CN103724419B - 一种猪脾转移因子纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种猪脾转移因子纯化方法，包括以下步骤：先将新鲜的、去除了结缔组织和脂肪的猪脾脏绞碎，再利用高压均质机对绞碎的糜状物进行均质化处理，而后进行适当稀释，再利用管式膜过滤系统过滤、超滤操作。本发明采用高压均质机快速破碎细胞，无需冻融步骤，能更有效缩短生产周期；选用管式膜过滤装置进行第一次过滤，由于其流道较宽、属于错流过滤，因此过滤效果更好、过滤速度更快、可以有效澄清料液；在管式膜过滤操作中向待过滤物中定期补加纯化水，相比于单纯的过滤操作能够显著提高收率。此外，本发明工艺简单、机械化程度较高，适于规模化生产需求，具有突出的推广前景。

Description

一种猪脾转移因子纯化方法

技术领域

本发明涉及兽用生物制品领域，尤其涉及一种猪脾转移因子制备方法。

背景技术

转移因子（Transferfactor，简称TF）是淋巴细胞释放的一种能够转移致敏信息的物质，它能够特异地将供体的细胞免疫信息转移给受体，从而增强受体的免疫功能，目前其在国外已成为一种应用广泛的增强免疫制剂。

转移因子存在于脾脏的淋巴细胞中，现有技术的转移因子制备方法普遍是将动物脾脏进行绞碎、破坏细胞结构使胞内转移因子释放到浆液中，再将浆液中的转移因子进行分离精制最终得到转移因子产品。

动物脾脏浆液成分复杂，因此动物TF不易分离纯化；动物TF分子量一般在3～15KD，属于小分子多肽，不含蛋白质，含6种以上氨基酸；不同动物和不同抗原特异性TF的分子量、肽分子大小和氨基酸种类略有差别；TF无热原；TF的活性不被胰酶所破坏；TF的活性对热不稳定，在冷冻条件下稳定。

鉴于以上特点，目前制备转移因子的现有技术主要采用透析法（Laurence法）或过滤法。

朱天新等先将组织绞碎，再冻融破碎，分别用Lanrence法和pH调节-超滤法提取转移因子，结果显示匀浆液冻融次数对转移因子的得率和质量有较大的影响，pH调节-超滤法适合于转移因子的大规模生产；顾平和陈德有先将脾脏组织研磨破碎，再冻融破碎，之后，使用絮凝剂和助滤剂作用微滤、超滤，该工艺操作简单，生产周期短，操作费用低，产量高，可以大规模工业化生产的新工艺。

中国专利申请“口服转移因子”（专利申请号:93121184.0）公开生产方法：将新鲜健康猪脾脏匀浆、冻融、透析、过滤除菌，制成转移因子原液；“一种抗小鹅瘟病毒转移因子的制备方法”（专利申请号:201210136306.0）公开一种制备特异性转移因子的方法：将免疫后的猪脾脏进行清洗、匀浆、冻融破碎，经过滤、超滤后获得原液；“一种猪脾转移因子注射液的生产方法”（专利申请号：201110126248.9）中使用匀浆、低温超声破碎、离心、超滤工艺提取转移因子；“制备转移因子的工艺方法-全滤法”（专利申请号:200310118439.6）则采用压滤、超滤、纳滤几种方法连续过滤的制备工艺；“制备转移因子的工艺方法——加热法”（专利申请号:200410039444.2）连续采用多种过滤法，增加加热处理的步骤；“一种抗鸡新城疫病毒转移因子的制备方法”（专利申请号:200810053541.5）用组织捣碎机、冻融、离心、超滤法制备工艺；“抗流感病毒转移因子的制备”（专利申请号:200610035059.X）用组织捣碎机捣碎、低温冻融、离心、中空纤维管超过滤的制备工艺；“静脉注射用转移因子制备工艺流程”（专利申请号:200410046404.0）使用冻融法和全滤法生产注射液，下游亦使用超滤进行截留筛分。

