CN104388511A - 一种促肝细胞生长素的制备方法 - Google Patents

一种促肝细胞生长素的制备方法 Download PDF

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王康林
马婕
陈玉海
苟希霞
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Abstract

本发明公开了一种促肝细胞生长素的制备方法，包括如下步骤：1)乳猪肝预处理；2)均质；3)酶解：乳猪肝匀浆置于反应容器中，滴加盐酸溶液至pH值为2.5-3.0，再加入胃蛋白酶搅拌后，将反应容器及其内容物置于水浴锅中水解得到酶解物料；4)灭活；5)离心；6)粗滤：将中性离心液先后经过截留分子量为100KD的中空纤维超滤装置和截留分子量为10KD的中空纤维超滤装置进行过滤得到粗滤液；7)超滤：粗滤液经截流分子量为6000D的超滤膜进行超滤得到促肝细胞生长素溶液。本发明工艺简单温和，而且节能环保，提取率高；所制备的促肝细胞生长素的活性较高，并且分子量小于6000D，安全性高，对人的过敏反应基本消除。

Description

一种促肝细胞生长素的制备方法
技术领域
本发明涉及促肝细胞生长素制备技术领域，尤其涉及一种促肝细胞生长素的制备方法。
背景技术
促肝细胞生长素是从新鲜乳猪肝脏中提取的小分子量多肽类混合物，分子量在10000以下。其药理作用主要为可刺激正常肝细胞DNA的合成，促进肝细胞再生，对损伤的肝细胞有保护作用，促进肝功能的恢复，还有调节机体的免疫功能和抗肝纤维化作用。临床上用于治疗重型肝炎、慢性活动性肝炎和肝硬化等。目前，针对促肝细胞生长素这一生物制剂类药物，已经有很多专利和文献报道。
在专利ZL03116052.2中，公开了一种促肝细胞生长素注射液及制备方法，其中的肝细胞生长素为从乳猪中提取分离获得的一种活性蛋白质，占总蛋白含量的60％以上，该促肝细胞生长素是通过以下方法制备：1)匀浆；2)搅拌：加提取液，室温下低速60rpm搅拌1h；3)加热：水浴加热提取罐，液体温度达到95℃时停止加热，保持15-20分钟；4)过滤；5)提纯：将过滤液上样至DEAE SepharoseFF柱中，采用含有氯化钠的PBS溶液进行洗脱，再用超滤膜除盐。该制备方法的工艺繁琐，还需要加盐的洗脱液洗脱后再脱盐，这些操作步骤都会损失活性物质的含量，造成提取物活性低，提取率低。
发明内容
基本背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种促肝细胞生长素的制备方法，采用酶解和超滤工艺，整个工艺简单温和，而且节能环保，提取率高；所制备的促肝细胞生长素的活性较高，并且分子量小于6000D，安全性高，对人的过敏反应基本消除。
本发明提出的一种促肝细胞生长素的制备方法，包括如下步骤：
S1、乳猪肝预处理：取乳猪肝，去除胆囊、筋膜和结缔组织，清水洗净，沥水后再用注射用水清洗，然后切成宽度为3-5cm的小块或细条状，再置于绞肉机中绞成粒径为1-3mm的乳猪肝颗粒；
S2、均质：将S1得到的乳猪肝颗粒加入胶体磨中以2800-3000rpm的转速研磨2.5-4.5min得到乳猪肝糜，将乳猪肝糜和注射用水按重量比为1-2:1-2加入搅拌机中，以280-300rpm的转速搅拌15-18min得到乳猪肝匀浆；
S3、酶解：将S2得到的乳猪肝匀浆置于反应容器中，滴加3-5mol/L盐酸溶液至pH值为2.5-3.0，再加入胃蛋白酶以150-180rpm的转速搅拌22-25min后，将反应容器及其内容物置于37-45℃的水浴锅中水解6-8h得到酶解物料，其中乳猪肝匀浆与胃蛋白酶的重量比为99-101:0.4-0.6；
