CN101225101A - 一种促肝细胞生长素溶液制备工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种促肝细胞生长素溶液制备工艺，该制备工艺，包括材料肝脏清洗步骤，肝组织破碎步骤，活性成分提取步骤，加热变性步骤，固液分离和pH值调整步骤，其特点是：所述的活性成分提取采取酶或酸水解的化学提取法，所述的酶水解提取法加入的酶为木瓜蛋白酶或胰蛋白酶或胃蛋白酶或中性蛋白酶，所述的酸水解提取法加入的酸为盐酸或磷酸或醋酸。本发明采用酶水解提取法或酸水解提取法等化学提取工艺，克服了现有技术反复冻融法存在的缺陷，简化了促肝细胞生长素溶液制备操作，缩短了生产周期，制备的促肝细胞生长素溶液产品质量完全符合国家药品监督管理局相关的国家药品标准要求，且制备收率高、生产成本低。
Description
技术领域
本发明涉及一种生化药品的制备工艺，特别是一种促肝细胞生长素溶液制备工艺。
背景技术
促肝细胞生长素pHGF是一种生化药品，主要用于治疗各种重症肝炎、慢性活动性肝炎和肝硬化等疾病，疗效确切、副作用小，已在临床应用10余年。促肝细胞生长素pHGF制备的主要原料是促肝细胞生长素溶液，促肝细胞生长素溶液是从新鲜的乳猪肝或小牛肝中提取的生物活性多肽溶液。现有技术促肝细胞生长素溶液制备工艺分两步，一是材料处理，二是促肝细胞生长素溶液制备。促肝细胞生长素溶液制备关键工艺，活性成分提取采用一种物理方法——反复冻融法，在肝脏清洗和肝组织破碎等材料处理后，将破碎的肝浆分装到容器中，放冷库冷冻，冻结后取出在恒温水浴摇床上振摇融化，再放冷库中冷冻，如此重复操作4～5次，进行活性成分提取。冻融结束后将匀浆液加热至75～100℃进行变性，再保温5～30分钟；保温结束后将提取液用冷却水冷却至常温，用离心机进行离心分离；取离心上清液，用10～50KD的超滤膜超滤；超滤液再用HCl或NaOH调节其pH值至6.0～7.0，最后，再用8～10KD的超滤膜超滤，即得促肝细胞生长素溶液。现有技术反复冻融法需要进行4～5次，存在操作麻烦、生产周期长，且收率低、成本高等缺陷。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服现有技术存在的缺陷，提供一种操作方便、生产周期短、收率高、成本低，且产品质量符合国家标准要求的促肝细胞生长素溶液制备工艺。
本发明解决上述问题所采用的技术方案是：该促肝细胞生长素溶液制备工艺，包括材料处理、活性成分提取、加热变性、固液分离和pH值调整，其特点是：所述的活性成分提取采取酶或酸水解的化学提取法，所述的促肝细胞生长素溶液制备工艺包括以下步骤：
a、材料肝脏清洗步骤，用水把肝脏中的血水冲洗干净；
b、肝组织破碎步骤，将清洗干净的肝脏进行肝组织破碎；
c、活性成分提取步骤，在破碎的肝浆中加肝浆重量0.5～5倍的水，均匀搅拌成匀浆液，所述的酶水解提取法在匀浆液中加入肝浆重量0.05％～5％的酶进行酶水解，水解时间为0.5～10小时，所述的酸水解提取法用酸调节匀浆液的pH值至1.0～6.0之间后，放入温度为-5～-30℃的冷库中冻结5～40小时，冻结后取出在45℃以下水浴中解冻，再将解冻后的酸水解液用氢氧化钠调节pH值至6.0～7.0；
d、加热变性步骤，将酶或酸水解后的匀浆液加热至75～100℃，保温5～30分钟，使匀浆液中的大分子蛋白质变性沉淀；
e、固液分离和pH值调整步骤，将加热变性保温结束后的酶或酸水解液用冷却水冷却至常温，进行固液分离，分离后的清液用HCl/NaOH调整pH值至6.0～7.0，即得促肝细胞生长素溶液。
