CN103194513B - 一种高效提取脾氨肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种高效提取脾氨肽的方法，具体步骤包括：将新鲜健康动物脾脏剪去脂肪、绞碎、称重后进行匀浆；在得到的匀浆液中添加低温蛋白酶，用量为每克动物脾脏匀浆液中添加0.6-1.3U，然后装入截留分子量为7000道尔顿的透析袋中，放到2-5℃无菌注射用水中透析，透析液用量为匀浆液重量的1倍，酶促透析时间为24～50小时；将得到的透析液冷冻干燥后得到脾氨肽干粉。本发明的方法能提高脾氨肽产量50%-150%，从而提高了动物脾脏的利用效率。
Description
技术领域
本发明属于生化制药领域，涉及一种生物活性成分的提取方法，具体涉及一种脾氨肽的提取方法。
背景技术
脾脏是人体及其它哺乳动物体内最大的免疫器官，占全身淋巴组织总量的25%，含有大量的淋巴细胞和巨嗜细胞，在体液免疫、细胞免疫、抗原提呈等免疫应答过程中发挥重要作用。脾脏在免疫应答过程有大量蛋白质（如抗体）和调控因子（如促吞噬素Tuftsin、肿瘤坏死因子TNF、白介素等）参与，所以脾脏富含具有免疫调节作用的生物活性多肽。
国内外早有报道，从动物脾脏中提取的多肽组分“脾氨肽”具有调节免疫等生理功能，但是其中具体的活性组分还不是很清楚，很可能是多组分共同作用的结果。已经报道的脾氨肽的提取方法大同小异，大体来讲都是先将健康动物（如猪、牛）的脾脏剪切、洗涤后制成匀浆液，再将匀浆液通过透析或超滤等方法（匀浆液不可用离心法或冻融法分离，因为该方法分离得到的产物不符合低分子量多肽的要求）处理获得低分子量组分（通常平均分子量3500道尔顿），该低分子量组分进一步处理后冷冻干燥即获得脾氨肽成品。这些脾氨肽提取方法一个主要的不足就是脾氨肽的得率比较低，因为这些方法都浪费掉了高分子量的蛋白质组分。这些高分子量蛋白组分虽然通过自行降解成多肽小分子透析出来，但量少。
因此，有必要在现有技术背景下，提出一种新的脾氨肽提取方法，能够高效、低成本地提取脾氨肽。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效提取脾氨肽的新方法，能够增加脾氨肽的产率，提高脾脏的利用效率。
本发明的上述目的是通过以下技术方案实现的：
提供一种高效提取脾氨肽的新方法，具体步骤包括：
A）将新鲜健康动物脾脏剪去脂肪、绞碎、称重后进行匀浆；
B）在步骤A）得到的匀浆液中添加低温蛋白酶，用量为每克动物脾脏匀浆液中添加0.6-1.3U，然后装入截留分子量为7000道尔顿的透析袋中，放到2-5℃无菌注射用水中透析，透析液用量为匀浆液重量的1倍，酶促透析时间为24～50小时；
C）将步骤B）得到的透析液冷冻干燥后得到脾氨肽干粉。
步骤A）所述的动物优选大规模人工饲养的肉用动物，进一步优选猪、牛或羊。
步骤A）所述的匀浆，优选使用胶体磨完成。
步骤B）所述的低温蛋白酶用量优选为每克动物脾脏匀浆液中添加0.9-1.3U；更优选为每克动物脾脏匀浆液中添加1.0-1.3U；最优选每克动物脾脏匀浆液中添加1.3U。
步骤B）所述的低温蛋白酶可以选自现有的各种低温蛋白酶或多种低温蛋白酶的混合物；优选食用植物来源的蛋白酶中的一种或两种以上的混合物；进一步优选木瓜蛋白酶或菠萝蛋白酶中的一种或两种的混合物。
步骤B）所述的无菌注射用水温度优选3～4℃。
步骤B）所述的酶促透析时间优选为48小时。
本发明所述的高效提取脾氨肽的新方法，最优选包括以下步骤：
