ES2353798T3 - Nuevos procedimientos de purificación del factor ix. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para separar el factor IX recombinante activo en una solución que comprende factor IX recombinante inactivo que comprende las etapas de: aplicar dicha solución a una resina de hidroxiapatita, lavar dicha resina de hidroxiapatita con un primer tampón fosfato para retirar las formas inactivas del factor eluir dicha resina hidroxiapatita con un segundo tampón fosfato, en el que dicho segundo tampón fosfato tiene una concentración mayor de fosfato que dicho primer tampón fosfato.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere en líneas generales a nuevos procedimientos de recuperación y purificación de proteínas y más específicamente a nuevos procedimientos para la recuperación y purificación del factor IX. 5

CAMPO DE LA INVENCIÓN

El advenimiento de la tecnología recombinante ahora permite la producción de elevados niveles de proteínas dentro de células huésped adecuadamente transformadas. Para proteínas secretadas, la purificación de la proteína de interés implica el aislamiento y purificación del medio de cultivo de la célula huésped. Típicamente, el medio de cultivo contiene nutrientes seleccionados (por ejemplo, vitaminas, aminoácidos, cofactores, minerales) y 10 factores de crecimiento/suplementos adicionales incluyendo insulina y posiblemente proteínas exógenas adicionales. El medio condicionado contiene no solamente el producto secretado de interés, sino también cantidades significativas de proteínas secretadas de la célula huésped adicionales y otras sustancias (por ejemplo, ácidos nucleicos, vesículas de membrana). Aunque se expresa a elevados niveles, el producto de interés puede representar una minoría de todas las proteínas presentes en el medio condicionado. No inesperadamente, las 15 proteínas secretadas por células huésped transformadas pueden tener características bastante diferentes de las del producto de interés (por ejemplo, carga, tamaño molecular, composición de aminoácidos). Asimismo, las proteínas secretadas de la célula huésped seleccionadas pueden mostrar propiedades muy similares a las del producto de interés, colocando de este modo una carga significativa sobre el procedimiento usado para la purificación. Cuando se desarrolla un procedimiento para la purificación de una proteína recombinante a partir de medio condicionado, es 20 importante que las condiciones usadas se limiten con respecto a la desnaturalización del producto de interés (condiciones que podrían usarse para explotar diferencias minoritarias entre proteínas secretadas para un mayor beneficio para la separación), haciendo de este modo que sea difícil separar el producto de interés de todas las demás proteínas de la célula huésped presentes.

Además de las proteínas secretadas de la célula huésped descritas anteriormente, el medio condicionado 25 también puede contener productos derivados del gen expresado de forma heteróloga que codifica el producto de interés. Éstos no son deseables para la sustancia de fármaco final e incluyen, por ejemplo, formas del producto que carecen de ciertas modificaciones post-traduccionales tales como glucosilación, sulfatación, carboxilación gamma, u otra modificación potencialmente necesaria para la actividad biológica. Además, pueden estar presentes formas proteolíticamente degradadas del producto de interés en el medio condicionado que también tienen que eliminarse 30 durante la purificación, pero que se parecen mucho al producto de interés. Desafortunadamente, la mayoría de los enfoques, tales como la cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía de interacción hidrófoba, y la cromatografía por exclusión de tamaño pueden no proporcionar el grado de resolución del producto de interés necesario para su uso en situaciones terapéuticas para seres humanos a partir de estas formas no deseadas. Para aprovechar toda la ventaja de las diferencias minoritarias entre el producto deseado y los contaminantes (por 35 ejemplo, pequeñas diferencias de carga, pequeñas diferencias en el tamaño molecular) a menudo es necesario el uso de desnaturalizantes fuertes. Dichos desnaturalizantes, sin embargo, pueden conducir a una pérdida de la actividad biológica, a la expresión de sitios neoantigénicos, y potencialmente pueden potenciar la descomposición química de modificaciones post-traduccionales seleccionadas.

Además de separar el producto de interés de las moléculas con propiedades similares (por ejemplo, formas 40 modificadas del gen expresado), también es importante reconocer la necesidad de separar el producto deseado de los componentes presentes en el medio condicionado con el que interacciona específicamente. Cuando la proteína de interés está cargada positivamente, tenderá a unirse a cualquier molécula cargada negativamente presente haciendo de este modo que la purificación de la proteína por procedimientos tradicionales sea muy difícil.

