CN104388510A - 一种高提取率高活性促肝细胞生长素的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高提取率高活性促肝细胞生长素的制备方法，包括如下步骤：1)乳猪肝预处理；2)均质；3)胃蛋白酶的制备；4)酶解：乳猪肝匀浆置于反应容器中，滴加盐酸溶液至pH值为2.5-3.5，再加入胃蛋白酶搅拌后，将反应容器及其内容物置于水浴锅中水解得到酶解物料；5)灭活；6)离心；7)粗滤：将中性离心液先后经过截留分子量为100KD的中空纤维超滤装置和截留分子量为10KD的中空纤维超滤装置进行过滤得到粗滤液；8)超滤：粗滤液经截流分子量为6000D的超滤膜进行超滤得到促肝细胞生长素溶液。本发明工艺简单温和，而且节能环保，提取率高；所制备的促肝细胞生长素的活性较高，安全性高。
Description
技术领域
本发明涉及促肝细胞生长素技术领域，尤其涉及一种高提取率高活性促肝细胞生长素的制备方法。
背景技术
促肝细胞生长素是从新鲜乳猪肝脏中提取的小分子量多肽类混合物，分子量在10000以下。其药理作用主要为可刺激正常肝细胞DNA的合成，促进肝细胞再生，对损伤的肝细胞有保护作用，促进肝功能的恢复，还有调节机体的免疫功能和抗肝纤维化作用。临床上用于治疗重型肝炎、慢性活动性肝炎和肝硬化等。目前，针对促肝细胞生长素这一生物制剂类药物，已经有很多专利和文献报道。
在专利ZL03116052.2中，公开了一种促肝细胞生长素注射液及制备方法，其中的肝细胞生长素为从乳猪中提取分离获得的一种活性蛋白质，占总蛋白含量的60％以上，该促肝细胞生长素是通过以下方法制备：1)匀浆；2)搅拌：加提取液，室温下低速60rpm搅拌1h；3)加热：水浴加热提取罐，液体温度达到95℃时停止加热，保持15-20分钟；4)过滤；5)提纯：将过滤液上样至DEAE SepharoseFF柱中，采用含有氯化钠的PBS溶液进行洗脱，再用超滤膜除盐。该制备方法的工艺繁琐，还需要加盐的洗脱液洗脱后再脱盐，这些操作步骤都会损失活性物质的含量，造成提取物活性低，提取率低。
发明内容
基本背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种高提取率高活性促肝细胞生长素的制备方法，采用酶解和超滤工艺，工艺简单温和，而且节能环保，提取率高；所制备的促肝细胞生长素的活性较高，并且分子量小于6000D，安全性高，对人的过敏反应基本消除。
本发明提出的一种高提取率高活性促肝细胞生长素的制备方法，包括如下步骤：
S1、乳猪肝预处理：取乳猪肝，去除胆囊、筋膜和结缔组织，清水洗净，沥水后再用注射用水清洗，然后切成宽度为3-5cm的小块或细条状，再置于绞肉机中绞成粒径为1-3mm的乳猪肝颗粒；
S2、均质：将S1得到的乳猪肝颗粒加入胶体磨中以3100-3250rpm的转速研磨2-3.5min得到乳猪肝糜，将乳猪肝糜和注射用水按重量比为5-6:4.5-5.5加入搅拌机中，以310-325rpm的转速搅拌14-17min得到乳猪肝匀浆；
S3、胃蛋白酶的制备：取猪胃粘膜研磨成猪胃粘膜糜后置于反应容器中，加入1.2-1.5wt％盐酸溶液，猪胃粘膜糜和盐酸溶液的体积比(g/ml)为22-25:27-30，将反应容器及其内容物置于47-50℃的水浴锅中浸提63-66min得到浸提液，将浸提液以5800-6200rpm的转速离心22-23min，取上清液进行低温干燥得到胃蛋白酶；
S4、酶解：将S2得到的乳猪肝匀浆置于反应容器中，滴加4-6mol/L盐酸溶液至pH值为2.5-3.5，再加入S3得到的胃蛋白酶以190-205rpm的转速搅拌19-22min后，将反应容器及其内容物置于37-45℃的水浴锅中水解6-8h得到酶解物料，其中乳猪肝匀浆与胃蛋白酶的重量比为99-101:0.7-1；
