CN104846048A - 一种动物多肽的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种动物多肽的提取方法，包括以下步骤：(1)取动物组织及动物骨骼作为原料，进行清洗、粉碎、保鲜处理；(2)将原料进行蒸煮升温至140℃，保温8小时；(3)降温至37-50℃后，加入到缓冲液中，加入木瓜蛋白酶或复合酶，进行水解；(4)水解后，将原料升温至146℃，干燥处理3小时；(5)降温至50℃进行保温，离心，取上清液；(6)上清液经活性炭吸附后即得。相对于现有技术，本发明采用酶法水解反应温和，氨基酸破坏小，安全可靠，易控制，无污染，且得到的胶原多肽纯度高，水溶性好，理化性质稳定。
Description
技术领域
本发明涉及动物多肽提取技术领域，特别是涉及一种动物多肽的提取方法。
背景技术
肽是涉及生物体内多种细胞功能的生物活性物质。截止2003年9月，生物体内已发现几百种肽，是机体完成各种复杂的生理活性必不可少的参与者。所有细胞都能合成多肽物质，其功能活动也受多肽的调节。它涉及激素、神经、细胞生长和生殖各领域，其重要性在于调节体内各个系统器官和细胞。酶法多肽的生理和药理作用主要是激活体内有关酶系，促进中间代谢膜的通透性，或通过控制DNA转录或翻译而影响特异的蛋白合成，最终产生特定的生理效应或发挥其药理作用。肽优于氨基酸，一是较氨基酸吸收快速；二是以完整的形式被机体吸收；三是主动吸收(氨基酸属被动吸收)；四是低耗，与氨基酸比较，肽吸收具有低耗或不需消耗能量的特点，肽通过十二指肠吸收后，直接进入血液循环，将自身能量营养输送到人体各个部位；五是肽吸收较氨基酸，具有不饱和的特点；六是氨基酸只有20种，功能可数，而肽以氨基酸为底物，可合成上百上千种。
目前，国内外研发生产的肽主要有三种。第一种是以植物蛋白质为原料加工成的钛制品，通称为植物多肽。目前国内外比较大的企业现行的肽制品主要是植物多肽。由于大豆类植物本身含蛋白质多，常为植物多肽的主要原料。但是由于豆类抗胰酶类强，往往由于酶解不彻底，影响产品的含肽量；此外，植物多肽的加工工艺、设备较为复杂，导致生产成本较高。第二种是以动物蛋白质为原料加工生产的肽，通称为动物多肽。动物多肽的原料来源主要是海洋生物和陆地生物。第三种是用已知肽的分子量和特殊功能，通过人工合成的方式生产的肽，这种合成肽是疫苗和治疗某种疾病的特殊药品，由于这种肽的生产设备和工艺要求特别严格，生产成本昂贵，临床观察期长，很难成为中小企业的产品。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，而提供一种动物多肽的提取方法，该提取工艺能够在保证动物多肽产品质量的情况下实现工业化生产。
为实现本发明的目的所采用的技术方案是：一种动物多肽的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取富含动物蛋白的动物组织及动物骨骼作为原料，进行清洗、粉碎、保鲜处理；
(2)将原料进行蒸煮升温至140℃，然后保温8小时；
(3)原料自然降温至37-50℃后，加入到Tris－缓冲液中，料液比(w/v)为1∶2，加入木瓜蛋白酶或复合酶，进行水解；
(4)水解后，将原料升温至146℃灭酶，干燥处理3小时；
(5)自然降温至50℃进行保温；然后在11000r/min下离心20min，取上清液；
(6)上清液经活性炭吸附后即得动物多肽。
优选的，所述步骤(3)中使用木瓜蛋白酶的水解时间为2-4小时。
优选的，所述步骤(3)使用木瓜蛋白酶水解时的pH值范围为4～6。