本发明促肝细胞生长素溶液制备工艺所述的“c、活性成分提取步骤”采用酶水解提取法加入的酶为木瓜蛋白酶或胰蛋白酶或胃蛋白酶或中性蛋白酶，酶的加入量为肝浆重量的2％，酶水解时间为8小时。
本发明促肝细胞生长素溶液制备工艺所述的“c、活性成分提取步骤”采用酸水解提取法加入的酸为盐酸或磷酸或醋酸，冷库的温度为-10±2℃，冻结时间为15±5小时。
本发明促肝细胞生长素溶液制备工艺所述的“b、肝组织破碎步骤”的肝组织破碎采用胶体磨匀浆破碎或超声波破碎。
本发明促肝细胞生长素溶液制备工艺所述的“e、固液分离和pH值调整步骤”分为两步：
e1、分离步骤，将加热变性保温结束后的酶或酸水解液用冷却水冷却至常温，用离心机进行离心固液分离；
e2、上清液超滤和pH值调整步骤，取离心分离后的上清液，用10～50KD的超滤膜超滤，将经过上述超滤的上清液用HCl/NaOH调整pH值至6.0～7.0，再用8～10KD的超滤膜进行超滤，超滤液即为促肝细胞生长素溶液。
本发明促肝细胞生长素溶液制备工艺所述的“c、活性成分提取步骤”中肝浆中水的加入量为肝浆重量的1倍，所述的“d、加热变性步骤”的加热温度为95±2℃，保温时间为15±5分钟，所述的“e2、上清液超滤和pH值调整步骤”中前后两次超滤分别使用50KD的超滤膜和10KD的超滤膜。
本发明与现有技术相比具有以下优点：1、本发明摈弃了现有技术采用的反复冻融活性成分提取工艺，而采用酶水解提取法或酸水解提取法等化学提取工艺，简化了操作，缩短了生产周期。2、本发明酶水解提取法或酸水解提取法制备的促肝细胞生长素溶液产品质量完全符合相关的国家药品监督管理局国家药品标准要求，且制备收率高、生产成本低。检定结果表示酶水解提取法或酸水解提取法制备的促肝细胞生长素溶液产品的性状、pH值、蛋白质、高分子量物质含量、多肽含量和活性等指标均达到或超过国家药品标准规定的指标。根据统计相同的投产量，酶水解提取法产出促肝细胞生长素溶液量最大、酸水解提取法产出量其次、现有技术反复冻融提取法产出量最低；制备的溶液多肽含量也是酶水解提取法最高、酸水解提取法其次、反复冻融提取法最低；单位成本酶水解提取法最低、酸水解提取法第二、反复冻融提取法最高。
具体实施方式
下面通过实施例，对本发明作进一步的阐述。
实施例1：
该促肝细胞生长素溶液制备工艺，包括材料处理、活性成分提取、加热变性、固液分离和超滤、pH值调整，材料处理主要进行肝脏清洗和肝组织破碎。本实施例活性成分提取采取酶水解化学活性成分提取方法，具体制备工艺包括以下六个步骤。
1、材料肝脏清洗步骤：去除新鲜的乳猪肝或小胎牛肝的脂肪和筋膜，用水把肝脏中的血水冲洗干净。
2、肝组织破碎步骤：将清洗干净的肝脏切碎，加入洁净水，进行肝组织破碎。本实施例肝组织破碎采用胶体磨匀浆破碎，也可以采用超声波等其它破碎方式。
3、活性成分提取步骤：在破碎的肝浆中以1∶1的重量比例加水，均匀搅拌制成匀浆液，加入的水量根据肝浆的具体情况，可以在肝浆重量的0.5～5倍之间调整；再在匀浆液中加入肝浆重量0.05％～5％的酶进行酶水解，水解时间为0.5～10小时。酶可以选用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶和中性蛋白酶中的一种，实施例酶的加入量为肝浆重量的2％，酶水解时间为8小时。
4、加热变性步骤：将经过酶水解的匀浆液加热至75～100℃，使匀浆液中的大分子蛋白质变性沉淀，加热保温时间为5～30分钟。实施例加热温度控制在95±2℃，保温时间为15±5分钟。