Lo siguiente es de interés general antecedente a la presente invención. Yan, documento USPN 4.981.952 45 (1 de enero de 1991) y Yan, y col. Bio/Technology 8:655 (julio de 1990) que describían el uso de cromatografía de intercambio aniónico por pseudos-afinidad para la purificación de proteínas dependientes de vitamina K. Josic, y col. J. Chrom. 632:1 (1993) describía el uso de cromatografía de afinidad por heparina para resolver el factor IX de otras proteínas dependientes de vitamina K. Suomela, Thromb. Res. 7:101 (1975); Suomela, Eur. J. Bio. Chem. 71:145 (1976); y Suomela, Thrombos. Haemostis. 35:211 (1976) describían el uso de hidroxiapatita en la separación de 50 diversos factores de coagulación y variantes plasmáticos del factor IX (en base a diferencias de carga debidas a la variación en el contenido de restos de carbohidrato, por ejemplo, ácido siálico y galactosa). Sin embargo, Reekers, y

col. Haemostasis 1:2 (1972) demostraron la incapacidad de la hidroxiapatita de separar los factores II, VII y IX entre sí y de otras proteínas plasmáticas. Schwinn, y col. documento USPN 4.411.794 describían la purificación parcial de factores de coagulación de la sangre usando hidroxiapatita en presencia de calcio a una concentración de 50-200 mM. Feldman, y col. Biotech. Blood Proteins 227:63 (1993) y Roberts, y col. Vox Sang 67(supl. 1): 69 (1994) describían la reducción de la infectividad vírica usando acidificación y Sepharose quelante cargada de cobre que 5 produjo bajos rendimientos de factor IX a partir de plasma humano.

Típicamente, los investigadores han usado combinaciones de técnicas cromatográficas tradicionales para purificar productos deseados. Frecuentemente, dichas técnicas no son suficientes para la purificación de un producto al nivel de pureza y consistencia deseado para un producto terapéutico para seres humanos. Los investigadores han intentado superar esta dificultad por el uso de cromatografía de afinidad en la que una proteína 10 de interés se une a un ligando inmovilizado con el que reacciona de forma específica. Después del lavado apropiado, el producto deseado puede eluirse por alteración de la interacción ligando proteína, a menudo produciendo un eluato significativamente más puro. Sin embargo, en el caso de la separación de un producto deseado de formas modificadas presentes en el medio condicionado, las técnicas cromatográficas de afinidad de una única etapa pueden no ser suficientes, y deben usarse junto con otras resinas de afinidad y/o técnicas de 15 separación tradicionales. Incluso las etapas de cromatografía de afinidad de alta resolución (por ejemplo, purificación por inmunoafinidad usando un anticuerpo monoclonal inmovilizado) pueden no producir suficiente resolución del producto deseado entre los otros componentes debido a los sitios comunes de interacción (por ejemplo, cuando está presente un epítope en el producto de interés, está presente también en una forma proteolíticamente degradada del producto). 20

Por consiguiente, sigue existiendo la necesidad en la técnica de procedimientos de purificación de proteínas que superen de forma eficaz dichas dificultades.

BREVE SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona procedimientos para separar el factor IX recombinante activo en una solución que comprende el factor IX recombinante inactivo que comprende las etapas de: aplicar dichas solución a 25 una resina de hidroxiapatita, lavar dicha solución a una resina de hidroxiapatita con un primer tampón fosfato para retirar las formas inactivas de factor IX, eluir dicha resina de hidroxiapatita con un segundo tampón fosfato, donde dicho segundo tampón fosfato tiene una concentración mayor de fosfato que dicho primer tampón fosfato. De acuerdo con los procedimientos de la invención, el factor IX puede expresarse por células en cultivo, o producirse de forma recombinante como saben los especialistas en la técnica. Los intervalos de concentración adecuados son 30 aquellos que son eficaces para retirar los contaminantes si eluir el factor IX e incluyen, por ejemplo, sal de 25 mM a 200 mM, y preferiblemente es cloruro sódico 200 mM.

En un aspecto adicional, dicho primer tampón fosfato es fosfato potásico 50 mM, NaCl 0,185 M, pH 7,2 y el segundo tampón fosfato es fosfato potásico 0,5 M, NaCl 0,2 M, pH 7,2.

Las resinas de hidroxiapatita adecuadas incluyen cualquiera que contenga fosfato cálcico tales como 35 Hidroxiapatita cerámica, Biogen HT, y otras, siendo preferida HA cerámica.

