PT1753778E - Processo para a purificação de eritropoietina - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "PROCESSO PARA A PURIFICAÇÃO DE ERITROPOIETINA" A presente invenção refere-se a um processo para a preparação de eritropoietina recombinante, a qual apresenta um grau de pureza particularmente elevado 98%). 0 processo compreende, pelo menos, 5 passos de purificação cromatográfica, nomeadamente, pelo menos, duas cromatografias de troca aniónica, pelo menos, uma cromatografia de interacção hidrofóbica, pelo menos, uma cromatografia de afinidade e, pelo menos, uma cromatografia em hidroxiapatita. Em formas de realização preferidas, o processo prescinde de qualquer cromatografia de exclusão e de qualquer cromatografia de fase reversa. A invenção refere-se, em particular, a um processo que compreende os seguintes passos de purificação cromatográfica na sequência indicada: i) uma primeira cromatografia de troca aniónica, ii) uma cromatograf ia de afinidade, que é, de um modo preferido, uma cromatografia de afinidade com corantes, iii) uma cromatografia de interacção hidrofóbica, iv) uma cromatografia em hidroxiapatita e v) uma segunda cromatografia de troca aniónica. A eritropoietina, abreviada por EPO, é uma glicoproteina que estimula a formação de eritrócitos na medula óssea. A EPO é formada principalmente nos rins e alcança dai o seu destino através da circulação sanguínea. No caso de insuficiência renal, os rins danificados não produzem EPO suficiente, ou não a produzem de todo o que tem como consequência que emerjam poucos 1 eritrócitos a partir das células estaminais da medula óssea. Esta anemia renal pode ser tratada através da administração de EPO em quantidades fisiológicas que estimulam a formação de eritrócitos na medula óssea. A EPO utilizada para a administração pode ser obtida a partir de urina humana ou ser produzida por métodos de tecnologia genética. Dado que a EPO está contida no corpo humano apenas em quantidades vestigiais reduzidas, o isolamento de EPO a partir da fonte natural para aplicações terapêuticas é praticamente impossível. Por conseguinte, são os métodos de tecnologia genética que oferecem a única possibilidade económica de produzir esta substância em quantidades maiores. A preparação recombinante de eritropoietina é possível desde a identificação do gene humano de eritropoietina no ano de 1984. Desde o início dos anos 90 foram desenvolvidos diversos produtos farmacêuticos que contêm eritropoietina humana que foi produzida por via da tecnologia genética em células eucarióticas, sobretudo em células de CHO (ovário de hamster chinês). A preparação de eritropoietina recombinante humana está descrita, por exemplo, nos documentos EP-A-0148605 e EP-A-205564. A preparação recombinante de eritropoietina realiza-se habitualmente em células hospedeiras de CHO. Enquanto estas eram, no passado, cultivadas em meio de cultura ao qual havia sido adicionado soro fetal bovino e, por vezes, também insulina bovina, actualmente, o cultivo tem lugar regularmente em meio livre de soro e de proteínas. Deste modo é possível reduzir, logo através do cultivo, o risco de contaminações com proteínas bovinas, vírus bovinos, ADN bovino ou outras substâncias indesejadas, que têm origem nos aditivos empregues no passado. 2

Meios livres de soro e de proteínas adequados para o cultivo de células eucarióticas são oferecidos por diferentes fornecedores, p. ex., o meio MAM-PF2, comercializado, entre outros, pela Bioconcept, Allschwil, Suíça, ou os meios DMEM e DMEM/F1.2, disponibilizados p. ex., pela Invitrogen/Gibco, Eggenstein, Alemanha.

Diversos processos de purificação cromatográfica para eritropoietina já foram também descritos no estado da técnica. 0 documento EP-A-0228452 descreve um processo para a purificação de eritropoietina biologicamente activa a partir de um líquido compreendendo os passos cromatográficos de cromatografia de troca aniónica e cromatografia de fase reversa.

No documento EP-A-0267678 descreve-se a purificação de uma eritropoietina preparada numa cultura livre de soro, realizando-se consecutivamente uma diálise, uma cromatografia de troca iónica, uma HPLC preparativa de fase reversa e uma cromatografia de filtração em gel. 0 passo de cromatografia de filtração em gel pode ser substituído, neste caso, por uma cromatografia de troca iónica. Propõe-se igualmente realizar uma cromatografia de afinidade com corantes numa coluna de Blue Trisacryl antes da (primeira) cromatografia de troca iónica.