5、分离步骤：加热变性保温结束后将酶水解液用冷却水冷却至常温，进行固液分离，实施例采用离心机进行固液离心分离，也可以采用其它的固液分离方式。
6、上清液超滤和pH值调整步骤：取离心分离后的上清液，用10～50KD的超滤膜超滤，再用HCl/NaOH调节经超滤分子截留的超滤溶液的pH值至6.0～7.0，再次用8～10KD的超滤膜进行超滤，超滤液即为促肝细胞生长素溶液。实施例这前后两次超滤分别选用50KD的超滤膜和10KD的超滤膜。
实施例2：
本实施例采取酸水解化学活性成分提取法，酸水解提取法的活性成分提取步骤的操作如下：
在经过“a、材料肝脏清洗步骤”和“b、肝组织破碎步骤”的破碎肝浆中加入肝浆重量1倍的水，均匀搅拌使其成为匀浆液，用酸调节匀浆液的pH值至1.0～6.0之间后，放入温度为-5～-30℃的冷库中冻结5～40小时，冻结后取出在45℃以下水浴中解冻，再将解冻后的酸水解液用氢氧化钠调节pH值至6.0～7.0。本实施例酸水解提取法使用的酸为盐酸或磷酸或醋酸，冷库的温度控制在-10±2℃，冻结时间为15±5小时。
本实施例的其它操作步骤同于实施例1。
根据促肝细胞生长素溶液中华人民共和国药品监督管理局国家药品标准WS-10001-(HD-0860)-2002的规定，对采用反复冻融法、酸水解提取法和酶水解提取法制备的促肝细胞生长素溶液进行检测，得出酶水解提取法制备的产品质量最优，现有技术反复冻融法相对比较最次。三种制备工艺制备的促肝细胞生长素溶液检测结果详见表1。
表1三种制备工艺制备的促肝细胞生长素溶液检测结果对照表
| 序号 | 项目 | 国家药品标准 | 反复冻融法 | 酸水解法 | 酶水解法 |
| 1 | 性状 | 为微黄色澄明液体 | 符合标准要求 | 符合标准要求 | 符合标准要求 |
| 2 | 鉴别 | 溶液显蓝紫色至紫红色 | 符合标准要求 | 符合标准要求 | 符合标准要求 |
| 3 | PH值 | 6.0～7.0 | 6.5 | 6.5 | 6.6 |
| 4 | 蛋白质 | 不得发生混浊或沉淀 | 符合标准要求 | 符合标准要求 | 符合标准要求 |
| 5 | 高分子量物质 | 不得过6.0％(注1) | 4.0％ | 3.5％ | 0.4％ |
| 6 | 活力测定 | 不得小于4.0(注2) | 6.7 | 5.6 | 6.5 |
| 7 | 异常毒性 | 符合供注射用 | 符合标准要求 | 符合标准要求 | 符合标准要求 |
| 8 | 热原 | 符合供注射用 | 符合标准要求 | 符合标准要求 | 符合标准要求 |
| 9 | 过敏性试验 | 符合供注射用 | 符合标准要求 | 符合标准要求 | 符合标准要求 |
| 10 | 无菌 | 符合供注射用 | 符合标准要求 | 符合标准要求 | 符合标准要求 |
| 11 | 多肽含量 | 大于5mg/ml(注3) | 6.5mg/ml | 15.3mg/ml | 22.0mg/ml |
注1：“不得过6.0％”指根据标准规定的测定法，采用液相色谱仪，记录色谱图，按峰面积归一化计算，小于胰岛素峰保留时间的峰面积之和不得过6.0％。注2：“不得小于4.0”指根据标准规定的促肝细胞生长素活性测定法(附一)测定，刺激指数不得小于4.0。注3：多肽含量按照标准规定的福林酚测定法(附二)测定。
