BR112015010796B1 - Processo para purificar galactocerebrosídeo-ssgalactosidase recombinante de humano, composição, e, uso da composição - Google Patents

Abstract

PROCESSO PARA PURIFICAR GALACTOCEREBROSÍDEO- Beta-GALACTOSIDASE RECOMBINANTE DE HUMANO, COMPOSIÇÃO, E, USO DA COMPOSIÇÃO A presente invenção refere-se a um processo para purificar Galactocerebrosídeo-Beta-Galactosidase recombinante de humano (rhGALC) a partir de uma cultura de células, em que uma fração de dita cultura de células que compreende rhGALC é submetida à croma-tografia em três resinas diferentes.

Description

Campo Técnico da Invenção

[001] A presente invenção refere-se a um protocolo de purificação de galactocerebrosideo-β-galactosidase recombinante de humano e aos produtos obteníveis por tal processo.

Fundamentos da Invenção

[002] Galactocerebrosídeo-e-galactosidase é uma enzima que catalisa a clivagem hidrolítica de galactose a partir de galactocerebrosídeo. Deficiência resulta em acúmulo de galactocerebrosídeo em tecidos. Métodos prévios relatados descrevem a purificação parcial de GALC de humano a partir de espécime natural, como fígado (Ben-Yoseph, Archives of Biochemistry and Biophysics, 1979), linfócitos (Sakai et al., J. Biochem., 1994) e urina (Chen et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1993). Os métodos são complicados devido à extrema hidrofobicidade e baixa abundância de GALC. As recuperações são extremamente baixas e os produtos obtidos são descritos como misturas de GALC de comprimento total GALC (80 kDa) e formas processadas (principalmente 50 e 30 kDa). Ademais, o objetivo destes relatórios prévios foi a caracterização da enzima e não a produção em grande escala para terapia de reposição de enzima (ERT, enzyme replace therapy) em humanos.

[003] Consequentemente, seria vantajoso um protocolo de purificação aprimorado de rhGALC que resulta em produto homogêneo (rhGALC de 80 kDa) de alta pureza em uma solução fisiológica adequada para uso em humanos.

Sumário da Invenção

[004] Foi desenvolvido um processo para a purificação de Galactocerebrosídeo-e-galactosidase recombinante de humano (rhGALC) que resulta em um produto final que atende plenamente às exigências de pureza e de qualidade para estudos em animais/humanos. O processo compreende três etapas cromatográficas principais e opcionalmente uma etapa de formulação por UFDF. Neste estudo colheita nova e clarificada de um biorreator de batelada alimentada de 20 L foi purificada com o processo otimizado para produzir rhGALC para estudos em animais/humanos.

[005] O protocolo de purificação é baseado na estratégia de três fases que consiste em etapas cromatográficas de captura, intermediária e refinamento com modos de ação diferentes. Preferivelmente, todas as etapas são realizadas em modo de ligação e incluem etapas de lavagem antes da eluição. Em uma modalidade, a etapa de captura é “Capto™ Blue”, a etapa intermediária é “Capto™ Adhere” e a etapa de refinamento é “Toyopearl Ether”.

[006] Duas etapas de inativação/remoção de vírus dedicadas são incluídas em modalidades do processo. O acervo de produto pode ser formulado por UFDF antes da filtração esterilizante para obter o produto final.

[007] O objetivo final é produzir rhGALC como terapia de reposição de enzima para o tratamento da doença de armazenamento lisossomal de enzima - Leucodistrofia de Células Globoides (doença de Krabbe). A doença de Krabbe é causada pela deficiência genética da enzima GALC. A deficiência de GALC resulta em acúmulo degenerativo do metabólito esfingolipídico galactosilesfingosina (psicosina), desmielinização, e morte precoce.

[008] Dessa forma, um objetivo da presente invenção refere-se ao fornecimento de um protocolo de purificação de rhGALC. Em particular, um objetivo da presente invenção é fornecer um protocolo de purificação de rhGALC com aplicabilidade em animais e humanos.

[009] Dessa forma, um aspecto da invenção relaciona-se a um processo para purificar galactocerebrosideo-β-galactosidase recombinante de humano (rhGALC) a partir de uma cultura de células, em que uma fração de dita cultura de células que compreende rhGALC é submetida à cromatografia em resinas, o processo compreendendo: a) uma etapa de captura na qual a dita rhGALC é purificada em uma primeira resina cromatográfica multimodal, opcionalmente seguida por inativação de vírus e/ou purificação por separação iônica; b) uma etapa intermediária na qual a dita rhGALC é purificada em uma segunda resina cromatográfica multimodal, opcionalmente seguida por inativação de vírus e/ou purificação por separação iônica; c) uma etapa de refinamento na qual a dita rhGALC é purificada em uma resina cromatográfica que é selecionada do grupo que consiste em uma resina cromatográfica multimodal, uma resina trocadora de ânions e uma resina cromatográfica de interação hidrofóbica (HIC, hydrophobic interaction chromatography).

[0010] Em modalidades específicas, a invenção também fornece um processo para purificar galactocerebrosideo-β-galactosidase recombinante de humano (rhGALC) a partir de uma cultura de células, em que uma fração da dita cultura de células que compreende rhGALC é submetida à cromatografia em resinas, o processo compreendendo: a) fornecer uma fração de dita cultura de células que compreende rhGALC; b) carregar a fração de dita cultura de células em uma primeira resina cromatográfica multimodal que compreende ligantes eletrostáticos; c) eluir rhGALC da primeira resina cromatográfica multimodal em um primeiro tampão de eluição que compreende pelo menos 30% de glicol propilênico e/ou glicol etilênico (v/v) obtendo com isso um primeiro eluato; d) carregar o primeiro eluato em uma segunda resina cromatográfica multimodal que compreende um ligante aniônico e hidrofóbico; e) eluir rhGALC da segunda resina cromatográfica em um segundo tampão de eluição que compreende pelo menos 30% de glicol propilênico e/ou glicol etilênico (v/v) e que tem um pH abaixo de 5,5, obtendo com isso um segundo eluato; f) carregar o segundo eluato em uma terceira resina cromatográfica que tem ligantes hidrofóbicos; e g) eluir rhGALC da terceira resina cromatográfica em um tampão aquoso, obtendo com isso um terceiro eluato.

[0011] Outro aspecto da presente invenção refere-se a uma composição que compreende rhGALC. A composição pode ser uma que é obtenível pelo processo de purificação de acordo com a presente invenção.

[0012] Ainda um outro aspecto da presente invenção é fornecer a composição de acordo com a presente invenção para uso como um medicamento.

[0013] Ainda um outro aspecto da presente invenção é fornecer uma composição de acordo com a presente invenção para uso no tratamento de Leucodistrofia de Células Globoides (doença de Krabbe).

[0014] Em ainda um outro aspecto, a invenção refere-se a um método de tratamento de Leucodistrofia de Células Globoides (doença de Krabbe) e/ou de redução ou alívio dos sintomas associados com Leucodistrofia de Células Globoides (doença de Krabbe), o dito método compreendendo uma etapa de administrar uma composição que compreende uma rhGALC purificada de acordo com a presente invenção a um indivíduo que necessita da mesma. Breve Descrição das Figuras Figura 1

[0015] Figura 1 mostra um esboço do processo para a purificação de rhGALC. Colheita de um biorreator de 20 L foi purificada em três ciclos cromatográficos em escala piloto. Os produtos da etapa de resina Ether (isto é, resina eterificada) foram reunidos e o processo continuou em um ciclo resultando em produto final TG1106. Figura 2

[0016] Figura 2 mostra o rendimento (atividade %) por etapa nos três ciclos cromatográficos e também os ciclos de UFDF e filtração. O rendimento total da colheita clarificada para o produto final é mostrado à direita. As atividades foram medidas como réplicas com pelo menos duas diluições em dois experimentos por cálculo, exceto para a etapa de resina Ether (isto é, resina eterificada) na qual o produto foi medido em um experimento. Figura 3

[0017] Figura 3 mostra um sumário da atividade restante total a partir da colheita clarificada para o produto final. As atividades foram medidas conforme na figura 2. Figura 4

[0018] Figura 4 mostra a análise por transferência de Western (Western blot) do produto final TG1106 e de padrões locais StG02 e StG03. GALC foi detectada com um anticorpo policlonal de coelho gerado contra StG02. Figura 5

[0019] Figura 5 mostra a análise por transferência de Western de produtos da etapa Ether, produto da UFDF e produto final TG1106 e de padrão local StG03 em carga excessiva. GALC foi detectada com um anticorpo policlonal de coelho gerado contra StG02. Figura 6

[0020] Figura 6 mostra a focalização isoelétrica em géis de pH 3-10 de TG1106 e de padrão local StG03. Figura 7

[0021] Figura 7 mostra SDS-PAGE corada com Azul Coloidal de produto final TG1106 e de amostras em processo posterior. Figuras 8 e 9

[0022] Figuras 8 e 9 mostram SDS-PAGE corada com Azul Coloidal de produto final TG1106 e de StG03 em várias concentrações. Figura 10

[0023] Figura 10 mostra Native PAGE 4 a 16% Bis-Tris corada com Azul Coloidal com deslocamento de absorbância máxima com o uso de Azul Brilhante Coomassie G250 em pH neutro. Análise de produto final TG1106 e de padrão local StG03.

[0024] A presente invenção será agora descrita com mais detalhes a seguir.

Descrição Detalhada Da Invenção Processo

[0025] Um aspecto da presente invenção fornece um processo para purificar galactocerebrosideo-β-galactosidase recombinante de humano (rhGALC) a partir de uma cultura de células, em que uma fração da dita cultura de células que compreende rhGALC é submetida à cromatografia em resinas, o processo compreendendo: d) uma etapa de captura na qual a dita rhGALC é purificada em uma primeira resina cromatográfica multimodal, opcionalmente seguida por inativação de vírus e/ou purificação por separação iônica; e) uma etapa intermediária na qual a dita rhGALC é purificada em uma segunda resina cromatográfica multimodal, opcionalmente seguida por inativação de vírus e/ou purificação por separação iônica; f) uma etapa de refinamento na qual a dita rhGALC é purificada em uma resina cromatográfica que é selecionada do grupo que consiste em uma resina cromatográfica multimodal, uma resina trocadora de ânions e uma resina cromatográfica de interação hidrofóbica (HIC).

[0026] De acordo com algumas modalidades da invenção, a dita etapa intermediária compreende a purificação de dita rhGALC na dita segunda resina cromatográfica multimodal, seguida pela purificação de dita rhGALC em uma resina cromatográfica selecionada do grupo que consiste em: uma resina cromatográfica multimodal, que é diferente da dita primeira e da dita segunda resinas cromatográficas multimodais; e uma resina cromatográfica de interação hidrofóbica (HIC).

[0027] De acordo com outras modalidades da invenção, as ditas primeira e segunda resinas cromatográficas multimodais são resinas diferentes.

[0028] A dita primeira resina cromatográfica multimodal pode em particular compreender ligantes eletrostáticos.

[0029] De acordo com outras modalidades da invenção, a dita segunda resina cromatográfica multimodal compreende um ligante aniônico e hidrofóbico.

[0030] Em ainda outras modalidades, a resina cromatográfica em dita etapa de refinamento é uma resina que tem ligantes hidrofóbicos.

[0031] A dita primeira resina cromatográfica multimodal pode em particular compreender como ligante um composto da fórmula (VI) conforme apresentada aqui abaixo.

[0032] A dita segunda resina cromatográfica multimodal pode em particular compreender como ligante um composto da fórmula (VIII) conforme apresentada aqui abaixo.

