪させた。室温で約12時間振盪した後、溶媒を、Whatman Durapore(0.45μm)薄膜フィルターで濾過した。
以下に典型的な共沈実験を述べるが、その原理は、タンパク質でコーティングされた微結晶の前のミリグラムバッチ調製から得られた。
共沈した結晶の単離後、光学顕微鏡および走査型電子顕微鏡を用いて結晶の特徴付けを行った。両技法は、製造された結晶のサイズおよび形状の測定を可能にした。
イソプロパノール中のD,L−バリン結晶の2.5%w/v懸濁液(上記のように調製した)25mlを高圧室中に装填し、すべてのイソプロパノールが除去されるまで超臨界流体CO2を懸濁液に通過させた。圧力をゆっくりと解放し、低残留溶媒、低い嵩密度の粉末を密封した容器に移した。超臨界流体乾燥プロセスは、狭いサイズ分散に影響しない。
(試験したDNAのタイプ)
・合成オリゴヌクレオチドDQA−HEX(Dept of Chemistry、Strathclyde University、UK)
5’HEX(T*C)6GTG CTG CAG GTG TAA ACT TGT ACC AG
HEX=2,5’,2’,4’,5’,7’−ヘキサクロロ−6−カルボキシフルオレセイン
T*=5−(3−アミノプロピニル)−2’−デオキシウリジン
医療用途:免疫応答に関係しているヒト白血球抗原であるクラスII主要組織適合抗原をコードするHLA−DQ領域中の第6染色体を検討するために一般的に使用される対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド(D.Graham、B.J.Mallinder、D.Whitcombe、N.D.Watson、およびW.E Smith.Anal.Chem.2002、74、1069〜1074)。
オリゴヌクレオチドでコーティングされた結晶を調製し、経肺投与に適している粒子を形成することを明らかにした。
実験は、純粋な蛍光標識したオリゴヌクレオチドDQA−Hexおよびそれとニシンの精子から得られる粗製のオリゴヌクレオチド調製物との混合物について行った。混合実験は、DQA−Hexの供給が限られてもオリゴヌクレオチドの装填量を変化させることを可能にした。
1.OCMCの調製
試料1:DQA−HEXおよび粗製オリゴヌクレオチドの混合物
粗製オリゴヌクレオチド4.6mg
ニシンの精子由来のDNA(Sigma D−3159、Lot 51K1281は、50bp未満の「粗製オリゴ」と名付けられた「粗製オリゴヌクレオチド」に分解した)
飽和D,L−バリン溶液300μlを添加し、よく混合し1分間煮沸し、次いで氷の上に置く。
DQA−Hex100μl(=26.3μg)を添加し、1分間煮沸し、添加の前に氷の上に置く。
この溶液を、室温において500rpmで磁気撹拌機(Heidolph MR3000)を用いて混合しながら、D,L−バリンで飽和された2−PrOH 6ml中に滴加し(Gilsonピペッター、イエローチップ)、約30分間沈降させ、次いで濾過し(Durapore薄膜フィルター、HVLP04700型)、ガラスバイアル中に結晶を移して空気乾燥させる。
添加の前に1分間煮沸し(次いで、氷の上に置いた)DQA−Hex100μl(=26.3μg)を、飽和D,L−バリン溶液300μlに添加し、よく混合する。
上記のような沈殿。
粉末15.41mg(試料1)または粉末13.52mg(試料2)を装填したカプセル。
(a)UV260nm−オリゴヌクレオチドの総量
Perkin Elmer−Lambda 3−UV/VIS Spectrometer、粗製オリゴヌクレオチドを用いる較正標準品。
(b)DQA−HEX中の蛍光マーカーHEXの蛍光(556/535nm)。
Perkin Elmer−LS45 Luminiscence Spectrometer、DQA−HEXを用いる較正標準品。
図17は、人工肺における微結晶の分布を示している。細粒分画(FPF)は、DQA−HEXと粗製オリゴの混合物でコーティングされた微結晶では29.9%であり、DQA−HEXのみでコーティングされた微結晶では24.4%であった。この結果は、オリゴヌクレオチド濃度を測定するために2種の異なる技法を用いて同様の結果が得られたことから、MSLIプロトコルが頑健性であることを示している。同様に、2つのタイプのオリゴヌクレオチドは密に混合され、粒子上のコーティングとして均一に分布されていると推測することができる。また、高い用量放出からは、粒子が自由流動性であること、および高いFPFからは、粒子が経肺製剤を調製するのに有用であることが見て分かる。
1.OCMCの製造:粗製オリゴヌクレオチド2mgを、TRIS(10mM、pH=7.8)50μlおよびD,L−バリン溶液の飽和水溶液150μlに溶かした。この溶液を、磁気撹拌機で撹拌しながら、Gilsonピペット(イエローチップ、0〜200μl)を用いて、D,L−バリンで飽和された2−PrOH 3mlに添加した。撹拌せずに、少なくともさらに30分間、バイアルを放置した。
