CN104388509A - 一种超声处理促肝细胞生长素的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种超声处理促肝细胞生长素的制备方法，步骤如下：1)乳猪肝预处理；2)均质；3)超声处理：将乳猪肝匀浆置于超声波处理机内利用超声波在冰浴中处理得到超声匀浆；4)酶解：超声匀浆置于反应容器中，滴加盐酸至pH值为2.5-3.5，再加入胃蛋白酶搅拌后，将反应容器及其内容物置于水浴锅中水解得到酶解物料；5)灭活；6)离心；7)粗滤：将中性离心液先后经过截留分子量为100KD的中空纤维超滤装置和截留分子量为10KD的中空纤维超滤装置进行过滤得到粗滤液；8)超滤：粗滤液经截流分子量为6000D的超滤膜进行超滤得到促肝细胞生长素溶液。本发明工艺简单温和，提取率高；终产物活性较高，安全性高。
Description
技术领域
本发明涉及促肝细胞生长素技术领域，尤其涉及一种超声处理促肝细胞生长素的制备方法。
背景技术
促肝细胞生长素是一种刺激新生的人和动物肝细胞DNA合成的药物，可促进肝细胞再生，加速肝脏组织的修复，恢复肝功能，改善肝脏枯否细胞的吞噬功能，防止来自肠道的毒素对肝细胞的损害，促进肝坏死后的修复，而且对肝细胞损伤有保护作用，对肝衰竭有明显的提高存活力的作用。
促肝细胞生长素目前已经有产品上市，以乳牛或者乳猪的新鲜肝脏器官为原料，经生化加工制备得到。但现有的制备方法产率低、活性低、蛋白质分子大、安全性不高。
发明内容
基本背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种超声处理促肝细胞生长素的制备方法，采用超声处理、酶解和超滤工艺，工艺简单温和，而且节能环保，提取率高；所制备的促肝细胞生长素的活性较高，并且分子量小于6000D，安全性高，对人的过敏反应基本消除。
本发明提出的一种超声处理促肝细胞生长素的制备方法，包括如下步骤：
S1、乳猪肝预处理：取乳猪肝，去除胆囊、筋膜和结缔组织，清水洗净，沥水后再用注射用水清洗，然后切成宽度为3-5cm的小块或细条状，再置于绞肉机中绞成粒径为1-3mm的乳猪肝颗粒；
S2、均质：将S1得到的乳猪肝颗粒加入胶体磨中以3000-3200rpm的转速研磨2-3min得到乳猪肝糜，将乳猪肝糜和注射用水按重量比为7-9:7-9加入搅拌机中，以300-320rpm的转速搅拌13-16min得到乳猪肝匀浆；
S3、超声处理：将S2得到的乳猪肝匀浆置于超声波处理机内利用超声波在冰浴中处理得到超声匀浆，超声波功率为500-550W，超声波频率为45-50kHz，超声波处理时间为60-80s；
S4、酶解：将S3得到的超声匀浆置于反应容器中，滴加2-4mol/L盐酸溶液至pH值为2.5-3.5，再加入胃蛋白酶以170-210rpm的转速搅拌35-38min后，将反应容器及其内容物置于40-45℃的水浴锅中水解6-7h得到酶解物料，其中乳猪肝匀浆与胃蛋白酶的重量比为99-101:0.7-0.8；
S5、灭活：将S4得到的酶解物料水浴加热至81-82℃，保温12-15min后，将温度降至室温静置得到灭活匀浆；
S6、离心：将S5得到的灭活匀浆加入离心瓶中，以4200-4500rpm的转速离心11-14min后，将上清液取出滴加2-4mol/L氢氧化钠溶液至pH为6.8-7.2得到中性离心液；
S7、粗滤：将S6得到的中性离心液经过截留分子量为100KD的中空纤维超滤装置进行第一次过滤后，再经过截留分子量为10KD的中空纤维超滤装置进行第二次过滤得到粗滤液，其中第一次过滤和第二次过滤的回流压力为0.03-0.06MPa；
