CN102492760B - 一种利用复合酶生产活性东北林蛙胶原蛋白低聚肽的方法 - Google Patents
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Abstract
一种利用复合酶生产活性东北林蛙胶原蛋白低聚肽的方法涉及胶原蛋白制备领域，该方法包括：1)将干东北林蛙皮浸灰、软化、过夜，水洗至中性；2)加入复合酶，酶解2～3小时，加热至85℃，灭活20分钟；3)活性炭脱色，超滤膜精制、浓缩，真空冷冻干燥，得到小分子活性林蛙胶原蛋白低聚肽。本发明的方法可以大幅度降低成本，酶解率为90％以上，提取率在30％以上同比增长5％左右，酶解后提取纯度可达90％-97％，极大地减少对环境的污染并简化操纵工序，高效，环保。
Description
技术领域
本发明涉及胶原蛋白低聚肽的制备领域，尤其涉及一种复合蛋白酶在最佳条件下酶解东北林蛙皮生产活性胶原蛋白低聚肽的方法。
背景技术
胶原蛋白低聚肽是胶原蛋白生物降解后的分子聚合物，由两个或两个以上氨基酸通过肽键连接而成。科学证实：人体皮肤的衰老就是胶原蛋白流失的过程。其对人的机体生理作用主要表现在：免疫调节、抗氧化、抗疲劳、广谱抗菌、抗肿瘤等方面，可广泛应用于医药、保健食品、化妆品等领域。目前，我国对胶原蛋白的需求每年约400吨。
胶原蛋白低聚肽主要来源可分为人工合成和胶原蛋白酶解两种。人工合成胶原蛋白低聚肽技术要求高，成本高昂，市场化程度低，使用效果不稳定。胶原蛋白酶解避免了化学降解法的反应环境极端，丢失活性，化学试剂残留等缺点。生物酶解后不仅具有稳定的活性和较强的生物相容性，更具有安全性高、过程易控制、分子量可控等优点。酶制剂的选择是酶解法生产活性低聚肽的关键，目前主要生产工艺都是采用胃蛋白酶等单一酶，由于酶解单一使其提取率低下，生产成本高。因此寻找一种提取率高、活性高的酶制剂生产活性低聚肽具有重要的意义。
现有的一种方法是以林蛙皮为原料采用酸酶法提取胶原蛋白的方法，其方法采用酸酶结合提取，破坏一部分肽键，使得胶原变成可以被醋酸溶解的可溶性胶原蛋白，从而达到提取的目的。酸酶结合提取条件为质量比胃蛋白酶∶原料＝1∶50，提取温度37℃，保温时间72h，提取缓冲液50ml 0.5mol/L冰醋酸，提取两次，最终的提取率可达到81.6％，胶原蛋白含量不少于26％。该工艺由于采用酸碱溶液破坏了胶原蛋白的活性，同时其工艺繁琐、成本较高、胶原蛋白提取率低，工业化生产尚有差距。
另一种方法是利用海洋生物提取海洋胶原蛋白的方法，主要有热水浸提法、酸法、碱法、盐法及酶法等。目前，酶解海洋胶原蛋白主要有单酶法和多酶法，多酶法又分为混合酶解法和分步酶解法。国内关于海洋胶原蛋白酶解的研究也非常多，木瓜蛋白酶酶解鱼皮得到短肽分子量为6000～29000D，该方法采用的单酶法提取率低下，分子量大且分散。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用复合酶生产活性东北林蛙胶原蛋白低聚肽的方法，该方法首次将复合酶法应用到林蛙皮胶原蛋白低聚肽的提取过程中，避免了单一酶制剂的酶解低效性，同时保持了其生物活性并且提高了提取率和生物相容性。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：
一种利用复合酶生产活性东北林蛙胶原蛋白低聚肽的方法，包括如下步骤：
第一步，将干的东北林蛙浸灰、软化，8小时后，水洗至中性；
第二步，向第一步水洗后的东北林蛙中加入复合酶，其加入量为第一步所述干的东北林蛙重量的1％～5％，调节酶解溶液的PH值为5.5～8.5，酶解溶液的温度为55℃～65℃，酶解2～3小时后，加热至85℃，灭活20分钟；
第三步，向第二步灭活后的溶液中加入重量为第一步所述干的东北林蛙重量的3％～5％的活性炭脱色，再经过超滤膜精制、浓缩，真空冷冻干燥，进而得到小分子活性林蛙胶原蛋白低聚肽。
