CN117801079A - 一种猫鼻气管炎病毒阳性血清及其制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种猫鼻气管炎病毒阳性血清及其制备方法。所述制备方法以兔或豚鼠作为免疫动物，采用鼻气管炎病毒gB、gC和gD基因抗原优势区域串联重组蛋白作为抗原进行免疫。采用本发明所述工艺制备的猫鼻气管炎病毒阳性血清中和效价高达1：2048倍以上且可满足ELISA、IFA和WB试验需求，本发明制备的猫鼻气管炎病毒阳性血清纯净性好，无菌、无支原体、无外源病毒污染，特异性强。同时，免疫动物为兔或豚鼠，为标准试验动物，降低了成本，减少了用猫制备阳性血清因同源动物而引起的外源病毒污染风险。本发明制备的阳性血清可用于猫鼻气管炎病毒疫苗质量控制如特异性检验和外源病毒检验以及诊断检测等用途。
Description
技术领域
本发明属于生物技术和动物病毒学领域，尤其涉及一种猫鼻气管炎病毒阳性血清的制备及应用。
背景技术
猫疱疹病毒1型(FHV-1)能够引起猫急性和高度接触性的传染病，即猫传染性鼻气管炎FHV-1病毒属疱疹病毒科，FHV感染的典型临床症状是体温升高、打喷嚏、咳嗽、角膜结膜炎、鼻眼浆液性或脓性分泌物和眼周皮肤溃疡。在幼猫和成年猫中均可发生，主要感染2～4个月龄，发病率高达100％，成年猫不引起死亡，幼猫死亡率可达50％，是目前已知最严重的猫呼吸道疾病之一。患病猫康复后可持续带毒，造成持续性感染或潜伏感染。FHV-1基因组编码多种蛋白质，已报道了17种病毒特异性蛋白和3种具有免疫原性的糖蛋白。其中的gB、gC和gD是具有免疫原性的糖蛋白。
已发文章和专利中尚未有猫鼻气管炎病毒阳性血清制备方法的报道和专利，所涉及的猫鼻气管炎病毒阳性血清数据，多为猫免疫后产生的抗体数据，但此种抗体效价低，且存在同源动物而引起同源其他外源病毒的污染。
发明内容
本发明通过对免疫程序的摸索，提供了一种针对猫鼻气管炎病毒高效价、高纯净性，特异性良好的阳性血清的制备工艺，所制备血清满足外源病毒检验、特异性检验等试验要求，以及为后期相关检测及预防产品的开发奠定了基础，对于兽用生物制品企业有重要的实际应用价值。
(一)要解决的技术问题
为了提升猫鼻气管炎病毒特异性阳性血清的效价，满足猫鼻气管炎病毒疫苗质量控制、诊断和预防技术需求，本发明提供了一种猫鼻气管炎病毒特异性阳性血清及其制备方法。
(二)技术方案
本发明第一方面提供一种猫鼻气管炎病毒gB-gC-gD串联重组蛋白，其序列为SEQID NO.1所示氨基酸序列。
在本发明中，重组蛋白也叫融合蛋白或重组融合蛋白，是通过DNA重组技术得到的三个基因抗原优势区域重组后的表达产物。具体为大肠杆菌表达系统表达的目的蛋白分子量约为70KD左右，在菌体破碎后沉淀物中高度表达。
gB、gC和gD蛋白是猫疱疹病毒主要的免疫原性抗原，可诱发和启动机体免疫系统产生免疫应答，诱导宿主细胞产生中和抗体，因此将gB、gC和gD蛋白主要抗原区域融合在一起表达，不仅能够提高中和抗体效价，还能减少与其他病原体的交叉反应。
在本发明的一些实施方案中，优选地，所述重组蛋白由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列组成。
本发明的第二方面提供一种编码本发明第一方面所述重组蛋白的基因，其包括SEQ ID NO.2所示核苷酸序列。
该基因序列是为了在大肠杆菌中表达所述重组蛋白，根据大肠杆菌对密码子的偏好性，对密码子进行了优化。不同物种对同义密码子的使用频率是不同的，而这种密码子偏好性对翻译过程有影响。如果一条mRNA有很多成簇的稀有密码子，这会对核糖体的运动速度造成负面影响，大大降低蛋白表达水平。在此对基因序列进行密码子优化，适用于大肠杆菌表达。
本发明首先提供了一种猫鼻气管炎病毒gB-gC-gD重组蛋白。