S4、灭活：将S3得到的酶解物料水浴加热至81-82℃，保温10-13min后，将温度降至室温静置得到灭活匀浆；
S5、离心：将S4得到的灭活匀浆加入离心瓶中，以3700-4200rpm的转速离心13-17min后，将上清液取出滴加3-5mol/L氢氧化钠溶液至pH为6.8-7.2得到中性离心液；
S6、粗滤：将S5得到的中性离心液经过截留分子量为100KD的中空纤维超滤装置进行第一次过滤后，再经过截留分子量为10KD的中空纤维超滤装置进行第二次过滤得到粗滤液，其中第一次过滤和第二次过滤的回流压力为0.05-0.10MPa；
S7、超滤：将S6得到的粗滤液再经截流分子量为6000D的超滤膜进行超滤得到促肝细胞生长素溶液，其中进液压力为0.15-0.20MPa，回流压力为0.05-0.10MPa。
优选地，S2中，将S1得到的乳猪肝颗粒加入胶体磨中以2850-2900rpm的转速研磨3-4min得到乳猪肝糜，将乳猪肝糜和注射用水按重量比为1-1.2:1-1.2加入搅拌机中，以290-300rpm的转速搅拌16-17min得到乳猪肝匀浆；
优选地，S3中，将S2得到的乳猪肝匀浆置于反应容器中，滴加4-5mol/L盐酸溶液至pH值为2.7-3.0，再加入胃蛋白酶以160-180rpm的转速搅拌23-25min后，将反应容器及其内容物置于40-42℃的水浴锅中水解6.5-7.5h得到酶解物料，其中乳猪肝匀浆与胃蛋白酶的重量比为99-101:0.5。
优选地，S5中，将S4得到的灭活匀浆加入离心瓶中，以3900-4100rpm的转速离心14-16min后，将上清液取出滴加4-5mol/L氢氧化钠溶液至pH为6.9-7.1得到中性离心液。
优选地，S7中，将S6得到的粗滤液再经截流分子量为6000D的超滤膜进行超滤得到促肝细胞生长素溶液，其中进液压力为0.17-0.18MPa，回流压力为0.06-0.09MPa。
优选地，包括如下步骤：
S1、乳猪肝预处理：取乳猪肝，去除胆囊、筋膜和结缔组织，清水洗净，沥水后再用注射用水清洗，然后切成宽度为3-5cm的小块或细条状，再置于绞肉机中绞成粒径为1-3mm的乳猪肝颗粒；
S2、均质：将S1得到的乳猪肝颗粒加入胶体磨中以2900rpm的转速研磨3min得到乳猪肝糜，将乳猪肝糜和注射用水按重量比为1:1加入搅拌机中，以300rpm的转速搅拌16.5min得到乳猪肝匀浆；
S3、酶解：将S2得到的乳猪肝匀浆置于反应容器中，滴加5mol/L盐酸溶液至pH值为3.0，再加入胃蛋白酶以170rpm的转速搅拌24min后，将反应容器及其内容物置于41℃的水浴锅中水解7h得到酶解物料，其中乳猪肝匀浆与胃蛋白酶的重量比为200:1；
S4、灭活：将S3得到的酶解物料水浴加热至82℃，保温10min后，将温度降至室温静置得到灭活匀浆；
S5、离心：将S4得到的灭活匀浆加入离心瓶中，以4000rpm的转速离心15min后，将上清液取出滴加5mol/L氢氧化钠溶液至pH为7.0得到中性离心液；
S6、粗滤：将S5得到的中性离心液经过截留分子量为100KD的中空纤维超滤装置进行第一次过滤后，再经过截留分子量为10KD的中空纤维超滤装置进行第二次过滤得到粗滤液，其中第一次过滤和第二次过滤的回流压力为0.07MPa；
S7、超滤：将S6得到的粗滤液再经截流分子量为6000D的超滤膜进行超滤得到促肝细胞生长素溶液，其中进液压力为0.17MPa，回流压力为0.07MPa。
上文中的KD为千道尔顿，D为道尔顿。