优选的，所述步骤(3)使用的木瓜蛋白酶浓度为480～600U/g。
优选的，所述步骤(3)中使用木瓜蛋白酶的水解条件为温度50℃、时间4h、pH5、酶浓度600U/g。
优选的，所述步骤(3)中加入的复合酶优选为等量的中性蛋白酶和胰蛋白酶。优选的，当使用复合酶时，所述步骤(3)中的水解时间优选为1-4小时。
现有技术中有使用酸水解的工艺，虽酸法较酶法水解强度高，但动物组织或骨骼中的灰分、色素易溶于酸，水解后需脱灰、脱色。相对于现有技术，本发明采用酶法水解反应温和，氨基酸破坏小，安全可靠，易控制，无污染，且得到的胶原多肽纯度高，水溶性好，理化性质稳定。
附图说明
图1所示为木瓜蛋白酶水解温度对水解度的影响曲线图；
图2所示为木瓜蛋白酶水解时间对水解度的影响曲线图；
图3所示为木瓜蛋白酶水解pH值对水解度的影响曲线图；
图4所示为木瓜蛋白酶浓度对酶解效果的影响曲线图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1：
一种动物多肽的提取方法，包括以下步骤：
(1)取猪内脏及猪骨作为原料，进行清洗、粉碎、保鲜处理；
(2)将原料进行蒸煮升温至140℃，然后保温8小时；
(3)原料自然降温至37-50℃后，加入Tris－缓冲液(0.05mol/L，pH7.5)中，料液比(w/v)为1∶2，加入木瓜蛋白酶，进行水解；
(4)水解后，将原料升温至146℃灭酶，干燥处理3小时；
(5)自然降温至50℃进行保温；然后在11000r/min下离心20min，取上清液；
(6)上清液经活性炭吸附后即得动物多肽。
本实施例1中使用的木瓜蛋白酶采购自广西杰沃利生物公司。
优选的，所述步骤(3)中的水解时间为2-4小时。酶是特定的蛋白质，只有在特定温度下，酶才能保持其最佳的活性。因此，温度对水解效果的影响较显著。如图1所示，本发明在使用木瓜蛋白酶或复合酶水解猪蛋白时，经过试验论证，温度在37-50℃，其水解度是在较高的范围的；而当温度从50℃增加到70℃，水解度逐渐下降，温度为50℃时水解度达到最高。因此，确定木瓜蛋白酶进行水解的最适温度范围为37-50℃。
优选的，所述步骤(3)中的水解时间为2-4小时。如图2所示，水解猪蛋白时，随水解时间的延长，水解度逐渐升高，但当水解一定时间后，水解度的升高趋于缓慢。这是因为随着水解的进行，蛋白质底物逐渐减少，且酶解产物不断积累对酶本身造成抑制。经过试验发现，木瓜蛋白酶水解胶原蛋白3h时后，水解度上升曲线逐渐趋于平坦，因此，选择木瓜蛋白酶水解猪蛋白的最适时间是2～4h。
优选的，所述步骤(3)水解时的pH值范围为4～6。因为，酶分子的活性部位一般由结合部位和催化部位组成，结合部位的功能是结合底物，催化部位则起催化底物化学反应的作用。活性部位的氨基酸侧链基团以特定的空间结构靠在一起形成活化中心，而活化中心必须在酶蛋白分子保持一定的空间构象时才能存在，从而发挥催化功能。活化中心这些基团对pH值变化较敏感，因此，只有在一定的pH值条件下，活化中心才能发挥最佳的催化作用，而且，随着pH值的变化活性中心的催化作用差异有可能很大。另外，酶的催化也和底物构像有很大关系，而底物蛋白构像也需要特定的pH值条件。如图3所示，木瓜蛋白酶水解猪蛋白时，pH值从3增加到5时，水解度逐渐升高；而当pH值从5增加到7时，水解度逐渐下降，pH值为5时水解度达到最高。