本发明又提供了所述猫鼻气管炎病毒gB-gC-gD重组蛋白在制备猫鼻气管炎病毒特异性阳性血清中的应用。
本发明再提供一种猫鼻气管炎病毒特异性阳性血清的制备方法，以兔或豚鼠作为免疫动物。
优选地，依次采用所述猫鼻气管炎病毒gB-gC-gD重组蛋白对免疫动物进行基础免疫；更优选所述猫鼻气管炎病毒gB-gC-gD重组蛋白，基础免疫时抗原含量为800μg/ml。
进一步优选地，所述基础免疫的免疫次数为2次，间隔时间为7～14天。每次免疫剂量为2ml/只；免疫方式为肌肉或皮下注射，免疫部位腿部肌肉或背部皮下。
作为优选，所述免疫动物为兔或豚鼠。
在所述基础免疫之后，还包括加强免疫，作为优选方案，所述加强免疫具体包括：采用猫鼻气管炎病毒gB-gC-gD重组蛋白对所述免疫动物进行加强免疫；更优选所述重组蛋白抗原含量为500μg/ml。
进一步优选地，所述加强免疫的免疫次数为2次，间隔时间为7～14天。加强免疫，每次免疫剂量为2ml/只；免疫方式为肌肉或皮下注射；免疫部位腿部肌肉或背部皮下。
按照本领域常识，在所述免疫接种后，还包括采集血清和测定效价的步骤，其中，采集血清的时间一般根据免疫接种的间隔时间进行确定，在此不做进一步限定。
在本发明的一些实施方案中，一般在最后一次免疫后14～21天，无菌采集免疫动物血液，分离血清，测定血清中和抗体效价，效价在1：2048以上，即得猫鼻气管炎病毒阳性血清。
本发明中的血清经过纯净性、支原体、外源病毒检测合格后，分装，贴上标签，注明血清名称、规格、日期等，-20℃以下保存。可用于鉴别检验、外源病毒检验和诊断等方面。
本领域人员可对本发明的优选方案进行组合，得到本发明的较佳实施例。
(三)有益效果
(1)本发明所制得的猫鼻气管炎病毒特异性阳性血清效价高达1：2048倍以上，比直接免疫猫所得血清效价高，可满足猫鼻气管炎病毒诊断技术和疫苗质量控制的要求。
(2)本发明中免疫动物为兔或豚鼠，均为标准试验动物，降低了成本，避免了用猫制备阳性血清所带来的符合要求的试验动物不易获得并且因同源动物所引起的其他外源病毒污染的风险。
(3)本发明所制备猫鼻气管炎病毒特异性阳性血清采用的是大肠杆菌表达的免疫原性蛋白，抗原制备过程安全、抗原含量可控，制备成本低，避免采用猫鼻气管炎病毒制备抗原带来的散毒风险，制备成本高的不足。
(4)免疫效价高达1：2048倍以上，比直接免疫猫所得血清效价高，可满足猫鼻气管炎病毒诊断技术和疫苗质量控制的要求。
(5)本发明制备的猫鼻气管炎病毒阳性血清纯净性好，无菌、无支原体、无外源病毒污染，特异性强。
(6)本发明制备的阳性血清可用于猫鼻气管炎病毒疫苗质量控制如特异性检验、鉴别检验和外源病毒检验以及诊断检测等用途。
附图说明
图1为纯化FHV-gB-gC-gD重组蛋白SDS-PAGE结果；
图2为纯化FHV-gB-gC-gD重组蛋白的SDS-PAGE结果；
图3为不同重组蛋白阳性血清的ELISA效价检测结果。
图4为FHV兔阳性WB反应性鉴定结果；FHV感染细胞样品分别与FHV-gB-gC-gD(A)、FHV-gB-gD(B)、FHV-gB-gC(C)、FHV-gD-gC(D)多抗血清反应。(图4中，蛋白质分子质量标准；1：与gB+gD血清反应；2：与gC+gD血清反应；3：与gB+gC血清反应；4：与gB+gC+gD血清反应。
图5为FHV兔阳性IFA反应性鉴定及效价检测结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
实施例1、猫鼻气管炎病毒重组蛋白的表达、鉴定
1.重组蛋白的表达及制备
利用DNAstar软件Protean对FHV病毒gB、gD和gC蛋白进行抗原表位相关信息的分析，主要包括抗原性分析(Antigenicity)、可接近性分析(Accessibility),亲水性分析(Hydrophilioity)、主键柔初性性(Flexibility)和抗原表位的定位(D eterminant)，初步预测可能的抗原优势区域，将预测的核苷酸片段以linker进行串联，按大肠杆菌偏爱的密码子，对串联的核苷酸序列进行了优化设计和人工合成。