2.OCMC懸濁液の分量(160〜800μl)を、Eppendorfバイアルに移し、9000rpmで回転させた(沈降によって分離したA7/B7/C7以外)。上清を注意深く取り除き、残った結晶を空気乾燥した。
3.既知量の飽和または飽和に近いD,L−バリンの水溶液への結晶の再溶解。
4.再溶解後の水相におけるオリゴヌクレオチド濃度の測定。
(オリゴヌクレオチド標準品:10μg/ml:OD260nm=0.226またはOD260nm=1:44.25μg/ml;H2O(あまり良く溶けない:約2mg/ml)あるいは飽和D,L−バリン溶液に溶かした。
(沈殿および溶解中のシステイン添加)
α1−アンチトリプシン16mgを、システイン10mg/mlを含有するTRIS緩衝液(20mM、pH8)0.4mlに溶かし、システイン10mg/mlを含有する乳糖で飽和されたTRIS緩衝液(20mM、pH8)1.2mlに添加した。この溶液0.4mlを、様々な量の水を含有するプロパノール6mlに滴加した。最終生成物中の活性およびタンパク質濃度は、システイン10mg/mlを含有するTRIS緩衝液0.8mlに結晶を溶かした後に測定した。
α1−アンチトリプシン10mgを、N−アセチルシステイン0.22mg/mlを含有する乳糖で飽和されたTRIS緩衝液(20mM、pH8)1mlに溶かし、この溶液0.4mlを、N−アセチルシステイン0.22mg/mlあるいは10mg/mlを含有するプロパン−2−オール6mlに滴加した。活性およびタンパク質濃度測定については、沈殿混合物と同じ濃度のN−アセチルシステインを含有するTRIS緩衝液0.4mlに結晶を溶かした。
これらは、生物活性を改善しかつ維持するために、添加剤または抗酸化剤などの賦形剤を共沈物に有利に添加できることを示している。
PCMCは、コア結晶材料としてのD,L−バリンあるいはL−グルタミンと共に、卵白アルブミン、ジフテリアトキソイドおよび破傷風トキソイドを用いて作製した。
すべての実験において、水溶液の半分の容量は、飽和アミノ酸溶液で構成した。卵白アルブミンは、粉末として供給された。コア材料上の理論的装填量が5、10、20および40%となるように、適切な量の粉末を量り分けた。これに、アミノ酸の50%飽和溶液が得られる量の水を添加するか、あるいは2−メチル−2,4−ペンタンジオールを水相に組み入れる場合には、アミノ酸の濃度を一定に保つため、添加されるジオールの容量で等しい容量の水を置き換えた。タンパク質と担体の共沈を、水溶液の10倍を超える容量の2−プロパノールまたは2−メチル−2,4−ペンタンジオール中で行い、ジオールを添加しない水溶液については9.1%の、水相にジオール20%を添加した場合は6.5%の沈殿溶媒中のH2Oの最終百分率を得た。
混合DT/TT PCMCについては、適切な容量のDTストック溶液(濃度=19.5mg/ml)およびTTストック溶液(濃度=27.5mg/ml)を、水溶液に添加して沈殿させ、必要な理論的装填量を得た。卵白アルブミン/TT PCMCについては、適切な量の卵白アルブミンを量り分け、これに必要な容量のTTを添加して必要な理論的装填量を得た。次いで、上述のように結晶を調製した。
DTの理論的装填量が5%であるワクチンでコーティングされた微結晶を製造した。L−グルタミンが結晶コア材料を構成し、水混和性有機溶媒として2−プロパノールを使用した。
DTは、14.5mg/mlの濃度で水溶液として供給された。DT溶液276μlを、飽和L−グルタミン溶液2313μlに添加した。これに、H2O 2037μlを添加し、混合物4.5mlを、磁気撹拌下、L−グルタミンで飽和された2−プロパノール45ml中で共沈させた。DT−グルタミン結晶約80mgが回収され、マウスにおけるワクチンの試用に50mgを用いた。DT−グルタミン結晶は4℃で保存した。
水性緩衝液中のDTの比較試料および乾燥DT−グルタミン微結晶の試料を以下の通り保存した。
4℃で2週間のインキュベーション、
室温で2週間のインキュベーション、
37℃で2週間のインキュベーション、および
45℃で2日間のインキュベーション。
マウスへの投与に先立って、インキュベートした微結晶をリン酸緩衝食塩水(PBS)に懸濁した。結晶1350マイクログラム(DT 50マイクログラム)をPBS 500マイクロリットルに懸濁した。1日目に、懸濁液50マイクロリットル(すなわち、DT5マイクログラム)を各マウスの左後肢に筋肉内投与した。
(パート1)
インスリン生物活性アッセイは、7.4のpHを得るために加熱(37℃)および通気(95%O2/5%CO2)した生理的食塩溶液(PSS)において試験した12週齢の雄性ウィスターラットから摘出した抵抗動脈(寸法200μm未満)で行った。薬物の管腔適用を可能にする圧力ミオグラフは、感度の初期手段を提供した。圧力系において、反対のガラスカニューレ(外のり寸法80μm)上に載置した動脈を、15分間にわたって5mmHg未満から40mmHgまで徐々に加圧し、アッセイを開始する前にさらに15分間保った。応答は、専用のビデオ解析ソフトウエア(MyoView)を用いて測定した。圧力ミオグラフは、極めて低い濃度(1×10−10M)におけるインスリンの血管拡張作用を検出することができる。