S5、灭活：将S4得到的酶解物料水浴加热至81-82℃，保温12-15min后，将温度降至室温静置得到灭活匀浆；
S6、离心：将S5得到的灭活匀浆加入离心瓶中，以4000-4300rpm的转速离心14-17min后，将上清液取出滴加4-6mol/L氢氧化钠溶液至pH为6.8-7.2得到中性离心液；
S7、粗滤：将S6得到的中性离心液经过截留分子量为100KD的中空纤维超滤装置进行第一次过滤后，再经过截留分子量为10KD的中空纤维超滤装置进行第二次过滤得到粗滤液，其中第一次过滤和第二次过滤的回流压力为0.04-0.07MPa；
S8、超滤：将S7得到的粗滤液再经截流分子量为6000D的超滤膜进行超滤得到促肝细胞生长素溶液，其中进液压力为0.13-0.16MPa，回流压力为0.04-0.07MPa。
优选地，S3中，取猪胃粘膜研磨成猪胃粘膜糜后置于反应容器中，加入1.3-1.4wt％盐酸溶液，猪胃粘膜糜和盐酸溶液的体积比(g/ml)为23-24:28-29，将反应容器及其内容物置于48-49℃的水浴锅中浸提64-65min得到浸提液，将浸提液以5900-6100rpm的转速离心22.3-22.6min，取上清液进行低温干燥得到胃蛋白酶。
优选地，S4中，将S2得到的乳猪肝匀浆置于反应容器中，滴加4.5-5.5mol/L盐酸溶液至pH值为2.7-3.2，再加入S3得到的胃蛋白酶以195-200rpm的转速搅拌20-21min后，将反应容器及其内容物置于40-42℃的水浴锅中水解6.7-7.8h得到酶解物料，其中乳猪肝匀浆与胃蛋白酶的重量比为99.4-100.2:0.8-0.9。
优选地，S6中，将S5得到的灭活匀浆加入离心瓶中，以4100-4200rpm的转速离心15-16min后，将上清液取出滴加4.7-5.6mol/L氢氧化钠溶液至pH为6.9-7.1得到中性离心液。
优选地，包括如下步骤：
S1、乳猪肝预处理：取乳猪肝，去除胆囊、筋膜和结缔组织，清水洗净，沥水后再用注射用水清洗，然后切成宽度为3-5cm的小块或细条状，再置于绞肉机中绞成粒径为1-3mm的乳猪肝颗粒；
S2、均质：将S1得到的乳猪肝颗粒加入胶体磨中以3200rpm的转速研磨3min得到乳猪肝糜，将乳猪肝糜和注射用水按重量比为1:1加入搅拌机中，以315rpm的转速搅拌15.5min得到乳猪肝匀浆；
S3、胃蛋白酶的制备：取猪胃粘膜研磨成猪胃粘膜糜后置于反应容器中，加入1.3wt％盐酸溶液，猪胃粘膜糜和盐酸溶液的体积比(g/ml)为23:28，将反应容器及其内容物置于490℃的水浴锅中浸提65min得到浸提液，将浸提液以6000rpm的转速离心22.5min，取上清液进行低温干燥得到胃蛋白酶；
S4、酶解：将S2得到的乳猪肝匀浆置于反应容器中，滴加5mol/L盐酸溶液至pH值为3，再加入S3得到的胃蛋白酶以200rpm的转速搅拌20min后，将反应容器及其内容物置于40℃的水浴锅中水解7h得到酶解物料，其中乳猪肝匀浆与胃蛋白酶的重量比为100:0.9；
S5、灭活：将S4得到的酶解物料水浴加热至81.8℃，保温14min后，将温度降至室温静置得到灭活匀浆；
S6、离心：将S5得到的灭活匀浆加入离心瓶中，以4200rpm的转速离心15min后，将上清液取出滴加5mol/L氢氧化钠溶液至pH为7得到中性离心液；
S7、粗滤：将S6得到的中性离心液经过截留分子量为100KD的中空纤维超滤装置进行第一次过滤后，再经过截留分子量为10KD的中空纤维超滤装置进行第二次过滤得到粗滤液，其中第一次过滤和第二次过滤的回流压力为0.06MPa；
S8、超滤：将S7得到的粗滤液再经截流分子量为6000D的超滤膜进行超滤得到促肝细胞生长素溶液，其中进液压力为0.14MPa，回流压力为0.05MPa。
上文中KD为千道尔顿，D为道尔顿。