No documento EP-A-0830376 descreve-se um processo para a purificação de eritropoietina no qual a EPO de um sobrenadante de cultura é submetido, no primeiro passo da purificação cromatográfica, a uma cromatografia de afinidade com corantes. No segundo passo segue-se uma cromatografia num suporte hidrofobizado, seguida de uma cromatografia em hidroxiapatita. Esta é depois sucedida de uma HPLC de fase reversa, seguida de 3 uma cromatografia de troca aniónica como último passo de crornatografia. 0 documento EP-A-1127063 descreve um processo de purificação para eritropoietina gue compreende os seguintes passos: precipitação diferenciada, cromatografia de interacção hidrofóbica, diafiltração, cromatografia de troca aniónica, cromatografia de troca catiónica e cromatografia de exclusão por tamanho. Os passos de purificação individuais realizam-se, no documento EP-A-1127063, na seguência mencionada. Numa variante do processo, a purificação compreende os seguintes passos: precipitação diferencial, cromatografia de interacção hidrofóbica, diafiltração, cromatografia de troca aniónica, cromatografia de troca catiónica, uma diafiltração adicional e cromatografia de exclusão por tamanho. Em qualquer caso, o processo prevê, no primeiro passo, uma precipitação, seguida de uma centrifugação. Prevê-se igualmente obrigatoriamente uma filtração em gel para finalizar a purificação cromatográfica. 0 pedido internacional WO-A-03/045996 descreve um processo de purificação para EPO compreendendo uma cromatografia de troca aniónica, seguida de uma cromatografia de fase reversa e uma cromatografia de troca aniónica adicional. À segunda cromatografia de troca aniónica sucede-se uma cromatografia de exclusão por tamanho, empregando-se um meio de filtração em gel. A purificação de eritropoietina é também objecto do documento EP-A-0428267. Neste caso realiza-se uma cromatografia numa coluna de Q Sepharose, parcialmente seguida de cromatografia de fase reversa e filtração em gel. 4 É objectivo da presente invenção apresentar um processo de purificação para eritropoietina que prescinde de passos de cromatografia de custos elevados, bem como, se possível, de passos complicados que podem exigir, além disso, o emprego de reagentes indesejados. A eritropoietina obtida com o processo de purificação de acordo com a invenção deverá corresponder aos critérios de pureza definidos pelas autoridades de licenciamento ou pela Farmacopeia Europeia. 0 teor de proteínas que têm origem na célula hospedeira (proteínas da célula hospedeira) deverá situar-se, em particular, abaixo de 100 ppm. O teor em ADN da célula hospedeira também deverá situar-se abaixo de 100 pg/mg de eritropoietina. Por fim, a eritropoietina obtida pela purificação deverá corresponder, relativamente à sua composição em isoformas, ao padrão definido na Farmacopeia Europeia (Ph. Eur.; 01/2002 :1316) . O processo também não deverá ter necessidade, tanto quanto possível, de uma cromatograf ia de fase reversa, tal como, p. ex., uma HPLC de FR. Neste tipo de cromatograf ia emprega-se habitualmente reagentes, tal como o acetonitrilo, que são subsequentemente difíceis de remover da proteína e podem ser nocivos para humanos. Uma outra desvantagem da HPLC-FR é o facto de serem frequentemente empregues solventes orgânicos de custos elevados que aumentam os custos de purificação, além disso, os solventes orgânicos são questionáveis em relação a danos ambientais e são também difíceis e perigosos de manusear. Ao todo, os meios utilizados na cromatografia de fase reversa são frequentemente indesejados. É evidente que o produto de eritropoietina obtido da purificação é orientado por elevados padrões relativamente à pureza e padrão de glicosilação. Estes elevados requisitos só 5 podem ser preenchidos através de um processo de purificação especialmente orientado para a eritropoietina que é o resultado de extensos estudos e análises.

Estes e outros objectivos são solucionados através do processo de purificação indicado na reivindicação 1. Nas reivindicações dependentes são descritas formas de realização preferidas. A invenção refere-se assim a um processo para a purificação de eritropoietina a partir de uma solução, em particular um sobrenadante de cultura, em que se realizam os seguintes passos a) até c) na sequência indicada: no passo a) uma primeira cromatografia de troca aniónica, no passo b) uma cromatografia de afinidade, uma cromatografia de interacção hidrofóbica e uma cromatografia em hidroxiapatita, na sequência indicada, e no passo c) uma segunda cromatografia de troca aniónica. 0 processo de purificação, de acordo com a invenção, utiliza deste modo, pelo menos, quatro métodos de separação cromatográfica diversos, nomeadamente (i) o da troca iónica com base na interacção competitiva de iões carregados, (ii) o da interacção hidrofóbica que se distingue por as regiões superficiais apoiares de uma proteína, no caso de elevadas concentrações salinas, sofrerem adsorção nos ligandos fracamente hidrofóbicos de uma fase estacionária, (iii) o da afinidade que assenta na adsorção específica e reversível de uma molécula a um parceiro de ligação individual, ligado à matriz, e (iv) o da cromatografia em hidroxiapatita que se baseia no emprego de cristais inorgânicos de hidroxiapatita. 6