重组蛋白核苷酸序列分别是SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID、No.5SEQ IDNo7，重组蛋白氨基酸序列分别是SEQ ID No.2、SEQ IDNo.4.、SEQ ID No.6.、SEQ IDNo.8.，分别记为FHV-gB-gC-gD、FHV-gB-gD、FHV-gB-gC、FHV-gC-gD。
对体外合成的蛋白基因片段，采用NdeⅠ和HindⅢ，并与相同处理的pET-30a(+)表达载体进行连接，将获得的重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，筛选阳性克隆。将鉴定为阳性的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，分别挑取含有特异性蛋白表达质粒的阳性单菌落、接种含卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡过夜后，筛选阳性重组菌命名为pET30-gB-gC-gD、pET30-gB-gD、pET30-gB-gC、pET30-gC-gD。
2.表达结果鉴定
FHV重组蛋白的SDS-PAGE表达鉴定结果显示，与诱导前对照相比，重组菌在IPTG诱导后，FHV-gB-gC-gD表达产物主要为不可溶性表达。重组蛋白的最适诱导表达条件为：将pET30-gB-gC-gD、pET30-gB-gD、pET30-gB-gC、pET30-gC-gD分别在37℃诱导4小时，收获菌体及上清。通过考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶扫描分析估计，该重组蛋大小约为70kDa，见图1。
3.纯化结果及特异性鉴定
对表达的猫鼻气管炎病毒重组蛋白进行纯化，蛋白纯化按照BeyoGoldTMHis-tagPurification Resin试剂盒蛋白纯化方法进行。将收集的样品用超滤法(超滤管)浓缩，纯度＞90％，见图2。
实施例2、猫鼻气管炎病毒阳性血清制备方法及其效果验证
1.猫鼻气管炎病毒亚单位疫苗的制备
1)将表达、纯化的猫鼻气管炎病毒重组蛋白FHV-gB-gC-gD、FHV-gB-gD、FHV-gB-gC或FHV-gC-gD，浓度分别调整为800μg/ml、1000μg/ml。
2)佐剂的配制：
按软脂酸∶角鳖烯∶吐温80∶司盘85＝15：15：7：63的重量比例称取，于恒温磁力搅拌水浴锅(80℃)中加热融化，搅拌均匀得油相。再按重量百分含量0.1％称取壳聚糖，溶于柠檬酸缓冲液(10mmol/L，pH 6.5)中，于80℃水浴中加热得水相。在磁力搅拌下，将油相加入热的水相中，(油相∶水相＝1∶10)。待搅拌均匀后，使用高剪切仪于12000r/min转速下剪切5分钟得到粗分散佐剂。然后使用超声破碎仪在300W振幅下破碎20分钟得初乳化佐剂。
3)亚单位疫苗配制：FHV-gB-gC-gD、FHV-gB-gD、FHV-gB-gC或FHV-gC-gD抗原液(1000μg/ml)分别与初乳佐剂按体积比1∶1混合，12000r/min转速下剪切1分钟，冰水浴10分钟，固化得FHV-gB-gC-gD、FHV-gB-gD、FHV-gB-gC或FHV-gC-gD猫鼻气管炎病毒重组蛋白亚单位疫苗，疫苗中FHV-gB-gC-gD、FHV-gB-gD、FHV-gB-gC或FHV-gC-gD猫鼻气管炎病毒重组蛋白抗原含量为500ug/ml。
2.猫鼻气管炎病毒阳性血清的制备。