本发明将乳猪肝研磨成乳猪肝糜，促使部分肝细胞的细胞膜破碎，再通过加水搅拌，使肝细胞中的蛋白质溶出；将猪胃粘膜研磨后，加入1.2-1.5wt％盐酸溶液消化猪胃粘膜细胞，再通过47-50℃时的浸提、离心封层和低温干燥得到高活性的胃蛋白酶，而且胃蛋白酶产率高；对乳猪肝匀浆滴加盐酸溶液不仅可以促使更多肝细胞破碎，加速蛋白质溶出，而且可以为下一步胃蛋白酶促进蛋白质水解营造适宜的反应环境，接着加入胃蛋白酶并搅拌，促使胃蛋白酶在酸性条件下与乳猪肝匀浆充分接触，在37-45℃的水浴锅中水解6-8h，充分水解大分子蛋白质，使之降解为小分子多肽链和小分子蛋白质；而将酶解物料水浴加热至81-82℃，保温12-15min，使胃蛋白酶和剩余的大分子蛋白质变性，有效的杀死可能存在的病毒和细菌，同时保证小分子多肽链和小分子蛋白质的活性；将灭活匀浆离心得到上清液使大分子蛋白质沉淀，而小分子多肽链和小分子蛋白质仍溶于溶液中；接着将中性离心液分别通过截留分子量为100KD的中空纤维超滤装置和截留分子量为10KD的中空纤维超滤装置，形成分级过滤，提高中性离心液的过滤效率，并得到分子量小于10KD的多肽和蛋白质，同时控制回流压力为0.04-0.07MPa，既提高了过滤效率，又能避免某些大分子在高压下通过中空纤维超滤装置；再经截流分子量为6000D的超滤膜进行超滤，同时进液压力为0.13-0.16MPa和回流压力为0.04-0.07MPa，使本发明所制备的促肝细胞生长素中的分子小于6000D，大大提高了有效组分含量浓度，而且安全性高。
本发明采用酶解和超滤工艺，工艺简单温和，而且节能环保，提取率高；所制备的促肝细胞生长素的活性较高，并且分子量小于6000D，安全性高，对人的过敏反应基本消除。
具体实施方式
下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1
本发明提出的一种高提取率高活性促肝细胞生长素的制备方法，包括如下步骤：
S1、乳猪肝预处理：取乳猪肝，去除胆囊、筋膜和结缔组织，清水洗净，沥水后再用注射用水清洗，然后切成宽度为3-5cm的小块或细条状，再置于绞肉机中绞成粒径为1-3mm的乳猪肝颗粒；
S2、均质：将S1得到的乳猪肝颗粒加入胶体磨中以3100rpm的转速研磨3.5min得到乳猪肝糜，将乳猪肝糜和注射用水按重量比为5:5.5加入搅拌机中，以310rpm的转速搅拌17min得到乳猪肝匀浆；
S3、胃蛋白酶的制备：取猪胃粘膜研磨成猪胃粘膜糜后置于反应容器中，加入1.2wt％盐酸溶液，猪胃粘膜糜和盐酸溶液的体积比(g/ml)为25:27，将反应容器及其内容物置于50℃的水浴锅中浸提63min得到浸提液，将浸提液以6200rpm的转速离心22min，取上清液进行低温干燥得到胃蛋白酶；
S4、酶解：将S2得到的乳猪肝匀浆置于反应容器中，滴加6mol/L盐酸溶液至pH值为2.5，再加入S3得到的胃蛋白酶以205rpm的转速搅拌19min后，将反应容器及其内容物置于45℃的水浴锅中水解6h得到酶解物料，其中乳猪肝匀浆与胃蛋白酶的重量比为101:0.7；
S5、灭活：将S4得到的酶解物料水浴加热至81℃，保温15min后，将温度降至室温静置得到灭活匀浆；
S6、离心：将S5得到的灭活匀浆加入离心瓶中，以4000rpm的转速离心17min后，将上清液取出滴加4mol/L氢氧化钠溶液至pH为7.2得到中性离心液；
S7、粗滤：将S6得到的中性离心液经过截留分子量为100KD的中空纤维超滤装置进行第一次过滤后，再经过截留分子量为10KD的中空纤维超滤装置进行第二次过滤得到粗滤液，其中第一次过滤和第二次过滤的回流压力为0.07MPa；
S8、超滤：将S7得到的粗滤液再经截流分子量为6000D的超滤膜进行超滤得到促肝细胞生长素溶液，其中进液压力为0.13MPa，回流压力为0.07MPa。
实施例2
本发明提出的一种高提取率高活性促肝细胞生长素的制备方法，包括如下步骤：