表35は、ノルアドレナリン前収縮(100=100%収縮)に対するインスリン媒介性弛緩を3例の平均(SD)で示しており、これらの値は、微結晶と対照との間に有意差がないことを示している(p>0.05)。
(ワイヤーミオグラフ試験)
次いで、続く試験に向けてより高い処理能力を得るため、ワイヤーミオグラフを使用した(P110およびP660、Danish MyoTech、Aarhus)。ワイヤー系において、2本の40μmステンレス鋼線材の間に動脈を載置し、一方をマイクロメーターに連結し、他方を力変換器に連結し、既知の標準寸法に設定し、最適な薬理学的反応を作り出した。力産生は、専用のソフトウエア(MyoDaq)によって捕らえた。すべてのバイオアッセイは、123mM KClの2つの洗浄液から始め、動脈における収縮機能を刺激し、続いて血管収縮薬アゴニストのトロンボキサンミメティック[U44169]への暴露によって前収縮させた。次いで、動脈を、浴内に直接(ワイヤー)か、あるいは一定圧力で徐々に注入することによって、ガラスの取り付けカニューレの先端に挿入された胎児用マイクロカニューレを通して管腔内に直接(圧力)漸増濃度のインスリンに暴露させた。
使用したインスリンは、USPウシ膵臓インスリン(Sigma I8405)であった。混合は、常に磁気撹拌によって行った。
結晶は、Durapore薄膜フィルター(0.4ミクロン)で濾過することによって単離し、次いで、換気フード中で空気乾燥した。
タンパク質装填量は、結晶の収率から決定される最大値に基づいている。
図20は、ミオグラフ結果の要約を示している。
トロンボキサンミメティック[U44169]による前収縮後、インスリン媒介性血管緊張低下プロフィールは、インスリンに特有であり、主に一酸化窒素シンターゼの活性化と、続く内皮一酸化窒素の放出を介してその効果を発揮する。
図21は、プロパン−2−オール中で沈殿したインスリン/D,L−バリンPCMCの倍率×1600におけるSEM画像である。図22は、プロパン−2−オール中で沈殿したインスリン/D,L−バリンの倍率×6400における他のSEM画像である。図21および22は、結晶がフレーク状であり、形状およびサイズが実質的に均一であること、ならびにインスリンの実質的に均一なコーティングが存在することを示している。
図23は、プロパン−2−オール中で沈殿したアルブミン/L−グルタミンPCMCのSEM画像である。この場合も、PCMCは均一であるが、針状である。
図24は、プロパン−2−オール中で沈殿した均一かつフレーク状のインスリン/L−ヒスチジンPCMCのSEM画像である。
図25は、プロパン−2−オール中で沈殿したα1−アンチトリプシン/D,L−バリンPCMCのSEM画像である。PCMCは、形状およびサイズが実質的に均一であることが分かり、フレーク状である。
この実施例において、我々は、驚いたことに、典型的な生体巨大分子よりもかなり小さい水溶性の生物活性化合物を用い、医薬製剤に適している生物活性分子でコーティングされた微結晶を製造するのにも共沈プロセスが使用できることを示す。これらの製剤は、バッチあるいは連続プロセスによって製造することができ、D,L−バリンなどの非吸湿性担体を有利に用いることができる。このプロセスを水溶性の抗生物質である硫酸トブラマイシンについて示すが、他の抗生物質および他の水溶性生物活性分子にも適用することができる。生物活性分子は、極性であり、共沈に使用するpHでイオン化する1個または複数の官能基を含むことが好ましい。このことは、水中での高い溶解度および水混和性有機溶媒中での溶解度の低下につながる傾向がある。また、化合物は、結晶化でコア材料によって形成される単位格子よりも大きな最大の寸法を有していることが好ましい。このことは、生物活性分子でコーティングされた微結晶の形成を助け、結晶格子内に生物活性分子が包接される可能性を最小限に抑えるはずである。
(バッチプロセス)
D,L−バリン担体結晶上に様々な理論的装填量の生物活性分子を含有するバッチは、硫酸トブラマイシン(SigmaからのT−1783)3mg(4.8%w/w)、6mg(9.1%w/w)あるいは12mg(16.7%w/w)を用いることによって調製した。いずれの場合にも、秤量した硫酸トブラマイシンを、蒸留水中のD,L−バリン1ml(60mg/mlで)に溶かした。上記0.5mlを、1500rpmで混合しながら、D,L−バリンで飽和されたPr2OH 10mlへ1mlのピペットを用いて滴加した。結晶を真空中で直ちにDurapore0.4ミクロンフィルターで濾過し、Pr2OH(1%H2Ov/v)10mlで洗浄し、換気フード中で空気乾燥した。
(理論的装填量4.8%w/w)