[0033] De acordo com outras modalidades a dita primeira resina cromatográfica multimodal compreende como ligante um composto da fórmula (VI) conforme apresentada aqui abaixo e a dita segunda resina cromatográfica multimodal compreende como ligante um composto da fórmula (VIII) conforme apresentada aqui abaixo. De acordo com estas modalidades é preferido que a dita rhGALC seja subsequentemente purificada em uma resina cromatográfica, que é uma resina eterificada. Exemplos de resinas eterificadas adequados são apresentados abaixo.

[0034] De acordo com algumas modalidades da invenção, a dita rhGALC é eluída da dita primeira resina cromatográfica multimodal em primeiro tampão de eluição que compreende pelo menos 30% de glicol propilênico e/ou glicol etilênico (v/v).

[0035] Em outras modalidades da invenção, a dita rhGALC é eluída da dita segunda resina cromatográfica multimodal em um segundo tampão de eluição que compreende pelo menos 30% de glicol propilênico e/ou glicol etilênico (v/v) e que tem um pH abaixo de 5,5.

[0036] O processo para purificar galactocerebrosideo-β-galactosidase recombinante de humano (rhGALC) de acordo com a invenção pode em particular compreender: a) fornecer uma fração de dita cultura de células que compreende rhGALC; b) carregar a fração de dita cultura de células em uma primeira resina cromatográfica multimodal que compreende ligantes eletrostáticos; c) eluir rhGALC da primeira resina cromatográfica multimodal em um primeiro tampão de eluição que compreende pelo menos 30% de glicol propilênico e/ou glicol etilênico (v/v) obtendo com isso um primeiro eluato; d) carregar o primeiro eluato em uma segunda resina cromatográfica multimodal que compreende um ligante aniônico e hidrofóbico; e) eluir rhGALC da segunda resina cromatográfica em um segundo tampão de eluição que compreende pelo menos 30% de glicol propilênico e/ou glicol etilênico (v/v) e que tem um pH abaixo de 5,5, obtendo com isso um segundo eluato; f) carregar o segundo eluato em uma terceira resina cromatográfica que tem ligantes hidrofóbicos; e g) eluir rhGALC da terceira resina cromatográfica em um tampão aquoso, obtendo com isso um terceiro eluato.

[0037] Há vários sinônimos para Galactocerebrosideo-β- Galactosidase Recombinante de Humano (rhGALC). Aqueles mais comumente usados são Galactocerebrosidase, Galactosilceramidase, Galcerase, Galactosilceramida-beta-galactosidase (EC3.2.1.46). Número(s) de acesso de Proteína é/são NP_000144.2 e P45803. É para ser entendido que a rhGALC de acordo com a presente invenção pode compreender etiquetas (tags).

[0038] Nos aspectos e nas modalidades de acordo com a invenção o termo Galactocerebrosideo-β-Galactosidase Recombinante de Humano (rhGALC) também inclui as partes funcionalmente equivalentes ou os análogos funcionalmente equivalentes das sequências de aminoácidos de comprimento total.

[0039] Determinadas características de rhGALC são importantes para conhecer quando configurar um protocolo de purificação de rhGALC ou de suas partes funcionalmente equivalentes ou de seus análogos funcionalmente equivalentes. Aproximadamente 80 kDa; 5 (ou 6) Sítios de glicosilação; Existe isoformas; pI teórico 5,9, encontrado 6,3; Sensível ao pH; pH 6,0-6,6 é preferido Extremamente hidrofóbico; Necessita de detergente para manter a atividade; Formação de dímero, trímero, tetrâmero;

[0040] Nos aspectos e nas modalidades da presente invenção conforme aqui descritos (descritas), a rhGALC ou a dita sua parte funcionalmente equivalente ou o dito seu análogo funcionalmente equivalente compreende uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste em: uma sequência de aminoácidos conforme apresentada em SEQ ID NO.: 2; uma parte funcionalmente equivalente de uma sequência de aminoácidos conforme definida em i); e um análogo funcionalmente equivalente de uma sequência de aminoácidos conforme definida em i) ou ii), a sequência de aminoácidos de dito análogo sendo pelo menos 75% idêntica a uma sequência de aminoácidos conforme definida em i) ou ii).

[0041] No contexto da presente invenção o termo “funcionalmente equivalente” significa que a dita parte ou o dito análogo de rhGALC é capaz de hidrolisar as ligações éster de galactose de galactocerebrosídeo, galactosilesfingosina, lactosilceramida, monogalactosildiglicerídeo, e do substrato cromogênico 2-hexadecanoilamino- 4-nitrofenil-b-D- galactopiranosídeo (HNG). Em modalidades específicas a dita parte ou o dito análogo de rhGALC mantém pelo menos 50%, como pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% da capacidade da enzima nativa (que tem a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 2) para hidrolisar as ligações éster de galactose de ditos compostos.

[0042] As propriedades catalíticas de dita parte ou de dito análogo de rhGALC podem ser determinadas pela medição da hidrólise de 2- hexadecanoilamino-4-nitrofenil-β-D- galactopiranosídeo (HNG) em 2- hexadecanoilamino-4-nitrofenol (HN) em pH 4,5. Em pH 10,5, HN é um produto de cor amarela, que pode ser determinado espectrofotometricamente a 410 nm. Um exemplo ilustrativo de tais medições é fornecido em Exemplo 12 no presente pedido.

[0043] Em modalidades específicas o análogo em iii) é pelo menos 80% idêntico a uma sequência conforme definida em i) ou ii), como pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou como pelo menos 99,5% idêntico a uma sequência conforme definida em i) ou ii).

[0044] Ademais, a dita rhGALC ou a sua dita parte funcionalmente equivalente ou o seu dito análogo funcionalmente equivalente pode em particular ser obtida (obtido) por expressão recombinante com o uso de uma sequência de ácido nucleico que compreende uma sequência selecionada do grupo que consiste em: uma sequência de ácido nucleico conforme apresentada em SEQ ID NO.: 1; uma sequência de ácido nucleico que é pelo menos 75% idêntica a uma sequência de ácido nucleico conforme definida em i).

[0045] Pode ser adicionalmente preferido que a sequência de ácido nucleico em ii) seja pelo menos 80% idêntica a uma sequência conforme definida em i), como pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou como pelo menos 99,5% idêntica a uma sequência conforme definida em i).

[0046] O termo “identidade de sequência” indica uma medição quantitativa do grau de homologia entre duas sequências de aminoácidos ou entre duas sequências de ácido nucleico de comprimentos iguais ou diferentes. Se as duas sequências a serem comparadas não forem de comprimentos iguais, elas precisam ser alinhadas para produzir o melhor ajuste possível, permitindo a inserção de lacunas ou, alternativamente, o truncamento nas extremidades das sequências de polipeptídeo ou das sequências de nucleotídeos. A identidade de sequência pode ser calculada como

em que Ndif é o número total de resíduos não idênticos nas duas sequências quando alinhadas e em que Nref é o número de resíduos em uma das sequências. Consequentemente, a sequência de DNA, AGTCAGTC, terá uma identidade de sequência de 75% com a sequência AATCAATC (Ndif = 2 e Nref = 8). Uma lacuna é considerada como não identidade do(s) resíduo(s) específico(s), isto é a sequência de DNA, AGTGTC, terá uma identidade de sequência de 75% com a sequência de DNA, AGTCAGTC (Ndif = 2 e Nref = 8). Etapas de pré-resina

[0047] A cultura de células que fornece a rhGALC não purificada pode provir de fonte diferentes. Em uma modalidade a cultura de células é proveniente de um biorreator que expressa a rhGALC.

[0048] Pode ser uma vantagem a modificação da fração da cultura de células antes da aplicação na primeira resina cromatográfica. Dessa forma, em uma modalidade o pH da fração é ajustado para abaixo de 7 antes do carregamento para a primeira resina cromatográfica como na faixa de 3 a 7, como na faixa de 4 a 7, como na faixa de 5 a 7 como na faixa de 6 a 7, como na faixa de 3 a 6, como na faixa de 3 a 5, ou como na faixa de 3 a 4. Também pode ser vantajoso filtrar (por exemplo por filtração de fluxo tangencial, filtração terminal ou filtração profunda) ou centrifugar a cultura de células para remover as células antes do carregamento. Dessa forma, em uma outra modalidade a fração de dita cultura de células é uma fração filtrada. Em ainda uma outra modalidade a dita fração da cultura de células que compreende rhGALC é uma colheita clarificada não diluída.

Etapas de primeira resina/etapas de captura

[0049] A primeira resina estabiliza a enzima e remove a cor do meio.

[0050] Tipos diferentes de multimodalidades podem ser adequados para a primeira resina cromatográfica multimodal. Dessa forma, em uma modalidade a primeira resina cromatográfica multimodal liga-se por intermédio de pelo menos interações hidrofóbicas e eletrostáticas. Em uma outra modalidade a primeira resina cromatográfica multimodal liga-se por intermédio de pelo menos interações aromáticas e eletrostáticas.

[0051] A dita primeira resina cromatográfica multimodal pode compreender como ligante um composto da fórmula (I), (II), (III), (V), (VI) ou (VII) abaixo.

[0052] Em ainda uma outra modalidade a primeira resina cromatográfica multimodal compreende como um ligante um composto da fórmula (I), (II) ou (III) abaixo.

[0053] Em particular, a dita primeira resina cromatográfica multimodal pode compreender como ligante um composto da fórmula (V), (VI) ou (VII).

em que R das substâncias de fórmulas (II) e (III) é um grupo funcional de fórmula (IV):

[0054] Em uma outra modalidade a primeira resina cromatográfica compreende um ligante da fórmula IV, fórmula V, fórmula VI ou fórmula VII. Resinas mais específicas também podem ser usadas como a primeira resina. Dessa forma, em ainda uma outra modalidade a primeira resina é selecionada do grupo que consiste em “Capto™ MMC”, “Capto™”” (Capto™ Blue (high sub)” e “Capto™ Blue (low)”), “Capto™ Adhere”, e “Blue Sepharose™ Fast Flow”; todas disponíveis junto à GE Healthcare.

[0055] “Capto MMC” é um trocador de cátions multimodal. Ele contém um grupo carboxílico e dessa forma suas características se parecem parcialmente com aquelas de um trocador de cátions fraco. Entretanto, em adição às interações iônicas vários outros tipos de interações estão envolvidos, incluindo ligação de hidrogênio e interação hidrofóbica. Capto™ Blue é um meio de bioprocesso por afinidade que se liga por intermédio de interações aromáticas e eletrostáticas. O ligante “Capto Adhere”, N-Benzil-N- metil-etanolamina, apresenta muitas funcionalidades para interação. As mais pronunciadas são interação iônica, ligação de hidrogênio e interação hidrofóbica.

[0056] Em outras modalidades a primeira resina é selecionada do grupo que consiste em “MEP HyperCel™ Mixed-Mode Chromatography Sorbent”, que está comercialmente disponível junto à Pall Corporation. “MEP HyperCel Sorbent” opera por um mecanismo de modo-misto e multimodo também descrito como Cromatografia de Ligação por Interação Hidrofóbica e Eluição por Indução de Carga Repulsiva (Hydrophobic Charge Induction Chromatography, HCIC). HCIC é baseada no comportamento dependente do pH de ligantes de modo dual, ionizáveis.

[0057] Em modalidades específicas a primeira resina tem um ligante da fórmula (VI). “Capto™ Blue” (“Capto™ Blue (high sub)” é um exemplo de uma tal resina.