A）将新鲜健康猪脾脏剪去脂肪、绞碎，称重后加入0.85倍重量无菌注射用水进行胶体磨匀浆；
B）在步骤A）得到的匀浆液中添加低温蛋白酶，用量为每克猪脾脏匀浆液中添加0.9-1.3U，然后装入截留分子量为7000道尔顿的透析袋中，放到2-5℃无菌注射用水中透析，透析液用量为匀浆液重量的1倍，酶促透析时间为48小时；
C）将上述透析液冷冻干燥后得猪脾脾氨肽干粉。
本发明的提取方法，通过在动物脾脏匀浆液中添加适量低温蛋白酶，将脾脏匀浆液中高分子量蛋白质酶解主动转化为低分子量的多肽组分。再通过透析处理，将加入的蛋白酶连同其它高分子量组分除去，从而保证了提取得到的脾氨肽的质量。
本发明方法中，由于脾氨肽的生产需要在低温下进行，因此我们选用低温蛋白酶进行酶促水解。
在此基础上，为了确定合理的低温蛋白酶用量，我们尝试了不同酶用量对脾氨肽产率的影响。我们向相同体积的脾脏匀浆液中分别加入不同量的低温蛋白酶，然后将这些匀浆液分别装入截留分子量7000道尔顿的透析袋中并将透析袋放入装有透析液（本工作中透析液为无菌注射用水）的容器中。由于透析袋孔径的限制，只有分子量小于7000道尔顿的多肽才能通过透析袋孔进入透析液中，而分子量大于7000道尔顿的蛋白质则被截留在透析袋中，从而达到将低分子量多肽与高分子量蛋白质分离的目的，使提取得到的脾氨肽100%为7KD以下。如果在匀浆液中加入蛋白酶，由于蛋白酶的分子量都大于7000道尔顿，蛋白酶会被截留在透析袋内。蛋白酶在透析袋内能将截留的高分子量蛋白质逐渐水解为低分子量的多肽，这些酶解产生的多肽也会通过透析袋孔进入透析液中，从而与蛋白酶分开，可以防止进一步酶解。
表1：菠萝蛋白酶的浓度对脾氨肽产率的影响（两个批次的实验结果）
批次1：
| 匀浆液中酶用量(U/g) | 0 | 0.13 | 0.31 | 0.5 | 0.60 | 0.94 | 1.30 | 1.57 | 1.89 |
| 透析液中脾氨肽浓度（mg/ml） | 0.74 | 0.80 | 0.81 | 1.02 | 1.12 | 1.42 | 1.90 | 2.21 | 2.43 |
批次2：
| 匀浆液中酶用量(U/g) | 0 | 0.60 | 0.76 | 0.82 | 0.88 | 0.94 | 1.00 | 1.13 | 1.30 |
| 透析液中脾氨肽浓度（mg/ml） | 0.92 | 1.36 | 1.25 | 1.46 | 1.65 | 1.72 | 1.69 | 2.00 | 2.06 |
如表1所示，在两个批次的实验中，随着低温蛋白酶用量增加，所得脾氨肽的量逐渐增加，当匀浆液中每克脾脏的蛋白酶用量为0.6-1.3U时，能提高脾氨肽产量50%-150%，特别是当匀浆液中每克脾脏的蛋白酶用量为1-1.3U时，脾氨肽的得率提高了1倍以上，产率提高极为显著。而在匀浆液中每克脾脏的蛋白酶用量为0.6U以下时，脾氨肽的产率明显偏低，不能满足工业生产的要求；在匀浆液中每克脾脏的蛋白酶用量为1.3U以上时，酶的用量过多，会出现脾氨肽的过度水解，作用效果显著下降，同时造成成本的浪费。综合考虑，我们选择匀浆液中每克脾脏的蛋白酶用量为1.3U为最适条件。
对于透析温度和时间的选择，本发明通过实验发现低温2-5℃及透析时间24-50小时可保证脾氨肽的质量及收率达到最佳匹配状态。
总之，本发明通过对脾氨肽提取过程中的酶的种类、用量、水解和透析的温度等多个关键技术的改进与选择，形成一种全新的脾氨肽提取方法，与现有技术中的提取方法相比，本发明提取方法的脾氨肽产率提高了50%-150%。