硫酸トブラマイシン(SigmaからのT−1783)30mgを、蒸留水中のD,L−バリン10ml(60mg/mlで)に溶かした。水溶液5mlを、750rpmの動的混合器速度を用いて、流速が水溶液用ポンプについては0.5ml/minであり、溶媒用ポンプについては10ml/minである実施例9に記載の連続共沈システムで、D,L−バリンで飽和されたPr2OH(100ml)と混合した。理論的装填量が4.8%w/wの結晶を捕集し、真空中Durapore0.4ミクロンフィルターで濾過し、プロパン−2−オール(1%H2Ov/vを含有する)50mlで洗浄し、換気フード中で空気乾燥した。
硫酸トブラマイシン(SigmaからのT−1783)20mgを、蒸留水中のD,L−バリン20ml(60mg/mlで)に溶かした。水溶液5mlを、750rpmの動的混合速度を用いて、流速が水溶液用ポンプについては0.5ml/minであり、溶媒用ポンプについては10ml/minである実施例9に記載の連続共沈システムで、D,L−バリンで飽和されたプロパン−2−オール(100ml)と混合した。結晶を捕集し、真空中Durapore 0.4ミクロンフィルターで濾過し、Pr2OH(1%H2Ov/v)50mlで洗浄し、換気フード中で空気乾燥した。
上記で調製したトブラマイシンでコーティングされたバリン結晶は、自由流動性かつ非吸湿性であり、医薬製剤の製造に適している。バッチプロセスによって調製された粒子のSEM画像は、バリン微結晶に特有のフレーク状形態および肺送達に適当となる5ミクロン未満の平均最大直径を有していることを示している。装填量を変化させてもサイズまたは形態に明らかな違いは認められない。図26は、装填量が9.1%w/wであるバッチプロセスによって調製された試料を示している。連続プロセスによって調製された粒子も、自由流動性であり、滑らかで明確な形態である。連続混合器において使用した低い混合率および小さな羽根車は、図27に示すように、バッチプロセスにおけるよりも大きな粒子を提供する。
驚いたことに、活性剤が生体巨大分子ではない生物活性分子でコーティングされた微結晶を得ることができ、連続共沈プロセスによって製造することができる。
例えば、針状形態の微結晶を、より大きく、より球状の粒子に凝集させることは、医薬製剤にとって有利なことがある。針状粒子は流動性に乏しいが、球体は、処理特性および薬物送達特性に優れた粉末を提供することができる。あるいは、微結晶針状晶の成長を変化させ、より短い棒状形態を作り出すことができれば、処理の改善も得ることができる。ここで、我々は、共沈剤よりもかなり低い濃度における無機、有機塩または緩衝塩などのある種の試剤の添加を用い、生物活性分子でコーティングされた微結晶の形状および凝集特性を変えることができることを示す。復元された製剤においてpH緩衝作用または等張性などの第2の機能を有する薬学的に許容できる添加剤が特に有利である。このタイプの添加剤の使用は、最終製剤において必要とされる成分数を最小限に抑える。
(実験)
サブチリシンCarlsberg5mg(0.7%w/w装填量、G7)または25mg(6.4%w/w装填量、G10)を、緩衝液(50mMクエン酸ナトリウム、150 mM塩化ナトリウム、pH5.5)4mlおよび蒸留水6mlに溶かした。上記0.25mlに、蒸留水中のL−グルタミン0.75ml(24.3mg/mlにおいて)を添加した。次いで、水溶液を、1500rpmで混合しながら、L−グルタミンで飽和されたEtOH 10ml中に1mlのピペットを用いて滴加した。結晶の分量をSEMスタブに直接付け、乾燥前の形態を評価した(G7*、G10*)。直ちに、残りの結晶を、真空中Durapore0.4ミクロンフィルターで濾過し、無水Pr2OH 5mlで洗浄し、換気フード中で空気乾燥した。
通常、水からエタノール中への共沈によって製造されるタンパク質でコーティングされたL−グルタミン微結晶は、寸法が約5ミクロンの針状形態を示す。驚いたことに、低濃度のクエン酸ナトリウムおよび塩化ナトリウム存在下での共沈は、針状晶の長さに著しい短縮を生じる。さらに、長さの変化は、タンパク質の濃度によって制御され、タンパク質装填量が増加するにつれて、より小さな棒状晶が製造される。図28および図30は、クエン酸ナトリウムおよび塩化ナトリウム存在下で共沈した典型的な生物活性分子でコーティングされたL−グルタミン結晶のSEM画像を示している。6.4%w/wにおいては、棒状晶の長さは、主に3ミクロン未満であり、平均して2ミクロン未満である。このような生物活性分子でコーティングされた微結晶のエタノール懸濁液は、医薬製剤にとって有利な特性を有することがある。例えば、当技術分野において知られている吸入装置を用いる経肺経路によって懸濁液を送達できる可能性がある。さらにタンパク質装填量の増加を用い、微結晶のサイズをさらに縮小することができる。個々の結晶で構成される乾燥粉末としての棒状晶の単離は、臨界点乾燥によって行うことができる。従来の微結晶のフィルター膜上への濾過と、続いて空気乾燥を用いた場合、著しい変形が起こり、針状晶または棒状晶の球状凝集塊で構成される粒子が製造される。これらの極めて表面積の大きな球状粒子は、自由流動性粉末を有利に形成し、非吸湿性である。また、それらを、10〜20秒未満の間など、極めて迅速に水溶液に復元することができる。球状凝集塊を示すSEM画像を、図29および図31に示す。針状微結晶の球状凝集塊への変形は、球状晶が、医薬製剤における処理および使用がかなり容易であるため極めて有利である。ここで示される結果と極めて類似した結果は、治療用タンパク質を含む他のタンパク質について得ることができる。