1)基础免疫：分别对每只兔皮下注射2ml的猫鼻气管炎病毒重组蛋白FHV-gB-gC-gD、FHV-gB-gD、FHV-gB-gC或FHV-gC-gD(800μg/ml)，7～14天后，同样剂量同样方法进行再次免疫。
2)加强免疫：基础免疫后每隔14天后分别对每只兔进行皮下注射2ml猫鼻气管炎病毒亚单位疫苗(500μg/ml)，免疫2次。
3.采集血清。
最后一次免疫14天后，无菌采集免疫动物血液，分离血清，分别获得FHV-gB-gC-gD、FHV-gB-gD、FHV-gB-gC或FHV-gC-gD为抗原制备的阳性血清。
血清的检验：对上述制备的阳性血清样品分别进行无菌检验、支原体检验、外源病毒检验、中和效价测定、特异性检验。特异性检验主要针对猫泛白细胞减少症病毒、猫杯状病毒等常见猫病原。结果显示所制备的阳性血清均为淡黄色澄清液体，无明显溶血或异物；无菌、无支原体、无外源病毒污染；未检测到猫泛白细胞减少症病毒、猫杯状病毒抗体，特异性良好。检验合格的血清混合，分装，贴上标签，注明血清名称、规格、日期等，-20℃以下保存。
4.按照现行《中国兽药典》规定的方法进行中和试验测定血清中和200TCID50猫鼻气管炎病毒的中和效价。结果显示，以FHV-gB-gC-gD为抗原免疫后所产生的阳性血清效价最高与FHV灭活后制备的抗原免疫后所产生的阳性血清中和抗体效价一致，均可达到1∶2048；其次是FHV-gB-gD对应的阳性血清，中和抗体效价为1∶1024；较低的为FHV-gB-gC和FHV-gC-gD对应的阳性血清，中和抗体效价为1∶512。
表1阳性血清中和抗体效价
| 抗原 | 中和抗体效价 |
| FHV-gB-gC-gD | 1：2048 |
| FHV-gB-gD | 1：1024 |
| FHV-gB-gC | 1：512 |
| FHV-gC-gD | 1：512 |
5.阳性血清ELISA效价检测
将纯化的灭活FHV病毒用包被液稀释至10μg/ml，以100μL/孔加入ELISA酶标板内，4℃包被过夜；弃孔内液体，PBST洗5遍，50g/L脱脂奶37℃封闭1h；弃孔内液体，PBST洗5遍，将阳性血清用PBS进行二倍比稀释，即1∶200～1∶102400，100μL/孔，37℃孵育1h；弃孔内液体，PBST洗5遍，加入1：10000稀释的HRP羊抗兔二抗，37℃孵育1h；弃孔内液体，PBST洗5遍，加入TMB显色，100μL/孔，37℃避光反应15min后，每孔加入50μL终止液，立即进行OD450nm值的读取；计算阳性血清与阴性血清OD450nm的比值(P/N)，当P/N≥2.1时判定为阳性，将阳性结果对应的抗体最高稀释倍数作为抗体的效价。
采用间接ELISA方法对三免后的兔抗FHV阳性血清进行效价测定，结果发现五种多抗的ELISA效价各不相同，其中FHV灭活病毒的血清抗体效价最高，不低于1∶409600；其次为FHV-gB-gC-gD的血清抗体，其效价可达1∶204800；FHV-gB-gD、FHV-gB-gC和FHV-gC-gD的血清抗体效价分别为1∶25600、1∶25600和1∶12800(图3)。
6.多抗WB反应性鉴定
将FHV感染F81细胞，24h后收集细胞样品，加入120μl细胞裂解液(50g/l SDS+10ml/l TritonX-100)，吹打混匀后再加入40μl 4×loading buffer，混匀后100℃处理样品15min。将蛋白样品于4℃12000r/min离心10min，取10μl上样用于SDS-PAGE；半干法25V1.2mA/cm 2转0.45μm硝酸纤维素膜30min；50g/L脱脂奶室温封闭1h；将兔抗FHV阳性血清以1∶500体积进行稀释，于4℃孵育5h；PBST洗膜3次；用HRP羊抗兔二抗(1∶10000稀释)室温孵育1h；PBST洗膜3次；加ECL反应液显色并观察结果。结果显示，将兔多抗血清按1∶500稀释后分别与FHV株感染的细胞样品反应，WB检测结果发现FHV-gB-gC-gD、FHV-gB-gD、FHV-gB-gC、FHV-gC-gD制备的血清抗体均与FHV感染样品有较好的反应性(图4)。