[0058] Obviamente é para ser entendido que o processo de acordo com a invenção também pode incluir algumas etapas padrão conhecidas pela pessoa versada. Dessa forma, em uma modalidade a primeira resina cromatográfica é pré-condicionada antes do carregamento. Em uma outra modalidade antes da etapa b) a primeira resina cromatográfica é lavada com um tampão de lavagem. Em uma outra modalidade a primeira resina cromatográfica é lavada em um tampão de lavagem que compreende no máximo 20% de glicol propilênico e/ou glicol etilênico (v/v), como no máximo 15%, como no máximo 10%, como no máximo 5%, como na faixa de 5 a 20%, como 5 a 15%, ou como cerca de 10% de glicol propilênico e/ou glicol etilênico. Em uma modalidade o tampão de lavagem compreende no máximo 20% de glicol propilênico. Em uma outra modalidade o tampão de lavagem compreende no máximo 20% glicol etilênico. Visto que rhGALC é extremamente hidrofóbica, glicol propilênico e/ou glicol etilênico são os eluentes preferidos.

[0059] O primeiro tampão de eluição pode ter componentes diferentes. Em uma modalidade em que a primeira resina é “Capto™ Blue”, o primeiro tampão de eluição compreende uma concentração total de glicol propilênico e/ou glicol etilênico (v/v) de 40 a 60%, como 45 a 60%, como 50 a 60%, como 40 a 55% como 40 a 50%, ou como cerca de 50%. Uma concentração alta de glicol propilênico e/ou glicol etilênico (v/v) é importante para a eluição apropriada da enzima.

[0060] Após a eluição as condições do tampão podem ser alteradas. Dessa forma, em uma modalidade após a etapa c) a concentração total de glicol propilênico e/ou glicol etilênico (v/v) no primeiro eluato é diminuída para abaixo de 30% antes da etapa d), como abaixo de 20%, como abaixo de 15%, ou como abaixo de 10%. Pela diminuição da concentração de glicol propilênico e/ou glicol etilênico a atividade enzimática de rhGALC é mantida. Em uma modalidade adicional após a etapa c) o pH do primeiro eluato é ajustado para um pH na faixa de 5 a 6,5, como 5,5 a 6,5 como 5,7 a 6,3 ou a cerca de 6,1. Devido à sensibilidade ao pH de rhGALC é preferido um pH na faixa de 6,0-6,6. Em ainda uma outra modalidade, após a etapa c) o teor de detergente no primeiro eluato é ajustado para 0,01% a 5%, como 0,5% a 5%, como 0,5% a 4%, como 0,5% a 3%, como 0,5% a 2%, como 0,5% a 1,5%. Em uma outra modalidade o detergente é um detergente Tween como Tween 20, Tween 40, Tween 60 ou Tween 80. Tweens também são conhecidos como polissorbatos. Os detergentes devem ser preferencialmente aprovados para uso em humanos, dessa forma o detergente também pode ser, por exemplo, Cremophor (Polioxil-35-óleo de rícino) e Pluronic F-127.

[0061] Em uma modalidade adicional o primeiro eluato é armazenado no detergente durante 5 horas a 48 horas, como 10 horas a 3 horas, ou como 16 a 24 horas, por exemplo à temperatura ambiente. Pelo armazenamento do primeiro eluato durante um período de tempo mais longo esta etapa funciona como uma etapa de inativação de vírus, especialmente se a concentração de detergente é alta como 1%.

[0062] Antes do carregamento para a segunda resina cromatográfica, o primeiro eluato pode ser pré-condicionado. Dessa forma, em uma modalidade, antes da etapa d) o primeiro eluato é misturado com um tampão de pré-condicionamento para a segunda resina cromatográfica. Em ainda uma modalidade a mistura ocorre ao se deixar o primeiro eluato entrar diretamente em contato com o tampão de pré-condicionamento para a segunda resina. Etapas de segunda resina/etapas intermediárias

[0063] Tipos diferentes de multimodalidades podem ser adequados para a segunda resina cromatográfica multimodal. Dessa forma, em uma modalidade a segunda resina cromatográfica liga-se por intermédio de interações iônicas, ligação de hidrogênio e interações hidrofóbicas.

[0064] Em uma outra modalidade a segunda resina cromatográfica compreende N-Benzil-N- metil-etanolamina como ligante. Em uma modalidade adicional a segunda resina cromatográfica compreende um ligante da fórmula:

ou um ligante da fórmula:

[0065] Em uma modalidade mais específica a segunda resina cromatográfica é selecionada do grupo que consiste em Capto™ Adhere, Hidroxiapatita Cerâmica de Tipo I (CHT Ceramic Hydroxyapatite Type I, CHT I) que está comercialmente disponível junto à Biorad, e “MEP HyperCel™ Mixed-Mode Chromatography Sorbent”, que está comercialmente disponível junto à Pall Corporation. Capto™ Adhere é um meio de bioprocesso trocador de ânions forte com funcionalidades multimodais. Se liga por intermédio de interações iônicas, ligação de hidrogênio e interação hidrofóbica. Hidroxiapatita Cerâmica interage com biomoléculas por modos múltiplos: troca de cátions ocorre quando grupos fosfato negativamente carregados interagem com grupos amino de proteínas. Complexos de coordenação mais fortes podem formar entre agrupamentos carboxila, porções fosforila, ou ambos, em biomoléculas e nos sítios de cálcio em hidroxiapatita cerâmica CHT via o mecanismo de afinidade por metais. MEP HyperCel Sorbent opera por um mecanismo de modo-misto ou multimodo também descrito como Cromatografia de Ligação por Interação Hidrofóbica e Eluição por Indução de Carga Repulsiva (Hydrophobic Charge Induction Chromatography, HCIC). HCIC é baseada em comportamento dependente de pH de ligantes de modo dual, ionizáveis.

[0066] Em modalidades específicas a segunda resina compreende um ligante da fórmula (VIII). Capto™ Adhere é um exemplo de uma tal resina.

[0067] Obviamente é para ser entendido que o processo de acordo com a invenção também pode incluir algumas etapas padrão conhecidas pela pessoa versada. Dessa forma, em uma modalidade a segunda resina cromatográfica é pré-condicionada antes do carregamento. Em uma outra modalidade, após a etapa d), a segunda resina cromatográfica é lavada em um tampão de lavagem. Em uma modalidade adicional, após a etapa d) a segunda resina cromatográfica é lavada em um tampão de lavagem com um pH na faixa de 3 a 5, como 4 a 5, ou como 4,5 a 5. Em ainda uma outra modalidade o tampão de lavagem adicionalmente compreende um álcool, como isopropanol.

[0068] Tampões eluentes diferentes podem ser usados para a segunda resina cromatográfica. Em uma modalidade na qual a segunda resina cromatográfica é Capto™ Adhere o segundo tampão de eluição compreende na faixa de 30 a 50% de glicol propilênico (v/v), como 30 a 45%, como 30 a 40%, como 35 a 50%, como 40 a 50%, ou como cerca de 40%. Como previamente mencionado, visto que rhGALC é extremamente hidrofóbica, glicol propilênico e/ou glicol etilênico são os eluentes preferidos. De novo rhGALC também é sensível ao pH. Dessa forma, em uma modalidade o segundo tampão de eluição tem um pH abaixo de 6 como abaixo de 5, como na faixa de 3 a 6, 4 a 6, ou 4 a 5. Em uma modalidade adicional, antes da etapa f), o segundo eluato é misturado com um tampão de pré- condicionamento para a terceira resina cromatográfica.

Possível procedimento intermediário de 2 etapas

[0069] Em algumas modalidades de acordo com a invenção, a etapa intermediária é realizada como um procedimento de 2 etapas conforme descrito a seguir:

Etapa intermediária a)

[0070] A etapa intermediária a) no procedimento de 2 etapas é realizada conforme descrito acima, isto é, com o uso de uma resina multimodal e tampões conforme definidos em relação às etapas de segunda resina/etapas intermediárias.

Etapa intermediária b)

[0071] Tipos diferentes de modalidades podem ser adequados em etapa intermediária b), incluindo resinas multimodais, resinas hidrofóbicas e resinas cromatográficas que compreendem um ligante com um grupo éter.

[0072] Em uma modalidade mais específica, a resina cromatográfica usada na etapa intermediária b) é selecionada do grupo que consiste em “PPG-600M”, e “Toyopearl Phenyl-650M”, que estão comercialmente disponíveis junto à Tosoh Bioscience, “Capto™ Blue” (“Capto™ Blue (high sub)” e “Capto™ Blue (low)”), “Capto™ Butyl”, “Butyl-S Sepharose 6” (funciona no modo de ligação-e-eluição ou no modo de fluxo direto), e “Macro-Prep Methyl HIC” (funciona no modo de ligação-e-eluição ou no modo de fluxo direto) que está disponível junto à Biorad.

[0073] “Toyopearl Phenyl-650M” é um meio para Cromatografia de Interação Hidrofóbica (HIC). “Capto™ Blue” é um meio para bioprocesso por afinidade que se liga por intermédio de interações aromáticas e eletrostáticas. “Capto™ Butyl” e “Butyl-S Sepharose 6” são meios para cromatografia de interação hidrofóbica (HIC). “Macro-Prep Methyl HIC Support” opera em um mecanismo de interação que é baseado em hidrofobicidade e carga. Os grupos metila são moderadamente hidrofóbicos. Dependendo do pH de tampões de carregamento e de eluição, os grupos carboxila podem ser explorados para ionicamente repelirem moléculas alvo enquanto que os grupos hidrofóbicos retêm contaminantes.

[0074] Conforme a pessoa versada perceberá, tampões eluentes diferentes podem ser usados para a segunda resina cromatográfica. Etapas de terceira resina/etapas de refinamento

[0075] Tipos diferentes de modalidades podem ser adequados para a terceira resina cromatográfica. Dessa forma, em uma modalidade a terceira resina cromatográfica compreende um ligante compreendendo um grupo éter. Em uma outra modalidade a terceira resina é hidrofóbica. Em ainda uma modalidade a terceira resina cromatográfica compreende [resina]- (OCH2CH2)nOH como um ligante, em que n é um número inteiro na faixa de 1 a 20 como 1 a 10, como 1 a 5, como 1 a 3, ou como 1 a 2.

[0076] Em uma modalidade mais específica a terceira resina cromatográfica é selecionada do grupo que consiste em resinas eterificadas, incluindo resinas “Toyopearl Ether”, como 650M, 650S 5PW, “PPG-600M” e “Toyopearl GigaCap Q-650”, que estão comercialmente disponíveis junto à Tosoh Bioscience, Hidroxiapatita Cerâmica CHT de Tipo I (CHT I) que está comercialmente disponível junto à Biorad, Q Sepharose Fast Flow (Q FF), que está comercialmente disponível junto à GE Healthcare, “MEP HyperCel™ Mixed-Mode Chromatography Sorbent”, que está comercialmente disponível junto à Pall Corporation, “Macro-Prep Methyl HIC” (funciona no modo de ligação-e-eluição ou no modo de fluxo direto), que está comercialmente disponível junto à BioRad, e “Butyl-S Sepharose 6” (funciona no modo de ligação-e-eluição ou no modo de fluxo direto) e “Capto DEAE”, que estão comercialmente disponíveis junto à GE Healthcare.

