RU2812347C1 - Способ получения бактериального продуцента рекомбинантного белка нуклеокапсида nc вируса sars-cov-2 - Google Patents
Способ получения бактериального продуцента рекомбинантного белка нуклеокапсида nc вируса sars-cov-2 Download PDFInfo
- Publication number
- RU2812347C1 RU2812347C1 RU2023127996A RU2023127996A RU2812347C1 RU 2812347 C1 RU2812347 C1 RU 2812347C1 RU 2023127996 A RU2023127996 A RU 2023127996A RU 2023127996 A RU2023127996 A RU 2023127996A RU 2812347 C1 RU2812347 C1 RU 2812347C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- recombinant
- tularensis
- gene
- plasmid
- strain
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 73
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 title claims abstract description 14
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 title claims description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title abstract description 29
- 241000589602 Francisella tularensis Species 0.000 claims abstract description 69
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 61
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 17
- 101150055766 cat gene Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 12
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 101150077981 groEL gene Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims abstract description 5
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims abstract description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims description 15
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 8
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 claims description 5
- 208000034784 Tularaemia Diseases 0.000 claims description 5
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 claims description 4
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 claims description 4
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims description 4
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 claims description 3
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 claims description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 2
- 101150034814 F gene Proteins 0.000 claims 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 abstract description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 abstract description 4
- 208000001528 Coronaviridae Infections Diseases 0.000 abstract description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 abstract description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract description 3
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 abstract description 2
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 abstract description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 abstract description 2
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 27
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 27
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 11
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 9
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 9
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 9
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 9
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 6
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 4
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 4
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 4
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 4
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 3
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 3
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- KJDSORYAHBAGPP-UHFFFAOYSA-N 4-(3,4-diaminophenyl)benzene-1,2-diamine;hydron;tetrachloride Chemical compound Cl.Cl.Cl.Cl.C1=C(N)C(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C(N)=C1 KJDSORYAHBAGPP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710139375 Corneodesmosin Proteins 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 description 2
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 2
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 2
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 2
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 2
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 2
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 2
- 241001292005 Nidovirales Species 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 2
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- SGKRLCUYIXIAHR-AKNGSSGZSA-N (4s,4ar,5s,5ar,6r,12ar)-4-(dimethylamino)-1,5,10,11,12a-pentahydroxy-6-methyl-3,12-dioxo-4a,5,5a,6-tetrahydro-4h-tetracene-2-carboxamide Chemical compound C1=CC=C2[C@H](C)[C@@H]([C@H](O)[C@@H]3[C@](C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@H]3N(C)C)(O)C3=O)C3=C(O)C2=C1O SGKRLCUYIXIAHR-AKNGSSGZSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 238000009020 BCA Protein Assay Kit Methods 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 102100031673 Corneodesmosin Human genes 0.000 description 1
- RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen sulfide Chemical compound S RWSOTUBLDIXVET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 229910021578 Iron(III) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N L-citrulline Chemical compound NC(=O)NCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101001044384 Mus musculus Interferon gamma Proteins 0.000 description 1
- RHGKLRLOHDJJDR-UHFFFAOYSA-N Ndelta-carbamoyl-DL-ornithine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=O RHGKLRLOHDJJDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 108010040201 Polymyxins Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 210000003578 bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000011545 carbonate/bicarbonate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 235000013477 citrulline Nutrition 0.000 description 1
- 229960002173 citrulline Drugs 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 230000000959 cryoprotective effect Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 229960003722 doxycycline Drugs 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 229910000037 hydrogen sulfide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K iron trichloride Chemical compound Cl[Fe](Cl)Cl RBTARNINKXHZNM-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 108010026228 mRNA guanylyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004898 n-terminal fragment Anatomy 0.000 description 1
- 229960000210 nalidixic acid Drugs 0.000 description 1
- MHWLWQUZZRMNGJ-UHFFFAOYSA-N nalidixic acid Chemical compound C1=C(C)N=C2N(CC)C=C(C(O)=O)C(=O)C2=C1 MHWLWQUZZRMNGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии. Способ получения продуцента рекомбинантного белка нуклеокапсида NC вируса SARS-CоV-2 на основе вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ заключается в конструировании стабильной рекомбинантной плазмиды pPNC-2 с рекомбинантным опероном, состоящим из промоторной области гена groE и фрагмента гена fopA, кодирующего лидерную последовательность FopL белка FopA F. tularensis, и структурной части рекомбинантного гена nc вируса SARS-CoV-2. Полученную таким способом плазмиду pPNC-2 с удаленным геном cat переносили в клетки штамма F. tularensis 15 НИИЭГ методом ко-трансформации с плазмидой pTV24 (TcR CmR) и после трехэтапной селекции и ПЦР-анализа был отобран синтезирующий иммуногенный рекомбинантный белок нуклеокапсида NC штамм F. tularensis 15-NC-2 без дополнительного маркера антибиотикоустойчивости гена cat. Предложенное изобретение позволяет получать модифицированный штамм F. tularensis, синтезирующий иммунологически активный рекомбинантный белок нуклеокапсида NC вируса SARS-CoV-2. Штамм может использоваться при создании прототипа живой комбинированной рекомбинантной вакцины для профилактики как коронавирусной инфекции, так и других инфекций, вызываемых внутриклеточными патогенами. 6 ил.