S8、超滤：将S7得到的粗滤液再经截流分子量为6000D的超滤膜进行超滤得到促肝细胞生长素溶液，其中进液压力为0.13-0.16MPa，回流压力为0.03-0.06MPa。
优选地，S3中，将S2得到的乳猪肝匀浆置于超声波处理机内利用超声波在冰浴中处理得到超声匀浆，超声波功率为520-540W，超声波频率为47-48kHz，超声波处理时间为65-75s。
优选地，S4中，将S3得到的超声匀浆置于反应容器中，滴加2.6-3mol/L盐酸溶液至pH值为2.8-3.2，再加入胃蛋白酶以180-200rpm的转速搅拌36-37min后，将反应容器及其内容物置于42-44℃的水浴锅中水解6.3-6.7h得到酶解物料，其中乳猪肝匀浆与胃蛋白酶的重量比为99.7-100:0.72-0.75。
优选地，S6中，将S5得到的灭活匀浆加入离心瓶中，以4300-4400rpm的转速离心12-13min后，将上清液取出滴加2.5-3.5mol/L氢氧化钠溶液至pH为6.9-7得到中性离心液；
优选地，S8中，将S7得到的粗滤液再经截流分子量为6000D的超滤膜进行超滤得到促肝细胞生长素溶液，其中进液压力为0.14-0.15MPa，回流压力为0.04-0.05MPa。
优选地，包括如下步骤：
S1、乳猪肝预处理：取乳猪肝，去除胆囊、筋膜和结缔组织，清水洗净，沥水后再用注射用水清洗，然后切成宽度为3-5cm的小块或细条状，再置于绞肉机中绞成粒径为1-3mm的乳猪肝颗粒；
S2、均质：将S1得到的乳猪肝颗粒加入胶体磨中以3100rpm的转速研磨2.5min得到乳猪肝糜，将乳猪肝糜和注射用水按重量比为1:1加入搅拌机中，以310rpm的转速搅拌14min得到乳猪肝匀浆；
S3、超声处理：将S2得到的乳猪肝匀浆置于超声波处理机内利用超声波在冰浴中处理得到超声匀浆，超声波功率为520W，超声波频率为48kHz，超声波处理时间为75s；
S4、酶解：将S3得到的超声匀浆置于反应容器中，滴加3mol/L盐酸溶液至pH值为3.2，再加入胃蛋白酶以200rpm的转速搅拌36min后，将反应容器及其内容物置于42℃的水浴锅中水解6.7h得到酶解物料，其中乳猪肝匀浆与胃蛋白酶的重量比为100:0.75；
S5、灭活：将S4得到的酶解物料水浴加热至81.5℃，保温14min后，将温度降至室温静置得到灭活匀浆；
S6、离心：将S5得到的灭活匀浆加入离心瓶中，以4400rpm的转速离心13min后，将上清液取出滴加3.5mol/L氢氧化钠溶液至pH为7得到中性离心液；
S7、粗滤：将S6得到的中性离心液经过截留分子量为100KD的中空纤维超滤装置进行第一次过滤后，再经过截留分子量为10KD的中空纤维超滤装置进行第二次过滤得到粗滤液，其中第一次过滤和第二次过滤的回流压力为0.05MPa；
S8、超滤：将S7得到的粗滤液再经截流分子量为6000D的超滤膜进行超滤得到促肝细胞生长素溶液，其中进液压力为0.15MPa，回流压力为0.05MPa。
上文中的KD为千道尔顿，D为道尔顿。
