CN104131056A

CN104131056A - 基于微波超声波技术的芝麻饼粕ace抑制肽的制备方法及用途

Info

Publication number: CN104131056A
Application number: CN201410271440.0A
Authority: CN
Inventors: 王振斌; 梁秋芳; 马海乐; 王林; 王世清
Original assignee: Jiangsu University
Current assignee: Jiangsu University
Priority date: 2014-06-18
Filing date: 2014-06-18
Publication date: 2014-11-05

Abstract

本发明公开了基于微波超声波技术的芝麻饼粕ACE抑制肽的制备方法及用途，属于农产品加工领域。芝麻饼粕经过粉碎加水溶解，然后微波（超声波）预处理，再在所得芝麻饼粕溶液中加入碱性蛋白酶酶解，对酶解体系施加超声波辅助酶解、最后灭酶，离心，超滤，浓缩喷雾干燥得到粉末状产品。该方法可以提高芝麻饼粕中蛋白的水解效率，提高酶的利用率。利用该方法制备的芝麻饼粕ACE抑制肽的ACE抑制活性高，多肽纯度高。本发明实现了芝麻饼粕的深加工和综合利用，对于提高其附加值具有重要意义。

Description

基于微波超声波技术的芝麻饼粕ACE抑制肽的制备方法及用途

技术领域

本发明属于ACE抑制肽制备技术领域，涉及基于超声波技术的芝麻饼粕的ACE抑制肽的制备方法及用途。

背景技术

人体内的血压受许多因素调节，来源于食品蛋白的ACE抑制肽可以抑制ACE 活性而达到降血压的作用，且安全性高，毒副作用小，成为了近几年的研究热点之一。芝麻是我国四大食用油料作物的佼佼者，在芝麻油制备过程中产生大量的芝麻饼粕下脚料。芝麻饼粕中含有丰富的蛋白质，多肽，氨基酸，矿物质，维生素，芝麻素等，营养价值丰富，其主要的用途是作为生产饲料的原料。应用单一。邵元龙等研究了芝麻多肽的水解工艺以及多肽的抗氧化活性。王连翠，唐张辉等利用酶法制备芝麻粕多肽研究得到了最佳水解工艺条件。然而，利用酶法制备芝麻饼粕ACE抑制肽，超滤得到分子量小于3kDa的小分子芝麻饼粕ACE抑制肽仅限于本课题组的报道。

超声波技术，微波技术对于有效成分的提取，高分子的降解，酶解反应等都有很好的促进作用。并且具有高效、廉价、无污染、操作简单、技术易推广应用等特点。近年来，超声波辅助原料酶解技术已经得到了广泛的应用。微波技术的应用较多集中在有效成分的提取、合成方面，而应用到多肽制备及其功能特性的研究则较少。Sakaklbara等观察到，在三种不同的超声强度下蔗糖酶水解速度均高于对照。王猛等利用微波技术提取葡萄籽粕中的花青素，和常规工艺比，花青素的提取率高，提取时间短。然而利用超声波或者微波对芝麻饼粕预处理，同时将超声与芝麻饼粕的酶解过程相结合的研究仅限于本研究课题组的报告。

基于该研究课题组的微波超声波技术制备芝麻饼粕ACE抑制肽，可以提高蛋白水解效率，酶的利用率，降低生产成本。从而得到一种活性较高，纯度高的ACE抑制肽。

发明内容：

本发明的目的是将微波（超声波）技术预处理原料芝麻饼粕，并且将超声波技术应用到芝麻饼粕的酶解反应中，制备具有抑制体内ACE活性的芝麻饼粕ACE抑制肽的方法及用途。

本发明上述目的是通过以下技术手段实现的：先将芝麻饼粕粉碎，加微波（超声波）处理溶解，然后用碱性蛋白酶进行ACE抑制肽的制备，同时在水解过程中施加超声波，最后离心，超滤，浓缩并且喷雾干燥得到分子量小于3kDa的粉末产品。

基于超声波技术的芝麻饼粕的ACE抑制肽的制备方法，按照下述步骤进行：

（1）对粉碎后的芝麻饼粕以与水1:5.5～1:50的质量比加入水形成混悬液，采用频率30MHz，功率为20～60W的微波处理2～8min；或者是采用工作/间歇时间为2 s/4 s，频率为20kHz，功率200～1000W,初始温度30～70℃的超声波处理5～30min。使其中蛋白溶解到水中形成水溶液；

（2）加入碱性蛋白酶进行酶解，酶的加入量为1000～5000u/g（酶活和底物质量比），酶解温度为30～70℃，pH为7～11，在酶解开始后对酶解体系采用，频率为20 kHz，功率20～80W的超声波处理，酶解时间为0～150min，酶解结束，停止超声波处理。酶解结束后，酶解液90℃水浴15min灭酶，在自然冷却到室温。

（3）离心取上清液真空抽滤(Φ9 cm)，选用截留分子量为1 kDa的平板膜，超滤分离得到分子质量在3 kDa (截留分子量为1kDa的超滤膜可以使最大分子量为3kDa的物质通过) 以下的产物，收集浓缩后喷雾干燥得到芝麻饼粕ACE抑制肽产品。