共沈プロセスにおける緩衝液および塩などの薬学的に許容できる試剤の低濃度における使用は、生物活性分子でコーティングされた微結晶の形態および凝集挙動に驚くほど大きく有用な違いを生じる。使用する調整剤の濃度は、最終製剤中に15%w/w未満、好ましくは10%w/w未満で存在するようにしなければならない。調整剤の濃度があまりに高い場合には、担体結晶からの相分離および第2のタイプの生物活性分子でコーティングされた結晶の形成に到ることがある。
L−グルタミン、D,L−バリンおよびグリシンの微結晶はそれぞれ、実施例9に記載の連続プロセスを用い、エタノール、イソプロパノールおよびイソプロパノール中への沈殿によって調製した。同じ材料および溶媒を用い、これも連続共沈プロセスによって、10%w/w装填量のアルブミンでコーティングされた微結晶を調製した。粉末X線回折を用い、タンパク質と共に、およびタンパク質なしに調製された乾燥粉末試料を比較した。
タンパク質と共に、およびタンパク質なしにエタノール中で沈殿したグルタミンのPXRDデータは、お互いに、および既知の単結晶構造(斜方晶系 P212121、16.020、7.762、5.119−Koetzle他Acta Cryst.B 1973、29、2571を参照)と完全に一致していることが分かった。図32は、得られた典型的データを示している。12〜18°領域に観察される幅広いこぶは、非晶質材料に起因するか、あるいは実験プロセスの人為的結果である可能性がある。アルブミン試料のピークは、純粋なグルタミンのピークよりもわずかに高い角度に位置する。
タンパク質を含む、および含まないPXRDパターンは本質的に一致している。2種の可能な既知の多形が存在する(単斜晶系 P21/c 5.21、22.10、5.41、β=109.2 Acta Cryst B 1969、25、296および三斜晶系 P−1 5.222、5.406、10.835、90.89、92.34、110.02 Acta Cryst C 1996、52、1759)。多形が存在することを確認することは、いくつかの要因によって複雑化される。試料の大きな好ましい配向は、3本の大きなピークを与え、パターンの残りはすべて比較的小さく、バックグラウンドから区別するのが困難である。したがって、これらのピークの位置はむしろ不正確である。三斜晶系試料は120Kで実行されている。したがって、PXRDを実行した室温とはわずかに異なる単位格子を有するはずであり、観察データとぴったり一致することは期待できないと思われる。2種の多形は、いくつかのむしろ類似したセル寸法を有し、かなり近い関係にあるため、よく似た予測ピークを与える。試料は単斜晶系多形である可能性が高いが、不確かである。
アルブミンと共沈したグリシンのPXRDは、純粋なグリシンのPXRDに比べて、余分なピークを示す。3形態のグリシンが報告されている(単斜晶系 P21/n、単斜晶系 P21および三方晶系−Acta Cryst 1972、28、1827;Acta Cryst 1960、13、35およびActa Cryst B 1980、36、115を参照)。どちらの試料にも三方晶系の証拠は存在しない。純粋なグリシンのPXRDは、P21/n多形とぴったり一致している。グリシン/Alb試料における余分なピークは、多少のP21多形の存在によって説明することができる。したがって、この試料は、かなりの量の両相が存在する2種の多形の混合物である。
PXRDデータは、粉末粒子のコアが、10%w/wのタンパク質との共沈後に高度に結晶性のままであることを示している。グルタミンおよびD,L−バリンの場合、タンパク質コーティングは、純粋な材料の沈殿と比較しても、コア結晶坦体の多形を変化させない。高度に結晶性のコアは、高湿度および高温に対して安定な医薬製剤を製造するのに有利である。グリシンに関しては、タンパク質は、異なる多形の部分的形成を促進するように見える。生体巨大分子との共沈によって水溶性薬物の多形が形成されるように誘導することは、例えば、多形が存在することが生物活性およびバイオアベイラビリティーに影響を及ぼすことがあるため、医薬製剤にとって有利である可能性がある。