附图说明
图1是常规法生产脾氨肽和本发明实施例1的酶促法生产脾氨肽的紫外吸收光谱比较，其中，左图是常规法生产脾氨肽的紫外吸收光谱，右图是本发明实施例1方法生产的脾氨肽的紫外吸收光谱。
具体实施方式
实施例1
低温蛋白酶酶促提取猪脾脾氨肽的方法，包括如下步骤：
A）将新鲜健康猪脾脏剪去脂肪、绞碎，称重后加入0.85倍重量无菌注射用水进行胶体磨匀浆；
B）在步骤A）得到的匀浆液中添加低温蛋白酶，用量为每克猪脾脏匀浆液中添加1.0-1.3U，然后装入截留分子量为7000道尔顿的透析袋中，放到3℃无菌注射用水中透析，透析液用量为匀浆液重量的1倍，酶促透析时间为48小时；
C）将上述透析液冷冻干燥后得猪脾脾氨肽干粉。
为了鉴定本实施例生产的脾氨肽是否合格，我们测定了所得产品的紫外吸收光谱。如图1所示，与常规法生产脾氨肽的紫外吸收光谱（左图）比较，酶促法生产脾氨肽的紫外吸收光谱（右图）与之几乎相同，表明酶促法生产的脾氨肽产品是合格的。两种方法生产的脾氨肽都在255nm有一个由芳香族氨基酸残基造成的吸收峰，提示它们主要由多肽组成。
实施例2
低温蛋白酶酶促提取牛脾脾氨肽的方法，包括如下步骤：
A）将新鲜健康牛脾脏剪去脂肪、绞碎，称重后加入0.85倍重量无菌注射用水进行胶体磨匀浆；
B）在步骤A）得到的匀浆液中添加低温蛋白酶，用量为每克牛脾脏匀浆液中添加0.6-1.0U，然后装入截留分子量为7000道尔顿的透析袋中，放到5℃无菌注射用水中透析，透析液用量为匀浆液重量的1倍，酶促透析时间为45小时；
C）将上述透析液冷冻干燥后得牛脾脾氨肽干粉。
Claims (8)
1.一种高效提取脾氨肽的方法，具体步骤包括：
A)将新鲜健康动物脾脏剪去脂肪、绞碎、称重后进行匀浆；
B)在步骤A)得到的匀浆液中添加低温蛋白酶，用量为每克动物脾脏匀浆液中添加0.6-1.3U，然后装入截留分子量为7000道尔顿的透析袋中，放到2-5℃无菌注射用水中透析，透析液用量为匀浆液重量的1倍，酶促透析时间为24～50小时；所述的低温蛋白酶为菠萝蛋白酶；
C)将步骤B)得到的透析液冷冻干燥后得到脾氨肽干粉。
2.权利要求1所述的高效提取脾氨肽的方法，其特征在于：步骤A)所述的动物为猪、牛或羊。
3.权利要求1所述的高效提取脾氨肽的方法，其特征在于：步骤A)所述的匀浆使用胶体磨完成。
4.权利要求1所述的高效提取脾氨肽的方法，其特征在于：步骤B)所述的低温蛋白酶用量为每克动物脾脏匀浆液中添加0.9-1.3U。
5.权利要求1所述的高效提取脾氨肽的方法，其特征在于：步骤B)所述的低温蛋白酶用量为每克动物脾脏匀浆液中添加1.3U。
6.权利要求1所述的高效提取脾氨肽的方法，其特征在于：步骤B)所述的无菌注射用水温度为3～4℃。
7.权利要求1所述的高效提取脾氨肽的方法，其特征在于：步骤B)所述的酶促透析时间为48小时。
8.权利要求1所述的高效提取脾氨肽的方法，包括以下步骤：
A)将新鲜健康猪脾脏剪去脂肪、绞碎，称重后加入0.85倍重量无菌注射用水进行胶体磨匀浆；
B)在步骤A)得到的匀浆液中添加低温蛋白酶，用量为每克猪脾脏匀浆液中添加0.9-1.3U，然后装入截留分子量为7000道尔顿的透析袋中，放到2-5℃无菌注射用水中透析，透析液用量为匀浆液重量的1倍，酶促透析时间为48小时；
C)将上述透析液冷冻干燥后得猪脾脾氨肽干粉。
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