La presente invención también proporciona composiciones de factor IX producidas por los procedimientos de la invención. El factor IX producido de este modo tiene una actividad específica en el intervalo de 240-400 U/mg, y es opcionalmente de aproximadamente 240 U/mg.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN 40

Como se usa en este documento, el término "factor IX" incluye, aunque sin limitación, factor IX aislado de plasma, líneas celulares transformadas, y factor IX producido de forma recombinante aislado del medio de cultivo de la célula huésped.

Como se usa en este documento, el término "columna de hidroxiapatita" incluye, aunque sin limitación: soporte de gel de fosfato cálcico incluyendo, por ejemplo, BioGel-HT, y hidroxiapatita cerámica. 45

Como se usa en este documento, el término "segundo tampón fosfato" incluye, aunque sin limitación: soluciones compuestas por un agente tamponante (fosfato) a concentraciones suficientes para alterar la interacción

del factor IX con la resina (por ejemplo, aproximadamente 0,20 M o mayor) y sal (por ejemplo, NaCl, KCl) presente a concentraciones suficientes para minimizar las interacciones de carga del factor IX con la resina de hidroxiapatita, a aproximadamente pH neutro (pH 7,2); el término "primer tampón fosfato" incluye, aunque sin limitación, soluciones compuestas por un agente tamponante (fosfato) a concentraciones suficientes para retirar las formas inactivas de factor IX de la resina de hidroxiapatita. 5

Una referencia a la actividad específica del factor IX de "U/mg" incluye, aunque sin limitación: la actividad biológica determinada en el ensayo de coagulación in vitro (APTT) usando plasma combinado o factor IX purificado, aislado de forma convencional. La concentración de proteína puede determinarse por cualquier de varios procedimientos validados apropiadamente incluyendo SEC, RP-HPLC, ensayos basado en colorante (por ejemplo, Bradford, Lowry) o absorbancia a 280 nm. La actividad del actor IX se determina de acuerdo con el procedimiento de 10 Pittman, D., y col., Blood 79:389-397 (1992) utilizando plasma deficiente en factor IX.

La Figura 1 proporciona una visión global. Aunque el orden de las etapas expuestas es la realización actualmente preferida, los especialistas en la técnica apreciarán que el orden puede re-configurarse si se desea y que pueden omitirse etapas.

Primero se retiran las células del medio condicionado, por ejemplo, por microfiltración (MF) utilizando 15 membranas de filtración de flujo tangencial con un tamaño de poro de aproximadamente 0,6 m. Opcionalmente, se prepara medio condicionado libre de células para la purificación por filtración a través de un filtro de profundidad de 0,45 m. El medio condicionado libre de células después puede concentrarse por ultrafiltración, si se desea, seguido de diafiltración en un tampón apropiado para su carga en la primera etapa cromatográfica. Como alternativa, el medio condicionado libre de células puede cargarse directamente en la primera columna de cromatografía 20 equilibrada en un tampón apropiado.

imagen1

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La etapa del procedimiento inicial, UF/DF nº 1, conlleva la concentración del medio condicionado que contiene factor IX libre de células por ultrafiltración, seguido de diafiltración. Aunque no es necesaria para la unión del factor IX a la primera columna de cromatografía, esta etapa es eficaz para eliminar los componentes del medio de cultivo celular de pequeño peso molecular. Dichos componentes pueden unirse a la columna de cromatografía inicial, disminuyendo de este modo la capacidad de la columna para el factor IX. La UF/DF nº 1 se usa para 5 intercambiar el factor IX en una solución de tampón apropiada para el posterior procesamiento.

En la primera etapa de cromatografía, el intercambio aniónico en Q-Sepharose Fast Flow (FF) (Pharmacia), el factor IX se captura y se purifica de los componentes de la célula huésped presentes en la combinación concentrada de la UF/DF nº 1. La columna Q-Sepharose FF adsorbe la proteína factor IX, y las proteínas de la célula huésped contaminantes con puntos isoeléctricos mayores que el pH de funcionamiento se retiran de la corriente de 10 procesamiento fluyendo a través de la columna. La columna a la se que adsorbe el factor IX después se lava antes de la elución para retirar los contaminantes unidos de forma débil y ajustar la conductividad del tampón en la preparación para la elución.