Description
Изобретение относится к области медицины и ветеринарии и может найти применение при создании препаратов микробиологического происхождения для профилактики инфекционного заболевания, вызываемой вирусом SARS-CoV-2.
Пандемия коронавирусной инфекции (COVID-19) была вызвана вирусом SARS-CoV-2, относящимся к семейству Coronaviridae порядка Nidovirales. Геном вирусов порядка Nidovirales представляет собой несегментированную однонитевую (+)РНК размером около 30 т.п.о [https://link.springer.com/book/10.1007/978-1-4939-2438-7]. РНК вируса SARS-CoV-2 содержит пять протяженных рамок считывания, кодирующих структурные белки шипа (S) [Wrapp et al., 2020; Walls et al., 2020; Jaimes et al., 2020], оболочки (E), мембраны (M) и нуклеокапсида (N) [Kang et al., 2020], и мультиферментный комплекс репликазы. При разработке коронавирусных вакцин, как правило, в качестве доминантного антигена используют белок S [Pang et al., 2020; Chen et al., 2020]. Однако, в отличие от гена белка S, ген белка N является более консервативным [Marra et al., 2003; Drosten et al., 2003; Grifoni et al., 2020; Holmes et al., 2003; Rota et al., 2003; Zhu et al., 2005], синтезируется в большом количестве в ходе инфекции и высоко иммуногенен [Cong et al., 2020]. В сыворотках переболевших коронавирусной инфекцией людей выявляется высокий уровень антител IgG к белку N [Leung et al., 2004], а среди T-клеток присутствуют популяции как хелперных, так и цитотоксических клеток, специфичных к белку N [Gao et al., 2003; Okada et al., 2005], в составе которого выявлено 8 CTL-эпитопов [Marra et al., 2003].
В качестве разрабатываемых или уже используемых вакцин против коронавирусной инфекции, вызываемой генетическими вариантами вируса SARS-CoV-2, используется ряд платформ на основе аденовирусов [Епифанова и др., 2017, Черенова и др., 2017] и бактерий Francisella tularensis [Jia et al., 2021].
Штаммы F. tularensis 15 НИИЭГ [Olsuf'ev, 1975] и LVS, являющиеся производными штамма F. tularensis 15 [Ellis et al., 2002], используют для создания живых вакцин для профилактики туляремии у людей. Эти вакцины индуцируют длительный специфический гуморальный и клеточно-опосредованный иммунитет [Elkins et al., 2002; Eneslatt et al., 2011].
Туляремийные вакцины на основе штаммов F. tularensis 15 НИИЭГ и LVS безопасны, обладают незначительной реактогенностью и рассматриваются в качестве бактериальных векторов для представления гетерологичных протективных антигенов иммунной системе с целью формирования длительного гуморального и клеточного иммунитета против гетерологичных патогенов [Kravchenko et al., 2007; Robinson et al., 2015, Jia et al., 2018, Jia et al., 2021 ; Павлов и др., Патент RU 2745161 C1, 2021].
Технический результат изобретения заключается в получении аттенуированного штамма F. tularensis 15-NC-2, синтезирующего антиген нуклеокапсида NC вируса SARS-CoV-2, способного индуцировать специфический гуморальный и клеточный иммунный ответ у экспериментальных мышей линии Balb/c.
Технический результат достигается тем, что предложен способ получения продуцента рекомбинантного белка нуклеокапсида NC вируса SARS-COV-2 на основе вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ, заключающийся в конструировании плазмиды pPNC-2 на основе стабильного репликона вектора рРМС1 с рекомбинантным опероном гена nc, состоящим из промоторной области гена groE и лидерной последовательности гена fopA F. tularensis, объединенных со структурной частью рекомбинантного гена nc, кодирующего рекомбинантный белок нуклеокапсида вируса SARS-COV-2, в три этапа: сначала был создан рекомбинантный оперон, встроенный в стабильный плазмидный вектор pPMC1 с селективным маркером устойчивости к хлорамфениколу cat, после удаления из плазмиды pPCNC фрагмента ДНК с геном cat была получена плазмида pPNC-2, которая была перенесена в клетки вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ методом ко-трансформации с нестабильно наследуемой туляремийным микробом плазмидой pTV24, и после селекции был получен штамм-продуцент F. tularensis 15-NC-2 без гена cat.