S1、乳猪肝预处理：取乳猪肝，去除胆囊、筋膜和结缔组织，清水洗净，沥水后再用注射用水清洗，然后切成宽度为3-5cm的小块或细条状，再置于绞肉机中绞成粒径为1-3mm的乳猪肝颗粒；
S2、均质：将S1得到的乳猪肝颗粒加入胶体磨中以3250rpm的转速研磨2min得到乳猪肝糜，将乳猪肝糜和注射用水按重量比为6:4.5加入搅拌机中，以325rpm的转速搅拌14min得到乳猪肝匀浆；
S3、胃蛋白酶的制备：取猪胃粘膜研磨成猪胃粘膜糜后置于反应容器中，加入1.5wt％盐酸溶液，猪胃粘膜糜和盐酸溶液的体积比(g/ml)为22:30，将反应容器及其内容物置于47℃的水浴锅中浸提66min得到浸提液，将浸提液以5800rpm的转速离心23min，取上清液进行低温干燥得到胃蛋白酶；
S4、酶解：将S2得到的乳猪肝匀浆置于反应容器中，滴加4mol/L盐酸溶液至pH值为3.5，再加入S3得到的胃蛋白酶以190rpm的转速搅拌22min后，将反应容器及其内容物置于37℃的水浴锅中水解8h得到酶解物料，其中乳猪肝匀浆与胃蛋白酶的重量比为99:1；
S5、灭活：将S4得到的酶解物料水浴加热至82℃，保温12min后，将温度降至室温静置得到灭活匀浆；
S6、离心：将S5得到的灭活匀浆加入离心瓶中，以4300rpm的转速离心14min后，将上清液取出滴加6mol/L氢氧化钠溶液至pH为6.8得到中性离心液；
S7、粗滤：将S6得到的中性离心液经过截留分子量为100KD的中空纤维超滤装置进行第一次过滤后，再经过截留分子量为10KD的中空纤维超滤装置进行第二次过滤得到粗滤液，其中第一次过滤和第二次过滤的回流压力为0.04MPa；
S8、超滤：将S7得到的粗滤液再经截流分子量为6000D的超滤膜进行超滤得到促肝细胞生长素溶液，其中进液压力为0.16MPa，回流压力为0.04MPa。
实施例3
本发明提出的一种高提取率高活性促肝细胞生长素的制备方法，包括如下步骤：
S1、乳猪肝预处理：取乳猪肝，去除胆囊、筋膜和结缔组织，清水洗净，沥水后再用注射用水清洗，然后切成宽度为3-5cm的小块或细条状，再置于绞肉机中绞成粒径为1-3mm的乳猪肝颗粒；
S2、均质：将S1得到的乳猪肝颗粒加入胶体磨中以3150rpm的转速研磨2.5min得到乳猪肝糜，将乳猪肝糜和注射用水按重量比为1.1:1加入搅拌机中，以320rpm的转速搅拌16min得到乳猪肝匀浆；
S3、胃蛋白酶的制备：取猪胃粘膜研磨成猪胃粘膜糜后置于反应容器中，加入1.4wt％盐酸溶液，猪胃粘膜糜和盐酸溶液的体积比(g/ml)为24:29，将反应容器及其内容物置于48℃的水浴锅中浸提64min得到浸提液，将浸提液以5900rpm的转速离心22.7min，取上清液进行低温干燥得到胃蛋白酶；
S4、酶解：将S2得到的乳猪肝匀浆置于反应容器中，滴加5.5mol/L盐酸溶液至pH值为2.8，再加入S3得到的胃蛋白酶以195rpm的转速搅拌21min后，将反应容器及其内容物置于43℃的水浴锅中水解7.2h得到酶解物料，其中乳猪肝匀浆与胃蛋白酶的重量比为100:0.8；
S5、灭活：将S4得到的酶解物料水浴加热至81.5℃，保温13min后，将温度降至室温静置得到灭活匀浆；
S6、离心：将S5得到的灭活匀浆加入离心瓶中，以4100rpm的转速离心16min后，将上清液取出滴加5.5mol/L氢氧化钠溶液至pH为6.9得到中性离心液；
S7、粗滤：将S6得到的中性离心液经过截留分子量为100KD的中空纤维超滤装置进行第一次过滤后，再经过截留分子量为10KD的中空纤维超滤装置进行第二次过滤得到粗滤液，其中第一次过滤和第二次过滤的回流压力为0.05MPa；
S8、超滤：将S7得到的粗滤液再经截流分子量为6000D的超滤膜进行超滤得到促肝细胞生长素溶液，其中进液压力为0.15MPa，回流压力为0.06MPa。
实施例4
本发明提出的一种高提取率高活性促肝细胞生长素的制备方法，包括如下步骤：