Estes princípios de cromatografia mencionados são também correspondentemente diferenciados nos foros da especialidade (ver p. ex. Bioanalytik, F. Lottspeich, H. Zorbas (editores), Heidelberg, Berlin, Spektrum Akad. Verlag 1998). Seja contudo salientado que a cromatografia de afinidade obrigatoriamente prevista no passo b) não é uma cromatografia em hidroxiapatita. 0 passo b) compreende, pelo contrário, tanto uma cromatografia de afinidade como também uma cromatografia em hidroxiapatita.

Numa forma de realização preferida, o processo de purificação de EPO compreende uma primeira cromatografia de troca aniónica, uma cromatografia de afinidade, uma cromatografia de interacção hidrofóbica, uma cromatografia em hidroxiapatita e uma segunda cromatografia de troca aniónica, na sequência mencionada. A cromatografia de afinidade é, de um modo preferido, uma cromatografia de afinidade com corantes. A segunda cromatografia de troca aniónica ocorre, numa forma de realização preferida, realizando-se um passo de lavagem ácida, com o qual as isoformas básicas da eritropoietina são eluídas por uma diminuição nítida do pH e, deste modo, separadas do produto final. 0 "passo de lavagem ácida" significa, neste caso, que o valor de pH do tampão de lavagem se situa nitidamente na gama ácida, de um modo preferido, entre 2,0 e 5,5, de um modo particularmente preferido, entre 3,0 e 4,5 e, de um modo mais preferido, a aproximadamente 4,0. O tampão adequado é sobretudo um tampão de acetato de sódio. Este passo de cromatografia é, por conseguinte, particularmente importante em relação ao padrão de glicosilação do produto final de EPO. 7 0 cultivo das células hospedeiras produtoras de eritropoietina ocorre num meio de cultura que está livre de proteínas e livre de componentes animais.

Em formas de realização preferidas, em nenhum estádio da purificação da EPO tem lugar qualquer cromatografia de fase reversa. Também se evita, tanto quanto possível, uma filtração em gel.

Descobriu-se que a eritropoietina obtida com o processo de acordo com a invenção apresenta um teor em proteínas da célula hospedeira de < 100 ppm e um teor em ADN da célula hospedeira < 100 pg/mg. O empobrecimento insuficiente em proteínas da célula hospedeira é, em particular, um problema frequente em processos de purificação do estado da técnica. O processo de acordo com a invenção oferece aqui vantagens particulares, dado que se alcança um empobrecimento fiável abaixo das 100 ppm. A eritropoietina obtida com o processo de acordo com a invenção tem uma pureza de, pelo menos, 95%, de um modo preferido, pelo menos, 98% e, de um modo particularmente preferido, pelo menos, 99%, em que a pureza é determinada por meio de HPLC-FR analítica. A HPLC-FR realizada para o efeito serve contudo apenas para fins analíticos, no âmbito da purificação, não se realiza, tanto quanto possível, qualquer HPLC de FR. A actividade da proteína deve perfazer, pelo menos, 100000 I.U./mg, de um modo preferido, pelo menos, 110000 I.U./mg e, de um modo particularmente preferido, pelo menos, 120000 I.U./mg (ver também Farmacopeia Europeia 01/2002:1316). A invenção descreve também preparações farmacêuticas que contêm a eritropoietina purificada de acordo com a invenção. A EPO é habitualmente formulada na forma liquida e é injectada, como tal, por via intravenosa ou subcutânea. São substâncias auxiliares adequadas nas formulações liquidas de EPO, p. ex., tampões tal como, p. ex., tampão fosfato, sais, tal como, por exemplo, cloreto de sódio, estabilizadores para a EPO, tal como, p. ex., aminoácidos, açúcares e álcoois de açúcares, bem como agentes tensioactivos, tal como, p. ex., Polissorbato 20/80. Nos documentos EP-A-0306824, EP-A-0607156 e EP-A-0909564 estão descritos exemplos para formulações, ver também os produtos comerciais NeoRecormon®, Erypo® na ROTE LISTE 2004. A eritropoietina purificada de acordo com a invenção é, de um modo preferido, eritropoietina recombinante humana, preparada em células eucarióticas. A eritropoietina recombinante é preparada, de um modo preferido, em células de mamíferos, de um modo particularmente preferido, em células de CHO, tal como descrito, p. ex., nos documentos EP-A-0205564 e EP-A-0148605. A fermentação ocorre segundo protocolos convencionais em meios de cultura obteníveis comercialmente.