[0077] A Hidroxiapatita Cerâmica interage com biomoléculas por modos múltiplos: troca de cátions ocorre quando grupos fosfato negativamente carregados interagem com os grupos amino de proteínas. Complexos de coordenação muito mais fortes podem formar entre agrupamentos carboxila, porções fosforila, ou ambos, em biomoléculas e nos sítios de cálcio na hidroxiapatita cerâmica CHT via o mecanismo de afinidade por metais. “Q Sepharose Fast Flow” é um meio (resina) para cromatografia de troca iônica (IEX). “MEP HyperCel Sorbent” opera pelo mecanismo de modo-misto ou multimodo também descrito como Cromatografia de Ligação por Interação Hidrofóbica e Eluição por Indução de Carga Repulsiva (Hydrophobic Charge Induction Chromatography, HCIC). HCIC é baseada no comportamento dependente do pH de ligantes de modo dual, ionizáveis. O meio “Toyopearl GigaCap Q-650” é uma resina trocadora de ânions de alta resolução, alta capacidade, “Macro-Prep Methyl HIC Support” opera em um mecanismo de interação que é baseado em hidrofobicidade e carga. “Butyl-S Sepharose 6” é um meio para cromatografia de interação hidrofóbica (HIC).

[0078] Em modalidades específicas a terceira resina cromatográfica é uma resina eterificada, tal como uma resina eterificada selecionada do grupo que consiste em as ditas resinas Toyopearl Ether, incluindo 650M, 650S e 5PW. Uma vantagem deste tipo de resina é que ela não necessita de glicol propilênico/glicol etilênico como eluente, mas pode usar um eluente aquoso.

[0079] Obviamente é para ser entendido que o processo de acordo com a invenção também pode incluir algumas etapas padrão conhecidas pela pessoa versada. Dessa forma, em uma modalidade a terceira resina cromatográfica é pré-condicionada antes do carregamento.

[0080] Dessa forma em uma modalidade o pré-condicionamento resulta em um tampão que compreende NH4Ac 1-2 M e NH4Cl 1-2 M. Em uma outra modalidade, após a etapa f) a terceira resina cromatográfica é lavada em um tampão de lavagem. Em ainda uma modalidade, após a etapa f), a terceira resina cromatográfica é lavada em um tampão de lavagem com um pH na faixa de 3-5, como 4-5, como 4,5-5, como 5,5-7 ou como cerca de 6,5. Isto é uma vantagem visto que rhGALC é sensível ao pH.

[0081] Tampões de lavagem diferentes podem ser utilizados para a terceira resina. Em uma modalidade, após a etapa f) a terceira resina cromatográfica é lavada com um primeiro tampão de lavagem que compreende NH4Ac a pelo menos 1M, como a pelo menos 2M ou como a pelo menos 3 M, ou como na faixa de 1 a 4M. Em ainda uma modalidade o primeiro tampão de lavagem compreende NH4Cl a pelo menos 1M, como a pelo menos 2M ou como a pelo menos 3 M, ou como na faixa de 1 a 3M e detergente a pelo menos 0,1%, como detergente a 0,1 a 2%.

[0082] Em uma modalidade um segundo tampão de lavagem contém concentrações de detergente e de sal mais baixas do que as do primeiro tampão de lavagem. Em ainda uma modalidade um terceiro tampão de lavagem contém concentrações de sal mais baixas que as do segundo tampão de lavagem. Em uma modalidade adicional o tampão de eluição é um tampão fosfato de sódio.

[0083] Para a rhGALC purificada ser adequada para, por exemplo, infusões em ser humano, o teor de detergente deve ser baixo. Dessa forma, em uma modalidade o terceiro tampão de eluição compreende abaixo de 1% de detergente, como abaixo de 0,01%, como abaixo de 0,001%, como abaixo de 0,001% de detergente. Em ainda uma modalidade o detergente é um detergente Tween, como Tween 80 ou Tween 20. Em uma outra modalidade o terceiro tampão de eluição tem um pH na faixa de 5 a 7, como 6 a 7, ou como 6,2 a 6,8.

[0084] Para aprimorar a etapa de eluição, o tampão de eluição pode compreender um sal. Dessa forma, em uma modalidade adicional o terceiro tampão de eluição compreende sal a pelo menos 100 mM, como NaCl e/ou KCl. NaCl e KCl podem ser excluídos, mas o produto pode ser então um pouco menos puro.

[0085] Em ainda uma modalidade o teor do produto final é ajustado para compreender manitol a pelo menos 150mM, como manitol a pelo menos 200 mM, como manitol a pelo menos 250 mM, ou como na faixa de 200 a 400 mM. A presença de manitol permite que o produto seja seco por congelamento.

Etapas de pós-resina

[0086] Para adicionalmente minimizar os níveis de por exemplo vírus e outras impurezas celulares indesejadas pode ser usada purificação adicional. Dessa forma, em uma modalidade, após a etapa g), o terceiro eluato é passado através de um filtro com um tamanho de filtro máximo de 0,1 μm. Em uma modalidade adicional, após a etapa g), o terceiro eluato é passado através de um filtro de exclusão por tamanho com um tamanho de filtro de no máximo 20 nanômetros, como no máximo 15 nanômetros, como um filtro Planova 15N.

[0087] Em ainda uma modalidade, o terceiro eluato é passado adicionalmente através de uma etapa de ultrafiltração/diafiltração com uma filtração de fluxo tangencial (TFF, tangential flow filtration) com o uso de uma membrana com corte de peso molecular (MWCO, molecular weight cut off) de abaixo de 50 kDa, como abaixo de 30 kDa, como abaixo de 15 kDa ou como abaixo de 10 kDa. Em uma modalidade adicional a membrana é uma membrana de poli(éter-sulfona), como uma membrana de poli(éter-sulfona) Pellicon. Em ainda uma modalidade a membrana é membrana de celulose regenerada.

Etapas adicionais

[0088] Com o propósito de adicionalmente aprimorar a qualidade do produto de acordo com a presente invenção, ele pode ser submetido à separação iônica. Opcionalmente, a separação iônica pode ser aplicada entre a etapa de captura e a etapa intermediária, entre a etapa intermediária e a etapa de refinamento ou no eluato da etapa de refinamento.

[0089] Quando se realiza a separação iônica entre a etapa de captura e a etapa intermediária ou após a etapa de refinamento, uma resina trocadora de ânions pode ser usada ou um filtro trocador de ânions pode ser usado, como uma membrana Mustang® Q, que está disponível junto à Pall Corporation. As membranas Mustang Q são trocadoras de ânions fortes, que eficazmente se ligam em DNA plasmídeo, proteínas negativamente carregadas, e partículas virais.

[0090] Quando se realiza a separação iônica entre a etapa intermediária e a etapa de refinamento ou após a etapa de refinamento, ela pode ser realizada em uma resina trocadora de ânions (AIEX) forte, como Capto Q, Giga Cap Q, Q FF. De acordo com tais modalidades, as resinas são usadas no modo de ligação. Também é possível incluir uma resina trocadora de ânions fraca, como Capto DEAE e DEAE FF, em particular quando a etapa de refinamento usa cromatografia de interação hidrofóbica (HIC).

[0091] Em outras modalidades a separação iônica pode ser aplicada imediatamente após a etapa de refinamento, como imediatamente após a eluição da dita resina eterificada.

[0092] Em modalidades alternativas a separação iônica pode ser aplicada após a etapa de ultrafiltração/diafiltração (UFDF).

[0093] Podem ser usados vários tampões diferentes durante a separação iônica. Em modalidades específicas, quando se aplica a separação iônica por exemplo em uma membrana Mustang Q imediatamente após a etapa de refinamento em resinas eterificadas, o filtro trocador de ânions ou a resina trocadora de ânions pode ser equilibrado (equilibrada) com fosfato de sódio 3,7mM, glicina 5mM, manitol 10mM, NaCl 0,075 M, Tween 80 0,0005%, pH 6,2. O produto pode ser diluído 1:1 (v:v) com fosfato de sódio 3,7mM, glicina 5mM, manitol 10mM, Tween 80 0,0005%, pH 6,2 opcionalmente com a adição de NaCl 0,15 M antes de ser passado através do filtro trocador de ânions ou da resina trocadora de ânions.

[0094] Em modalidades alternativas, quando se aplica a separação iônica por exemplo em uma membrana Mustang Q após a etapa de UFDF, o filtro trocador de ânions ou a resina trocadora de ânions pode ser equilibrado (equilibrada) com fosfato de sódio 3,7mM, NaCl 0,2 M, glicina 5mM, manitol 10mM, Tween 80 0,0005%, pH 6,2. O produto pode ser diluído com NaCl 1M até que a condutividade seja 20 mS/cm (aproximadamente 1 volume de produto : 0,2 volume de NaCl 1 M) antes da passagem dele através de um filtro trocador de ânions ou de uma resina trocadora de ânions.

[0095] Antes da filtração esterilizante o produto pode, de acordo com estas modalidades, ser diluído com o tampão de formulação, como um tampão de formulação sem NaCl para trazer a condutividade de volta para 15 mS/cm (NaCl 0,15 M).

Composições

[0096] A rhGALC purificada de acordo com a presente invenção difere de outras rhGALC's purificadas, por exemplo em pureza, atividade enzimática específica, e presença de produtos processados. Dessa forma, em um aspecto a presente invenção refere-se a uma composição que compreende rhGALC.

[0097] Em particular a rhGALC é uma que é obtenível pelo processo de purificação de acordo com a presente invenção.

[0098] Outros produtos purificados podem compreender produtos processados de rhGALC. Em uma modalidade a razão molar entre a rhGALC de comprimento total (80 kDa) e os produtos principais processados (50kDa + 30 kDa) na composição é pelo menos 50:2,5, como pelo menos 50:1, como pelo menos 100:1, como pelo menos 200:1, ou como 500:1. Em uma outra modalidade a razão molar entre a rhGALC de comprimento total (80 kDa) e os dois produtos principais processados (30 kDa + 50 kDa) na composição é pelo menos 50:2,5, como pelo menos 100:1, como pelo menos 200:1, como 500:1. As formas processadas de 30 kDa e 50 kDa de rhGALC puderam ser vistas como bandas menores e foram estimadas em <0,5% (consulte a seção de exemplos e a figura 5).

[0099] Em outras modalidades, a composição de acordo com a presente invenção contém muito poucas proteínas da célula hospedeira. A pessoa versada na técnica estará ciente de existência de vários métodos adequados para determinar o teor de proteínas da célula hospedeira e de outros contaminantes. Em particular, o teor de proteínas da célula hospedeira pode ser determinado por ELISA. De modo geral, o teor de proteínas da célula hospedeira é satisfatório se for 500 ng/mg ou menor. Em algumas modalidades da invenção, o teor de proteínas da célula hospedeira é 450 ng/mg ou menor, como 300 ng/mg ou menor, ou como 250 ng/mg ou menor. Em ainda uma modalidade a quantidade de proteínas da célula hospedeira é abaixo de 200 ng/mg na composição, como abaixo de 100 ng/mg rhGALC, como abaixo de 40 ng/mg rhGALC ou como abaixo de 30 ng/mg rhGALC. Como pode ser visto a partir da seção de exemplos, as impurezas foram estimadas em cerca de 30 ng de HCP (proteínas da célula hospedeira) por mg de rhGALC determinadas por ELISA.

[00100] Em algumas modalidades da invenção, o teor de proteínas da célula hospedeira é 20 ng/mg ou menor.

[00101] Em ainda uma modalidade a atividade enzimática na composição é pelo menos 15 kU/mL ou como pelo menos 30 kU/mL. Como pode ser visto na seção de exemplos, a atividade enzimática no produto final foi estimada em 42,5 kU/mL.