微結晶の懸濁液の濾過は、生成物の固化および圧縮につながることがある。これは可逆的であるが、別のプロセスステップを必要とする。臨界点乾燥を有利に用い、溶媒懸濁液から直接、無溶媒で低密度の生物活性分子でコーティングされた微結晶の粉末を得ることができる。これらの粉末は、非吸湿性であり、低い帯電を示すため、経肺製剤を調製するための極めて魅力的な特性を有している。臨界点CO2乾燥によって調製された粉末を用い、従来の濾過試料に比べて残留溶媒含量が極めて低く、細粒分画の増加した医薬製剤を製造することができる。超臨界CO2を使用する臨界点乾燥は、組織試料のための確立した技法である。それは、アセトン、イソプロパノールまたはエタノールなどの混和性溶媒中に予め浸漬または懸濁された試料中に、または試料を通して未臨界または超臨界CO2を送り込むものである。溶媒はCO2に溶け、その臨界点を超えて加熱し、液気界面の形成なしに排気口を通して膨張することができる流体中に浸漬された試料が残る。このことは、毛管力を最小限に抑え、粒子間凝集および圧縮を著しく低減する。臨界点乾燥が含水量の高い試料に適していないのは、水がCO2に十分可溶性でないためである。
サブチリシンCarlsbergを連続プロセスによって、2−プロパノール(D,L−バリンで飽和された)中にD,L−バリン(60mg/ml)と共沈させ、理論的タンパク質装填量10%および溶媒中の含水量3.9%v/vとした。懸濁液を沈降させ、過剰の溶媒をデカントし、残りの懸濁液をアセトンで順に洗浄して過剰の2−プロパノールを除去し、溶媒の含水量を0.5%v/vとした。懸濁液の1分量をDurapore 0.4ミクロンフィルター上の濾過によって乾燥し(SC/DLVal 2)、第2の試料は、臨界点乾燥によって乾燥した(SC/DLVal 3)。
タンパク質でコーティングされた微結晶の特徴であるコア微結晶およびタンパク質コーティングは、単一の連続した自己集合プロセスによって生じる。生物活性分子の予め形成された微結晶との静電気的結合がこのプロセスの機構において重要であるか否かを評価するために、非水媒体中で微結晶の表面電位を測定することは興味深かった。荷電粒子を取り囲む液体層は、2つの部分、すなわちイオンが強力に結合している内部領域(シュテルン層)およびイオンがあまり堅固に会合していない外部(拡散)領域として存在する。拡散層内には、内部でイオンおよび粒子が安定な実体を形成する概念的境界が存在する。粒子が移動する場合(例えば、重力により)、境界内のイオンもまた移動する。これらのイオンは、境界を越えて粒子と共に移動することはない。この境界(流体力学的ずり面)における電位がゼータ電位である。ゼータ電位の符号および大きさは、粒子の表面電荷によって異なり、例えば、負のゼータ電位は、全体として負電荷の粒子を示す。レーザードップラー速度測定を用いるMalvern Zetasizerを使用し、一定pHで様々なコア材料の沈殿によって製造された微結晶のゼータ電位について符号およびおおよその大きさを測定した。測定は、希薄なアセトニトリル懸濁液として懸濁された予め調製された微結晶またはタンパク質でコーティングされた微結晶で行った。ポリスチレンラテックスを用いて機械を較正した。データを、表「ゼータ電位」に示す。タンパク質の非存在下で溶媒中に沈殿させたグリシン、グルタミンおよびバリン微結晶はすべて、負のゼータ電位を示す。静電気的結合が形成の機構にとって重要であれば、全体として正電荷の生体分子のみが、これらの負に荷電した材料上にコーティングを形成するであろうことが予想される。タンパク質上の電荷は、pHの関数である。電荷は、pI以上のpH値では負となり、pI以下のpHでは正となる。pIが4.85と報告されているタンパク質、アデノシンデアミナーゼ(ADM)を用い、pI以上のpHにおける共沈によって、上記担体材料を用いてタンパク質でコーティングされた微結晶が容易に調製されることが判明した。これらのタンパク質でコーティングされた微結晶のゼータ電位を表「ゼータ電位」に示す。負の残留値が結晶をコーティングしているアデノシンデアミナーゼと一致しているのは
、共沈のpHにおいてタンパク質も負に荷電しているためである。pH7.02で調製されたアデノシンデアミナーゼでコーティングされたバリン結晶(ADM/バリン)については、負のタンパク質コーティングによってゼータ電位の明らかな増加が認められる。これらの結果は、共沈プロセスを介し、負に荷電したタンパク質を、同じ負の表面電荷を示す材料の微結晶上にコーティングできることを示している。このことは、コーティングの機構が、予め形成された微結晶への生物活性分子の静電気的結合に帰することができないことを示している。静電気的結合機構が存在しない別の指標は、核酸などのポリアニオンを用い、共沈によって微結晶を効率的にコーティングすることができるという事実によって得られる。例えば、裸のバリン結晶では負のゼータ電位が観察されるにもかかわらず、DNAでコーティングされたバリン微結晶を製造することができる。したがって、共沈は、生物活性分子でコーティングされた微結晶を得るための一般的プロセスを提供し、広範囲のpHおよび塩条件にわたって効率的に有利に行うことができる。