Por "eritropoietina" entende-se, no contexto da presente invenção, qualquer proteína que tem a capacidade de estimular a formação de eritrócitos na medula óssea e pode ser identificada inequivocamente, de acordo com o ensaio descrito na Farmacopeia Europeia (Ph. Eur.; 01/2002:1316) como eritropoietina (determinação da actividade em murganhos policitémicos ou normocitémicos). A eritropoietina pode ser a eritropoietina humana do tipo selvagem ou uma variante desta, com uma ou várias substituições, deleções ou adições de aminoácidos. A formulação contendo eritropoietina, de acordo com a invenção, pode ser 9 igualmente um conjugado no qual a proteína está presente, p. ex., na forma conjugada com polímeros, tal como, p. ex., polialquilenoglicóis, a denominada eritropoietina PEGilada.

Por "purificação de eritropoietina" ou "enriquecimento de eritropoietina" entende-se, no caso presente, que a proteína eritropoietina é obtida de uma mistura em forma muito pura, a eritropoietina contida na mistura é portanto enriquecida até não estarem substancialmente contidas quaisquer proteínas adicionais a par da eritropoietina.

Os princípios cromatográficos utilizados no processo de acordo com a invenção são correntes ao especialista, em todo o caso descritos pormenorizadamente em manuais correntes ou protocolos dos fornecedores de matrizes de cromatografia. Matrizes adequadas e informações de antecedentes, bem como instruções para a realização das diversas cromatografias encontram-se, p. ex., no catálogo de produtos e nas informações dos produtos da Amersham Biosciences (ver também www.amershambiosciences.com) ou também no catálogo de produtos da Bio-Rad (ver também www.bio-rad.com).

As cromatografias de troca aniónica podem ser realizadas com resinas de troca aniónica ou membranas convencionais, obteníveis comercialmente. As resinas de troca aniónica típicas que podem ser empregues compreendem grupos funcionais, tal como dietilaminoetilo (DEAE), menciona-se aqui a DEAE-Sepharose (Amersham Biosciences), Macroprep DEAE (Bio-Rad), Fractorgel EMD DEAE (Merck); aminoetilo quaternário (QAE), menciona-se aqui, Toyopearl QAE (Toyo Biosep); amónio quaternário, menciona-se aqui Q-Sepharose XL (Amersham Biosciences), Q-Sepharose FF (Amersham Biosciences), Resource Q (Amersham Biosciences), 10

Source 30 Q (Amersham Biosciences), Macro Prep High Q (BioRad), Toyopearl Super Q (Toyo Biosep); dimetilaminoetilo (DMAE), menciona-se aqui Fractogel EMD DMAE (Merck); trimetilaminoetilo (TMAE), menciona-se aqui Fractogel EMD TMAE (Merck); Sartobind agente de adsorção a membrana (MA) Q100 (Sartorius). São permutadores aniónicos preferidos as resinas com ligandos de amónio quarternário ou terciário. Assim, p. ex., numa forma de realização preferida do processo de acordo com a invenção, emprega-se na primeira e segunda cromatografia de troca aniónica, respectivamente, Q Sepharose XL ou Source 30 Q (ambas obteníveis na Amersham Biosciences) . Utiliza-se, de um modo particularmente preferido, Q Sepharose XL na primeira cromatografia de troca aniónica e Source 30 Q na segunda cromatografia de troca aniónica. A cromatografia de afinidade pode ser igualmente realizada com resinas convencionais, comercialmente obteníveis. Indicam-se aqui, a título de exemplo, Sepharose com corantes, Sepharose com heparina, HiTrap Blue HPcolunas (Cibacron Blue F3G-A), Blue Sepharose (Cibacron Blue F3G-A), resinas de afinidade péptido-ligando, resinas de afinidade a anticorpos, resinas de afinidade a lectina, cromatografia de afinidade a ADN imobilizado ou nucleótidos imobilizados e a agentes de adsorção específicos para grupos, tal como, p. ex., a gelatina acoplada a agarose.