本发明采用复合酶酶解东北林蛙皮的方法，可大幅度降低成本，酶解率为90％以上，提取率在30％以上，同比增长5％左右；酶解后提取纯度可达90％～97％，能极大地减少对环境的污染并简化操纵工序，在高效、环保方面优势突出，适用于工业化生产；所制得的林蛙胶原蛋白低聚肽的分子量为800～1200D。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细说明。
本发明的方法是利用东北林蛙油产业的废弃物-林蛙皮为原料，软化去脂后通过两种酶制剂复配的方式酶解生产活性林蛙胶原蛋白低聚肽。
实施例1
准确称取干东北林蛙皮1kg，室温下加水至完全浸泡林蛙皮，浸灰、软化8小时，其中搅拌几次，至皮完全软化，表皮颜色完全溶出后，搅拌均匀，测定并调节pH值为6.8～7.2。
将物料转入反应釜加热至60～65℃时，加入质量为干东北林蛙重量1％的复合酶，复合酶为木瓜蛋白酶、动物蛋白水解酶按照1.5∶1进行复配，匀速搅拌，转速为50转/分钟，酶解3小时。再经85℃，20分钟灭酶，使用重量为干东北林蛙重量3％～5％的活性炭脱色，超滤膜精制，浓缩，真空冷冻干燥，得350g林蛙胶原蛋白低聚肽，提取率为35％，林蛙胶原蛋白低聚肽产品呈微黄色，复水时间短，水溶性好，低聚肽含量97％，重金属1.8ppm。其中，超滤膜精制中的膜元件孔径为10nm，工作压力为0.5MPa，工作温度为40℃；动物蛋白水解酶为碱性蛋白水解酶或胃蛋白水解酶。
实施例2
方法同实施例1，酶解时提取PH值为7.0～7.5，其它条件同实施例1，得产品320g，提取率为32％，产品颜色浅黄，复水时间较短，水溶性较好，低聚肽含量95％，重金属含量1.9ppm。
实施例3
方法同实施例1，复合酶添加量为干东北林蛙重量的1.5％，其它条件同实施例1，得产品330g，提取率为33％，产品颜色浅黄，复水时间较短，水溶性好，低聚肽含量96％，重金属含量2.1ppm。
实施例4
方法同实施例1，酶解温度为55℃，其它条件同实施例1，得产品325g，提取率为32.5％，产品颜色浅黄，复水时间较短，水溶性好，低聚肽含量91％，重金属含量2.3ppm。
实施例5
方法同实施例1，酶解时提取PH值为8.0～8.5，其它条件同实施例1，得产品310g，提取率为31％，产品颜色黄，复水时间较短，水溶性较好，低聚肽含量90％，重金属含量2.2ppm。
实施例6
方法同实施例1，酶解时间为2小时，其它条件同实施例1，得产品300g，提取率为30％，产品颜色浅黄，复水时间较短，水溶性较好，低聚肽含量90％，重金属含量2.0ppm。
实施例7
方法同实施例1，酶解时提取PH值为5.5～6.0，其它条件同实施例1，得产品315g，提取率为31.5％，产品颜色黄，复水时间较短，水溶性好，低聚肽含量91％，重金属含量2.3ppm。
Claims (1)
1.一种利用复合酶生产活性东北林蛙胶原蛋白低聚肽的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
第一步，将干的东北林蛙浸灰、软化，8小时后，水洗至中性；
第二步，向第一步水洗后的东北林蛙中加入复合酶，其加入量为第一步所述干的东北林蛙重量的1%～5%，调节酶解溶液的PH值为6.8～7.2，酶解溶液的温度为60℃～65℃，酶解2～3小时后，加热至85℃，灭活20分钟；所述复合酶为木瓜蛋白酶和动物蛋白水解酶，按照质量比木瓜蛋白酶：动物蛋白水解酶为1.5:1进行复配而成，其中，动物蛋白水解酶为碱性蛋白水解酶或胃蛋白水解酶；
第三步，向第二步灭活后的溶液中加入重量为第一步所述干的东北林蛙重量的3%～5%的活性炭脱色，再经过超滤膜精制、浓缩，真空冷冻干燥，进而得到小分子活性林蛙胶原蛋白低聚肽。
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