7.阳性血清IFA反应性鉴定
将FHV感染F81细胞，24h后弃培养上清，每孔加入100μl V(甲醇)∶V(丙酮)＝1∶1固定液，-20℃固定20min，弃去固定液；每孔加100μl50g/L脱脂奶，室温封闭1h；弃封闭液，用PBS按1∶200～16400稀释多抗，每孔加100μL，37℃孵育2h，PBST洗3遍；避光，每孔加100μL50g/L PBS稀释的FITC羊抗兔抗体(1∶500稀释)，37℃孵育30min，PBST洗3遍；荧光显微镜观察实验结果。结果显示，将兔抗FHV阳性血清按二倍比稀释后分别与FHV感染的细胞样品进行孵育，对各多抗的IFA反应性进行鉴定，结果发现FHV-gB-gC-gD抗体，其IFA反应效价可达1∶800，当1∶200稀释时可以获得理想的荧光信号；FHV-gB-gD、FHV-gB-gC和FHV-gC-gD抗体在1∶200的稀释倍数下与FHV的反应性仍然较弱(图5)。上述结果表明，虽然这四种抗体的WB反应性和效价均较好，但只有FHV-gB-gC-gD抗体具有较好的IFA反应性。而由FHV-gB-gC-gD所制备的阳性血清IFA反应敏感，效价高，特异性强。并且，全病毒抗原制备过程复杂，抗原成分不单一，阳性血清非特异性强。
而本研究采用抗原优势区域串联的重组蛋白为抗原来制备的多抗，其优势在于：制备容易，成分简单，所产生的抗体效价高，特异性好。
此外，与单抗相比，此方法制备的阳性血清周期短，成本低，成功效率高，试验难度低。
实施例3、阳性血清在猫鼻气管炎病毒外源病毒检验中的应用
选取本发明实施例2由FHV-gB-gC-gD所制备的中和效价为1:2048的阳性血清分别用于猫鼻气管炎病毒的外源病毒检验(病毒含量分别为108.0TCID50/ml、108.5TCID50/ml)。按照现行《中国兽药典》三部附录方法，取1ml稀释病毒液与阳性血清进行中和，然后进行外源病毒检验。结果：所有样品均未出现中和不完全的现象，且阳性血清未造成细胞毒性。
Claims (8)
1.猫鼻气管炎病毒重组蛋白，为猫鼻气管炎病毒gB、gC和gD基因抗原优势区域串联重组蛋白。
2.根据权利要求1所述的猫鼻气管炎病毒重组蛋白，其特征在于，所述猫鼻气管炎病毒重组蛋白的序列为序列表中序列1。
3.权利要求1或2所述的猫鼻气管炎病毒重组蛋白的编码基因，其特征在于，所述编码基因的序列为序列表中序列2。
4.权利要求1或2所述的猫鼻气管炎病毒重组蛋白在制备猫鼻气管炎病毒高效价阳性血清中的应用。
5.一种猫鼻气管炎病毒阳性血清的制备方法，其特征在于，用猫鼻气管炎病毒重组蛋白为抗原对免疫动物进行基础免疫；采集免疫动物血液并制备血清，得到猫鼻气管炎病毒阳性血清；所述免疫动物为兔或豚鼠；所述猫鼻气管炎病毒重组蛋白为权利要求1或2所述的猫鼻气管炎病毒重组蛋白。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述基础免疫的免疫次数为2次，每毫升疫苗中含抗原蛋白800μg，免疫剂量为2ml/次。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：在所述基础免疫之后，还包括加强免疫2次，所述加强免疫具体包括：采用猫鼻气管炎病毒重组蛋白亚单位疫苗，每毫升疫苗中含抗原蛋白500μg，对所述免疫动物进行加强免疫；每次免疫剂量为2ml/次；两次免疫间隔时间为7～14天；
优选的,所述猫鼻气管炎病毒亚单位疫苗的制备方法如下：将表达、纯化的猫鼻气管炎病毒重组蛋白，与佐剂混合制得。
8.权利要求5～7中任意一项所述的方法制备的猫鼻气管炎病毒阳性血清。
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