CN103305575A - 一种利用复合蛋白酶制备活性胶原蛋白的方法 - Google Patents

一种利用复合蛋白酶制备活性胶原蛋白的方法 Download PDF

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黄荣醒
郁帅陆
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Abstract

本发明公开了一种利用复合蛋白酶制备活性胶原蛋白的方法，包括以下步骤：向已经过预处理的鱼皮中加入复合蛋白酶进行酶解；酶解完成后，抑制复合蛋白酶；将酶解液进行离心，取上清液；将上清液超滤浓缩再进行盐析；再超滤脱盐并浓缩，即得。本发明方法安全性高，无副作用，所制备得到的活性胶原蛋白具有提取率、纯度和热变性温度等优点。

Description

一种利用复合蛋白酶制备活性胶原蛋白的方法
技术领域
本发明涉及生物医用材料的制备领域，具体涉及一种通过将胶原蛋白进行复合酶解以制备活性胶原蛋白的方法。
背景技术
国内目前对利用复合酶提取活性胶原蛋白的研究刚刚起步，国内数所高校进行了复合酶提取活性胶原蛋白的研究，在蛋白酶的选择、酶解工艺等方面取得一定的进展。目前采用酶解法提取活性胶原蛋白，应用的蛋白水解酶较为单一，主要有胰蛋白酶、胃蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶等。对于大多数活性胶原蛋白的生物活性来说，其工业化生产还有一定的难度，主要是因为酶在胶原蛋白水解过程中容易变性，分离和提纯难度大，检测手段和技术不够成熟。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种利用复合蛋白酶制备活性胶原蛋白的方法，该方法能够充分的将胶原蛋白酶解，活性胶原蛋白提取率高，所制得的活性胶原蛋白的分子量分布范围优，该方法可以进行规模化生产。
本发明采用的技术方案为：一种利用复合蛋白酶制备活性胶原蛋白的方法，包括以下步骤：
（1）向已经过预处理的鱼皮中加入复合蛋白酶进行酶解；
（2）酶解完成后，抑制复合蛋白酶；
（3）将酶解液进行离心，取上清液；
（4）将上清液超滤浓缩再进行盐析；
（5）再超滤脱盐并浓缩，即得。
为了达到更好的技术效果，步骤（1）中所述鱼皮混合液浓度为2.0-8.0wt%，调节pH至2-6。
所述的复合蛋白酶由木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、动物蛋白水解酶、酸性蛋白酶和胃蛋白酶中的任意两种或两种以上所组成。
所述的酶解按照以下条件进行：复合蛋白酶的用量为鱼皮混合液重量2.0-8.0wt%，酶解温度是4-16℃，酶解时间6-10h，酶解反应体系的pH值控制在5.0-9.0。
步骤（2）中所述的灭活复合蛋白酶的方法如下：向胶原蛋白酶解反应体系中加入抑制剂。
步骤（3）中将酶解液按照以下方法离心，得到澄清透明的上清液：离心转速为4000-5000r/min。
步骤（4）中所述的超滤浓缩按照以下条件进行：操作压力0.15-0.35MPa，温度4-10℃，pH 2-6，超滤膜孔径为10-50nm；
步骤（4）中所述的盐析按照以下条件进行：胶原蛋白溶液浓度为2.5-5.5%，NaCl浓度为10-30%，pH值为2-6，温度为4-10℃。
步骤（5）中所述的超滤按照以下条件进行：操作压力0.5-1.0Mpa，温度为4-10℃，pH2-6，超滤膜孔径为100-200nm。
本发明利用单因素试验和正交试验对复合蛋白酶的水解条件进行优化，建立了pH、酶解温度、酶解时间、酶与底物的比例、底物浓度与酶水解度的关系，得到复合蛋白酶的最佳水解条件为：胰蛋白酶和木瓜蛋白酶比例为1-3:1，复合蛋白酶的用量为鱼皮混合液质量的2.0-8.0wt%，底物浓度2.0-8.0wt%，pH5.0-9.0，在4-16℃条件下酶解6-10h，其最高胶原蛋白提取率达到91.2%。
在此基础上，本发明又系统优化和筛选了超滤浓缩、盐析、透析脱盐、超滤去除小分子等工艺条件，与前面的复合蛋白酶的水解条件相配套，建立了一套完整的复合蛋白酶提取活性胶原蛋白的方法。
有益效果：本发明方法安全性高，无副作用，所制备得到的活性胶原蛋白具有提取率、纯度和热变性温度等优点。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行详细的说明。
实施例1：一种利用复合蛋白酶制备活性胶原蛋白的方法，包括以下步骤：
（1）向已经过预处理的鱼皮中加入复合蛋白酶进行酶解；所述鱼皮混合液浓度为2.0wt%，调节pH至2，所述的复合蛋白酶由木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶所组成，所述的酶解按照以下条件进行：复合蛋白酶的用量为鱼皮混合液重量2.0wt%，酶解温度是4℃，酶解时间6h，酶解反应体系的pH值控制在5.0；
（2）酶解完成后，抑制复合蛋白酶；所述的灭活复合蛋白酶的方法如下：向胶原蛋白酶解反应体系中加入抑制剂。
（3）将酶解液进行离心，取上清液；将酶解液按照以下方法离心，得到澄清透明的上清液：离心转速为4000r/min；
（4）将上清液超滤浓缩再进行盐析；所述的超滤浓缩按照以下条件进行：操作压力0.15MPa，温度4℃，pH 2，超滤膜孔径为10nm；所述的盐析按照以下条件进行：胶原蛋白溶液浓度为2.5%，NaCl浓度为10%，pH值为2，温度为4℃；
（5）再超滤脱盐并浓缩，即得；所述的超滤按照以下条件进行：操作压力0.5Mpa，温度为4℃，pH2，超滤膜孔径为100nm。
实施例2：一种利用复合蛋白酶制备活性胶原蛋白的方法，包括以下步骤：
（1）向已经过预处理的鱼皮中加入复合蛋白酶进行酶解；所述鱼皮混合液浓度为8.0wt%，调节pH至6，所述的复合蛋白酶由胰蛋白酶、中性蛋白酶所组成，所述的酶解按照以下条件进行：复合蛋白酶的用量为鱼皮混合液重量8.0wt%，酶解温度是16℃，酶解时间10h，酶解反应体系的pH值控制在9.0；
（2）酶解完成后，抑制复合蛋白酶；所述的灭活复合蛋白酶的方法如下：向胶原蛋白酶解反应体系中加入抑制剂。
（3）将酶解液进行离心，取上清液；将酶解液按照以下方法离心，得到澄清透明的上清液：离心转速为5000r/min；
（4）将上清液超滤浓缩再进行盐析；所述的超滤浓缩按照以下条件进行：操作压力0.35MPa，温度10℃，pH 6，超滤膜孔径为50nm；所述的盐析按照以下条件进行：胶原蛋白溶液浓度为5.5%，NaCl浓度为30%，pH值为6，温度为10℃；
（5）再超滤脱盐并浓缩，即得；所述的超滤按照以下条件进行：操作压力1Mpa，温度为10℃，pH6，超滤膜孔径为200nm。
实施例3：一种利用复合蛋白酶制备活性胶原蛋白的方法，包括以下步骤：
（1）向已经过预处理的鱼皮中加入复合蛋白酶进行酶解；所述鱼皮混合液浓度为6.0wt%，调节pH至4，所述的复合蛋白酶由胰蛋白酶、中性蛋白酶所组成，所述的酶解按照以下条件进行：复合蛋白酶的用量为鱼皮混合液重量6.0wt%，酶解温度是8℃，酶解时间8h，酶解反应体系的pH值控制在8.0；
（2）酶解完成后，抑制复合蛋白酶；所述的灭活复合蛋白酶的方法如下：向胶原蛋白酶解反应体系中加入抑制剂。
（3）将酶解液进行离心，取上清液；将酶解液按照以下方法离心，得到澄清透明的上清液：离心转速为4500r/min；
（4）将上清液超滤浓缩再进行盐析；所述的超滤浓缩按照以下条件进行：操作压力0.3MPa，温度8℃，pH4，超滤膜孔径为30nm；所述的盐析按照以下条件进行：胶原蛋白溶液浓度为4%，NaCl浓度为20%，pH值为4，温度为6℃；
（5）再超滤脱盐并浓缩，即得；所述的超滤按照以下条件进行：操作压力0.8Mpa，温度为8℃，pH4，超滤膜孔径为150nm。
应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