本发明将乳猪肝研磨成乳猪肝糜，促使部分肝细胞的细胞膜破碎，再通过加水搅拌，使肝细胞中的蛋白质溶出；向乳猪肝匀浆中滴加盐酸溶液不仅可以促使更多肝细胞破碎，加速蛋白质溶出，而且可以为下一步胃蛋白酶促进蛋白质水解营造适宜的反应环境，然后加入胃蛋白酶并搅拌，促使胃蛋白酶在酸性条件下与乳猪肝匀浆充分接触，在37-45℃的水浴锅中水解6-8h，充分水解大分子蛋白质，使之降解为小分子多肽链和小分子蛋白质；而将酶解物料水浴加热至81-82℃，保温10-13min，使胃蛋白酶和剩余的大分子蛋白质变性，有效的杀死可能存在的病毒和细菌，同时保证小分子多肽链和小分子蛋白质的生物活性；将灭活匀浆离心得到上清液使大分子蛋白质沉淀，而小分子多肽链和小分子蛋白质仍溶于溶液中；接着将中性离心液分别通过截留分子量为100KD的中空纤维超滤装置和截留分子量为10KD的中空纤维超滤装置，形成分级过滤，提高中性离心液的过滤效率，并得到分子量小于10KD的多肽和蛋白质，同时控制回流压力为0.05-0.10MPa，既提高了过滤效率，又能避免某些大分子在高压下通过中空纤维超滤装置；再经截流分子量为6000D的超滤膜进行超滤，同时进液压力为0.15-0.20MPa和回流压力为0.05-0.10MPa，使本发明所制备的促肝细胞生长素中的分子小于6000D，大大提高了有效组分含量浓度，而且安全性高。
本发明中，采用酶解和超滤工艺，整个工艺简单温和，而且节能环保，提取率高；所制备的促肝细胞生长素的活性较高，并且分子量小于6000D，安全性高，对人的过敏反应基本消除。
具体实施方式
下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1
本发明提出的一种促肝细胞生长素的制备方法，包括如下步骤：
S1、乳猪肝预处理：取乳猪肝，去除胆囊、筋膜和结缔组织，清水洗净，沥水后再用注射用水清洗，然后切成宽度为3-5cm的小块或细条状，再置于绞肉机中绞成粒径为1-3mm的乳猪肝颗粒；
S2、均质：将S1得到的乳猪肝颗粒加入胶体磨中以3000rpm的转速研磨2.5min得到乳猪肝糜，将乳猪肝糜和注射用水按重量比为2:1加入搅拌机中，以300rpm的转速搅拌15min得到乳猪肝匀浆；
S3、酶解：将S2得到的乳猪肝匀浆置于反应容器中，滴加5mol/L盐酸溶液至pH值为2.5，再加入胃蛋白酶以180rpm的转速搅拌22min后，将反应容器及其内容物置于45℃的水浴锅中水解6h得到酶解物料，其中乳猪肝匀浆与胃蛋白酶的重量比为101:0.4；
S4、灭活：将S3得到的酶解物料水浴加热至81℃，保温13min后，将温度降至室温静置得到灭活匀浆；
S5、离心：将S4得到的灭活匀浆加入离心瓶中，以3700rpm的转速离心17min后，将上清液取出滴加3mol/L氢氧化钠溶液至pH为7.2得到中性离心液；
S6、粗滤：将S5得到的中性离心液经过截留分子量为100KD的中空纤维超滤装置进行第一次过滤后，再经过截留分子量为10KD的中空纤维超滤装置进行第二次过滤得到粗滤液，其中第一次过滤和第二次过滤的回流压力为0.10MPa；
S7、超滤：将S6得到的粗滤液再经截流分子量为6000D的超滤膜进行超滤得到促肝细胞生长素溶液，其中进液压力为0.15MPa，回流压力为0.10MPa。
实施例2
本发明提出的一种促肝细胞生长素的制备方法，包括如下步骤：
S1、乳猪肝预处理：取乳猪肝，去除胆囊、筋膜和结缔组织，清水洗净，沥水后再用注射用水清洗，然后切成宽度为3-5cm的小块或细条状，再置于绞肉机中绞成粒径为1-3mm的乳猪肝颗粒；
S2、均质：将S1得到的乳猪肝颗粒加入胶体磨中以2800rpm的转速研磨4.5min得到乳猪肝糜，将乳猪肝糜和注射用水按重量比为1:2加入搅拌机中，以280rpm的转速搅拌18min得到乳猪肝匀浆；