本发明采用微波预处理芝麻饼粕，超声波辅助酶解，与经过同样的酶解过程但是不施加微波、超声波、不超滤的对照试验相比，可以使ACE抑制肽的得率显著提高，ACE抑制率从30.95%提高到了68.34%，IC₅₀值从6.03 mg/mL降到了2.62mg/ml；采用超声波预处理芝麻饼粕，超声波辅助酶解，与经过同样的酶解过程但是不施加超声波、不超滤的对照试验相比，可以使ACE抑制肽的得率显著提高的同时，ACE抑制率从30.95%提高到了68.45%，IC₅₀值从6.03 mg/mL降到了2.75mg/ml。大大提高了酶解效率和产品活性。

具体实施方式

本发明测定芝麻饼粕水解肽的ACE抑制率，IC₅₀值（IC₅₀值指的是对ACE抑制率达到50%时的多肽水溶液的浓度，该值越小，则表示其对ACE的抑制活性就越高）来反映芝麻饼粕水解物对ACE的抑制活性。

实施例1

对粉碎后的芝麻饼粕以与水1:11.9的比例加入水中形成混悬液，在机械搅拌的条件下，采用工作/间歇时间定为2 s/4 s、功率为400W, 超声处理20 min，使蛋白溶解于水中，形成芝麻饼粕蛋白水溶液；以酶活1700 u/g（酶活和底物质量比）加入碱性蛋白酶（无锡杰能科生物工程有限公司，100000u/g），温度为46℃，pH值为8.88，功率为50W,其他条件和预处理的超声波一样，超声处理24min后停止酶解，酶解液90℃水浴15min灭酶。自然冷却至室温，离心取上清液真空抽滤(Φ9 cm)，选用截留分子质量为1 kDa的平板膜，超滤分离得到分子量在3 kDa下的产物，收集浓缩后喷雾干燥得到芝麻饼粕ACE抑制肽产品。测定ACE抑制率，IC₅₀值，具体测定方法如下：

用6 mLpH 8.3、0.1 mol/L硼酸缓冲液溶解3 mg酶解产物， 25 μL ACE(1 u ACE溶于10 mL的pH 8.3、0.1 mol/L的硼酸缓冲液中，该缓冲液含0.3 mol/L NaCl)加入到含10 μL样品的离心管中，37℃保温5 min，随后加入6.5 mmol/L的马尿酰-组氨酰-亮氨酸(N-Hippuryl-L-histidyl-L-leucine,HHL) 40 μL，在37℃恒温反应30 min，加入85 μL浓度为1 mol/L的HCl终止反应，同时用10 μL的pH 8.3硼酸缓冲液作空白对照反应，所得反应液直接用于HPLC分析。

HPLC条件：ZORBAX-C₁₈柱(4.6×150 mm，填料粒径5 μm)；检测波长228 nm；进样量8 μL；柱温25℃；流动相为超纯水-乙腈(80:20，各含0.5‰三氟乙酸)；流速1.0 mL/min。计算公式如下：

R=(A-B)/A*100%

式中：R—ACE抑制率,%；

A—空白对照组Hip的峰面积；

B—添加ACE抑制肽组Hip的峰面积。

称取一定质量样品配成不同浓度的溶液，以浓度为横坐标，抑制率为纵坐标绘成圆滑的曲线，从曲线中计算IC₅₀值。

对照试验：对粉碎后的芝麻饼粕以与水1:11.9的比例加入水中形成混悬液，在机械搅拌的条件下，不施加超声，再按照上述相同酶解过程处理，但是不施加超声，酶解结束后的灭酶，离心，取上清液喷雾干燥以及测定方法均按照上述方法处理。

经过测定，对照组的酶解产物多肽的ACE抑制率为30.95%，IC₅₀值为6.03mg/ml,实验组的酶解产物多肽的ACE抑制率为72.5%，IC₅₀值为3.82mg/ml。可见，在同等过程条件下，伴随着多肽的纯度的提高，采用超声波的酶解产物多肽的ACE抑制率显著提高了，IC₅₀值明显降低了。

实例2

对粉碎后的芝麻饼粕以与水1:11.9的比例加入水中形成混悬液，在机械搅拌的条件下，功率为40W, 微波处理5.5 min，使蛋白溶解于水中，形成芝麻饼粕蛋白水溶液；以酶活1700 u/g（酶活和底物质量比）加入碱性蛋白酶（无锡杰能科生物工程有限公司，100000u/g），温度为46℃，pH值为8.88，采用工作/间歇时间定为2 s/4 s、功率为40W, 超声处理24min其他条件和预处理的超声波一样，超声处理24min后停止酶解，酶解液90℃水浴15min灭酶。自然冷却至室温，离心取上清液真空抽滤(Φ9 cm)，选用截留分子质量为1 kDa的平板膜，超滤分离得到分子量在3 kDa下的产物，收集浓缩后喷雾干燥得到芝麻饼粕ACE抑制肽产品。测定水解产物多肽得率和ACE抑制率，IC₅₀值，具体测定方法参照实例1。