通过以上现有技术的技术方案可以发现，透析法是指对动物脾脏匀浆的上清液进行若干次透析，实现对转移因子的分离纯化，此法操作简单，但生产周期长，操作费用高，难以进行工业化大规模生产；相对而言过滤法的生产周期较短、自动化程度较高，但是却存在收率较低的问题，其主要原因在于过滤步骤本身造成的转移因子损失，因此有必要开发一种猪脾转移因子纯化工艺，能够在保证过滤法工艺优势的基础上减少过滤步骤造成的转移因子损失，从而提升生产效率。

发明内容

为克服现有技术的技术缺陷，本发明提供一种利用管式膜过滤装置进行微滤的猪脾转移因子纯化方法，微滤过程中定期补加纯化水从而有效减少过滤步骤中的功效成分损失。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种猪脾转移因子制备方法，包括以下步骤：

1)将猪脾脏经绞肉机绞碎，粗绞得到肉糜，加入0.1～0.5倍质量的纯化水，经胶体磨充分研磨，而后继续加入纯化水直至本步骤所加入的纯化水总质量为肉糜总质量的1.4～1.6倍为止，混合均匀，即得到匀浆待用；

2)利用高压均质机对步骤1）得到的匀浆进行均质处理，均质处理过程中浆液温度不高于40℃；

3)将步骤2）均质处理后的匀浆与纯化水以1:0.4（w:v）比例混合均匀，混合过程温度不高于35℃，得到浆液混合物待用；

4)利用管式膜过滤装置以100KD孔径对步骤3）得到的浆液混合物进行过滤，过滤期间每滤出步骤3）得到的浆液混合物总体积1/7倍体积的滤液时，向剩余浆液混合物中补加步骤3）得到的浆液混合物总体积1/7倍体积的纯化水，继续过滤，直至收集到步骤3）得到的浆液混合物总体积10/7～11/7倍体积的滤液，即为待超滤液，停止过滤；

5)利用超滤系统，以5KD孔径对步骤4）得到的待超滤液进行超滤，收集滤液即为转移因子原液。

上述技术方案中，步骤1）所述的猪脾脏为新鲜的、去除了结缔组织和脂肪的猪脾脏；步骤4）中纯化水补加次数为8～10次。

上述管式膜过滤装置和超滤系统均由天津膜天膜工程技术有限公司制造。纯化水标准参照《中华人民共和国兽药典》的规定。

上述技术方案中，管式膜是膜组件的一种形式，适用于超滤、微滤、纳滤和反渗透等膜分离技术，现已被广泛用于电泳漆涂装生产线、果汁澄清、油田回灌水的处理及各种物。其优点是：流道宽，采用错流过滤，粗大的膜管直径，允许高污染的料液在其中高速流动；料液的预处理精度要求低，即使是高固含量的料液，也可最大限度地清洁膜表面，减少污垢在膜表面堆积阻塞；组件的压力损失小，其流道可以加长，过滤效率相对可以提高；膜的使用寿命长，独特的膜支撑体结构防止膜破裂。

在管式膜过滤步骤中，通过向待过滤物中定期补加纯化水，可以起到稀释、冲洗、提高过滤效果的作用，从而提升转移因子收率，同时还可以维持料液温度处于适宜范围、提升废液中其他有效成分的回收率。

本发明采用高压均质机快速破碎细胞，无需冻融步骤，能更有效缩短生产周期；选用管式膜过滤装置进行第一次过滤，由于其流道较宽、属于错流过滤，因此过滤效果更好、过滤速度更快、可以有效澄清料液；在管式膜过滤操作中向待过滤物中定期补加纯化水，相比于单纯的过滤操作能够显著提高收率。此外，本发明工艺简单、机械化程度较高，适于规模化生产需求，具有突出的推广前景，纯化得到的转移因子原液可以用于制备非特异性免疫调节剂，用于增强动物机体免疫功能。