Trata-se, de um modo preferido, de uma cromatografia de afinidade com corantes, em particular com o emprego de Blue Sepharose (p. ex. Blue Sepharose 6 Fast Flow da Amersham Biosciences). Mas também são adequadas outras matrizes de afinidade com corantes tal como, p. ex., o produto DyeMatrex da firma Millipore. 11 A cromatografia de interacção hidrofóbica também pode ser realizada com matrizes habituais. São adequadas as matrizes tal como butil-, fenil-, propil- ou octil-Sepharose (Amersham

Biosciences), Macro-Prep metilo ou t-butilo (Bio-Rad) e

Fractogel EMD com ligandos de propilo ou de fenilo (Merck). Trata-se, de um modo preferido, de Sepharose de butilo (p. ex. Butyl Sepharose 4 Fast Flow da Amersham Biosciences).

Para a cromatografia em hidroxiapatita podem ser empregues materiais habituais de hidroxiapatita. A hidroxiapatita é uma forma de fosfato de cálcio. Emprega-se, de um modo preferido, CHT, hidroxiapatita cerâmica, (Bio-Rad), de um modo particularmente preferido, CHT, hidroxiapatita cerâmica do tipo I (Bio-Rad). 0 padrão de isoformas do produto final da EPO, obtido portanto por meio do processo de acordo com a invenção e determinado após a segunda cromatografia de troca aniónica é comparável com o padrão BRP-EPO (ver Farmacopeia Europeia 01/2002:1316) .

Os seguintes exemplos deverão explicar a invenção sem a restringir.

Exemplos: A EPO é preparada em células de CHO. A fermentação ocorre segundo protocolos padrão tal como estes estão descritos na literatura de patentes e cientifica para células eucarióticas, em particular, de CHO. O cultivo ocorre em meio de cultura que está livre de proteínas e livre de componentes animais (p. ex. 12 MAM-PF2, obtenível na Bioconcept, Allschwil, Suíça, segundo as recomendações do fornecedor). A colheita tem lugar após uma fase de produção com uma duração de, no máximo, sete dias. As células são separadas, neste caso, através de um filtro de profundidade e uma subsequente filtração a 0,2 pm. As células podem ser removidas alternativamente por separação por centrifugação. O filtrado livre de células é subsequentemente concentrado no factor de aproximadamente 10, por meio de ultrafiltração, e submetido a diafiltração contra tampão fosfato. A diafiltração serve para reduzir a condutividade abaixo dos 5 mS/cm, para preparar a solução de proteínas para o primeiro passo cromatográfico, o denominado passo de captura.

Resumo do processo de purificação 1. Passo de cromatografia (captura, IEX 1)

Como passo de "captura" realiza-se uma cromatografia de troca iónica (IEX) em Q Sepharose XL. Neste primeiro passo de purificação concentra-se a substância activa eritropoietina. Este passo serve, além disso, para converter a substância activa numa forma de armazenagem mais estável. A lavagem ocorre com fosfato de Na 20 mM, pH 7,5, a eluição com cloreto de sódio 0,3 M a pH 7,5. A seguir à cromatografia de troca aniónica pode-se realizar uma filtração a 0,2 pm. 13 2. Passo de cromatografia (afinidade)

No passo seguinte ocorre uma cromatografia de afinidade em Blue Sepharose 6 FF (adquirida na Amersham Biosciences). Após troca do tampão sobre a coluna e um passo de lavagem adicional, ocorre a eluição em cloreto de sódio 1 M. Mistura-se o eluato com tampão contendo sais e isopropanol para a cromatografia de interacção hidrofóbica subsequente,. 3. Passo de cromatografia (CIH)

Aplica-se o eluato misturado com o tampão contendo sais e isopropanol, no passo seguinte, sobre uma coluna de cromatografia de interacção hidrofóbica (CIH; BUtyl Sepharose 4 FF, adquirida na Amersham Biosciences). Após um passo de lavagem (cloreto de sódio 2 M em 10% de isopropanol) ocorre a eluição da substância activa com cloreto de sódio 0,75 M em 23% de isopropanol (v/v). 4. Passo de cromatografia (hidroxiapatita)

Submete-se subsequentemente o eluato da cromatografia de interacção hidrofóbica a uma cromatografia em hidroxiapatita (CHT-I hidroxiapatita cerâmica, adquirida na Bio-Rad). Pode-se diluir anteriormente. A diluição ocorre, de um modo preferido, introduzindo o eluato da coluna CIH directamente em tampão Tris (Tris/HCl 20 mM, CaCl2 5 mM, pH 6,9) . A concentração final em isopropanol perfaz, de um modo preferido, aproximadamente 9% após a diluição. Esta solução é depois aplicada directamente sobre a coluna de hidroxiapatita. 14