[00102] A composição de acordo com a presente invenção tem, como uma de suas características, um teor muito alto de rhGALC monomérica (80 kDa) e um teor muito baixo de agregados (dímeros e multímeros de rhGALC). Preferencialmente, as quantidades de agregados estão abaixo do teor mínimo de detecção, como quando detectadas por inspeção visual. A composição de acordo com a invenção então terá aparência transparente e não turva.

[00103] Alternativamente, a formação de agregados e os teores de agregados podem ser medidos por transmitância a 580 nm (T580). Com o uso deste método uma transmitância de >95% como >96%, >96,5%, >97%, >98% ou maior que >99%, indica teores satisfatórios de agregados. Outro método comumente usado é SEC (size exclusion chromatography, cromatografia de exclusão por tamanho).

[00104] A pessoa versada na técnica estará ciente da existência de outros métodos adequados para medir/avaliar o teor de agregados de proteínas, incluindo métodos de espalhamento de luz dinâmica e método de partículas subvisuais (contagem de partículas subvisuais).

[00105] Em uma modalidade preferida, menos que 1,5% (p/p) da rhGALC na dita composição de acordo com a invenção está sob a forma de agregados, como menos que 1% (p/p), por exemplo menos que 0,5% (p/p), menos que 0,25%(p/p), menos que 0,2% (p/p), menos que 0,1% (p/p), menos que 0,05% (p/p) ou menos que 0,01% (p/p). O teor de rhGALC monomérica (80 kDa) é pelo menos 95% (p/p), como pelo menos 96%(p/p), ou pelo menos 97% (p/p), por exemplo pelo menos 98% (p/p), preferencialmente pelo menos 98,5% ((p/p), pelo menos 99,5% ((p/p), ou 99% (p/p).

[00106] As composições de acordo com a presente invenção podem ser usadas como um medicamento. Dessa forma, um aspecto da presente invenção refere-se à composição de acordo com a presente invenção para uso como um medicamento.

[00107] Em ainda um outro aspecto a invenção refere-se à composição de acordo com a presente invenção para uso no tratamento de Leucodistrofia de Células Globoides (doença de Krabbe).

[00108] Em um outro aspecto a invenção refere-se ao uso da composição de acordo com a presente invenção para a preparação de medicamento para o tratamento de Leucodistrofia de Células Globoides (doença de Krabbe).

[00109] Em ainda um outro aspecto a invenção refere-se a um método de tratamento de Leucodistrofia de Células Globoides (doença de Krabbe) e/ou de redução ou alívio dos sintomas associados com Leucodistrofia de Células Globoides (doença de Krabbe), o dito método compreendendo uma etapa de administrar uma composição que compreende uma rhGALC purificada de acordo com a presente invenção a um indivíduo que necessita da mesma. Sequências SEQ ID NO.: 1 ggctactctc ggcttcctgg caacgccgag cgaaagctat gactgcggcc gcgggttcgg 60 cgggccgcgc cgcggtgccc ttgctgctgt gtgcgctgct ggcgcccggc ggcgcgtacg 120 tgctcgacga ctccgacggg ctgggccggg agttcgacgg catcggcgcg gtcagcggcg 180 gcggggcaac ctcccgactt ctagtaaatt acccagagcc ctatcgttct cagatattgg 240 attatctctt taagccgaat tttggtgcct ctttgcatat tttaaaagtg gaaataggtg 300 gtgatgggca gacaacagac ggcactgagc cctcccacat gcattatgca ctagatgaga 360 attatttccg aggatacgag tggtggttga tgaaagaagc taagaagagg aatcccaata 420 ttacactcat tgggttgcca tggtcattcc ctggatggct gggaaaaggt ttcgactggc 480 cttatgtcaa tcttcagctg actgcctatt atgtcgtgac ctggattgtg ggcgccaagc 540 gttaccatga tttggacatt gattatattg gaatttggaa tgagaggtca tataatgcca 600 attatattaa gatattaaga aaaatgctga attatcaagg tctccagcga gtgaaaatca 660 tagcaagtga taatctctgg gagtccatct ctgcatccat gctccttgat gccgaactct 720 tcaaggtggt tgatgttata ggggctcatt atcctggaac ccattcagca aaagatgcaa 780 agttgactgg gaagaagctt tggtcttctg aagactttag cactttaaat agtgacatgg 840 gtgcaggctg ctggggtcgc attttaaatc agaattatat caatggctat atgacttcca 900 caatcgcatg gaatttagtg gctagttact atgaacagtt gccttatggg agatgcgggt 960 tgatgacggc ccaagagcca tggagtgggc actacgtggt agaatctcct gtctgggtat 1020 cagctcatac cactcagttt actcaacctg gctggtatta cctgaagaca gttggccatt 1080 tagagaaagg aggaagctac gtagctctga ctgatggctt agggaacctc accatcatca 1140 ttgaaaccat gagtcataaa cattctaagt gcatacggcc atttcttcct tatttcaatg 1200 tgtcacaaca atttgccacc tttgttctta agggatcttt tagtgaaata ccagagctac 1260 aggtatggta taccaaactt ggaaaaacat ccgaaagatt tctttttaag cagctggatt 1320 ctctatggct ccttgacagc gatggcagtt tcacactgag cctgcatgaa gatgagctgt 1380 tcacactcac cactctcacc actggtcgca aaggcagcta cccgcttcct ccaaaatccc 1440 agcccttccc aagtacctat aaggatgatt tcaatgttga ttacccattt tttagtgaag 1500 ctccaaactt tgctgatcaa actggtgtat ttgaatattt tacaaatatt gaagaccctg 1560 gcgagcatca cttcacgcta cgccaagttc tcaaccagag acccattacg tgggctgccg 1620 atgcatccaa cacaatcagt attataggag actacaactg gaccaatctg actataaagt 1680 gtgatgttta catagagacc cctgacacag gaggtgtgtt cattgcagga agagtaaata 1740 aaggtggtat tttgattaga agtgccagag gaattttctt ctggattttt gcaaatggat 1800 cttacagggt tacaggtgat ttagctggat ggattatata tgctttagga cgtgttgaag 1860 ttacagcaaa aaaatggtat acactcacgt taactattaa gggtcatttc gcctctggca 1920 tgctgaatga caagtctctg tggacagaca tccctgtgaa ttttccaaag aatggctggg 1980 ctgcaattgg aactcactcc tttgaatttg cacagtttga caactttctt gtggaagcca 2040 cacgctaata cttaacaggg catcatagaa tactctggat tttcttccct tctttttggt 2100 tttggttcag agccaattct tgtttcattg gaacagtata tgaggctttt gagactaaaa 2160 ataatgaaga gtaaaagggg agagaaattt atttttaatt taccctgtgg aagattttat 2220 tagaattaat tccaagggga aaactggtga atctttaaca ttacctggtg tgttccctaa 2280 cattcaaact gtgcattggc cataccctta ggagtggttt gagtagtaca gacctcgaag 2340 ccttgctgct aacactgagg tagctctctt catcttattt gcaagcggtc ctgtagatgg 2400 cagtaacttg atcatcactg agatgtattt atgcatgctg accgtgtgtc caagtgagcc 2460 agtgtcttca tcacaagatg atgctgccat aatagaaagc tgaagaacac tagaagtagc 2520 tttttgaaaa ccacttcaac ctgttatgct ttatgctcta aaaagtattt ttttattttc 2580 ctttttaaga tgatactttt gaaatgcagg atatgatgag tgggatgatt ttaaaaacgc 2640 ctctttaata aactacctct aacactattt ctgcggtaat agatattagc agattaattg 2700 ggttatttgc attatttaat ttttttgatt ccaagttttg gtcttgtaac cactataact 2760 ctctgtgaac gtttttccag gtggctggaa gaaggaagaa aacctgatat agccaatgct 2820 gttgtagtcg tttcctcagc ctcatctcac tgtgctgtgg tctgtcctca catgtgcact 2880 ggtaacagac tcacacagct gatgaatgct tttctctcct tatgtgtgga aggaggggag 2940 cacttagaca tttgctaact cccagaattg gatcatctcc taagatgtac ttacttttta 3000 aagtccaaat atgtttatat ttaaatatac gtgagcatgt tcatcatgtt gtatgattta 3060 tactaagcat taatgtggct ctatgtagca aatcagttat tcatgtaggt aaagtaaatc 3120 tagaattatt tataagaatt actcattgaa ctaattctac tatttaggaa tttataagag 3180 tctaacatag gcttagctac agtgaagttt tgcattgctt ttgaagacaa gaaaagtgct 3240 agaataaata agattacaga gaaaattttt tgttaaaacc aagtgatttc cagctgatgt 3300 atctaatatt ttttaaaaca aacattatag aggtgtaatt tatttacaat aaaatgttcc 3360 tactttaaat atacaattca gtgagttttg ataaattgat atacccatgt aaccaacact 3420 ccagtcaagc ttcagaatat ttccatcacc ccagaaggtt ctcttgtata cctgctcagt 3480 cagttccttt cactcccaat tgttggcagc cattgatagg aattctatca ctataggtta 3540 gttttctttg ttccagaaca tcatgaaagc ggcgtcatgt actgtgtatt cttatgaatg 3600 gtttctttcc atcagcataa tgatttgaga ttggtccatg ttgtgtgatt cagtggtttg 3660 ttccttctta tttctgaaga gttttccatt gtatgaatat accacaattt gtttcctccc 3720 caccagtttc tgatactaca attaaaactg tctacattta c 3761 SEQ ID NO.: 2 Met Thr Ala Ala Ala Gly Ser Ala Gly Arg Ala Ala Vai Pro Leu Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ala Pro Gly Gly Ala Tyr Vai Leu Asp Asp Ser Asp Gly Leu Gly Arg Glu Phe Asp Gly He Gly Ala Vai Ser Gly Gly Gly Ala Thr Ser Arg Leu Leu Vai Asn Tyr Pro Glu Pro Tyr Arg Ser Gin lie Leu Asp Tyr Leu Phe Lys Pro Asn Phe Gly Ala Ser Leu His lie Leu Lys Vai Glu lie Gly Gly Asp Gly Gin Thr Thr Asp Gly Thr Glu Pro Ser His Met His Tyr Ala Leu Asp Glu Asn Tyr Phe Arg Gly Tyr Glu Trp Trp Leu Met Lys Glu Ala Lys Lys Arg Asn Pro Asn lie Thr Leu lie Gly Leu Pro Trp Ser Phe Pro Gly Trp Leu Gly Lys Gly Phe Asp Trp Pro Tyr Vai Asn Leu Gin Leu Thr Ala Tyr Tyr Vai Vai Thr Trp lie Vai Gly Ala Lys Arg Tyr His Asp Leu Asp lie Asp Tyr lie Gly lie Trp Asn Glu Arg Ser Tyr Asn Ala Asn Tyr lie Lys lie Leu Arg Lys Met Leu Asn Tyr Gin Gly Leu Gin Arg Vai Lys lie lie Ala Ser Asp Asn Leu Trp Glu Ser He Ser Ala Ser Met Leu Leu Asp Ala Glu Leu Phe Lys Vai Vai Asp Vai lie Gly Ala His Tyr Pro Gly Thr His Ser Ala Lys Asp Ala Lys Leu Thr Gly Lys Lys Leu Trp Ser Ser Glu Asp Phe Ser Thr Leu Asn Ser Asp Met Gly Ala Gly Cys Trp Gly Arg lie Leu Asn Gin Asn Tyr lie Asn Gly Tyr Met Thr Ser Thr lie Ala Trp Asn Leu Vai Ala Ser Tyr Tyr Glu Gin Leu Pro Tyr Gly Arg Cys Gly Leu Met Thr Ala Gin Glu Pro Trp Ser Gly His Tyr Vai Vai Glu Ser Pro Vai Trp Vai Ser Ala His Thr Thr Gin Phe Thr Gin Pro Gly Trp Tyr Tyr Leu Lys Thr Vai Gly His Leu Glu Lys Gly Gly Ser Tyr Vai Ala Leu Thr Asp Gly Leu Gly Asn Leu Thr lie lie lie Glu Thr Met Ser His Lys His Ser Lys Cys lie Arg Pro Phe Leu Pro Tyr Phe Asn Vai Ser Gin Gin Phe Ala Thr Phe Vai Leu Lys Gly Ser Phe Ser Glu lie Pro Glu Leu Gin Vai Trp Tyr Thr Lys Leu Gly Lys Thr Ser Glu Arg Phe Leu Phe Lys Gin Leu Asp Ser Leu Trp Leu Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Thr Leu Ser Leu His Glu Asp Glu Leu Phe Thr Leu Thr Thr Leu Thr Thr Gly Arg Lys Gly Ser Tyr Pro Leu Pro Pro Lys Ser Gin Pro Phe Pro Ser Thr Tyr Lys Asp Asp Phe Asn Vai Asp Tyr Pro Phe Phe Ser Glu Ala Pro Asn Phe Ala Asp Gin Thr Gly Vai Phe Glu Tyr Phe Thr Asn lie Glu Asp Pro Gly Glu His His Phe Thr Leu Arg Gin Vai Leu Asn Gin Arg Pro lie Thr Trp Ala Ala Asp Ala Ser Asn Thr lie Ser lie lie Gly Asp Tyr Asn Trp Thr Asn Leu Thr lie Lys Cys Asp Vai Tyr lie Glu Thr Pro Asp Thr Gly Gly Vai Phe lie Ala Gly Arg Vai Asn Lys Gly Gly lie Leu lie Arg Ser Ala Arg Gly lie Phe Phe Trp lie Phe Ala Asn Gly Ser Tyr Arg Vai Thr Gly Asp Leu Ala Gly Trp lie lie Tyr Ala Leu Gly Arg Vai Glu Vai Thr Ala Lys Lys Trp Tyr Thr Leu Thr Leu Thr lie Lys Gly His Phe Ala Ser Gly Met Leu Asn Asp Lys Ser Leu Trp Thr Asp lie Pro Vai Asn Phe Pro Lys Asn Gly Trp Ala Ala lie Gly Thr His Ser Phe Glu Phe Ala Gin Phe Asp Asn Phe Leu Vai Glu Ala Thr Arg