优选的，所述步骤(3)使用的木瓜蛋白酶浓度为480～600U/g。图4可以看出，酶浓度对水解效果有显著的影响。水解猪蛋白时，随酶浓度的增加，水解度逐渐升高。因为当底物浓度与反应时间一定时，底物的水解度取决于酶浓度，只有当酶分子在体系中趋于饱和后，部分酶分子不能和底物接触时，水解度的提高才会减慢甚至停止。但从图4中可发现，当酶浓度达到一定值时，随酶浓度的增加水解度的升高趋于缓慢。由于水解底物是有限的，当酶量达到一定程度时，就可将大部分的底物反应掉。由于水解底物的缺乏，这时即使再增加酶量，也无法使水解度得到显著提高，而且还会增加成本。木瓜蛋白酶水解胶原蛋白时，加酶量达到540U/g时，水解度上升速度已非常缓慢。
下表为木瓜蛋白酶酶解猪骨胶原蛋白的试验结果
因此，所述步骤(3)中使用木瓜蛋白酶的水解条件为温度50℃、时间4h、pH5、酶浓度600U/g，该条件下的水解度为16.87％。
实施例2：
一种动物多肽的提取方法，包括以下步骤：
(1)取猪内脏及猪骨作为原料，进行清洗、粉碎、保鲜处理；
(2)将原料进行蒸煮升温至140℃，然后保温8小时；
(3)原料自然降温至37-50℃后，加入Tris－缓冲液(0.05mol/L，pH7.5)中，料液比(w/v)为1∶2，加入复合酶，进行水解；
(4)水解后，将原料升温至146℃灭酶，干燥处理3小时；
(5)自然降温至50℃进行保温；然后在11000r/min下离心20min，取上清液；
(6)上清液经活性炭吸附后即得动物多肽。
优选的，所述步骤(3)中加入的复合酶优选为等量的中性蛋白酶和胰蛋白酶。实施例2中使用的中性蛋白酶(19630U/g)，采购自上海源叶生物科技有限公司；胰蛋白酶(174850U/g)，采购自上海生物技术公司。
优选的，当使用复合酶时，所述步骤(3)中的水解时间优选为1-4小时。经过试验发现，当水解时间在1、4h时，酶解液的水解度达到较大值；水解时间在4h后，水解度逐渐变小；这是因为蛋白酶解得到多肽，随着酶解时间的增加，其肽段断裂，产生氨基酸残基，掩盖了某些氨基酸末端的活性基团或活性位点，使其水解率下降。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种动物多肽的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取富含动物蛋白的动物组织及动物骨骼作为原料，进行清洗、粉碎、保鲜处理；
(2)将原料进行蒸煮升温至140℃，然后保温8小时；
(3)原料自然降温至37-50℃后，加入到Tris－缓冲液中，料液比(w/v)为1∶2，加入木瓜蛋白酶或复合酶，进行水解；
(4)水解后，将原料升温至146℃灭酶，干燥处理3小时；
(5)自然降温至50℃进行保温；然后在11000r/min下离心20min，取上清液；
(6)上清液经活性炭吸附后即得动物多肽。
2.根据权利要求1所述的一种动物多肽的提取方法，其特征在于所述步骤(3)中木瓜蛋白酶所需的水解时间为2-4小时。
3.根据权利要求1所述的一种动物多肽的提取方法，其特征在于所述步骤(3)木瓜蛋白酶的水解时的pH值范围为4～6。
4.根据权利要求1所述的一种动物多肽的提取方法，其特征在于所述步骤(3)使用的木瓜蛋白酶浓度为480～600U/g。
5.根据权利要求1所述的一种动物多肽的提取方法，其特征在于所述步骤(3)中使用木瓜蛋白酶的水解条件为温度50℃、时间4h、pH5、酶浓度600U/g。
6.根据权利要求1所述的一种动物多肽的提取方法，其特征在于所述步骤(3)中加入的复合酶为等量的中性蛋白酶和胰蛋白酶。
7.根据权利要求6所述的一种动物多肽的提取方法，其特征在于所述步骤(3)使用复合酶的水解时间为1-4小时。
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