Claims (6)

1.一种利用复合蛋白酶制备活性胶原蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）向已经过预处理的鱼皮中加入复合蛋白酶进行酶解；
（2）酶解完成后，抑制复合蛋白酶；
（3）将酶解液进行离心，取上清液；
（4）将上清液超滤浓缩再进行盐析；
（5）再超滤脱盐并浓缩，即得。
2.根据权利要求1所述的一种利用复合蛋白酶制备活性胶原蛋白的方法，其特征在于：步骤（1）中所述鱼皮混合液浓度为2.0-8.0wt%，调节pH至2-6；所述的复合蛋白酶由木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、动物蛋白水解酶、酸性蛋白酶和胃蛋白酶中的任意两种或两种以上所组成；所述的酶解按照以下条件进行：复合蛋白酶的用量为鱼皮混合液重量2.0-8.0wt%，酶解温度是4-16℃，酶解时间6-10h，酶解反应体系的pH值控制在5.0-9.0。
3.根据权利要求1所述的一种利用复合蛋白酶制备活性胶原蛋白的方法，其特征在于：步骤（2）中所述的灭活复合蛋白酶的方法如下：向胶原蛋白酶解反应体系中加入抑制剂。
4.根据权利要求1所述的一种利用复合蛋白酶制备活性胶原蛋白的方法，其特征在于：步骤（3）中将酶解液按照以下方法离心，得到澄清透明的上清液：离心转速为4000-5000r/min。
5.根据权利要求1所述的一种利用复合蛋白酶制备活性胶原蛋白的方法，其特征在于：步骤（4）中所述的超滤浓缩按照以下条件进行：操作压力0.15-0.35MPa，温度4-10℃，pH 2-6，超滤膜孔径为10-50nm；所述的盐析按照以下条件进行：胶原蛋白溶液浓度为2.5-5.5%，NaCl浓度为10-30%，pH值为2-6，温度为4-10℃。
6.根据权利要求1所述的一种利用复合蛋白酶制备活性胶原蛋白的方法，其特征在于：步骤（5）中所述的超滤按照以下条件进行：操作压力0.5-1.0Mpa，温度为4-10℃，pH2-6，超滤膜孔径为100-200nm。
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