Após a lavagem com tampão de fosfato de potássio 10 mM ocorre a eluição da eritropoietina. Ajusta-se o valor de pH do eluato a pH 7,4 com HC1. 5. Passo de cromatografia (IEX 2)

Para o passo cromatográf ico seguinte, e de um modo preferido último, carrega-se a solução contendo EPO sobre uma matriz de troca iónica (Source 30 Q, adguirida na Amersham Biosciences). Este passo de cromatografia inclui um passo de lavagem ácida com acetato de sódio (pH 4,0), de modo a empobrecer as isoformas básicas da substância activa. Após ajuste do valor de pH, através de um passo de lavagem adicional, a pH 7,4, ocorre a eluição da eritropoietina com cloreto de sódio 200 mM.

Subseguentemente, no âmbito da filtração de vírus, pode-se realizar novamente uma filtração a 0,2 pm. A solução de substância activa é designada de bulk e pode ser congelada repentinamente por meio de azoto líguido e pode ser depois armazenada a -80 °C. A eritropoietina obtida pode ser formulada na forma de uma formulação líguida em conjunto com substâncias auxiliares habituais farmaceuticamente aceitáveis. 15

Os passos de cromatografia individuais em detalhe 1. Primeira cromatografia de troca aniónica (passo de captura) A equilibração da matriz de Q Sepharose XL (0,6 L ± 0,05 L) ocorre com fosfato de Na 20 mM, pH 7,5 (até o valor de pH perfazer 7,5 ± 0,3 e a condutividade <5 mS/cm atrás da coluna) . Depois ocorre a aplicação da amostra. Subsequente lava-se a coluna com o tampão de equilibração, portanto fosfato de Na 20 mM, pH 7,5. Para a eluição subsequentemente utiliza-se fosfato de Na 20 mM, NaCl 300 mM, pH 7,5.

No âmbito do passo de captura prescinde-se, em regra, de um passo de lavagem ácida. A pureza da eritropoietinas eluida perfaz > 65%, medida com HPLC-FR. A seguir ao passo de captura pode ocorrer uma filtração a 0,2 pm. De um modo preferido, o eluato é directamente bombeado através de um filtro de 0,2 pm durante a eluição com cloreto de sódio. 2. Cromatografia de afinidade em Blue Sepharose A equilibração da coluna ocorre com fosfato de Na 20 mM, NaCl 0,1 M, pH 7,5. Subsequentemente aplica-se a amostra obtida a partir do passo de captura sobre a coluna, em que esta pode ser anteriormente diluída com fosfato de Na 20 mM, pH 7,5, para a preparação para a cromatografia de afinidade. 16

Subsequentemente lava-se, uma vez, com Tris-HCl 20 mM, NaCl 0,1 M, pH 7,5. O segundo passo de lavagem ocorre com Tris/HCl 20 mM, NaCl 5 mM, NaCl 0,1 M, pH 7,5. A eluição ocorre com Tris/HCl 100 mM, CaCl2 5 mM, NaCl 1 M, pH 7,5. A cromatografia de afinidade em Blue Sepharose serve, entre outros, para o empobrecimento em proteínas da célula hospedeira. O teor em proteínas da célula hospedeira é determinado habitualmente por meio de ELISA. Esta e outras estratégias para a análise das proteínas da célula hospedeira podem ser consultadas, p. ex., em Hoffman K. (2000) Biopharm, vol. 13, n° 6, páginas 38-45. O rendimento de eritropoietina, medido com HPLC-FR, perfaz, pelo menos, 65%, de um modo preferido, pelo menos, 70%, após a cromatografia de afinidade em Blue Sepharose. A pureza, medida igualmente com HPLC-FR, perfaz, pelo menos, 90%, de um modo preferido, pelo menos, 95%. 3. Cromatografia de interacçao hidrofóbica (CIH) A cromatografia de interacção hidrofóbica realiza-se com Butyl Sepharose 4 FF como matriz. Esta matriz é fisicamente estável e permite elevadas velocidades de fluxo. A concentração de sal necessária para a ligação à EPO (NaCl 2 M) é ajustada por mistura do eluato da Blue Sepharose 6 FF com tampão contendo NaCl 4 Μ. A amostra é adicionalmente ajustada a 10% de isopropanol (v/v). A condutividade da amostra prevista para o carregamento da coluna de CIH deverá situar-se, se possível, entre 95 e 17 110 mS/cm. A condutividade do tampão de equilibraçao deverá situar-se igualmente nesta gama.