S3、酶解：将S2得到的乳猪肝匀浆置于反应容器中，滴加3mol/L盐酸溶液至pH值为3.0，再加入胃蛋白酶以150rpm的转速搅拌25min后，将反应容器及其内容物置于37℃的水浴锅中水解8h得到酶解物料，其中乳猪肝匀浆与胃蛋白酶的重量比为99:0.6；
S4、灭活：将S3得到的酶解物料水浴加热至81.8℃，保温11min后，将温度降至室温静置得到灭活匀浆；
S5、离心：将S4得到的灭活匀浆加入离心瓶中，以4200rpm的转速离心13min后，将上清液取出滴加5mol/L氢氧化钠溶液至pH为6.8得到中性离心液；
S6、粗滤：将S5得到的中性离心液经过截留分子量为100KD的中空纤维超滤装置进行第一次过滤后，再经过截留分子量为10KD的中空纤维超滤装置进行第二次过滤得到粗滤液，其中第一次过滤和第二次过滤的回流压力为0.05MPa；
S7、超滤：将S6得到的粗滤液再经截流分子量为6000D的超滤膜进行超滤得到促肝细胞生长素溶液，其中进液压力为0.20MPa，回流压力为0.05MPa。
实施例3
本发明提出的一种促肝细胞生长素的制备方法，包括如下步骤：
S1、乳猪肝预处理：取乳猪肝，去除胆囊、筋膜和结缔组织，清水洗净，沥水后再用注射用水清洗，然后切成宽度为3-5cm的小块或细条状，再置于绞肉机中绞成粒径为1-3mm的乳猪肝颗粒；
S2、均质：将S1得到的乳猪肝颗粒加入胶体磨中以2850rpm的转速研磨4min得到乳猪肝糜，将乳猪肝糜和注射用水按重量比为1.2:1加入搅拌机中，以290rpm的转速搅拌17min得到乳猪肝匀浆；
S3、酶解：将S2得到的乳猪肝匀浆置于反应容器中，滴加4mol/L盐酸溶液至pH值为2.7，再加入胃蛋白酶以160rpm的转速搅拌23min后，将反应容器及其内容物置于40℃的水浴锅中水解7.5h得到酶解物料，其中乳猪肝匀浆与胃蛋白酶的重量比为99:0.5；
S4、灭活：将S3得到的酶解物料水浴加热至81.5℃，保温13min后，将温度降至室温静置得到灭活匀浆；
S5、离心：将S4得到的灭活匀浆加入离心瓶中，以3900rpm的转速离心16min后，将上清液取出滴加4mol/L氢氧化钠溶液至pH为7.1得到中性离心液；
S6、粗滤：将S5得到的中性离心液经过截留分子量为100KD的中空纤维超滤装置进行第一次过滤后，再经过截留分子量为10KD的中空纤维超滤装置进行第二次过滤得到粗滤液，其中第一次过滤和第二次过滤的回流压力为0.06MPa；
S7、超滤：S7中，将S6得到的粗滤液再经截流分子量为6000D的超滤膜进行超滤得到促肝细胞生长素溶液，其中进液压力为0.18MPa，回流压力为0.06MPa。
实施例4
本发明提出的一种促肝细胞生长素的制备方法，包括如下步骤：
S1、乳猪肝预处理：取乳猪肝，去除胆囊、筋膜和结缔组织，清水洗净，沥水后再用注射用水清洗，然后切成宽度为3-5cm的小块或细条状，再置于绞肉机中绞成粒径为1-3mm的乳猪肝颗粒；
S2、均质：将S1得到的乳猪肝颗粒加入胶体磨中以2900rpm的转速研磨3min得到乳猪肝糜，将乳猪肝糜和注射用水按重量比为1:1加入搅拌机中，以300rpm的转速搅拌16.5min得到乳猪肝匀浆；
S3、酶解：将S2得到的乳猪肝匀浆置于反应容器中，滴加5mol/L盐酸溶液至pH值为3.0，再加入胃蛋白酶以170rpm的转速搅拌24min后，将反应容器及其内容物置于41℃的水浴锅中水解7h得到酶解物料，其中乳猪肝匀浆与胃蛋白酶的重量比为200:1；
S4、灭活：将S3得到的酶解物料水浴加热至82℃，保温10min后，将温度降至室温静置得到灭活匀浆；
S5、离心：将S4得到的灭活匀浆加入离心瓶中，以4000rpm的转速离心15min后，将上清液取出滴加5mol/L氢氧化钠溶液至pH为7.0得到中性离心液；