本发明将乳猪肝研磨成乳猪肝糜，促使部分肝细胞的细胞膜破碎，再通过加水搅拌，使肝细胞中的蛋白质溶出；将乳猪肝匀浆进行冰浴超声处理，利用超声波的空泡效应，进一步将肝细胞的细胞膜破碎，更加有利于肝细胞中的蛋白质溶出，而冰浴的低温不仅使肝细胞的细胞膜在热胀冷缩的效应下失去弹性，更易破碎，还能防止微生物的生长繁殖，避免蛋白质被消耗；向超声匀浆中滴加盐酸溶液一方面可以促使更多肝细胞破碎，加速蛋白质溶出，另一方面还可以为下一步胃蛋白酶促进蛋白质水解营造适宜的反应环境，接着加入胃蛋白酶并搅拌，促使胃蛋白酶在酸性条件下与超声匀浆充分接触，在40-45℃的水浴锅中水解6-7h，充分水解大分子蛋白质，使之降解为小分子多肽链和小分子蛋白质；而将酶解物料水浴加热至81-82℃，保温12-15min，使胃蛋白酶和剩余的大分子蛋白质变性，有效的杀死可能存在的病毒和细菌，同时保证小分子多肽链和小分子蛋白质的生物活性；将灭活匀浆离心得到上清液使大分子蛋白质沉淀，而小分子多肽链和小分子蛋白质仍溶于溶液中；接着将中性离心液分别通过截留分子量为100KD的中空纤维超滤装置和截留分子量为10KD的中空纤维超滤装置，形成分级过滤，提高中性离心液的过滤效率，并得到分子量小于10KD的多肽和蛋白质，同时控制回流压力为0.03-0.06MPa，既提高了过滤效率，又能避免某些大分子在高压下通过中空纤维超滤装置；再经截流分子量为6000D的超滤膜进行超滤，同时进液压力为0.13-0.16MPa和回流压力为0.03-0.06MPa，使本发明所制备的促肝细胞生长素中的分子小于6000D，大大提高了有效组分含量浓度，而且安全性高。
本发明采用超声处理、酶解和超滤工艺，工艺简单温和，而且节能环保，提取率高；所制备的促肝细胞生长素的活性较高，并且分子量小于6000D，安全性高，对人的过敏反应基本消除。
具体实施方式
下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1
本发明提出的一种超声处理促肝细胞生长素的制备方法，包括如下步骤：
S1、乳猪肝预处理：取乳猪肝，去除胆囊、筋膜和结缔组织，清水洗净，沥水后再用注射用水清洗，然后切成宽度为3-5cm的小块或细条状，再置于绞肉机中绞成粒径为1-3mm的乳猪肝颗粒；
S2、均质：将S1得到的乳猪肝颗粒加入胶体磨中以3100rpm的转速研磨2.5min得到乳猪肝糜，将乳猪肝糜和注射用水按重量比为1:1加入搅拌机中，以310rpm的转速搅拌14min得到乳猪肝匀浆；
S3、超声处理：将S2得到的乳猪肝匀浆置于超声波处理机内利用超声波在冰浴中处理得到超声匀浆，超声波功率为520W，超声波频率为48kHz，超声波处理时间为75s；
S4、酶解：将S3得到的超声匀浆置于反应容器中，滴加3mol/L盐酸溶液至pH值为3.2，再加入胃蛋白酶以200rpm的转速搅拌36min后，将反应容器及其内容物置于42℃的水浴锅中水解6.7h得到酶解物料，其中乳猪肝匀浆与胃蛋白酶的重量比为100:0.75；
S5、灭活：将S4得到的酶解物料水浴加热至81.5℃，保温14min后，将温度降至室温静置得到灭活匀浆；
S6、离心：将S5得到的灭活匀浆加入离心瓶中，以4400rpm的转速离心13min后，将上清液取出滴加3.5mol/L氢氧化钠溶液至pH为7得到中性离心液；
S7、粗滤：将S6得到的中性离心液经过截留分子量为100KD的中空纤维超滤装置进行第一次过滤后，再经过截留分子量为10KD的中空纤维超滤装置进行第二次过滤得到粗滤液，其中第一次过滤和第二次过滤的回流压力为0.05MPa；
S8、超滤：将S7得到的粗滤液再经截流分子量为6000D的超滤膜进行超滤得到促肝细胞生长素溶液，其中进液压力为0.15MPa，回流压力为0.05MPa。
实施例2
本发明提出的一种超声处理促肝细胞生长素的制备方法，包括如下步骤：
S1、乳猪肝预处理：取乳猪肝，去除胆囊、筋膜和结缔组织，清水洗净，沥水后再用注射用水清洗，然后切成宽度为3-5cm的小块或细条状，再置于绞肉机中绞成粒径为1-3mm的乳猪肝颗粒；