Способ создания штамма F. tularensis 15 -NC-2 заключается в конструировании на основе вектора рРМС1 рекомбинантной плазмиды pPNC-2, содержащей рекомбинантный оперон, состоящий из промоторной области гена groE и фрагмента гена fopA, кодирующего лидерную последовательность FopL белка FopA F. tularensis, и структурной части рекомбинантного гена nc вируса SARS-CoV-2. В отличие от вектора рРМС1, в рекомбинантной плазмиде отсутствует ген cat. Полученную плазмиду pPNC-2 переносят в клетки реципиентного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ методом ко-трансформации с плазмидой pTV24 (TcR CmR), нестабильно наследуемой клетками туляремийного микроба. Отбор трансформантов проводили на среде FT-агар с тетрациклином. Наличие плазмиды pPNC-2 в клонах с фенотипом TcR выявляли методом ПЦР с праймерами, специфичными к рекомбинантному гену nc, и методом электрофореза. Селекцию клонов, несущих только одну плазмиду pPNC-2, проводили после культивирования биплазмидного штамма на среде ЖПС и высева культуры до изолированных колоний на среду FT-агар без антибиотиков. Целевые клоны отбирали по фенотипу TcS CmS, отсутствию плазмиды pTV24 и наличию ПЦР-сигнала с праймерами, специфичными к рекомбинантному гену nc. В результате был получен стабильно синтезирующий иммуногенный рекомбинантный белок NC, штамм F. tularensis 15-NC-2 с плазмидой pPNC-2 с рекомбинантным геном nc и без гена cat.
На первом этапе конструировали нуклеотидную последовательность с рекомбинантным геном nc размером 1050 п.о., фланкированную сайтами HindIII/BamHI, основываясь на нуклеотидной последовательности гена "N" из базы данных GenBank: MZ054890.1. Используя в качестве матрицы химически синтезированный рекомбинантный ген nc и праймеры FG Hind и RG Bam (таблица 1), методом ПЦР нарабатывали ампликон с рекомбинантным геном nc, который затем гидролизовали рестриктазами HindIII и BamHI и встраивали в плазмидный вектор pBlueScriptIIKS/SK(+) между сайтами HindIII и BamHI. В результате была получена плазмида pBPNC, которую вводили методом электропорации в клетки E. coli DH5α.
На втором этапе на основе вектора рРМС1 создавали плазмиду pPCNC с рекомбинантным опероном, состоящим из промоторной области гена groE и фрагмента гена fopA, кодирующего лидерную последовательность FopL белка FopA F. tularensis, и структурной части гена nc вируса SARS-CoV-2. Для этого плазмиду р17 [Kravchenko et al., 2007], содержащую, помимо репликона плазмиды рРМС1 с геном cat, промоторную область гена groE и фрагмент гена fopA, кодирующего лидерную последовательность FopL белка FopA F. tularensis, линеаризовали рестриктазой BamHI и дополнительно частично гидролизовали рестриктазой HindIII. Продукты гидролиза разделяли методом электрофореза и выделяли фрагмент HindIII-BamHI размером 4295 п.о., который затем объединяли с ампликоном с рекомбинантным геном nc, гидролизованным рестриктазами HindIII/BamHI, в кольцевую структуру. Созданную плазмиду pPCNC переносили в клетки F. tularensis 15 НИИЭГ методом электропорации. Клоны с рекомбинантной плазмидой отбирали на среде FT-агар с хлорамфениколом с последующим ПЦР-анализом с праймерами, специфичными для рекомбинантного гена nc - FG Hind/RG Bam. В результате был получен клон F. tularensis 15 (pPCNC) с плазмидой pPCNC.
На третьем этапе создавали делеционный вариант плазмиды pPCNC без гена cat. Плазмиду pPCNC гидролизовали рестриктазой XhoI и фрагменты плазмиды замыкали в кольцевые структуры лигазой фага Т4. В полученный препарат вносили плазмиду pTV24 и этой смесью трансформировали клетки F. tularensis 15 НИИЭГ методом электропорации. Селекцию трансформантов проводили на среде FT-агар с тетрациклином. Среди клонов с фенотипом TcR методом ПЦР с праймерами FG Hind и RG Bam и методом электрофоретического анализа выявляли клоны, которые, наряду с плазмидой pTV24 (13,4 т.п.о., TcR CmR)(Youngman et al.,1983), содержали плазмиду pPNC-2 (4,5 т.п.о.) с геном nc. Биплазмидный штамм культивировали в среде ЖПС, затем бактериальную культуру рассевали на FT-агар до изолированных колоний, далее среди клонов с фенотипом TcS CmS методом ПЦР выявляли клоны с рекомбинантным геном nc и без гена cat, и методом электрофореза выявляли клоны с плазмидой pPNC-2, утратившие плазмиду pTV24. Таким образом был получен чувствительный к хлорамфениколу моноплазмидный штамм F. tularensis 15-NC-2.
Синтез рекомбинантного белка NC клетками штамма F. tularensis 15-NC-2 подтверждали методом вестерн-блота с мышиными моноклональными антителами NCC6, специфичными к N-концевой части молекулы рекомбинантного белка NC, выделенного из штамма-продуцента E. coli. Наличие эпитопов в рекомбинантном белке NC, иммунологически идентичных эпитопам вирусного белка N, подтверждали методом вестерн-блота с использованием сывороток людей, переболевших коронавирусной инфекцией COVID-19. Уровень синтеза рекомбинантного белка NC клетками штамма F. tularensis 15-NC-2 определяли методом «сэндвич»-ИФА с парой мышиных моноклональных антител NCC6 и NCG10-биотин, специфичных к рекомбинантному белку NC.