Típicamente, las proteínas unidas se eluyen de la Q-Sepharose FF aumentando la fuerza iónica del tampón. El procedimiento de purificación del factor IX, sin embargo, emplea esta resina en un modo de intercambio 15 aniónico de pseudo-afinidad en el que se eluye el factor IX activo por la adición de, por ejemplo, cloruro cálcico al tampón. Este catión divalente provoca la elución de las formas activas del factor IX de la resina. Algunas formas menos activas del factor IX también pueden eluir de la columna de Q-Sepharose FF con este tampón de elución. Las formas inactivas seleccionadas del factor IX y otras proteínas contaminantes de la célula huésped permanecen unidas a la columna. La etapa de Q-Sepharose FF consigue un aumento significativo en la pureza del factor IX. 20

En la segunda etapa de cromatografía, la combinación de elución de Q-Sepharose FF se carga directamente, sin dilución, en la columna de Sulfato Matrex Cellufine. El factor IX se adsorbe a la columna, mientras que otras proteínas contaminantes (por ejemplo, PACE soluble y otras proteínas de la célula huésped presentes en el eluato de Q-Sepharose FF) se retiran de la corriente de procesamiento fluyendo a través de la columna. La columna se lava con un tampón de baja fuerza iónica para retirar todas las proteínas que no se han unido. El factor 25 IX se eluye por un aumento en la fuerza iónica del tampón, usando sal (por ejemplo, cloruro sódico).

La eliminación adicional de formas inactivas del factor IX se obtiene durante la tercera etapa de cromatografía, cromatografía en columna de HA cerámica. El pH de la combinación de elución de Sulfato Matrex Cellufine se ajusta a aproximadamente 7,5, y la combinación de elución se carga entonces directamente en la columna de HA cerámica. El factor IX se adsorbe por la columna. La columna de HA cerámica se lava con tampón 30 para retirar los contaminantes unidos de forma débil, seguido de un lavado con fosfato potásico 50 mM, NaCl 0,185 M (pH 7,2) para retirar los contaminantes unidos de forma más fuerte, incluyendo las formas inactivas del factor IX. El factor IX activo unido se eluye de una forma por etapas usando una solución que contiene una concentración mayor de fosfato potásico (por ejemplo, 200 mM o mayor, pH 7,2) como eluyente.

La cuarta etapa de cromatografía, cromatografía con Fractogel EMD-Quelato-Cu(II), elimina los bajos 35 niveles de proteínas contaminantes de la célula huésped aún presentes en el la corriente de producto. La combinación de elución de HA cerámica se carga directamente en la columna de Fractogel EMD-Quelato-Cu(II). El factor IX y varias proteínas contaminantes se adsorben a la columna. El factor IX activo purificado se eluye de la columna por bajas concentraciones de imidazol (por ejemplo, aproximadamente 15 mM) en el tampón, y las proteínas contaminantes residuales de la célula huésped se retiran de la corriente de producto quedando unidas a la 40 columna.

Finalmente, la combinación de elución de Fractogel EMD-Quelato-Cu(II) se concentra por ultrafiltración, seguido de diafiltración (UF/DF nº 2) en un tampón idéntico a un tampón de formulación excepto en que no contiene polisorbato 80. Un tampón de formulación adecuado comprende histidina, glicina, sacarosa, y polisorbato-80 opcionalmente a 10 mM, 260 mM, el 1%, y el 0,005%, respectivamente. Después de completarse la diafiltración, el 45 factor IX se concentra para conseguir una concentración diana. La combinación de producto se retira del aparato de UF/DF 2 y se formula por la adición de polisorbato 80 a una concentración diana del 0,005%. La sustancia de fármaco de factor IX después se filtra (0,2 m), se muestrea, se marca, y se almacena congelada a aproximadamente -80ºC. La última etapa del procedimiento, UF/DF nº 2, es eficaz para concentrar y diafiltrar la sustancia de fármaco de factor IX purificado sin desnaturalización o pérdida significativa de la proteína. El análisis 50 por SDS-PAGE (reducido y no reducido) es un procedimiento usado para evaluar el rendimiento global del procedimiento. Cada etapa proporciona más del 80% al 100% de rendimiento y el rendimiento global promedio del factor IX es de aproximadamente el 51%. El rendimiento global del procedimiento se determina a partir de la

actividad de coagulación que entra en el procedimiento de purificación y la actividad total de coagulación en la sustancia de fármaco de factor IX (excluyendo el material retirado como muestras y retenciones durante el procedimiento).