S2、均质：将S1得到的乳猪肝颗粒加入胶体磨中以3000rpm的转速研磨3min得到乳猪肝糜，将乳猪肝糜和注射用水按重量比为7:9加入搅拌机中，以300rpm的转速搅拌16min得到乳猪肝匀浆；
S3、超声处理：将S2得到的乳猪肝匀浆置于超声波处理机内利用超声波在冰浴中处理得到超声匀浆，超声波功率为500W，超声波频率为50kHz，超声波处理时间为60s；
S4、酶解：将S3得到的超声匀浆置于反应容器中，滴加4mol/L盐酸溶液至pH值为2.5，再加入胃蛋白酶以210rpm的转速搅拌35min后，将反应容器及其内容物置于45℃的水浴锅中水解6h得到酶解物料，其中乳猪肝匀浆与胃蛋白酶的重量比为101:0.7；
S5、灭活：将S4得到的酶解物料水浴加热至81℃，保温15min后，将温度降至室温静置得到灭活匀浆；
S6、离心：将S5得到的灭活匀浆加入离心瓶中，以4200rpm的转速离心14min后，将上清液取出滴加2mol/L氢氧化钠溶液至pH为7.2得到中性离心液；
S7、粗滤：将S6得到的中性离心液经过截留分子量为100KD的中空纤维超滤装置进行第一次过滤后，再经过截留分子量为10KD的中空纤维超滤装置进行第二次过滤得到粗滤液，其中第一次过滤和第二次过滤的回流压力为0.06MPa；
S8、超滤：将S7得到的粗滤液再经截流分子量为6000D的超滤膜进行超滤得到促肝细胞生长素溶液，其中进液压力为0.13MPa，回流压力为0.06MPa。
实施例3
本发明提出的一种超声处理促肝细胞生长素的制备方法，包括如下步骤：
S1、乳猪肝预处理：取乳猪肝，去除胆囊、筋膜和结缔组织，清水洗净，沥水后再用注射用水清洗，然后切成宽度为3-5cm的小块或细条状，再置于绞肉机中绞成粒径为1-3mm的乳猪肝颗粒；
S2、均质：将S1得到的乳猪肝颗粒加入胶体磨中以3150rpm的转速研磨2.3min得到乳猪肝糜，将乳猪肝糜和注射用水按重量比为8:8.5加入搅拌机中，以305rpm的转速搅拌15min得到乳猪肝匀浆；
S3、超声处理：将S2得到的乳猪肝匀浆置于超声波处理机内利用超声波在冰浴中处理得到超声匀浆，超声波功率为540W，超声波频率为47kHz，超声波处理时间为65s；
S4、酶解：将S3得到的超声匀浆置于反应容器中，滴加2.6mol/L盐酸溶液至pH值为2.8，再加入胃蛋白酶以180rpm的转速搅拌37min后，将反应容器及其内容物置于44℃的水浴锅中水解6.3h得到酶解物料，其中乳猪肝匀浆与胃蛋白酶的重量比为99.7:0.72；
S5、灭活：将S4得到的酶解物料水浴加热至82℃，保温13min后，将温度降至室温静置得到灭活匀浆；
S6、离心：将S5得到的灭活匀浆加入离心瓶中，以4300rpm的转速离心12min后，将上清液取出滴加2.5mol/L氢氧化钠溶液至pH为6.9得到中性离心液；
S7、粗滤：将S6得到的中性离心液经过截留分子量为100KD的中空纤维超滤装置进行第一次过滤后，再经过截留分子量为10KD的中空纤维超滤装置进行第二次过滤得到粗滤液，其中第一次过滤和第二次过滤的回流压力为0.04MPa；
S8、超滤：将S7得到的粗滤液再经截流分子量为6000D的超滤膜进行超滤得到促肝细胞生长素溶液，其中进液压力为0.14MPa，回流压力为0.04MPa。
实施例4
本发明提出的一种超声处理促肝细胞生长素的制备方法，包括如下步骤：
S1、乳猪肝预处理：取乳猪肝，去除胆囊、筋膜和结缔组织，清水洗净，沥水后再用注射用水清洗，然后切成宽度为3-5cm的小块或细条状，再置于绞肉机中绞成粒径为1-3mm的乳猪肝颗粒；