从反复冻融法、酸水解提取法和酶水解提取法3种制备工艺的收率、产品中有效成分多肽含量以及生产成本统计中，得知酶水解提取法最先进，其收率最高，投入100Kg乳猪肝，能产出促肝细胞生长素溶液142Kg；溶液中多肽含量最高，达到22.0mg/ml，总多肽量远远高于其他2种方法；制备成本最低，若以现有技术反复冻融法作为1来测算，则酸水解提取法的成本为0.5，酶水解法的制备成本为0.25。三种制备工艺的收率和成本详见表2。
表2三种制备工艺的收率和成本比较表
| 提取方法 | 投入乳猪肝量(Kg) | 产出促肝细胞生长素溶液量(Kg) | 促肝细胞生长素溶液中多肽含量(mg/ml) | 成本比值 |
| 反复冻融法 | 100 | 70 | 6.5 | 1 |
| 酸水解法 | 100 | 112 | 15.3 | 0.5 |
| 酶水解法 | 100 | 142 | 22.0 | 0.25 |
Claims (6)
1.一种促肝细胞生长素溶液制备工艺，包括材料处理、活性成分提取、加热变性、固液分离和pH值调整，其特征在于：所述的活性成分提取采取酶或酸水解的化学提取法，所述的促肝细胞生长素溶液制备工艺包括以下步骤：
a、材料肝脏清洗步骤，用水把肝脏中的血水冲洗干净；
b、肝组织破碎步骤，将清洗干净的肝脏进行肝组织破碎；
c、活性成分提取步骤，在破碎的肝浆中加肝浆重量0.5～5倍的水，均匀搅拌成匀浆液，所述的酶水解提取法在匀浆液中加入肝浆重量0.05％～5％的酶进行酶水解，水解时间为0.5～10小时，所述的酸水解提取法用酸调节匀浆液的pH值至1.0～6.0之间后，放入温度为-5～-30℃的冷库中冻结5～40小时，冻结后取出在45℃以下水浴中解冻，再将解冻后的酸水解液用氢氧化钠调节pH值至6.0～7.0；
d、加热变性步骤，将酶或酸水解后的匀浆液加热至75～100℃，保温5～30分钟，使匀浆液中的大分子蛋白质变性沉淀；
e、固液分离和pH值调整步骤，将加热变性保温结束后的酶或酸水解液用冷却水冷却至常温，进行固液分离，分离后的清液用HCl/NaOH调整pH值至6.0～7.0，即得促肝细胞生长素溶液。
2.根据权利要求1所述的促肝细胞生长素溶液制备工艺，其特征在于：所述的“c、活性成分提取步骤”采用酶水解提取法加入的酶为木瓜蛋白酶或胰蛋白酶或胃蛋白酶或中性蛋白酶，酶的加入量为肝浆重量的2％，酶水解时间为8小时。
3.根据权利要求1所述的促肝细胞生长素溶液制备工艺，其特征在于：所述的“c、活性成分提取步骤”采用酸水解提取法加入的酸为盐酸或磷酸或醋酸，冷库的温度为-10±2℃，冻结时间为15±5小时。
4.根据权利要求2或3所述的促肝细胞生长素溶液制备工艺，其特征在于：所述的“b、肝组织破碎步骤”的肝组织破碎采用胶体磨匀浆破碎或超声波破碎。
5.根据权利要求4所述的促肝细胞生长素溶液制备工艺，其特征在于：所述的“e、固液分离和pH值调整步骤”分为两步：
e1、分离步骤，将加热变性保温结束后的酶或酸水解液用冷却水冷却至常温，用离心机进行离心固液分离；
e2、上清液超滤和pH值调整步骤，取离心分离后的上清液，用10～50KD的超滤膜超滤，将经过上述超滤的上清液用HCl/NaOH调整pH值至6.0～7.0，再用8～10KD的超滤膜进行超滤，超滤液即为促肝细胞生长素溶液。
6.根据权利要求5所述的促肝细胞生长素溶液制备工艺，其特征在于：所述的“c、活性成分提取步骤”中肝浆中水的加入量为肝浆重量的1倍，所述的“d、加热变性步骤”的加热温度为95±2℃，保温时间为15±5分钟，所述的“e2、上清液超滤和pH值调整步骤”中前后两次超滤分别使用50KD的超滤膜和10KD的超滤膜。
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