Los siguientes ejemplos ilustran la práctica de la invención. Estos ejemplos son solamente para propósitos ilustrativos. 5

El Ejemplo 1 describe la concentración de la proteína por ultrafiltración/diafiltración; el Ejemplo 2 se refiere a la purificación del factor IX por cromatografía de intercambio aniónico de pseudo-afinidad sobre Q-sepharose fast flow; el Ejemplo 3 describe la purificación del factor IX por cromatografía sobre Sulfato Matrex Cellufine; el Ejemplo 4 se refiere a la purificación de la proteína con cromatografía con hidroxiapatita; el Ejemplo 5 describe la purificación de la proteína por cromatografía de afinidad con metal inmovilizado; y el Ejemplo 6 se refiere a la concentración y 10 formulación de la proteína por ultrafiltración/diafiltración.

Ejemplo 1 - Concentración de Proteína por Ultrafiltración/Diafiltración

Opcionalmente, la ultrafiltración/diafiltración (UF/DF nº 1) puede realizarse para concentrar y para intercambiar el tampón del medio condicionado libre de células usando filtración en membrana de flujo tangencial. La membrana usada en el dispositivo de flujo tangencial sirve como filtro selectivamente permeable que separa 15 sustancias en base al peso molecular. Los componentes de la solución de elevado peso molecular, tales como el factor IX, se retienen por la membrana, y los componentes de bajo peso molecular, tales como sales inorgánicas y componentes del tampón, pasan libremente a través de la estructura de membrana porosa y se retiran en el producto permeado.

Cuando se extrae el tampón del dispositivo de flujo tangencial a una velocidad más rápida que a la que se 20 añade el tampón de remplazo al producto retenido, la solución de proteína se concentra. Cuando el tampón de remplazo se añade al producto retenido de flujo tangencial a una velocidad aproximadamente igual a la velocidad a la que se extrae el tampón a través de la membrana, el tampón inicial se diluye continuamente (diafiltración de proteína). En estas condiciones, los compuestos de bajo peso molecular se intercambian fácilmente y la concentración de proteína permanece constante. La adición de cinco volúmenes de producto retenido de tampón 25 provoca un remplazo teórico de ≥99% del tampón inicial.

Antes de su uso, el sistema de UF/DF nº 1 se equilibra con TRIS 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5. El medio condicionado libre de células se concentra aproximadamente 20 veces con relación al volumen inicial del medio condicionado libre de células. El medio condicionado libre de células concentrado después se diafiltra en el tampón. La diafiltración se completa cuando al menos cinco volúmenes de producto retenido del tampón han pasado a través 30 de la membrana, provocando una eliminación teórica de ≥99% de las sales y otros componentes de bajo peso molecular presentes en el medio condicionado libre de células.

Una vez se ha completado la diafiltración, el producto retenido se concentra si es necesario. El equipo después se lava abundantemente con suficiente tampón para recuperar el producto de factor IX residual del depósito y los conductos. La combinación después se extrae por bombeo del recipiente de UF/DF y se filtra a través de un 35 filtro de 0,2 m esterilizado en autoclave. La combinación de UF/DF nº 1 se almacena de 2 a 8ºC hasta que se procese adicionalmente.

Ejemplo 2 - Purificación del factor IX por Cromatografía de Intercambio Aniónico de Pseudo-Afinidad en Q-Sepharose Fast Flow

Q-Sepharose Fast Flow (FF) (Pharmacia) es una resina de intercambio aniónico fuerte compuesta por una 40 matriz de agarosa reticulada que está covalentemente derivatizada con un grupo amina cuaternaria a través de un corto enlazador. Las proteínas ácidas (tales como el factor IX) y otras sustancias poli-iónicas con una carga negativa neta al pH de funcionamiento se unen a Q-Sepharose FF mediante interacciones de carga. Típicamente, los componentes unidos se eluyen de forma diferencial de Q-Sepharose FF por la alteración de estas interacciones de carga con soluciones de conductividad aumentada. Sin embargo, el procedimiento de purificación del factor IX 45 emplea la resina Q-Sepharose FF en un modo de pseudo-afinidad. El factor IX se eluye de la columna usando una solución que contiene cloruro cálcico a baja concentración (10 mM). La inclusión de iones calcio en el tampón de elución causa un cambio conformacional en el factor IX que provoca su elución de la resina.