S2、均质：将S1得到的乳猪肝颗粒加入胶体磨中以3200rpm的转速研磨2min得到乳猪肝糜，将乳猪肝糜和注射用水按重量比为9:7加入搅拌机中，以320rpm的转速搅拌13min得到乳猪肝匀浆；
S3、超声处理：将S2得到的乳猪肝匀浆置于超声波处理机内利用超声波在冰浴中处理得到超声匀浆，超声波功率为550W，超声波频率为45kHz，超声波处理时间为80s；
S4、酶解：将S3得到的超声匀浆置于反应容器中，滴加2mol/L盐酸溶液至pH值为3.5，再加入胃蛋白酶以170rpm的转速搅拌38min后，将反应容器及其内容物置于40℃的水浴锅中水解7h得到酶解物料，其中乳猪肝匀浆与胃蛋白酶的重量比为99:0.8；
S5、灭活：将S4得到的酶解物料水浴加热至81.8℃，保温12min后，将温度降至室温静置得到灭活匀浆；
S6、离心：将S5得到的灭活匀浆加入离心瓶中，以4500rpm的转速离心11min后，将上清液取出滴加4mol/L氢氧化钠溶液至pH为6.8得到中性离心液；
S7、粗滤：将S6得到的中性离心液经过截留分子量为100KD的中空纤维超滤装置进行第一次过滤后，再经过截留分子量为10KD的中空纤维超滤装置进行第二次过滤得到粗滤液，其中第一次过滤和第二次过滤的回流压力为0.03MPa；
S8、超滤：将S7得到的粗滤液再经截流分子量为6000D的超滤膜进行超滤得到促肝细胞生长素溶液，其中进液压力为0.16MPa，回流压力为0.03MPa。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种超声处理促肝细胞生长素的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、乳猪肝预处理：取乳猪肝，去除胆囊、筋膜和结缔组织，清水洗净，沥水后再用注射用水清洗，然后切成宽度为3-5cm的小块或细条状，再置于绞肉机中绞成粒径为1-3mm的乳猪肝颗粒；
S2、均质：将S1得到的乳猪肝颗粒加入胶体磨中以3000-3200rpm的转速研磨2-3min得到乳猪肝糜，将乳猪肝糜和注射用水按重量比为7-9:7-9加入搅拌机中，以300-320rpm的转速搅拌13-16min得到乳猪肝匀浆；
S3、超声处理：将S2得到的乳猪肝匀浆置于超声波处理机内利用超声波在冰浴中处理得到超声匀浆，超声波功率为500-550W，超声波频率为45-50kHz，超声波处理时间为60-80s；
S4、酶解：将S3得到的超声匀浆置于反应容器中，滴加2-4mol/L盐酸溶液至pH值为2.5-3.5，再加入胃蛋白酶以170-210rpm的转速搅拌35-38min后，将反应容器及其内容物置于40-45℃的水浴锅中水解6-7h得到酶解物料，其中乳猪肝匀浆与胃蛋白酶的重量比为99-101:0.7-0.8；
S5、灭活：将S4得到的酶解物料水浴加热至81-82℃，保温12-15min后，将温度降至室温静置得到灭活匀浆；
S6、离心：将S5得到的灭活匀浆加入离心瓶中，以4200-4500rpm的转速离心11-14min后，将上清液取出滴加2-4mol/L氢氧化钠溶液至pH为6.8-7.2得到中性离心液；
S7、粗滤：将S6得到的中性离心液经过截留分子量为100KD的中空纤维超滤装置进行第一次过滤后，再经过截留分子量为10KD的中空纤维超滤装置进行第二次过滤得到粗滤液，其中第一次过滤和第二次过滤的回流压力为0.03-0.06MPa；
S8、超滤：将S7得到的粗滤液再经截流分子量为6000D的超滤膜进行超滤得到促肝细胞生长素溶液，其中进液压力为0.13-0.16MPa，回流压力为0.03-0.06MPa。