S6、粗滤：将S5得到的中性离心液经过截留分子量为100KD的中空纤维超滤装置进行第一次过滤后，再经过截留分子量为10KD的中空纤维超滤装置进行第二次过滤得到粗滤液，其中第一次过滤和第二次过滤的回流压力为0.07MPa；
S7、超滤：将S6得到的粗滤液再经截流分子量为6000D的超滤膜进行超滤得到促肝细胞生长素溶液，其中进液压力为0.17MPa，回流压力为0.07MPa。
实施例5
本发明提出的一种促肝细胞生长素的制备方法，包括如下步骤：
S1、乳猪肝预处理：取乳猪肝，去除胆囊、筋膜和结缔组织，清水洗净，沥水后再用注射用水清洗，然后切成宽度为3-5cm的小块或细条状，再置于绞肉机中绞成粒径为1-3mm的乳猪肝颗粒；
S2、均质：将S1得到的乳猪肝颗粒加入胶体磨中以2880rpm的转速研磨3.5min得到乳猪肝糜，将乳猪肝糜和注射用水按重量比为1:1.2加入搅拌机中，以295rpm的转速搅拌17min得到乳猪肝匀浆；
S3、酶解：将S2得到的乳猪肝匀浆置于反应容器中，滴加4.5mol/L盐酸溶液至pH值为2.9，再加入胃蛋白酶以180rpm的转速搅拌25min后，将反应容器及其内容物置于42℃的水浴锅中水解6.5h得到酶解物料，其中乳猪肝匀浆与胃蛋白酶的重量比为101:0.5；
S4、灭活：将S3得到的酶解物料水浴加热至81.2℃，保温12min后，将温度降至室温静置得到灭活匀浆；
S5、离心：将S4得到的灭活匀浆加入离心瓶中，以4100rpm的转速离心14min后，将上清液取出滴加4.5mol/L氢氧化钠溶液至pH为6.9得到中性离心液；
S6、粗滤：将S5得到的中性离心液经过截留分子量为100KD的中空纤维超滤装置进行第一次过滤后，再经过截留分子量为10KD的中空纤维超滤装置进行第二次过滤得到粗滤液，其中第一次过滤和第二次过滤的回流压力为0.08MPa；
S7、超滤：S7中，将S6得到的粗滤液再经截流分子量为6000D的超滤膜进行超滤得到促肝细胞生长素溶液，其中进液压力为0.17MPa，回流压力为0.09MPa。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种促肝细胞生长素的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： 
S1、乳猪肝预处理：取乳猪肝，去除胆囊、筋膜和结缔组织，清水洗净，沥水后再用注射用水清洗，然后切成宽度为3-5cm的小块或细条状，再置于绞肉机中绞成粒径为1-3mm的乳猪肝颗粒； 
S2、均质：将S1得到的乳猪肝颗粒加入胶体磨中以2800-3000rpm的转速研磨2.5-4.5min得到乳猪肝糜，将乳猪肝糜和注射用水按重量比为1-2:1-2加入搅拌机中，以280-300rpm的转速搅拌15-18min得到乳猪肝匀浆； 
S3、酶解：将S2得到的乳猪肝匀浆置于反应容器中，滴加3-5mol/L盐酸溶液至pH值为2.5-3.0，再加入胃蛋白酶以150-180rpm的转速搅拌22-25min后，将反应容器及其内容物置于37-45℃的水浴锅中水解6-8h得到酶解物料，其中乳猪肝匀浆与胃蛋白酶的重量比为99-101:0.4-0.6； 
S4、灭活：将S3得到的酶解物料水浴加热至81-82℃，保温10-13min后，将温度降至室温静置得到灭活匀浆； 
S5、离心：将S4得到的灭活匀浆加入离心瓶中，以3700-4200rpm的转速离心13-17min后，将上清液取出滴加3-5mol/L氢氧化钠溶液至pH为6.8-7.2得到中性离心液； 