具体实施方式

实施例1

1)将冷冻的猪脾脏约65.0kg表面包装去掉，然后用纯化水过夜解冻；

2)第二天使用纯化水冲洗脾脏，挑拣出不合格脾脏，去除筋膜、脂肪等大块组织；

3)称量以6.0kg/份脾脏经绞肉机绞碎，粗绞2遍；

4)每2份混合，加入0.3倍质量（3.6kg）的纯化水，混匀，依次经斜行齿胶体磨研磨2遍，菱形齿胶体磨研磨1遍，放入洁净盛料桶，共装5桶；剩余脾脏回收冷冻保存；

5)再向每桶中补加1.2倍质量（14.4kg）的纯化水，搅拌制成匀浆；

6)匀浆经高压均质机进行破壁，均质2遍，在线降温控制浆液温度处于25～30℃；

7)破壁后的浆液全部注入料液罐，以1:0.4（w:v=150kg:60L）比例使用预冷纯化水稀释，最终温度控制在20～25℃以内，得到约210L浆液混合物；

8)按照管式膜过滤装置（0.1μm，天津膜天膜工程技术有限公司）操作规程，对步骤7）得到的210L浆液混合物进行过滤；每滤出30L滤液即向剩余浆液混合物中补加30L纯化水继续过滤，直至收集到300L滤液，停止过滤，过程中纯化水补加次数共计9次。

9)按照超滤系统（5KD，天津膜天膜工程技术有限公司）操作规程，对步骤8）得到的300L滤液进行超滤操作，收集透过液即为转移因子原液，共收集327kg原液；

实施例2

1)将冷冻的猪脾脏约65.0kg表面包装去掉，然后用纯化水过夜解冻；

2)第二天使用纯化水冲洗脾脏，挑拣出不合格脾脏，去除筋膜、脂肪等大块组织；

3)称量以6.0kg/份脾脏经绞肉机绞碎，粗绞2遍；

4)每2份混合，加入0.1倍质量（1.2kg）的纯化水，混匀，依次经斜行齿胶体磨研磨2遍，菱形齿胶体磨研磨1遍，放入洁净盛料桶，共装5桶；剩余脾脏回收冷冻保存；

5)每桶加入1.3倍质量（15.6kg）的纯化水，搅拌制成匀浆；

6)匀浆经高压均质机进行破壁，均质2遍，在线降温控制浆液温度处于35～40℃；

7)破壁后的浆液全部注入料液罐，以1:0.4（w:v=150kg:60L）比例使用预冷纯化水稀释，最终温度控制在30～35℃以内，得到约210L浆液混合物；

8)按照管式膜过滤装置（0.1μm，天津膜天膜工程技术有限公司）操作规程，对步骤7）得到的210L浆液混合物进行过滤；每滤出30L滤液即向剩余浆液混合物中补加30L纯化水继续过滤，直至收集到330L滤液，停止过滤，过程中纯化水补加次数共计10次。

9)按照超滤系统（5KD，天津膜天膜工程技术有限公司）操作规程，对步骤8）得到的330L滤液进行超滤操作，收集透过液即为转移因子原液，共收集359kg原液；

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种猪脾转移因子制备方法，包括以下步骤：

1)将猪脾脏经绞肉机绞碎，粗绞得到肉糜，向肉糜中加入肉糜总质量0.1～0.5倍质量的纯化水，经胶体磨充分研磨，而后继续加入纯化水直至本步骤所加入的纯化水总质量为肉糜总质量的1.4～1.6倍为止，混合均匀，即得到匀浆待用；

2)利用高压均质机对步骤1）得到的匀浆进行均质处理，均质处理过程中浆液温度不高于40℃；

3)将步骤2）均质处理后的匀浆与纯化水以1:0.4（w:v）比例混合均匀，混合过程温度不高于35℃，得到浆液混合物待用；

4)利用管式膜过滤装置以0.1μm孔径对步骤3）得到的浆液混合物进行过滤，过滤期间每滤出步骤3）得到的浆液混合物总体积1/7倍体积的滤液时，向剩余浆液混合物中补加步骤3）得到的浆液混合物总体积1/7倍体积的纯化水，继续过滤，直至收集到步骤3）得到的浆液混合物总体积10/7～11/7倍体积的滤液，即为待超滤液，停止过滤；

5)利用超滤系统，以5KD孔径对步骤4）得到的待超滤液进行超滤，收集滤液即为转移因子原液。

2.根据权利要求1所述的一种猪脾转移因子制备方法，其特征在于步骤1）所述的猪脾脏为新鲜的、去除了结缔组织和脂肪的猪脾脏。

3.根据权利要求1所述的一种猪脾转移因子制备方法，其特征在于步骤4）中纯化水补加次数为8～10次。