Equilibra-se a coluna de CIH com Tris/HCl 20 mM, NaCl 2 M, 10% de isopropanol, pH 7,5. Após a aplicação da amostra, ocorre a lavagem com o tampão de equilibraçao. A eluição ocorre com o seguinte tampão de eluição: Tris/HCl 20 mM, CaCl2 5 mM, NaCl 0,75 M, 23% (v/v) de isopropanol, pH 6,9. O volume de eluição perfaz 1 volume de coluna.

Demonstrou-se que, no âmbito do processo de purificação aqui apresentado em detalhe, uma concentração de isopropanol de 23% (v/v) no tampão de eluição conduz a uma eluição óptima da EPO para perdas simultaneamente minimizadas.

Para evitar uma precipitação da EPO devido a longa actuação de isopropanol (23%, v/v), introduz-se o eluato directamente em tampão Tris durante a eluição. A concentração de isopropanol do eluato diluído perfaz por fim 9% (v/v). O rendimento em eritropoietina após este passo de cromatografia perfaz, pelo menos, 65%, de um modo preferido, pelo menos, 70%, de um modo particularmente preferido, pelo menos, 80%. A pureza perfaz, pelo menos, 92%, de um modo preferido, pelo menos, 95%. 4. Cromatografia em hidroxiapatita O eluato da cromatografia em Butyl Sepharose 4 FF pode ser carregado sobre a coluna de hidroxiapatita (HAP) sem condicionamento adicional. Por esta razão, um tampão de 18 equilibração Tris contendo isopropanol para a equilibração da coluna resulta das condições de eluição da cromatografia de interacção hidrofóbica. Após o carregamento da coluna, remove-se o isopropanol através de um passo de lavagem.

Os tampões empregues para o passo de cromatografia em hidroxiapatita são os seguintes:

Tampão de equilibração: Tris/HCl 20 mM, NaCl2 5 mM,

NaCl 0,25 M, 9% de isopropanol, pH 6,9. O primeiro passo de lavagem ocorre com o tampão de equilibração, o segundo passo de lavagem com: Tris/HCl 10 mM,

CaCl2 5 mM, pH 6,8. O tampão de eluição é o seguinte

Tris/HCl 10 mM, CaCl2 0,5 mM, K2HP04 10 mM, pH 6,8. O rendimento do passo de cromatografia em hidroxiapatita perfaz, pelo menos, 65%, de um modo preferido, pelo menos, 70%. A pureza da EPO obtida perfaz, pelo menos, 97%, de um modo preferido, pelo menos, 98%. A cromatografia por meio de hidroxiapatita serve, ao todo, para a remoção do isopropanol do passo de cromatografia de interacção hidrofóbica. A eluição da EPO da coluna de hidroxiapatita pode ocorrer, de um modo preferido, através de uma eluição em etapas (fosfato de potássio de 0 aos 10 mM) . Contudo, também se pode empregar um gradiente linear (por exemplo de fosfato de potássio de 0 aos 40 mM). A seguir à cromatografia em hidroxiapatita, realiza-se, numa forma de realização preferida do processo de acordo com a 19 invenção, uma filtração de vírus. Esta filtração de vírus pode ser realizada, por exemplo, com um filtro Planova 15N do grupo Asahi Kasei. A membrana de filtração possui uma dimensão de poros de 15 nm e assegura também o empobrecimento em poliovírus e parvovírus. 5. Segunda cromatografia de troca iónica

Como último passo de purificação realiza-se uma cromatografia de troca iónica por meio de Source 30 Q. O passo é caracterizado sobretudo por um passo de lavagem ácida, com o qual as isoformas básicas da eritropoietina são eluídas devido a uma diminuição do pH e são, deste como, separadas do produto final. Este passo de cromatografia é, por conseguinte, particularmente importante em relação ao padrão de glicosilação do produto final de EPO.

Como sistema tampão para o segundo passo de troca iónica para a purificação de eritropoietina utiliza-se um tampão fosfato. Após o carregamento da amostra e um primeiro passo de lavagem, realiza-se um passo de lavagem "ácida". Sob estas condições eluem-se as isoformas básicas da eritropoietina. A equilibração e o primeiro passo de lavagem ocorrem com fosfato de Na 10 mM, pH 7,4. O passo de lavagem ácida ocorre com um tampão de lavagem com um teor em acetato de sódio de 20 mM e um valor de pH de 4,0. O volume de lavagem do passo de lavagem ácida perfaz 2 volumes de coluna.