Q-Sepharose FF se usa para capturar el factor IX del producto retenido de UF/DF nº 1; para retirar los contaminantes no cargados y básicos de la corriente de procesamiento (en la fracción no unida durante la carga de la columna); para separar el factor IX de las proteínas ácidas (que se unen a la resina pero no se eluyen por la adición de cloruro cálcico al tampón), incluyendo formas inactivas del factor IX; y para suministrar una corriente de procesamiento de factor IX concentrado en la posterior etapa de cromatografía del procedimiento de purificación, 5 Sulfato Matrex Cellufine.

Opcionalmente, todas las operaciones de cromatografía para esta etapa se realizan de 2º a 8ºC. La columna de Q-Sepharose FF primero se carga con TRIS 50 mM, NaCl 2 M, pH 8,0, seguido de equilibrado con TRIS 50 mM, NaCl 150 mM, pH 8,0. El producto retenido de la UF/DF nº 1 se carga en la columna de Q-Sepharose FF, y después se lava la columna con TRIS 50 mM, NaCl 200 mM, pH 8,0. Este primer lavado asegura que la carga 10 completa haya pasado a través de la columna y que se hayan lavado del sistema las impurezas no adsorbentes en la carga, así como los contaminantes que se unen de forma débil a la resina. La columna después se lava con TRIS 50 mM, NaCl 100 mM, pH 8,0 para disminuir la conductividad en la preparación para la elución.

El factor IX se eluye de la columna con TRIS 50 mM, NaCl 100 mM, CaCl2 10 mM, pH 8,0, y el producto eluido se recoge en forma de un único pico. El eluato de Q-Sepharose FF se muestrea y almacena de 2 a 8ºC hasta 15 que experimente el procesamiento adicional. Opcionalmente, la columna puede regenerarse y reutilizarse.

Ejemplo 3 - Purificación del factor IX por Cromatografía en Sulfato Matrex Cellufine

El Sulfato Matrex Cellufine está compuesto por perlas de celulosa esferoidales derivatizadas con ésteres de sulfato. Puede usarse como un análogo de heparina inmovilizado para la purificación por afinidad de proteínas que contiene dominios de unión a heparina. También puede usarse para cromatografía de intercambio catiónico a causa 20 de sus funciones sulfato cargadas negativamente. Las proteínas básicas, otras sustancias poli-iónicas con una carga positiva neta al pH de funcionamiento, y las proteínas de unión a heparina se unen a la resina y se eluyen con soluciones de fuerza iónica creciente. La resina de Sulfato Matrex Cellufine se usa en el procedimiento de purificación del factor IX para la eliminación de proteínas de la célula huésped diferentes del factor IX en la combinación de elución de Q-Sepharose FF y, opcionalmente, para proporcionar condiciones de tampón apropiadas 25 para la carga de la columna de hidroxiapatita.

Opcionalmente, todas las operaciones de cromatografía para esta etapa se realizan de 2 a 8ºC. En la preparación para la etapa de carga, la columna de Sulfato Matrex Cellufine se equilibra con TRIS 50 mM, pH 8,0. La combinación de elución de Q-Sepharose FF se carga directamente en la columna de Sulfato Matrex Cellufine equilibrada, la columna se lava con TRIS 50 mM, NaCl 150 mM, CaCl2 10 mM, pH 8,0 para asegurar que toda la 30 carga ha pasado a través de la columna y que las impurezas unidas de forma débil se retiran del sistema. Después, la columna puede lavarse para retirar los iones calcio antes de la elución.

Después de que se hayan completado las etapas de lavado, la columna de Sulfato Matrex Cellufine se eluye con TRIS 50 mM, NaCl 500 mM, pH 8,0, y el eluato se recoge en forma de una única combinación de elución de absorción de UV. La combinación de elución de Sulfato Matrex Cellufine se muestrea y se almacena de 2º a 8ºC 35 hasta que se procese adicionalmente. Opcionalmente, la columna puede regenerarse y reutilizarse.