对照试验：对粉碎后的芝麻饼粕以与水1:11.9的比例加入水中形成混悬液，在机械搅拌的条件下，不施加微波，再按照上述相同酶解过程处理，但是不施加超声，酶解结束后的灭酶，离心，超滤以及测定方法均按照上述方法处理。

经过测定，对照组的酶解产物多肽的ACE抑制率为28.25%，IC₅₀值为5.73mg/ml,实验组的酶解产物多肽的ACE抑制率为66.0%，IC₅₀值为3.85mg/ml。可见，在同等过程条件下，伴随着多肽的纯度的提高，采用超声波的酶解产物多肽的ACE抑制率显著提高了，IC₅₀值明显降低了。

实例3

对粉碎后的芝麻饼粕以与水1:11.9的比例加入水中形成混悬液，在机械搅拌的条件下，采用工作/间歇时间定为2 s/4 s、功率为800W, 超声处理20 min，使蛋白溶解于水中，形成芝麻饼粕蛋白水溶液；以酶活2500 u/g（酶活和底物质量比）加入碱性蛋白酶（无锡杰能科生物工程有限公司，100000u/g），温度为46℃，pH值为8.88，功率为40W,其他条件和预处理的超声波一样，超声处理30min后停止酶解，酶解液90℃水浴15min灭酶。自然冷却至室温，离心取上清液真空抽滤(Φ9 cm)，选用截留分子质量为1 kDa的平板膜，超滤分离得到分子量在3 kDa下的产物，收集浓缩后喷雾干燥得到芝麻饼粕ACE抑制肽产品。测定水解产物多肽得率和ACE抑制率，IC₅₀值。具体测定方法参照实例1。

空白试验参照实例1。

经过测定，对照组的酶解产物多肽的ACE抑制率为31.25%，IC₅₀值为5.93mg/ml,实验组的酶解产物多肽的ACE抑制率为66.70%，IC₅₀值为3.80mg/ml。可见，在同等过程条件下，伴随着多肽的纯度的提高，采用超声波的酶解产物多肽的ACE抑制率显著提高了，IC₅₀值明显降低了。

实例4

对粉碎后的芝麻饼粕以与水1:11.9的比例加入水中形成混悬液，在机械搅拌的条件下，功率为40W, 微波处理5min，使蛋白溶解于水中，形成芝麻饼粕蛋白水溶液；以酶活1700 u/g（酶活和底物质量比）加入碱性蛋白酶（无锡杰能科生物工程有限公司，100000u/g），温度为46℃，pH值为8.88，采用工作/间歇时间定为2 s/4 s、功率为50W, 超声处理30min其他条件和预处理的超声波一样，超声处理24min后停止酶解，酶解液90℃水浴15min灭酶。自然冷却至室温，离心取上清液真空抽滤(Φ9 cm)，选用截留分子质量为1 kDa的平板膜，超滤分离得到分子量在3 kDa下的产物，收集浓缩后喷雾干燥得到芝麻饼粕ACE抑制肽产品。测定水解产物多肽得率和ACE抑制率，IC₅₀值，具体测定方法参照实例1。

空白试验参照实例2。

经过测定，对照组的酶解产物多肽的ACE抑制率为32.02%，IC₅₀值为6.73mg/ml,实验组的酶解产物多肽的ACE抑制率为67.20%，IC₅₀值为2.67mg/ml。可见，在同等过程条件下，伴随着多肽的纯度的提高，采用超声波的酶解产物多肽的ACE抑制率显著提高了，IC₅₀值明显降低了。

Claims

1.基于超声波技术的芝麻饼粕的ACE抑制肽的制备方法，其特征在于按照下述步骤进行：

（1）对粉碎后的芝麻饼粕以与水1:5.5～1:50的质量比加入水形成混悬液，采用频率30MHz，功率为20～60W的微波处理2～8min；使其中蛋白溶解到水中形成水溶液；

（2）加入碱性蛋白酶进行酶解，在酶解开始后对酶解体系采用，频率为20 kHz，功率20～80W的超声波处理，酶解时间为0～150min，酶解结束，停止超声波处理；

酶解结束后，酶解液90℃水浴15min灭酶，在自然冷却到室温；

（3）离心取上清液真空抽滤(Φ9 cm)，选用截留分子量为1 kDa的平板膜，超滤分离得到分子质量在3 kDa以下的产物，收集浓缩后喷雾干燥得到芝麻饼粕ACE抑制肽产品。

2.根据权利要求1所述的基于超声波技术的芝麻饼粕的ACE抑制肽的制备方法，其特征在于步骤（1）中或者是采用工作/间歇时间为2 s/4 s，频率为20kHz，功率200～1000W,初始温度30～70℃的超声波处理5～30min。

3.根据权利要求1所述的基于超声波技术的芝麻饼粕的ACE抑制肽的制备方法，其特征在于步骤（2）中酶的加入量为1000～5000u/g，酶解温度为30～70℃，pH为7～11。