Отличием предлагаемого способа конструирования штамма F. tularensis 15-NC-2, синтезирующего белок нуклеокапсида NC вируса SARS-CoV-2, на основе модификации вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ с помощью плазмиды, кодирующей рекомбинантный ген nc вируса SARS-CoV2, без селективного маркера антибиотикоустойчивости, от ранее разработанных способов получения аттенуированных штаммов F. tularensis, не содержащих селективных маркеров антибиотикоустойчивости и экспрессирующих гены гетерологичных антигенов в составе бактериальной хромосомы методом аллельного обмена в хромосоме F. tularensis, а также от использованных ранее маркированных генами антибиотикоустойчивости рекомбинантных плазмид, экспрессирующих гены гетерологичных антигенов [Kravchenko et al., 2007; Robinson et al., 2015; Jia et al., 2018] является использование рекомбинантной плазмиды без селективного маркера для экспрессии целевого гена в клетках вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ.
В результате разработанного способа был получен штамм F. tularensis 15-NC-2 без маркеров антибиотикоустойчивости, синтезирующий рекомбинантный белок NC вируса SARS-Co2, иммунологически близкий к нативному вирусному белку “N”.
Разработанный способ позволяет создавать модифицированные вакцинные штаммы F. tularensis, синтезирующие гетерологичные протективные антигены, без дополнительных генов антибиотикоустойчивости, что открывает широкие возможности использования данных штаммов F. tularensis для создания перспективных эффективных рекомбинантных вакцин для защиты организмов человека и животных от возбудителей вирусных и бактериальных внутриклеточных инфекций.
Основные свойства штамма F. tularensis 15-NC-2
Культурально-морфологические. Бактерии штамма F. tularensis 15-NC-2 представляют собой мелкие кокковидные и палочковидные клетки размерами 0,2-0,7 мкм, неподвижные, грамотрицательные, полиморфные, спор и капсул не образующие, аэробы, ауксотрофы, культивирующиеся при температуре от 15°C до 42°C в полноценных средах с глюкозой и повышенной концентрацией цистеина (FT- агар). Оптимальные условия выращивания: 37°C, рН 6,8-7,4.
Среды для культивирования штамма F. tularensis 15-NC-2: плотная питательная среде FT-агар (ФБУН ГНЦ ПМБ, Оболенск); жидкая питательная среда г/л: 5 г ферментативного гидролизата казеина, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г хлористого натрия, 12 г однозамещенного фосфата калия, рН 7,2, 1% глюкоза, 10 мг цистеина, 10 мг хлористого железа. На FT-агаре при температуре 37°C выпуклые, блестящие, гладкие, голубовато-белые, непрозрачные, однородные колонии появляются через 48 ч, а через 72 ч размер колоний достигает 2,0-2,5 мм.
Стабильность. При пересевах на плотных питательных средах штамм F. tularensis 15-NC-2 не диссоциирует, стабильно наследует рекомбинантную плазмиду и сохраняет способность синтезировать рекомбинантный белок NC.
Биохимические свойства. Клетки штамма F. tularensis 15-NC-2 утилизируют цистеин с образованием сероводорода, на среде Даунса ферментируют глюкозу и мальтозу, не ферментируют глицерин, сахарозу и лактозу. Устойчивы к эритромицину, полимиксину, пенициллину, ампициллину, чувствительны к стрептомицину, тетрациклину, доксициклину, гентамицину, канамицину, налидиксовой кислоте, не обладают цитруллинуреидазной и фосфатазной активностью. Штамм синтезирует рекомбинантный белок нуклеокапсида NC.
Условия хранения культуры штамма: культура штамма F. tularensis 15 NC-2 хранится при температуре +4°C на косяках среды FT-агара до 1 месяца.
Способ и условия хранения: штамм F. tularensis 15 NC-2 хранится в лиофильно высушенном состоянии в криозащитной среде при температуре (4-8)°C. Рекомендуемая перезакладка культуры - каждые 5 лет.
Технологические особенности при культивировании. Технологических особенностей при культивировании штамма F. tularensis 15-NC-2 в сравнении с вакцинным штаммом F. tularensis 15 НИИЭГ нет.
Изобретение иллюстрируется следующими фигурами:
Фиг. 1 - Нуклеотидная последовательность гена “N” вируса SARS-CoV-2.
Фиг. 2 - Структурная схема плазмиды p17.
Фиг. 3 - Структурная схема плазмиды pPCNC.
Фиг. 4 - Структурная схема плазмиды pPNC-2.
Фиг. 5. - Иммуноблоттинг ультразвуковых дезинтегратов рекомбинантных клонов штамма F. tularensis (pPCNC) с мышиными моноклональными антителами NCC6 к белку NC.