驚いたことに、連続流共沈によって調製され、復元された生物活性分子製剤は、すでに報告されているバッチプロセスによって調製された試料よりも高い生物活性を有利に示すことができることが見いだされた。ここで、その効果を酵素のブドウ糖酸化酵素および乳酸脱水素酵素について明らかにするのは、標準的酵素アッセイを用い、高い精度でそれらの生物活性を測定できるからである。フロー式共沈装置を使用する同様の改善は、治療用生体分子および他の生物活性分子についても得ることができる。連続流プロセスによって調製された製剤中の生物活性分子も、例えば高温および湿度の上昇で高い安定性を示すことができ、保存による凝集、化学的分解または変性に対して、より耐性を有する。以下の実施例において、試料は、バッチ共沈あるいは連続流沈殿法によって同一組成の出発材料を用いて調製し、それらの生物活性を比較した。
ブドウ糖酸化酵素(GO)、2.5mg/mlを、25℃で貧溶媒としてのイソプロパノール中にグリシンと共沈させた。バッチプロセスでは、GO/グリシン水溶液0.5mlを、750rpmで撹拌する25mmの撹拌子を用い、30mlのバイアル中、グリシン/イソプロパノール9.5ml中に滴加することによって共沈させた。連続流プロセスでは、GO/グリシン水溶液の流速は0.25ml/minであり、グリシン/イソプロパノールの流速は4.75ml/minであった。フローセルの羽根速度は750rpmであった。
結果を、表37:ブドウ糖酸化酵素に示す。
ラクトバチルス属由来のD−乳酸脱水素酵素(LDH)をL−グルタミンと共沈させた。L−グルタミンの脱イオン水飽和溶液(約100ml)(約150mg/ml)は、40℃で一夜、インキュベーター中で撹拌して室温まで冷却し、0.45μmのDurapore(ミリポア)フィルターで濾過することによって調製した。この溶液のpHを塩酸でpH7.3に調整した。LDH(3.15mg)およびウシ血清アルブミン(16mg)をL−グルタミン水溶液10mlに溶かし、溶解を助けるため緩やかに回転させた。アルブミンは、タンパク質希釈剤およびLDHとの共沈物として使用した。LDH/L−グルタミン水溶液中の最終LDH濃度は、0.315mg/mlであった。バッチプロセスでは、LDH/L−グルタミン水溶液0.5mlを、25℃において750rpmで撹拌する25mmの撹拌子を用い、30mlのバイアル中、L−グルタミンで飽和されたエタノール9.5ml中に滴加することによって共沈させた。連続流型沈殿装置では、LDH/L−グルタミン水溶液の流速は0.25ml/minであり、L−グルタミン/エタノールの流速は4.75ml/minであった。フローセルの羽根速度は、25℃において750rpmであった。
驚いたことに、これらの実施例において、連続流型沈殿装置で調製されたタンパク質試料の生物活性は、同一の出発組成物を使用しているにもかかわらず、バッチ反応器で調製された試料よりも高いことが判明した。何がその原因であるかは不明である。混合ステップ中、フロー式沈殿装置内の空気−溶媒界面がかなり相対的に低く、生物活性分子および得られるコーティングされた微結晶が混合から生じる剪断力に暴露される時間もより少ない。このことが、安定な元のまたは元に近い立体配座を保つ共沈分子の割合を最大限に高めた可能性がある。このことは、フロー式共沈装置を用いて調製された生体分子製剤の保存安定性で観察された改善と一致する。生物活性の良好な保持ならびに温度および湿度の上昇に対する安定性の強化は、生物医薬製剤にとって極めて有利な特性である。高い生物活性は、治療的効力の増大を生み出すことができ、一方、保存中の生物活性分子の安定性の強化は、ほんの少量の分解生成物の投与から生じることがある免疫反応などの有害な副作用の危険性を軽減するであろう。
Claims (17)
- 粒子を形成する連続的フロー法であって、前記粒子が、共沈剤分子を含む非吸湿性の内部結晶コアと、1種または複数の生物活性分子を含む外部コーティングとを有する微結晶を含み、前記生物活性分子が、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸、ワクチン成分、もしくはそれらの組合せであり、
(a)共沈剤分子および生物活性分子を含み、該共沈剤分子が4kDa未満の分子量を有し、水飽和溶解度の5〜100%であって、且つ、150mg/ml以下の濃度である、水溶液であって、前記共沈剤分子および生物活性分子を含み、90℃を超える融点を有する共沈物を形成することができる水溶液の連続流を提供するステップと、
(b)前記共沈剤分子および生物活性分子が溶液から共沈して粒子を形成するように、前記生物活性分子/共沈剤分子の水溶液の連続流と、より大量の水混和性の有機溶媒の流れと急速に混合するステップと
を含む方法。 - 該共沈剤分子が水飽和溶解度の20〜80%の濃度であって、且つ、150mg/ml以下の濃度である、請求項1記載の方法。
- 該共沈剤分子が25℃で12〜150ml/mlの水溶性を有する、請求項1又は2記載の方法。