S1、乳猪肝预处理：取乳猪肝，去除胆囊、筋膜和结缔组织，清水洗净，沥水后再用注射用水清洗，然后切成宽度为3-5cm的小块或细条状，再置于绞肉机中绞成粒径为1-3mm的乳猪肝颗粒；
S2、均质：将S1得到的乳猪肝颗粒加入胶体磨中以3200rpm的转速研磨3min得到乳猪肝糜，将乳猪肝糜和注射用水按重量比为1:1加入搅拌机中，以315rpm的转速搅拌15.5min得到乳猪肝匀浆；
S3、胃蛋白酶的制备：取猪胃粘膜研磨成猪胃粘膜糜后置于反应容器中，加入1.3wt％盐酸溶液，猪胃粘膜糜和盐酸溶液的体积比(g/ml)为23:28，将反应容器及其内容物置于49℃的水浴锅中浸提65min得到浸提液，将浸提液以6000rpm的转速离心22.5min，取上清液进行低温干燥得到胃蛋白酶；
S4、酶解：将S2得到的乳猪肝匀浆置于反应容器中，滴加5mol/L盐酸溶液至pH值为3，再加入S3得到的胃蛋白酶以200rpm的转速搅拌20min后，将反应容器及其内容物置于40℃的水浴锅中水解7h得到酶解物料，其中乳猪肝匀浆与胃蛋白酶的重量比为100:0.9；
S5、灭活：将S4得到的酶解物料水浴加热至81.8℃，保温14min后，将温度降至室温静置得到灭活匀浆；
S6、离心：将S5得到的灭活匀浆加入离心瓶中，以4200rpm的转速离心15min后，将上清液取出滴加5mol/L氢氧化钠溶液至pH为7得到中性离心液；
S7、粗滤：将S6得到的中性离心液经过截留分子量为100KD的中空纤维超滤装置进行第一次过滤后，再经过截留分子量为10KD的中空纤维超滤装置进行第二次过滤得到粗滤液，其中第一次过滤和第二次过滤的回流压力为0.06MPa；
S8、超滤：将S7得到的粗滤液再经截流分子量为6000D的超滤膜进行超滤得到促肝细胞生长素溶液，其中进液压力为0.14MPa，回流压力为0.05MPa。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种高提取率高活性促肝细胞生长素的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、乳猪肝预处理：取乳猪肝，去除胆囊、筋膜和结缔组织，清水洗净，沥水后再用注射用水清洗，然后切成宽度为3-5cm的小块或细条状，再置于绞肉机中绞成粒径为1-3mm的乳猪肝颗粒；
S2、均质：将S1得到的乳猪肝颗粒加入胶体磨中以3100-3250rpm的转速研磨2-3.5min得到乳猪肝糜，将乳猪肝糜和注射用水按重量比为5-6:4.5-5.5加入搅拌机中，以310-325rpm的转速搅拌14-17min得到乳猪肝匀浆；
S3、胃蛋白酶的制备：取猪胃粘膜研磨成猪胃粘膜糜后置于反应容器中，加入1.2-1.5wt％盐酸溶液，猪胃粘膜糜和盐酸溶液的体积比(g/ml)为22-25:27-30，将反应容器及其内容物置于47-50℃的水浴锅中浸提63-66min得到浸提液，将浸提液以5800-6200rpm的转速离心22-23min，取上清液进行低温干燥得到胃蛋白酶；
S4、酶解：将S2得到的乳猪肝匀浆置于反应容器中，滴加4-6mol/L盐酸溶液至pH值为2.5-3.5，再加入S3得到的胃蛋白酶以190-205rpm的转速搅拌19-22min后，将反应容器及其内容物置于37-45℃的水浴锅中水解6-8h得到酶解物料，其中乳猪肝匀浆与胃蛋白酶的重量比为99-101:0.7-1；
S5、灭活：将S4得到的酶解物料水浴加热至81-82℃，保温12-15min后，将温度降至室温静置得到灭活匀浆；
S6、离心：将S5得到的灭活匀浆加入离心瓶中，以4000-4300rpm的转速离心14-17min后，将上清液取出滴加4-6mol/L氢氧化钠溶液至pH为6.8-7.2得到中性离心液；