Фиг. 6. - Иммуноблоттинг рекомбинантного белка NC, выделенного из E. coli, с сыворотками иммунизированных штаммом F. tularensis 15-NC-2 мышей (разведение 1:40).
Пример 1. Получение ампликона со структурной частью рекомбинантного гена nc и его клонирование в векторе pBlueScriptIIKS/SK(+) в клетках E. coli.
Для клонирования ампликона со структурной частью рекомбинантного гена nc были разработаны праймеры FG Hind, (5'- aaactgcaagcttggataatggacccc -3') и RG Bam (5'-aggggatcctcaggcctgagttgagtcag-3'), комплементарные N- и С-концевой частям гена “N”, согласно нуклеотидной последовательности (фиг.1), приведенной в базе данных GenBank: MZ054890.1.
На основе синтезированной матричной ДНК рекомбинантного гена nc и праймеров FG Hind и RG Bam был получен ампликон размером 1056 п.о., фланкированный сайтами для рестриктаз HindIII и BamHI. Гидролизованный рестриктазами HindIII и BamHI ампликон был встроен между сайтами рестрикции HindIII и BamHI вектора pBlueScriptIIKS/SK(+), полученный препарат ДНК трансформировали в клетки E. coli DH5α методом электропорации. Селекцию плазмидосодержащих клонов проводили на среде LA с Ap (100 мкг/мл) и с Х-gal (20 мкг/мл). Среди бесцветных трансформантов целевые клоны с рекомбинантной плазмидой, несущей рекомбинантный ген nc, выявляли методом ПЦР с праймерами FG Hind и RG Bam и электрофоретическим анализом. В результате был получен штамм E. coli DH5α (pBNC) с плазмидой pBNC.
Пример 2. Создание плазмиды pPCNC на основе репликона плазмиды рРМС1 и гена cat, содержащей рекомбинантный оперон, состоящий из промоторной области гена groE и фрагмента гена fopA, кодирующего лидерную последовательность FopL белка FopA F. tularensis, и структурной части рекомбинантного гена nc.
Из клеток штамма E. coli DH5α (pBNC) выделяли плазмиду pBNC, гидролизовали ее рестриктазами HindIII и BamHI и после электрофоретического разделения выделяли фрагмент размером 1050 п. о с рекомбинантным геном nc. ДНК плазмиды р17 (фиг. 2), созданной на основе плазмидного вектора рРМС1, содержащей промоторную область гена groE и фрагмент гена fopA, кодирующего лидерную последовательность FopL белка FopA F. tularensis (GenBank: AM233362.1), была линеаризована рестриктазой BamHI, частично гидролизована рестриктазой HindIII и после электрофоретического разделения был выделен фрагмент размером 4295 п.о.
В результате объединения ДНК-лигазой фага Т4 в кольцевую структуру фрагмента HindIII-BamHI размером 4295 п.о. и фрагмента HindIII-BamHI с рекомбинантным геном nc размером 1050 п.о. была получена плазмида pPCNC. Созданную плазмиду переносили в клетки F. tularensis 15 НИИЭГ методом электропорации. Селекцию трансформантов проводили на FT-агаре с Cm (3 мкг/мл). Плазмидосодержащие клоны F. tularensis15(pPCNC) с рекомбинантным геном nc выявляли методом ПЦР с праймерами FG Hind и RG Bam и после рестрикционного анализа плазмид из nc (+) клонов был отобран клон с рекомбинантной плазмидой pPCNC (фиг. 3).
Пример 3. Получение делеционного варианта плазмиды pPCNC с рекомбинантным опероном nc без гена cat.
Для удаления гена cat из плазмиды pPCNC препарат плазмидной ДНК гидролизовали рестриктазой XhoI и после электрофоретического разделения фрагментов ДНК выделяли фрагмент размером 4295 п.о., который был замкнут в кольцевую структуру с помощью ДНК-лигазы фага Т4. Полученную кольцевую структуру смешивали с плазмидной ДНК pTV24 в молярном соотношении 1000:1 и ко-трансформировали в клетки F. tularensis15 НИИЭГ методом электропорации. Селекцию трансформантов проводили на среде FT-агар с Tc (10 мкг/мл). Среди тетрациклин-устойчивых клонов методом ПЦР с праймерами FG Hind и RG Bam и электрофоретическим анализом выявляли биплазмидные клоны F. tularensis, несущие рекомбинантный ген nc. Для удаления плазмиды pTV24 из биплазмидного штамма с фенотипом NC+ TcR CmR бактериальные клетки культивировали в ЖПС в течение 20 ч и культуру высевали на FT-агар до изолированных колоний. Среди выросших клонов отбирали клоны с фенотипом TcS CmS и методом электрофореза подтверждали отсутствие плазмиды pTV24 и наличие плазмиды pPNC-2 размером 4,5 т.п.о. (фиг. 4). Таким образом был получен штамм F. tularensis 15-NC-2, несущий плазмиду pPNC-2 с рекомбинантным опероном nc и без гена cat.