[00110] Deve ser observado que as modalidades e características descritas no contexto de um dos aspectos da presente invenção também se aplicam aos outros aspectos da presente invenção.

[00111] Todas as referências de patente e de não patente citadas no presente pedido, são por meio deste aqui incorporadas em suas totalidades a título de referências.

[00112] A invenção será agora descrita com mais detalhes nos seguintes exemplos não limitadores.

Exemplos

[00113] Um processo a jusante (DSP, downstream process) para a purificação de galactocerebrosideo-β-galactosidase recombinante de humano (rhGALC) que resulta em um produto final que atende às exigências de qualidade e de pureza para estudos em animais foi desenvolvido e testado em escala piloto. O processo consiste em três etapas cromatográficas e uma etapa de formulação por UFDF. Neste estudo colheita nova e clarificada de um biorreator em batelada de 20 L foi purificada com um processo otimizado em escala piloto para produzir rhGALC para estudos em animais e por exemplo protocolos de tratamento de seres humanos. O protocolo é resumido na figura 1. Exemplo 1 Equipamentos, materiais, tampões e métodos Equipamentos Sistema cromatográfico: • Biological Duo-Flow™ aprimorado com um Maximizer 80 (BioRad). Bomba peristáltica: • MasterFlex L/S modelo 77200-60 (Cole-Parker Instrument Company) Sistema de filtração de fluxo tangential: • “Pellicon® 2 Mini filter holder” com manômetros (Millipore) e bomba peristáltica Watson Marlow SciQ 323, tubulação com 6 mm I0. Agitador magnético: • MR 3001 k (Heidolph) Balanças: • EA35EDE-I máximo 35 kg (Sartorius) • BP1200 máximo 1.200 g (Sartorius) Colunas: • Index 70/500 (GE Healthcare) Bancada com fluxo de ar laminar (LAF bench, Laminar AirFlow bench): • LaminarAir (Holten) Resinas, filtros e recipientes Filtro de colheita: • Millistak+® Pod C0HC 0,054 m2 (Millipore) Resinas cromatográficas: Etapa de captura: • Capto™ Blue (high sub) (GE Healthcare) Etapa intermediária: • Capto™ Adhere (GE Healthcare) Etapa de refinamento: • Toyopearl Ether-650M (Tosoh) Cassete de UFDF: • Pellicon 2 MINI 30 K (MWCO de 30 kDa, V-screen (câmara de alimentação do tipo V), de 0,1 m2, n° de catálogo P2B030V01, Millipore) Filtração esterilizante: • PES 0,22 μm, diâmetro de 75 mm, (NALGENE n° de catálogo 595-4520) Recipientes para o produto final: • Garrafas estéreis de 30 mL (Nalgene) • Frascos estéreis criogênicos de 1,8 mL (Nalgene)

Tampões

[00114] Os tampões foram preparados a partir de compostos químicos de qualidade p.a. e água de qualidade Milli-Q. Os tampões foram filtrados através de filtro de 0,22 μm e armazenados à temperatura ambiente durante o máximo de 5 dias. As receitas de preparação são mostradas nas tabelas 1 a 4 para a etapa respectiva.

[00115] Tampões para Capto™ Blue: a) Condicionamento: fosfato de sódio 40 mM, pH 6,1±0,1 b) Equilibração: fosfato de sódio 20 mM, Tween 80 (t-80) 0,1% (p:p), glicerol 5% volume:volume (v:v), pH 6,1±0,1 c) Lavagem: fosfato de sódio 100 mM, NaCl 1,5 M, glicol propilênico (1,2-propanodiol) 10% (v:v), isopropanol (IPA) 5% (v:v), t-80 0,2% (p:p), pH 7,0 ±0,1 d) Lavagem 2: Tampão de equilibração e) Tampão de eluição: fosfato de sódio 20 mM, glicol propilênico 50% (v:v), t-80 0,5%, NaCl 1 M, pH 6,5±0,1 f) Mistura de eluição: fosfato de sódio 20 mM, NaCl 0,15 M, t- 80 1,3%, pH 6,1±0,1 Tabela 1: Preparação de tampão por L para a etapa de captura: “Capto Blue (high sub)”

[00116] Tampões para Capto™ Adhere: a) Tampão de equilibração: fosfato de sódio 20 mM, NaCl 0,15 M, t-80 0,05% (p:p)), pH 6,1±0,1 b) Tampão de lavagem 1: acetato de sódio 200 mM, NaCl 1 M, IPA 5% (v:v), t-80 0,5% (p:p), pH 4,7±0,1 c) Tampão de lavagem 2: acetato de sódio 10 mM, t-80 0,1% (p:p), pH 4,7±0,1 d) Tampão de lavagem 3: 50% de tampão de lavagem 2 e 50% de tampão de eluição e) Tampão de eluição: acetato de sódio 10 mM, NaCl 300 mM, t-80 0,1% (p:p), IPA 5% (v:v), glicol propilênico 40% (v:v), pH 4,55±0,1 f) Mistura de eluição tampão: fosfato de sódio 140 mM, t-80 0,0005% (p:p), pH 6,5±0,2 Tabela 2: Preparação de tampão por L para a etapa intermediária: “Capto Blue Adhere”

[00117] Tampões para “Toyopearl Ether-650M”: a) Tampão de condicionamento: NH4AC 3,3 M, NH4CI 2,6 M, t-80 0,1% (p:p), pH 6,1±0,1 b) Tampão de equilibração: NH4AC 1,6 M, NH4CI 1,2 M, fosfato de sódio 50 mM, t-80 0,0005% (p:p) pH 6,4±0,1 c) Lavagem 1: NH4Ac 3,3 M, N LCl 2,3 M, t-80 0,5% (p:p), pH 6,5 d) Lavagem 2: Tampão de equilibração e) Lavagem 3: 70% de tampão de equilibração e 30% de tampão de eluição f) Eluição: fosfato de sódio 50 mM, NaCl 140 mM, t-80 0,0005% (p:p), pH 6,4±0,1 Tabela 3: Preparação de tampão por L para a etapa de refinamento: “Toyopearl Ether-650M”

[00118] Tampão para UFDF: Tampão de equilibração e diafiltração: fosfato de sódio 3,7 mM, NaCl 150 mM, glicina 5 mM, manitol 10 mM, Tween 80 0,0005% (p:p), pH 6,2+0,15. Tabela 4: Preparação de tampão por L e concentração para a etapa de UFDF.

- Tampões para limpeza em local: - Tampão para limpeza Capto Blue, Capto Adhere e UFDF: NaOH 1 M - Tampão para limpeza Toyopearl Ether: NaOH 0,5 M - Tampão para neutralização todas as etapas: fosfato de sódio 140 mM, pH 6,6±0,2 - Tampão para armazenamento Blue, Adhere, Ether: etanol 20% - Tampão para armazenamento cassete de UFDF: NaOH 0,1 M Tabela 5: Preparação de tampão por L de tampões para limpeza em local e de armazenamento

Análise em processo

[00119] Atividade enzimática foi medida pelo procedimento 65; ensaio HNG para analisar galactocerebrosidase (GALC). O padrão local de rhGALC, StG01, é usado para a preparação de uma curva padrão.

[00120] Concentração de proteína: a concentração de proteína foi medida pelo procedimento 75; a determinação de proteína de rhGALC com o uso do ensaio de proteínas de 600 nm “Pierce 660 nm Protein Assay”. Diluições do padrão local StG02 conforme a curva padrão. Concentração de proteína de StG02 foi determinada externamente por análise de aminoácidos (AAA) (Centro de Análise de Aminoácidos, Universidade de Upsala, Suécia). Para informação A280 foi medida dividindo-se a absorbância observada pelo coeficiente de extinção teórico 2,5 de GALC de humano.

[00121] Atividade específica foi calculada dividindo-se a atividade enzimática pela concentração de proteína de rhGALC.

[00122] Identidade foi analisada pelo procedimento 70, análise por transferência de Western (Western Blot) de galactocerebrosidase recombinante de humano (rhGALC). Um anticorpo policlonal, purificado em “Protein A Sepharose”, gerado contra o padrão local StG02 foi usado para detecção.

[00123] Focalização isoelétrica (IEF, IsoElectric Focusing) foi analisada pelo procedimento 74 em gel Novex IEF de pH 3-10 para avaliar o ponto isoelétrico de rhGALC. O produto final foi comparado com o padrão local de rhGALC, StG03, como uma medição adicional de identidade.

[00124] Pureza foi analisada pelo procedimento 69 com SDS-PAGE (4-12% Bis-Tris NuPAGE, tampão MOPS [3-(N-morpholino)propanesulfonic acid]) corado com Azul Coloidal.

[00125] Impurezas foram analisadas pelo procedimento 43; método de ELISA para a determinação de proteínas de célula hospedeira de CHO (Chinese Hamster Ovary, ovário de hamster chinês).

[00126] Concentração de Tween foi quantificada pelo procedimento 73 com um método de RP-HPLC.