S7、粗滤：将S6得到的中性离心液经过截留分子量为100KD的中空纤维超滤装置进行第一次过滤后，再经过截留分子量为10KD的中空纤维超滤装置进行第二次过滤得到粗滤液，其中第一次过滤和第二次过滤的回流压力为0.04-0.07MPa；
S8、超滤：将S7得到的粗滤液再经截流分子量为6000D的超滤膜进行超滤得到促肝细胞生长素溶液，其中进液压力为0.13-0.16MPa，回流压力为0.04-0.07MPa。
2.根据权利要求1所述高提取率高活性促肝细胞生长素的制备方法，其特征在于，S3中，取猪胃粘膜研磨成猪胃粘膜糜后置于反应容器中，加入1.3-1.4wt％盐酸溶液，猪胃粘膜糜和盐酸溶液的体积比(g/ml)为23-24:28-29，将反应容器及其内容物置于48-49℃的水浴锅中浸提64-65min得到浸提液，将浸提液以5900-6100rpm的转速离心22.3-22.6min，取上清液进行低温干燥得到胃蛋白酶。
3.根据权利要求1或2所述高提取率高活性促肝细胞生长素的制备方法，其特征在于，S4中，将S2得到的乳猪肝匀浆置于反应容器中，滴加4.5-5.5mol/L盐酸溶液至pH值为2.7-3.2，再加入S3得到的胃蛋白酶以195-200rpm的转速搅拌20-21min后，将反应容器及其内容物置于40-42℃的水浴锅中水解6.7-7.8h得到酶解物料，其中乳猪肝匀浆与胃蛋白酶的重量比为99.4-100.2:0.8-0.9。
4.根据权利要求1-3任一项所述高提取率高活性促肝细胞生长素的制备方法，其特征在于，S6中，将S5得到的灭活匀浆加入离心瓶中，以4100-4200rpm的转速离心15-16min后，将上清液取出滴加4.7-5.6mol/L氢氧化钠溶液至pH为6.9-7.1得到中性离心液。
5.根据权利要求1-4任一项所述高提取率高活性促肝细胞生长素的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、乳猪肝预处理：取乳猪肝，去除胆囊、筋膜和结缔组织，清水洗净，沥水后再用注射用水清洗，然后切成宽度为3-5cm的小块或细条状，再置于绞肉机中绞成粒径为1-3mm的乳猪肝颗粒；
S2、均质：将S1得到的乳猪肝颗粒加入胶体磨中以3200rpm的转速研磨3min得到乳猪肝糜，将乳猪肝糜和注射用水按重量比为1:1加入搅拌机中，以315rpm的转速搅拌15.5min得到乳猪肝匀浆；
S3、胃蛋白酶的制备：取猪胃粘膜研磨成猪胃粘膜糜后置于反应容器中，加入1.3wt％盐酸溶液，猪胃粘膜糜和盐酸溶液的体积比(g/ml)为23:28，将反应容器及其内容物置于490℃的水浴锅中浸提65min得到浸提液，将浸提液以6000rpm的转速离心22.5min，取上清液进行低温干燥得到胃蛋白酶；
S4、酶解：将S2得到的乳猪肝匀浆置于反应容器中，滴加5mol/L盐酸溶液至pH值为3，再加入S3得到的胃蛋白酶以200rpm的转速搅拌20min后，将反应容器及其内容物置于40℃的水浴锅中水解7h得到酶解物料，其中乳猪肝匀浆与胃蛋白酶的重量比为100:0.9；
S5、灭活：将S4得到的酶解物料水浴加热至81.8℃，保温14min后，将温度降至室温静置得到灭活匀浆；
S6、离心：将S5得到的灭活匀浆加入离心瓶中，以4200rpm的转速离心15min后，将上清液取出滴加5mol/L氢氧化钠溶液至pH为7得到中性离心液；
S7、粗滤：将S6得到的中性离心液经过截留分子量为100KD的中空纤维超滤装置进行第一次过滤后，再经过截留分子量为10KD的中空纤维超滤装置进行第二次过滤得到粗滤液，其中第一次过滤和第二次过滤的回流压力为0.06MPa；
S8、超滤：将S7得到的粗滤液再经截流分子量为6000D的超滤膜进行超滤得到促肝细胞生长素溶液，其中进液压力为0.14MPa，回流压力为0.05MPa。
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