Пример 4. Синтез рекомбинантного белка NC клетками штамма F. tularensis15 (pPCNC).
Для детекции синтеза рекомбинантного белка NC бактериальными клетками штамма F. tularensis 15 (pPCNC) применяли метод иммуноблоттинга с использованием мышиных моноклональных антител NCC6, специфичных к N-концевому фрагменту рекомбинантного белка NC, выделенного из штамма-продуцента E. coli.
Для анализа использовали ночную культуру F. tularensis 15 (pPCNC), выращенную на FT-агаре. 50 мг биомассы суспендировали в 1 мл ЗФР и разрушали бактериальные клетки с помощью ультразвука на дезинтеграторе «Ultrasonic Homogenizer» (Cole Parmer, США) с микронасадкой при мощности 150 Вт в режиме обработки 30 с × 6 с интервалом 1 мин. Для разделения белков электрофорезом в 10% полиакриламидном геле (ПААГ) с SDS образцы лизатов смешивали с 2-кратным буфером для нанесения в соотношении 1:1 (объем/объем), кипятили в течение 10 мин и вносили в лунки геля. Для иммуноблоттинга в качестве контрольного антигена использовали рекомбинантный белок нуклеокапсида NC с молекулярной массой ≈50 кДа, выделенный из штамма-продуцента E. coli. После разделения белки из геля переносили на мембрану Hybond P (PVDF GE Healthcare, Великобритания) полусухим методом. Мембрану блокировали 1%-ным раствором БСА в течение 30 мин при температуре 4°С и затем вносили моноклональные антитела NCC6 в рабочем разведении 1:500 и инкубировали в течение 1 ч при температуре 37°С. Комплекс антиген-антитело выявляли с помощью конъюгата вторичных козьих антител к IgG мыши-пероксидаза хрена («Sigma», США). Мембрану окрашивали в растворе субстрата для пероксидазы хрена 3,3'-диаминобензидин тетрагидрохлорида (ДАБ) (AppliChem, Германия).Таким образом показано, что штамм F. tularensis15(pPCNC) с рекомбинантным опероном, состоящим из промоторной области гена groE и фрагмента гена fopA, кодирующего лидерную последовательность FopL белка FopA F. tularensis, и структурной части рекомбинантного гена nc способен синтезировать рекомбинантный белок нуклеокапсида NC с молекулярной массой 50±0,7 кДа (фиг. 5).
Пример 5. Оценка уровня синтеза рекомбинантного белка нуклеокапсида NC клетками штамма F. tularensis 15-NC-2.
Уровень синтеза рекомбинантного белка нуклеокапсида NC клетками F. tularensis 15-NC-2 определяли методом ИФА в варианте «сэндвич». Для приготовления препарата антигена была использована ночная агаровая культура, ресуспендированная в буфере 50 мМ трис-HC, 0,4 М хлорида натрия, рН 7,5 до конечной концентрации сырой биомассы 100 мг/мл и дезинтегрированная ультразвуком четырежды по 15 сек с интервалом 30 с. Разрушенную биомассу центрифугировали при 12000 об/мин в течение 5 мин и супернатант ультразвукового дезинтеграта клеток использовали для постановки ИФА. Концентрацию общего белка в супернатанте определяли с помощью набора ВСА Protein Assay Kit (Sigma-Aldrich, США).
Моноклональные антитела NCC6 с концентрацией 5 мкг/мл в карбонатно-гидрокарбонатном буферном растворе pH 9,6 вносили по 100 мкл в лунки 96-луночного планшета для ИФА Nunc-Maxisorp (Nunc, Дания) и иммобилизировали при 4°С в течение 18 ч. Неспецифическую сорбцию блокировали 5% раствором обезжиренного молока (Oxiod, Великобритания) в фосфатно-солевом буферном растворе (ФСБ) при 37°С в течение 30 мин. Готовили по три повтора двукратных серийных разведений исследуемых образцов супернатантов дезинтеграта культур F. tularensis и контрольного препарата белка NC в диапазоне концентраций 100-0,05 нг/мл, вносили в лунки с адсорбированными моноклональными антителами и инкубировали при 37°С в течение 2 ч . После промывки планшета добавляли раствор биотинилированных моноклональных антител NCG10 в рабочем разведении 1:2000 и инкубировали при 37°С в течение 1 ч. Планшет трижды промывали ФСБ с добавлением Твина-20, добавляли конъюгат стрептавидина с пероксидазой хрена (Thermo-Fisher, США) в рабочем разведении 1:10000 и инкубировали 30 мин при 37°С. После промывки вносили в лунки по 100 мкл раствора субстрата для пероксидазы хрена 3,3',5,5'тетраметилбензидина (ТМБ) (Thermo-Fisher, США) и через 5 мин инкубирования реакцию останавливали добавлением 50 мкл 0,1 М серной кислоты. Оптическую плотность ОП450 измеряли с помощью микропланшетного спектрофотометра Varioscan LUX (Thermo-Fisher, США) с коррекцией фонового поглощения при OD620. Полученные данные анализировали и строили графики с помощью компьютерной программы Sigma-Plot 12.3.