[00127] Native PAGE foi realizada conforme uma medição de formações de rhGALC para informação. A análise foi realizada de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen).

[00128] Osmolalidade (osmômetro Vapro) e pH (Metrohm) foram medidos no produto final TG1106.

[00129] Composição de carboidratos foi medida pela instrução 25 (outras diluições do padrão) por HPLC com detecção por fluorescência de monossacarídeos liberados marcados com 2-AA.

Colheita:

[00130] Após o fechamento do biorreator, acetato de sódio, de pH 5, é adicionado à colheita dentro do biorreator para manter o pH <7, que é ideal para a enzima. A colheita com pH estabilizado é bombeada para fora do biorreator através de filtros de profundidade com tampão, para remover as células. Os filtros são enxaguados com tampão de condicionamento após a filtração. A razão entre a mistura final de colheita e o tampão de condicionamento deve ser ~2:1 (p:p). Informação geral sobre as condições de processo:

[00131] A equilibração, o carregamento e a lavagem de equilibração das etapas cromatográficas são realizados com uma bomba peristáltica com vazão máxima de 100 mL/min, correspondendo a 150 cm/h. As partes restantes dos experimentos são realizadas com o sistema Biological Duo-Flow aprimorado com Maximizer 80, com uma vazão máxima de 80 mL/min, correspondendo a 125 cm/h. As vazões podem ser ajustadas se é usado um sistema cromatográfico mais apropriado. Entretanto, tampões com glicol propilênico (PG, Propylene Glycol) devem ser utilizados com a vazão indicada.

[00132] Todas as etapas cromatográficas são realizadas no modo de ligação e contêm várias etapas de lavagem. Concentração alta de PG é necessária para a eluição da rhGALC hidrofóbica das primeiras duas etapas no processo. Para manter a atividade enzimática o produto necessita ser coletado em recipientes preenchidos destas etapas. Não é necessário solvente orgânico para a eluição na etapa de refinamento.

[00133] Todos os tampões, exceto o tampão de condicionamento para Capto Blue, contêm detergente (Tween 80), que parece ser necessário para manter a atividade enzimática de rhGALC. O meio de colheita contém Pluronic, que substitui Tween no tampão de condicionamento para Capto Blue. Outro motivo para omitir Tween no tampão de condicionamento é que ele poderia causar opalescência da colheita após ~ > 6 horas de armazenamento à temperatura ambiente.

Capto Blue

[00134] “Capto™ Blue” é um meio de bioprocesso por afinidade que se liga por intermédio de interações aromáticas e eletrostáticas.

[00135] A colheita condicionada é carregada na coluna de Capto Blue dentro do período de tempo de 24 horas após a clarificação. A partir de um biorreator de 20 L são necessários 3 ciclos de Capto Blue em escala piloto (740 mL). A coluna é lavada com tampão de equilibração e um tampão de lavagem contendo 10% de glicol propilênico (PG) e 5% de isopropanol (IPA). A eluição é realizada com um tampão contendo 50% de PG para dentro de um recipiente preenchido. A coleta para dentro de um recipiente enchido com o tampão de mistura de eluição tem três propósitos: 1) Decrescer a concentração de PG para manter a estabilidade enzimática de rhGALC. 2) Atuar como uma etapa de inativação de vírus dedicada. A concentração final de detergente foi 1% e o acervo de produto foi armazenado durante >16 horas à temperatura ambiente. 3) Condicionar o acervo de produto para a etapa seguinte no DSP (downstream process, processo a jusante), Capto Adhere.

[00136] Conforme descrito acima o produto Blue pode ser coletado para dentro de um tampão de mistura de eluição. A concentração final de Tween é 1% e o acervo é armazenado durante16-24 horas à temperatura ambiente como uma etapa de inativação de vírus dedicada.

Capto Adhere

[00137] “Capto™ Adhere” é um meio de bioprocesso de troca aniônica forte com funcionalidades multimodais. Se liga por intermédio de interações iônicas, ligação de hidrogênio e interação hidrofóbica.

[00138] O produto de Capto Blue é carregado em três ciclos sequenciais após o tempo máximo de retenção de 4 dias na coluna de Capto Adhere. O período de tempo de retenção inicia com 18-20 horas à temperatura ambiente como uma etapa de inativação viral. No caso de tempo de retenção mais longo o acervo de produto é movido para 5°C±3°C durante o tempo restante. Ele é movido de volta para a temperatura ambiente 8 a 15 horas antes da operação de acumulação à temperatura ambiente. O acervo de produto é carregado em pH 6,1. O pH é decrescido rapidamente para 4,7 por uma lavagem em força iônica alta e com IPA seguida por uma lavagem em força iônica baixa. A eluição é realizada com tampão em pH 4,55 contendo 40% de PG para dentro de um recipiente preenchido para aumentar o pH e decrescer a concentração de PG para manter a atividade enzimática de rhGALC.

Toyopearl Ether

[00139] “Toyopearl Ether-650M” é um polímero metacrílico (de tamanho de partícula de 65 μm) com elevadas estabilidades mecânica e química. A resina Ether tem a hidrofilicidade mais alta na série Tosoh dos ligantes de interação hidrofóbica e é projetada para a purificação de proteínas muito hidrofóbicas.

[00140] O produto proveniente de Capto Adhere é armazenado durante o máximo de 24 horas à temperatura ambiente ou 4 dias a 5°C±3°C. Se armazenado frio ele é movido de volta para a temperatura ambiente 8 a 15 horas antes da operação para acumulação à temperatura ambiente.

[00141] É misturado 1:2,5 (p:p) com o tampão de condicionamento da etapa de resina Ether (três ciclos) contendo concentrações altas de acetato de amônio, de cloreto de amônio e de Tween. A coluna de Ether é equilibrada com um tampão com concentração de Tween 200x mais baixa em comparação com o início condicionado. Após o carregamento a colune é lavada com tampão de equilibração. A etapa de lavagem seguinte aumenta as concentrações de Tween e de sal. Ela é seguida por uma lavagem demorada com o tampão de equilibração para decrescer as concentrações de Tween de novo e uma lavagem com uma mistura de tampões de equilibração e de eluição para decrescer as concentrações de sais de amônio. A eluição é realizada com um tampão fosfato de sódio contendo teor baixo de Tween (0,0005%) e de cloreto de sódio, em pH 6,4. Filtração de vírus em filtro Planova 15N

[00142] Em escala de produção, a etapa de refinamento será seguida com nanofiltração através de filtro Planova 15N como uma etapa de remoção viral dedicada. UFDF

[00143] Os três acervos de produto de refinamento são reunidos e formulados em um ciclo de ultrafiltração/diafiltração (UFDF) com filtração de fluxo tangential (TFF) com o uso de uma membrana de poli(éter-sulfona) Pellicon® com corte de peso molecular (MWCO) de 30 kDa. As três câmaras de alimentação são do tipo V com canais abertos e a área do cassete é de 0,1 m2.

[00144] A bomba é ajustada para 230 rpm e a pressão de transmembrana (TMP, TransMembrane Pressure) é 50 kPa (60 kPaentrada/40 kPasaída). A membrana é equilibrada com tampão de formulação e o primeiro volume de tampão é trocado por diluição seguida por concentração (UF) e 7 vezes diafiltração (DF). São trocados, no total, oito volumes de tampão. Filtração e enchimento

[00145] O produto da UFDF (retentado) é filtrado através de um filtro de PES de 0,22 μm sob condição asséptica em uma bancada LAF. Recipientes estéreis de vários volumes (0,25 a 20 mL por frasco/garrafa) são cheios com o produto final. O produto final é chamado de TG1106 e é armazenado congelado a -80°C±10° C.

Exemplo 2 Sumário dos resultados

[00146] O rendimento total do processo a jusante (downstream process, DSP) a partir da colheita clarificada proveniente do biorreator de 20 L para o produto final foi 74% com base na atividade.

[00147] A atividade total em ~19,5 L de colheita clarificada foi 23 milhões de Unidades. O rendimento total no produto final, TG1106, foi 17 milhões de Unidades ou 1,0 g de rhGALC pura.

Rendimento com base na atividade, e condições

[00148] O rendimento total (74%) foi calculado a partir da colheita clarificada até o produto final. A razão foi que o processo de clarificação ainda não havia sido decidido e não era parte deste estudo.

[00149] As etapas cromatográficas foram realizadas em três ciclos. Os produtos das três etapas de refinamento foram reunidos e formulados em uma UFDF. O produto da UFDF foi esterilmente filtrado e divido em recipientes. O rendimento, baseado em atividade % para cada etapa e ciclo é mostrado na figura 2. A atividade total da colheita clarificada até o produto final é mostrada na figura 3.

[00150] O rendimento médio para a etapa de captura, Capto Blue, foi 84%±8,1%.

[00151] O rendimento médio para a etapa intermediária, Capto Adhere, foi 87%±3,5%.

[00152] O rendimento médio para a etapa de refinamento, Toyopearl Ether, foi 76%±0,6%*

[00153] O rendimento para a etapa de UFDF foi 117%.

[00154] O rendimento para a filtração esterilizante final foi 102%. Resultados das análises

[00155] Amostras em processo e produto final foram analisados por um conjunto de métodos analíticos conforme descritos acima. A tabela abaixo resume os resultados analíticos do produto final TG1106.

Exemplo 3 Identidade - Transferência de Western (Western blot)

[00156] O produto purificado foi identificado como GALC de humano por análise por transferência de Western.

[00157] As proteínas nos produtos de refinamento, no produto da UFDF e no produto final foram separadas por SDS-PAGE e eletroforeticamente transferidas para uma membrana de poli(difluoreto de vinilideno) (PVDF, polyvinylidene difluoride). rhGALC foi detectada com um anticorpo policlonal de coelho anti-GALC gerado contra o padrão local de rhGALC, StG02. Os anticorpos haviam sido purificados em uma coluna de Protein Sepharose (GE Healthcare). Detectaram GALC de 80 kDa e também as formas processadas de GALC de 50 kDa e de 30 kDa. Uma escada de proteínas (Protein Ladder) pré-corada foi usada para verificar a transferência e para estimar o peso molecular (MW) aparente.

[00158] A figura 4 mostra uma transferência (blot) na qual a rhGALC de 80 kDa foi detectada no produto final. Não foram detectadas formas processadas nesta carga de proteínas. Os padrões locais, StG02 e StG03, foram analisados como referências. Os padrões haviam sido analisados por análise de aminoácidos e suas composições de aminoácidos foram correlacionadas com a composição teórica de GALC de humano. A figura 5 foi carregada com proteína em excesso e em adição à rhGALC de 80 kDa ambas as formas processadas de 50 kDa e de 30 kDa foram identificadas como bandas fracas. Uma banda adicional, com MW aparente de 160 kDa, foi identificada, provavelmente dímero de rhGALC que não foi totalmente dissolvido por SDS sob condições redutoras.

Exemplo 4 Focalização isoelétrica

[00159] O ponto isoelétrico do produto final TG1106 calculado foi de 6,35.

[00160] TG1106 e o padrão StG03 foram separados de acordo com a alteração em um gel de focalização isoelétrica (IEF) de pH 3-10. A eletroforese foi realizada a frio (sobre gelo) a 100V durante 1 hora, então a 200V durante 1 hora e finalmente a 500V durante 2 horas. O gel, mostrado na figura 6, foi corado com Azul Coloidal. O ponto isoelétrico (pI) calculado foi estimado em 6,35, o qual foi mais alto que o pI teórico de 5,9 de GALC. Não houve diferença entre TG1106 e StG03.