Subsequentemente lava-se, em regra, mais uma vez com um tampão fosfato, através do qual o valor de pH é elevado para 20 7,4. A eluição ocorre com um gradiente em etapas de NaCl de 0 aos 0,2 M. Contudo, um gradiente linear é também adequado, p. ex., de NaCl de 0 aos 0,5 M. O tampão de eluição tem a composição: fosfato de Na 20 mM, NaCl 0,2 M, pH 7,4. A eluição ocorre ao longo de 1,5 volumes de coluna. O rendimento perfaz, pelo menos, 65%, de um modo preferido, pelo menos, 70% e, de um modo particularmente preferido, pelo menos, 75%. A pureza perfaz, pelo menos, 98%, de um modo preferido, pelo menos, 99%. O produto de EPO obtido, por fim, tem uma actividade biológica h 100000 I.U./mg no bioensaio, um teor de ADN < 100 pg/mg de proteína, uma pureza em EPO de > 98%, um teor em célula hospedeira (PCH, proteínas de célula hospedeira) < 100 ppm e um padrão de isoformas (na ECZ) que preenche os requisitos da Farmacopeia Europeia.

Todas as cromatografias em coluna são realizadas, de resto, segundo as recomendações e protocolos dos fornecedores das matrizes ou das colunas (p. ex., relativamente as velocidades de fluxo, aos volumes de coluna empregues para a lavagem ou para a eluição, ao diâmetro e alturas de leito das colunas etc.).

Lisboa, 9 de Julho de 2009 21

Claims (18)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Processo para o enriquecimento de eritropoietina, preparada por cultivo de células hospedeiras eucarióticas num meio de cultura, numa mistura proteica, em que se realizam os seguintes passos a)-c) na sequência indicada: a) uma primeira cromatografia de troca aniónica, b) uma cromatografia de afinidade, uma cromatografia de interacção hidrofóbica e uma cromatografia em hidroxiapatita, na sequência indicada, e c) uma segunda cromatografia de troca aniónica.
2. 2. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a cromatografia de afinidade está configurada como cromatografia de afinidade com corantes.
3. 3. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a segunda cromatografia de troca aniónica compreende um passo de lavagem ácida.
4. 4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores compreendendo adicionalmente, pelo menos, um passo de filtração.
5. 5. Processo de acordo com a reivindicação 4, em que uma filtração tem lugar após o último passo de purificação cromatográfica do passo b). 1
6. 6. Processo de acordo com a reivindicação 4 ou 5, em que uma filtração tem lugar após a segunda cromatografia de troca aniónica.
7. 7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a mistura proteica é um filtrado do meio de cultura livre de células hospedeiras, que é submetido a uma diafiltração antes da primeira cromatografia de troca aniónica.
8. 8. Processo de acordo com a reivindicação 7, em que o filtrado livre de células hospedeiras é submetido a uma ultrafiltração antes da diafiltração.
9. 9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o meio de cultura é livre de proteínas e livre de componentes animais.
10. 10. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o processo não compreende qualquer cromatografia de fase reversa.
11. 11. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o processo não compreende qualquer filtração em gel.
12. 12. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o processo não compreende qualquer precipitação de proteínas.
13. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o processo não compreende, para além 2 13. disso, quaisquer passos de purificação cromatográfica adicionais.
14. 14. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a eritropoietina enriquecida após a segunda cromatografia de troca aniónica apresenta um teor em proteínas da célula hospedeira < 100 ppm.
15. 15. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a eritropoietina enriquecida após a segunda cromatografia de troca aniónica apresenta um teor em ADN da célula hospedeira < 100 pg/mg.
16. 16. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a eritropoietina enriquecida após a segunda cromatografia de troca aniónica apresenta uma pureza > 98%, determinada por meio de HPLC de FR.
17. 17. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a eritropoietina enriquecida após a segunda cromatografia de troca aniónica apresenta uma actividade > 100000 I.U./mg.
18. 18. Processo para a preparação de uma formulação líquida de eritropoietina, compreendendo os seguintes passos: i) enriquecimento de eritropoietina, preparada por cultivo de células hospedeiras eucarióticas num meio de cultura, numa mistura proteica, em que se realizam os seguintes passos a)-c) na sequência indicada: a) uma primeira cromatografia de troca aniónica, 3 b) uma cromatografia de afinidade, uma cromatografia de interacção hidrofóbica e uma cromatografia em hidroxiapatita, na sequência indicada, e c) uma segunda cromatografia de troca aniónica, e (ii) formulação da eritropoietina enriquecida no passo i) com substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis, tal como tampões, sais e estabilizadores, numa formulação liquida. Lisboa, 9 de Julho de 2009 4