В результате было показано, что в супернатанте дезинтеграта культуры F. tularensis 15-NC-2 с концентрацией общего растворимого белка 5,65 мг/мл содержалось 2,56 мкг/мл рекомбинантного белка NC, что соответствует 0,04% от суммарной фракции растворимого белка клеток штамма F. tularensis.
Пример 6. Специфический гуморальный ответ мышей линии Balb/c, иммунизированных штаммом F. tularensis 15-NC-2, на рекомбинантный белок нуклеокапсида NC.
Для определения уровня гуморального иммунного ответа на рекомбинантный белок нуклеокапсида NC, синтезируемый клетками F. tularensis 15-NC-2, группу из 5 мышей линии Balb/c иммунизировали штаммом F. tularensis 15-NC-2 в дозе 1×105 КОЕ/мышь и через 40 сут анализировали мышиные сыворотки методом иммуноблоттинга с рекомбинантным белком нуклеокапсида NC, выделенным из E. coli (фиг. 6).
Согласно полученным данным, в сыворотках крови мышей линии Balb/c, иммунизированных штаммом F. tularensis 15-NC-2 в дозе 1×105 КОЕ/мышь, через 40 сут присутствовали специфические антитела к нуклеокапсиду NC.
Пример 7. Специфический клеточный иммунный ответ на рекомбинантный белок нуклеокапсида NC мышей линии Balb/c, иммунизированных штаммом F. tularensis 15-NC-2.
Специфический клеточный ответ у иммунных мышей линии Balb/c оценивали по уровню синтеза интерферона спленоцитами, активированными рекомбинантным белком нуклеокапсида NC. Группу из 5 мышей линии Balb/c иммунизировали подкожно штаммом F. tularensis 15-NC-2 в дозе 1×105 КОЕ/мышь, а в качестве контрольной группы иммунизировали группу из 5 мышей линии Balb/c штаммом F. tularensis 15НИИЭГ в дозе 1×102 КОЕ/мышь. Через 40 сут после иммунизации от мышей были выделены спленоциты. В лунки 96-луночного планшета для культуры клеток вносили суспензию спленоцитов в количестве 105 кл/лунку, добавляли 100 мкл рекомбинантного белка нуклеокапсида NC в концентрации 5 мкг/мл или ультразвукового дезинтеграта бактериальной суспензии в концентрации 108 КОЕ/мл штамма F. tularensis 15 НИИЭГ и инкубировали в среде RPMI 1640 (GIBCO Invitrogen, Великобритания) с добавлением 10 мкг/мл гентамицина (GIBCO Invitrogen, Великобритания) в атмосфере CO2 5% при 37°С в течение 48 ч. В качестве положительного контроля использовали ConA (Sigma-Aldrich, США) в концентрации 5 мкг/мл, в качестве отрицательного контроля использовали среду RPMI 1640.
Уровень секреции IFN-γ активированными спленоцитами оценивали с помощью набора Mouse IFN-Gamma ELISA Kit по методике фирмы-производителя (Invitrogen ThermoFisher Scientific, США). Оптическую плотность в лунках определяли на планшетном спектрофотометре MultiscanFC (ThermoFisher, США) при длине волны 450 нм.
Показано, что иммунизация мышей рекомбинантным и контрольным штаммами F. tularensis приводит к формированию выраженного клеточного иммунного ответа на суммарный антиген ультразвукового дезинтеграта бактериальной суспензии штамма F. tularensis 15 НИИЭГ (13,4 нг/мл для контрольного штамма и 20,7 нг/мл для рекомбинантного штамма). Активация препаратом ConA спленоцитов сравниваемых групп иммунных мышей находилась на сходных уровнях (5,7 нг/мл для контрольного штамма и 3,6 нг/мл для рекомбинантного штамма). Уровень секреции IFN-γ активированными спленоцитов иммунизированных рекомбинантым штаммом мышей достоверно отличался от мышей, иммунизированных контрольным штаммом (981 и 27,6 пкг/мл, соответственно)
Claims (1)
- Способ получения бактериального продуцента рекомбинантного белка нуклеокапсида NC вируса SARS-CоV-2, заключающийся в конструировании плазмиды pPNC-2 на основе стабильного репликона вектора рРМС1 с рекомбинантным опероном гена nc, состоящим из промоторной области гена groE и лидерной последовательности гена fopA F. tularensis, объединенных со структурной частью рекомбинантного гена nc, кодирующего рекомбинантный белок нуклеокапсида NC вируса SARS-CоV-2, в три этапа: сначала был создан рекомбинантный оперон, который был встроен в стабильный плазмидный вектор pPMC1 с селективным маркером устойчивости к хлорамфениколу cat, после удаления из плазмиды pPCNC фрагмента ДНК с геном cat была получена плазмида pPNC-2, которая была перенесена в клетки вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ методом ко-трансформации с нестабильно наследуемой туляремийным микробом плазмидой pTV24, и после селекции был получен штамм-продуцент F. tularensis 15-NC-2 без гена cat, синтезирующий иммуногенный рекомбинантный белок нуклеокапсида NC, способный индуцировать специфический гуморальный и клеточный иммунный ответ у экспериментальных мышей линии Balb/c.