Ejemplo 4 - Purificación de Proteína con Cromatografía en Hidroxiapatita

La hidroxiapatita cerámica (HA cerámica) es una forma sintética de fosfato cálcico que consta de partículas macroporosas esferoidales con elevada resistencia mecánica. La HA cerámica separa las proteínas con un amplio intervalo de cargas y puntos isoeléctricos en gran medida en base a las interacciones de carga. El factor IX es una 40 proteína ácida que se une a la HA cerámica a aproximadamente pH neutro. Típicamente, las proteínas ácidas se eluyen de la HA cerámica por la adición de fosfato a la solución tampón. La concentración de fosfato necesaria para la elución varía, dependiendo de las propiedades de la molécula de interés, permitiendo de este modo la elución diferencial de las proteínas unidas. La HA cerámica se usa en el procedimiento de purificación del factor IX para retirar el factor IX inactivo, y otros contaminantes, en la combinación de elución de Sulfato Matrex Cellufine y para 45 intercambiar el tampón del eluato por uno compatible con la etapa cromatográfica final. Como la etapa de cromatografía final es cromatografía de afinidad con metal inmovilizado, los tampones usados para la elución de la HA cerámica se seleccionan para que sean compatibles con la IMAC. Esto evita una diafiltración durante el procedimiento u otro procedimiento de intercambio de tampón. Los tampones tales como Tris, glicina, histidina no son compatibles con la IMAC a causa de la alteración de la interacción del ligando inmovilizado de ión metálico. La 50 elución de la columna de HA cerámica con tampones fosfato evita dichas complicaciones.

En la preparación para la carga; la columna de HA cerámica se equilibra con TRIS 50 mM, NaCl 500 mM, pH 7,5. La combinación de elución se Sulfato Matrex Cellufine se titula a pH 7,5 con HCl diluido y se carga directamente en la columna de HA cerámica. Después de completarse la carga, la columna se lava con tampón (NaCl 0,5 M, TRIS 50 mM, pH 7,5) para asegurar que toda la carga haya pasado a través de la columna y que se retiren de la columna los contaminantes unidos de forma débil. A continuación, la columna se lava con K2HPO4 50 5 mM, NaCl 185 mM, pH 7,2 para retirar las formas inactivas del factor IX de la corriente de procesamiento.

Después de completarse las etapas de lavado, el factor IX unido se eluye con K2HPO4 500 mM, NaCl 200 mM, pH 7,2, y el eluato de factor IX se recoge en forma de una única combinación de elución de absorción de UV. La combinación de eluato se muestrea y se almacena de 2 a 8ºC hasta que experimente procesamiento adicional. Opcionalmente, la columna puede regenerarse y reutilizarse. 10

Ejemplo 5 - Purificación de la Proteína por Cromatografía de Afinidad con Metal Inmovilizado

El Fractogel-EMD-Quelato está compuesto por un polímero de metacrilato derivatizado con grupos funcionales iminodiacéticos a los que pueden unirse iones metálicos en estado de transición. En la preparación para su uso en el procedimiento de purificación, la resina se carga con iones de cobre usando una solución de sulfato de cobre. Las proteínas capaces de interaccionar con los iones de cobre inmovilizados se retienen en la columna, y los 15 contaminantes que no interaccionan pasan a su través en la fracción no unida. Las proteínas unidas se eluyen de la resina usando soluciones que contienen imidazol. Puede usarse una etapa de Fractogel-EMD-Quelato-Cu(II) en el procedimiento de purificación de proteína para retirar de la corriente de procesamiento los contaminantes que no se unen al ión metálico inmovilizado o que requieren mayores concentraciones de imidazol para la elución que las requeridas por el factor IX. El término IMAC (cromatografía de afinidad con metal inmovilizado) también se usa para 20 indicar esta etapa de cromatografía.

En la preparación para la carga, la columna de Fractogel-EMD-Quelato no cargada (sin ión metálico inmovilizado) se lava con ácido acético 100 mM, NaCl 500 mM, pH 4,0 y se carga posteriormente con CuSO4 200 mM, NaCl 500 mM. Los iones de cobre unidos de forma débil se retiran por lavado de la resina cargada con ácido acético 100 mM, NaCl 500 mM, pH 4,0, seguido de imidazol 200 mM, NaCl 500 mM, pH 7,1. La resina de Fractogel-25 EMD-Quelato-Cu(II) después se equilibra en K2HPO4 200 mM, NaCl 200 mM, pH 7,1 (Equilibrado V): La combinación de elución de HA cerámica se carga directamente en la columna de Fractogel-EMD-Quelato-Cu(II) equilibrada.

Después de completarse la carga, la columna se lava con tampón de equilibrado para asegurar que toda la carga ha pasado a través de la columna. El factor IX unido a la resina se eluye usando K2HPO4 20 mM, imidazol 15 30 mM, NaCl 100 mM, pH 7,1. El eluato de Fractogel-EMD-Quelato-Cu(II) se recoge en forma de una única combinación que absorbe UV. Después de la recogida, la combinación de elución se diluye con 20 ml de EDTA 500 mM, pH 8,0 por litro de eluato de columna. La combinación de elución diluida se almacena a temperatura ambiente hasta que experimente procesamiento adicional.