S6、粗滤：将S5得到的中性离心液经过截留分子量为100KD的中空纤维超滤装置进行第一次过滤后，再经过截留分子量为10KD的中空纤维超滤装置进行第二次过滤得到粗滤液，其中第一次过滤和第二次过滤的回流压力为0.05-0.10MPa； 
S7、超滤：将S6得到的粗滤液再经截流分子量为6000D的超滤膜进行超滤得到促肝细胞生长素溶液，其中进液压力为0.15-0.20MPa，回流压力为0.05-0.10MPa。 
2.根据权利要求1所述促肝细胞生长素的制备方法，其特征在于，S2中，将S1得到的乳猪肝颗粒加入胶体磨中以2850-2900rpm的转速研磨3-4min得到乳猪肝糜，将乳猪肝糜和注射用水按重量比为1-1.2:1-1.2加入搅拌机中，以290-300rpm的转速搅拌16-17min得到乳猪肝匀浆。 
3.根据权利要求1或2所述促肝细胞生长素的制备方法，其特征在于，S3中，将S2得到的乳猪肝匀浆置于反应容器中，滴加4-5mol/L盐酸溶液至pH值为2.7-3.0，再加入胃蛋白酶以160-180rpm的转速搅拌23-25min后，将反应容器及其内容物置于40-42℃的水浴锅中水解6.5-7.5h得到酶解物料，其中乳猪肝匀浆与胃蛋白酶的重量比为99-101:0.5。 
4.根据权利要求1-3任一项所述促肝细胞生长素的制备方法，其特征在于，S5中，将S4得到的灭活匀浆加入离心瓶中，以3900-4100rpm的转速离心14-16min后，将上清液取出滴加4-5mol/L氢氧化钠溶液至pH为6.9-7.1得到中性离心液。 
5.根据权利要求1-4任一项所述促肝细胞生长素的制备方法，其特征在于，S7中，将S6得到的粗滤液再经截流分子量为6000D的超滤膜进行超滤得到促肝细胞生长素溶液，其中进液压力为0.17-0.18MPa，回流压力为0.06-0.09MPa。 
6.根据权利要求1-5任一项所述促肝细胞生长素的制备方法，其特征在于，包括如下步骤： 
S1、乳猪肝预处理：取乳猪肝，去除胆囊、筋膜和结缔组织，清水洗净，沥水后再用注射用水清洗，然后切成宽度为3-5cm的小块或细条状，再置于绞肉机中绞成粒径为1-3mm的乳猪肝颗粒； 
S2、均质：将S1得到的乳猪肝颗粒加入胶体磨中以2900rpm的转速研磨3min得到乳猪肝糜，将乳猪肝糜和注射用水按重量比为1:1加入搅拌机中，以 300rpm的转速搅拌16.5min得到乳猪肝匀浆； 
S3、酶解：将S2得到的乳猪肝匀浆置于反应容器中，滴加5mol/L盐酸溶液至pH值为3.0，再加入胃蛋白酶以170rpm的转速搅拌24min后，将反应容器及其内容物置于41℃的水浴锅中水解7h得到酶解物料，其中乳猪肝匀浆与胃蛋白酶的重量比为200:1； 
S4、灭活：将S3得到的酶解物料水浴加热至82℃，保温10min后，将温度降至室温静置得到灭活匀浆； 
S5、离心：将S4得到的灭活匀浆加入离心瓶中，以4000rpm的转速离心15min后，将上清液取出滴加5mol/L氢氧化钠溶液至pH为7.0得到中性离心液； 
S6、粗滤：将S5得到的中性离心液经过截留分子量为100KD的中空纤维超滤装置进行第一次过滤后，再经过截留分子量为10KD的中空纤维超滤装置进行第二次过滤得到粗滤液，其中第一次过滤和第二次过滤的回流压力为0.07MPa； 
S7、超滤：将S6得到的粗滤液再经截流分子量为6000D的超滤膜进行超滤得到促肝细胞生长素溶液，其中进液压力为0.17MPa，回流压力为0.07MPa。 
CN201410586429.3A 2014-10-27 2014-10-27 一种促肝细胞生长素的制备方法 Pending CN104388511A (zh)

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