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2812347C1 true RU2812347C1 (ru) | 2024-01-30 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2766292C1 (ru) * | 2021-08-05 | 2022-03-14 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток и предприятие по производству бактерийных препаратов" Федерального медико-биологического агентства (ФГУП СПбНИИВС ФМБА России) | Состав вакцины против covid-19 |
| RU2021131096A (ru) * | 2021-10-25 | 2023-04-25 | Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран) | Способ получения и очистки функционально активного рекомбинантного белка nsp1 sars-cov-2 и способ идентификации потенциальных лекарственных соединений против covid-19 направленных на ингибирование nsp1 |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2766292C1 (ru) * | 2021-08-05 | 2022-03-14 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток и предприятие по производству бактерийных препаратов" Федерального медико-биологического агентства (ФГУП СПбНИИВС ФМБА России) | Состав вакцины против covid-19 |
| RU2021131096A (ru) * | 2021-10-25 | 2023-04-25 | Федеральное Государственное Бюджетное Учреждение Науки Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук (Имб Ран) | Способ получения и очистки функционально активного рекомбинантного белка nsp1 sars-cov-2 и способ идентификации потенциальных лекарственных соединений против covid-19 направленных на ингибирование nsp1 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3633933B2 (ja) | 弱毒化細菌における組換え融合タンパク質の発現 | |
| JPH10501987A (ja) | パピローマウイルス用ポリヌクレオチドワクチン | |
| EA012037B1 (ru) | Поливалентные вакцины, содержащие рекомбинантные вирусные векторы | |
| CN113845576B (zh) | 重组猫疱疹病毒1型gB-gD蛋白及其应用 | |
| JPH03504336A (ja) | 組換えポックスウイルス及び連鎖球菌ｍタンパク質ワクチン | |
| CN111925452B (zh) | 猪肺炎支原体基因工程亚单位疫苗、其制备方法及应用 | |
| CN112921005B (zh) | 一株杂交瘤细胞株及其产生的犬细小病毒vp2蛋白单克隆抗体和应用 | |
| US10125175B2 (en) | Method for enhancing immunogenicity of epitope peptide of HPV antigen, virus-like particle, and method for preparing HPV vaccine | |
| CN109303916A (zh) | 焦亡相关蛋白gsdmd在制备菌蜕疫苗中的应用 | |
| JPH04504656A (ja) | ボルデテラワクチン | |
| Sremac et al. | Recombinant gas vesicles from Halobacterium sp. displaying SIV peptides demonstrate biotechnology potential as a pathogen peptide delivery vehicle | |
| EA001092B1 (ru) | Выделенные последовательности днк, кодирующие капсидные белки l1 и l2 папилломавируса человека типа 18, вектор для экспрессии последовательностей днк, способ получения вирусоподобных частиц и способ индуцирования иммунного ответа | |
| CN113403329B (zh) | 一种用于猫冠状病毒的rna疫苗及其构建方法 | |
| RU2630620C2 (ru) | Вакцинация с помощью рекомбинантных дрожжей с формированием защитного гуморального иммунного ответа против определенных антигенов | |
| KR20160150277A (ko) | 돼지 유행성 설사 바이러스 유래 수용성 재조합 항원 단백질 및 이를 포함하는 돼지 유행성 설사 예방 또는 치료용 백신 조성물 | |
| CN117431200A (zh) | 一种在芽孢表面展示新城疫病毒hn蛋白的重组枯草芽孢杆菌、构建方法及应用 | |
| RU2812347C1 (ru) | Способ получения бактериального продуцента рекомбинантного белка нуклеокапсида nc вируса sars-cov-2 | |
| CN107936123A (zh) | 一种猪传染性胃肠炎病毒融合蛋白及其制备方法和应用 | |
| CN110016457B (zh) | 一株重组细粒棘球蚴Eg95基因的粗糙型布鲁氏菌及其疫苗生产方法 | |
| CN111454989A (zh) | 一种嵌合型基因i型乙型脑炎病毒病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用 | |
| CN105566475B (zh) | 日本血吸虫重组蛋白及其制备方法和应用 | |
| CN112094354B (zh) | 副鸡禽杆菌基因工程亚单位疫苗、其制备方法及应用 | |
| CN113896773B (zh) | 重组fcv抗原及猫嵌杯病毒基因工程亚单位疫苗 | |
| CN116785418A (zh) | 一种鱼源无乳链球菌亚单位疫苗及其制备方法与应用 | |
| CN101988058B (zh) | 一种基因表达组合物、猪生殖与呼吸道综合症口服疫苗及其制备方法 |