- 前記生物活性分子が、抗体又は抗体断片である請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- (c)前記粒子を前記水混和性の有機溶媒から単離するステップをさらに含むことを特徴とする請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- 前記水混和性の有機溶媒は、以下の溶媒:メタノール;エタノール;プロパン−1−オール;プロパン−2−オール;アセトン、乳酸エチル、テトラヒドロフラン、2−メチル−2,4−ペンタンジオール、1,5−ペンタンジオール、ならびに様々なサイズのポリエチレングリコール(PEGS)およびポリオールのいずれか、またはそれらの任意の組合せから選択される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記有機溶媒を生物活性分子および/または共沈剤で予め飽和することによって、前記水溶液を添加および混合したときに前記2成分が一緒に析出することを確実にする、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 急速に混合するステップにおいて、乱流または乱流に近い状態が生じる、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 前記共沈剤分子が、以下のもの:アミノ酸、ペプチド、糖、無機塩、またはそれらの誘導体のいずれか、あるいはそれらの任意の組合せから選択される、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記ステップ(c)が、超臨界CO 2 を用いる臨界点乾燥によって実施される、請求項5〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記水混和性の有機溶媒の流速が、前記生物活性分子/共沈剤分子の水溶液の流速の4〜100倍である、請求項1〜10のいずれか1項記載の方法。
- 前記生物活性分子/共沈剤分子の水溶液の流速が0.1〜20ml/分である、請求項1〜11のいずれか1項記載の方法。
- 前記水混和性の有機溶媒の流速が、2〜200ml/分である、請求項1〜12のいずれか1項記載の方法。
- 前記粒子が、病原体の抗原成分、又はワクチンとして使用するためのものであり、前記生物活性分子が、細菌、ウイルス、ジフテリアトキソイド、および破傷風トキソイドからなる群から選択されるか、又は、ジフテリア、破傷風、ポリオ、百日咳、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、HIV、狂犬病、及びインフルエンザの、サブユニット、弱毒化、及び不活微生物ワクチンからなる群より選択される、請求項1〜3、5〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 前記生物活性分子が、HiB(B型インフルエンザ菌)タンパク質、肺炎球菌のタンパク質、生ウイルスワクチンからなる群より選択されるタンパク質と結合している多糖類である、請求項1〜3、5〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 前記粒子が、癌用に開発されるワクチンの製剤化に使用される、請求項1〜3、5〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 前記粒子が、以下のもの:バリンの結晶コアおよびインスリンのコーティング、グリシンの結晶コアおよびアンチトリプシンのコーティング、グルタミン酸ナトリウムの結晶コアおよびインスリンのコーティング、メチオニンの結晶コアおよびインスリンのコーティング、アラニンの結晶コアおよびインスリンのコーティング、バリンの結晶コアおよびインスリンのコーティング、ヒスチジンの結晶コアおよびインスリンのコーティング、グリシンの結晶コアおよびα1−アンチトリプシンのコーティング、グルタミンの結晶コアおよびアルブミンのコーティング、バリンの結晶コアおよびオリゴヌクレオチドDQA−HEXのコーティング、バリンの結晶コアおよびα1−アンチトリプシンのコーティングとさらにN−アセチルシステインの抗酸化剤外部コーティング、バリンの結晶コアおよび卵白アルブミンのコーティング、グルタミンの結晶コアおよび卵白アルブミンのコーティング、バリンの結晶コアおよびジフテリアトキソイドのコーティング、グルタミンの結晶コアおよびジフテリアトキソイドのコーティング、バリンの結晶コアおよびジフテリアトキソイドのコーティング、グルタミンの結晶コアおよび破傷風トキソイドのコーティング、バリンの結晶コアおよびジフテリアトキソイドと破傷風トキソイドの混合物のコーティング、グルタミンの結晶コアおよびジフテリアトキソイドと破傷風トキソイドの混合物のコーティングから選択される、請求項1、2、5〜13のいずれか1項に記載の方法。
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