2.根据权利要求1所述超声处理促肝细胞生长素的制备方法，其特征在于，S3中，将S2得到的乳猪肝匀浆置于超声波处理机内利用超声波在冰浴中处理得到超声匀浆，超声波功率为520-540W，超声波频率为47-48kHz，超声波处理时间为65-75s。
3.根据权利要求1或2所述超声处理促肝细胞生长素的制备方法，其特征在于，S4中，将S3得到的超声匀浆置于反应容器中，滴加2.6-3mol/L盐酸溶液至pH值为2.8-3.2，再加入胃蛋白酶以180-200rpm的转速搅拌36-37min后，将反应容器及其内容物置于42-44℃的水浴锅中水解6.3-6.7h得到酶解物料，其中乳猪肝匀浆与胃蛋白酶的重量比为99.7-100:0.72-0.75。
4.根据权利要求1-3任一项所述超声处理促肝细胞生长素的制备方法，其特征在于，S6中，将S5得到的灭活匀浆加入离心瓶中，以4300-4400rpm的转速离心12-13min后，将上清液取出滴加2.5-3.5mol/L氢氧化钠溶液至pH为6.9-7得到中性离心液。
5.根据权利要求1-4任一项所述超声处理促肝细胞生长素的制备方法，其特征在于，S8中，将S7得到的粗滤液再经截流分子量为6000D的超滤膜进行超滤得到促肝细胞生长素溶液，其中进液压力为0.14-0.15MPa，回流压力为0.04-0.05MPa。
6.根据权利要求1-5任一项所述超声处理促肝细胞生长素的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、乳猪肝预处理：取乳猪肝，去除胆囊、筋膜和结缔组织，清水洗净， 沥水后再用注射用水清洗，然后切成宽度为3-5cm的小块或细条状，再置于绞肉机中绞成粒径为1-3mm的乳猪肝颗粒；
S2、均质：将S1得到的乳猪肝颗粒加入胶体磨中以3100rpm的转速研磨2.5min得到乳猪肝糜，将乳猪肝糜和注射用水按重量比为1:1加入搅拌机中，以310rpm的转速搅拌14min得到乳猪肝匀浆；
S3、超声处理：将S2得到的乳猪肝匀浆置于超声波处理机内利用超声波在冰浴中处理得到超声匀浆，超声波功率为520W，超声波频率为48kHz，超声波处理时间为75s；
S4、酶解：将S3得到的超声匀浆置于反应容器中，滴加3mol/L盐酸溶液至pH值为3.2，再加入胃蛋白酶以200rpm的转速搅拌36min后，将反应容器及其内容物置于42℃的水浴锅中水解6.7h得到酶解物料，其中乳猪肝匀浆与胃蛋白酶的重量比为100:0.75；
S5、灭活：将S4得到的酶解物料水浴加热至81.5℃，保温14min后，将温度降至室温静置得到灭活匀浆；
S6、离心：将S5得到的灭活匀浆加入离心瓶中，以4400rpm的转速离心13min后，将上清液取出滴加3.5mol/L氢氧化钠溶液至pH为7得到中性离心液；
S7、粗滤：将S6得到的中性离心液经过截留分子量为100KD的中空纤维超滤装置进行第一次过滤后，再经过截留分子量为10KD的中空纤维超滤装置进行第二次过滤得到粗滤液，其中第一次过滤和第二次过滤的回流压力为0.05MPa；
S8、超滤：将S7得到的粗滤液再经截流分子量为6000D的超滤膜进行超滤得到促肝细胞生长素溶液，其中进液压力为0.15MPa，回流压力为0.05MPa。
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- 2014-10-27 CN CN201410583530.3A patent/CN104388509A/zh active Pending
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