Ejemplo 6 - Concentración y Formulación de la Proteína por Ultrafiltración/Diafiltración nº 2 35

Para transferir el factor IX a un tampón de elección, se usa una etapa de combinación de ultrafiltración/diafiltración. La UF de flujo tangencial/DF es un procedimiento de separación no cromatográfica que puede usarse para concentrar e intercambiar de tampón las sustancias en solución. Se dirige una corriente de alimentación paralela a la superficie de una membrana selectivamente permeable, y se aplica presión en el lado del producto retenido de la salida de la membrana para realizar el transporte de agua y los solutos en la superficie de la 40 membrana en base a su permeabilidad relativa. En estas circunstancias, los componentes de la corriente de suministro de bajo peso molecular pasan libremente a través de los poros de la membrana en la fracción del producto permeado, y las sustancias de mayor peso molecular (por ejemplo, el factor IX) se retienen por la membrana y constituyen la fracción del producto retenido. De esto modo, puede eliminarse el agua y las sales tamponantes de la combinación de elución de Fractogel-EMD-Quelato-Cu(II), y puede concentrarse el factor IX a 45 una concentración diana.

Opcionalmente, un componente de cartucho de bobina espiral del sistema de flujo tangencial se equilibra primero con histidina 10 mM, glicina 260 mM, sacarosa al 1%, pH 6,8. La combinación de elución de Fractogel-EMD-Quelato-Cu(II) (previamente diluida con EDTA 500 mM) después se transfiere al recipiente a presión del producto retenido de acero inoxidable del aparato de flujo tangencial en la preparación para la concentración de proteína. 50

Después de que se haya completado la transferencia, la solución del producto retenido se bombea de forma continua desde el recipiente a presión a través del cartucho de bobina espiral y de nuevo al recipiente a presión a una presión transmembrana positiva neta. El volumen del producto retenido se controla de forma continua durante esta operación midiendo la fracción de producto permeado usando un recipiente de recogida graduado.

Cuando se alcanza el volumen diana del producto retenido, la combinación del producto retenido se diafiltra 5 en el tampón de elección. Durantes esta operación, el tampón de diafiltración se bombea en el recipiente a presión a la misma velocidad a la que fluye el producto permeado desde el sistema, manteniendo de este modo un volumen constante del producto retenido.

Después de completarse la etapa de diafiltración, la fracción del producto retenido se concentra a un volumen diana usando ultrafiltración. La fracción efluente del recipiente a presión del producto retenido se detiene, y 10 la fracción del producto retenido en el cartucho de bobina espiral se lava abundantemente en el recipiente a presión del producto retenido con un volumen diana del tampón de elección. El producto de factor IX diafiltrado, concentrado se recupera del recipiente a presión por bombeo en frascos de combinación de tara determinada.

La combinación de producto de factor IX se diluye con histidina 10 mM, glicina 260 mM, sacarosa al 1%, polisorbato 80 al 1%, pH 6,8 hasta una concentración final del 0,005% de polisorbato 80. El producto después se 15 mezcla minuciosamente y se filtra a través de un filtro de 0,2 m (previamente equilibrado en histidina 10 mM, glicina 260 mM, sacarosa al 1%, polisorbato 80 al 0,005%, pH 6,8) en frascos de Teflón despirogenados. La proteína después se muestrea, se marca, se congela rápidamente en nitrógeno líquido, y se almacena a -80ºC.

Claims (2)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un procedimiento para separar el factor IX recombinante activo en una solución que comprende factor IX recombinante inactivo que comprende las etapas de:

   aplicar dicha solución a una resina de hidroxiapatita,

   lavar dicha resina de hidroxiapatita con un primer tampón fosfato para retirar las formas inactivas del factor 5 IX,

   eluir dicha resina hidroxiapatita con un segundo tampón fosfato, en el que dicho segundo tampón fosfato tiene una concentración mayor de fosfato que dicho primer tampón fosfato.
2. 2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicho primer tampón fosfato es fosfato potásico 50 mM, NaCl 0,185 M, pH 7,2 y dicho segundo tampón fosfato es fosfato potásico 0,5 M, NaCl 0,2 M, pH 7,2. 10