Exemplo 5 Pureza-SDS-PAGE

[00161] A pureza no produto final TG1106 foi estimada em >99%. A rhGALC processada foi estimada em <0,5%.

[00162] As amostras em processo foram separadas, principalmente de acordo com o tamanho, por eletroforese (SDS-PAGE), em um gel NuPAGE 4 a 12% Bis-Tris com tampão MOPS. A rhGALC e as impurezas potenciais foram visualizadas por Azul Coloidal. O Azul Coloidal tem uma resposta linear dinâmica que é independente do tipo de proteína, significando que desde que as concentrações de proteína sejam suficientes, ele é preferível para a estimativa do grau de pureza em comparação coma coloração com prata. O peso molecular (MW) aparente de rhGALC é 80 kDa, enquanto que as formas processadas têm pesos moleculares aparentes de 50 kDa e 30 kDa.

[00163] A figura 7 mostra varredura de amostras em processo. Conforme visto impurezas foram visualizadas após as etapas Capto Blue e Capto Adhere, enquanto que apenas rhGALC foi visualizada após a etapa Ether. A banda a ~160 kDa, pode ser possivelmente um dímero de rhGALC, porque ela também é identificada por transferência de Western (consulte também a figura 6).

[00164] Figuras 8 e 9 comparam o produto final TG1106 com o padrão local StG03 para estimativa da pureza. Nenhuma banda da carga alta de TG1106, exceto rhGALC, teve intensidade mais elevada que o StG03 mais baixo. Para a concentração mais alta de TG1106 pode ser vista uma banda estranha exatamente abaixo do dímero de rhGALC, vista em ambos os géis. Isto é mais provavelmente um artefato porque não é visto de modo algum na carga seguinte mais alta. Por causa da banda dupla estranha na carga mais alta, a pureza foi calculada a partir da banda mais alta seguinte na figura 10; 100% a 0,8% (0,14 μg/16 μg) = pureza de 99,2%. Em carga excessiva de rhGALC as formas processadas de 30 kDa e 50 kDa puderam ser visualizadas como bandas de intensidade baixa. Nenhumas destas bandas tiveram intensidade mais elevada que a banda de 80 kDa para o padrão mais baixo significando que o processamento foi <0,5%.

[00165] A banda de 160 kDa pode ser um artefato. Poderia ser que em concentração alta de rhGALC o SDS no tampão de amostra não seja suficiente para formar monômeros dos multímeros de rhGALC (consulte Native PAGE, 7.2.5). Mas se não, a estimativa poderia ser que a intensidade do “dímero” para a carga de 16 μg de TG1106 16 é similar à da banda de 80 kDa para a carga de 0,36 μg de StG03 0,36, significando ~2% desta forma no produto final.

Exemplo 6 Native PAGE

[00166] Native PAGE mostra que a formação maior de rhGALC é o dímero, mas há multímeros com até 10 moléculas de rhGALC.

[00167] Native PAGE foi realizada para informação de formações de rhGALC em pH neutro. Conforme visto na figura 10, rhGALC teve uma escada de formações. O produto final TG1106 foi comparado com o padrão local de rhGALC, StG03, e o padrão foi similar. Poderia ser que a banda mais baixa (MW aparente de 80 a 100 kDa) seria o monômero de rhGALC e a segunda banda o dímero de rhGALC, seguida pelas formações complementares de mais monômeros e/ou dímeros de rhGALC. Foram visualizadas sobre o gel até sete formas de rhGALC. O dímero de rhGALC foi o mais intenso em carga. Um estudo por microscopia eletrônica prévio verificou que há várias formas das quais a forma maior tem um diâmetro de ~20 nm, que poderia corresponder ao dímero de rhGALC.

Exemplo 7 Impurezas-HCP ELISA

[00168] As proteínas de célula hospedeira (HCP host cell proteins) CHO residuais foram quantificadas em 30 ng/mg de rhGALC no produto final TG1106.

[00169] As proteínas de célula hospedeira (HCP) de ovário de hamster chinês (CHO, Chinese hamster ovary) foram analisadas como uma medição de impurezas. Anticorpos genéricos comprados junto à Cygnus Technologies foram usados no ELISA. Os anticorpos foram gerados a partir das proteínas de célula tipicamente secretadas (3G 0016-AF) e também de proteínas intracelulares (C0016-PA) de células CHO. O padrão foi preparado a partir de HCP 10% lisada e 90% secretada das células CHO parenterais (cepa DG44).

[00170] As HCP foram medidas após as etapas de resina Ether, a etapa de UFDF e no produto final. O padrão local de rhGALC StG02, e Tox ASA foram analisados como referências.

[00171] Conforme visto na tabela 23 o processo reduziu os teores de HCP para 30 ng/mg de rhGALC no produto final TG1106. Os teores de HCP residuais foram similares no produto da etapa de resina Ether e no produto final indicando que a etapa de UFDF não removeu nenhumas HCP adicionais.

[00172] Os teores de HCP após a etapa de resina Ether, a etapa de UFDF e no produto final TG1106. StG02, StG03 e Tox ASA são referências.

Exemplo 8 Composição de monossacarídeos

[00173] O grau preliminar de glicosilação foi estimado em 7% e cada mol de rhGALC continha 2 a 3 mols de resíduos de manose-6-fosfato.

[00174] Apenas uma análise preliminar foi realizada no produto final TG1106. Ela indica que rhGALC tem ~7 % (p:p) de carboidratos. A glicosilação é mais provavelmente do tipo alta em manose.

[00175] Os dados preliminares indicam os seguintes mols de cada monossacarídeo por mol de rhGALC: Glicose-amina (GLCN):

Discussão

[00176] O processo de três etapas cromatográficas otimizado aqui descrito produziu um produto de rhGALC puro que atende as exigências de qualidade para estudos em animais e mais provavelmente também para estudos clínicos. O DNA necessita ser analisado.

[00177] O rendimento do biorreator B5:19, baseado em atividade enzimática desde a colheita clarificada até o produto final foi 74%. Tendo-se em mente que GALC é uma proteína muito hidrofóbica, este foi especialmente satisfatório.

[00178] A clarificação da colheita foi a única etapa sem rendimento aceitável. Visto que há possíveis aprimoramentos a serem avaliados, o rendimento do processo posterior DSP foi calculado da colheita clarificada e condicionada. Cerca de 20% de atividade foi perdido pela filtração profunda. Um estudo prévio indicou que TFF pôde aprimorar o rendimento da clarificação. O rendimento total, incluindo a clarificação, foi 58%.

[00179] O pI teórico de GALC é 5,9, enquanto que o pI encontrado foi 6,3. Visto que rhGALC contém M6P ácido e ácido siálico isto foi surpreendente. Experimentos, antes deste estudo, mostraram que rhGALC é muito sensível ao pH; durante períodos de armazenamento longos ela é apenas estável próxima de seu pI; pH 6,0-6,6. Teoricamente, pH próximo do pI deve ser evitado em um processo posterior DSP para evitar precipitação, mas para o processo posterior DSP de rhGALC este é a única possibilidade. O produto foi límpido em todo o processo posterior DSP e sem a tendência de opalescência. Uma explicação para o pI alto poderia ser que as formações de micelas de Tween/rhGALC alteram os aminoácidos expostos do produto predito. Tween foi incluído em todos os tampões do processo posterior DSP (exceto Tampão de Condicionamento para Capto™ Blue, no qual Tween foi substituído por Pluronic) para manter a atividade enzimática. A concentração mínima de Tween para manter a estabilidade necessita ser avaliada.

[00180] As eluições de ambas as etapas de captura e intermediária foram complicadas. Glicol propilênico (PG) foi um pré-requisito para ambos os tampões de eluição. Em adição, outros aditivos e otimização cuidadosa dos tampões foram necessários para rendimento ideal. Uma desvantagem poderia ser que os contaminantes elevadamente higroscópicos pudessem coeluir com a rhGALC. Prosaposina, uma proteína hidrofóbica de 70 kDa, foi identificada (por transferência de Western com um anticorpo anti-saponina A) como contaminante após a etapa de captura e a etapa intermediária. Concentração alta de PG não é ótima para a atividade enzimática de rhGALC e dessa forma a colheita foi em recipientes preenchidos.

[00181] Alguns comentários adicionais das etapas do processo:

[00182] A etapa de captura, Capto™ Blue, estabilizou a enzima e removeu a cor do meio, que foi seu objetivo principal. De importância primordial para o rendimento foi a preparação do tampão de eluição de modo correto. Ele precisa conter 50% (v:v) de glicol propilênico, o que corresponde a 521 g/L de tampão.

[00183] A etapa intermediária, Capto™ Adhere, removeu a maior parte dos contaminantes. Condições ácidas foram necessárias para a eluição. Para evitar precipitação da proteína foi importante alterar as condições ácidas de modo rápido, por um tampão com força iônica alta. O tampão foi então trocado por um tampão ácido com força iônica baixa. As rações foram que as impurezas adicionais foram removidas e para garantir que o produto eluído fosse ácido, mas com força iônica baixa para haver a capacidade para mudar rapidamente o pH de volta para >6 pela colheita para dentro de um recipiente preenchido com o tampão de pH 6,5.

[00184] “Toyopearl Ether” combinou um rendimento suficiente com o uso de tampões aquosos, sem nenhuns solventes orgânicos como PG e IPA, com a possibilidade de remover as HCP finais com características hidrofóbicas. Uma vantagem foi que a eluição com rendimento aceitável foi possível com um tampão fosfato com cloreto de sódio. Uma desvantagem foi que concentrações extremas de sal foram necessárias para a ligação de rhGALC. Um volume grande de tampão de condicionamento foi necessário, tornando longo o tempo de carregamento.

[00185] Esta etapa foi eficaz na separação de rhGALC dos contaminantes com características similares às de rhGALC. De importância para a eliminação eficiente dos contaminantes foi a alteração repetida, mas em concentrações de Tween e de sal, o que poderia ser descrito como ciclos de lavagem e enxágue. Prosaposina não pôde ser identificada após a etapa de resina Ether.

[00186] Duas etapas de remoção/inativação viral dedicadas são parte do processo em escala de produção. Nenhuns experimentos de inoculação de vírus foram realizados, mas em relação ao rendimento e ao fluxo as etapas pareceram promissoras.

[00187] Uma etapa de inativação com detergente foi combinada com a eluição da etapa de captura. A concentração alta de Tween não teve influência negativa sobre a ligação à coluna intermediária e a atividade enzimática permaneceu após o armazenamento à temperatura ambiente durante 24 horas (também se combinado com armazenamento durante 3 dias a +5°C). O plano é ter uma etapa de filtração de vírus, com filtro Planova 15N, após a etapa com resina Ether. Isto foi verificado como factível em um estudo prévio e não foi repetido. Estimativa em escala grande preliminar calcula que 80 L de produto podem ser filtrados através de filtro Planova 15N de 1 m2 em ~5 horas.

[00188] UFDF, com um filtro de MWCO de 30 kDa de V-screen (câmara de alimentação do tipo V), foi usada para formulação e concentração após a etapa de refinamento. O filtro de V-screen (câmara de alimentação do tipo V), com canais abertos, está apenas disponível em escala piloto (0,1 m2) o que exige quantidades grandes de produto para estudos de otimização. As condições foram modificadas em graus pequenos com base nos três experimentos de UFDF no estudo prévio. Uma desvantagem da UFDF poderia ser que o Tween se acumula. Os produtos da etapa de resina Ether foram lavados e eluídos com tampão contendo apenas 0,0005% de Tween. Foi difícil quantificar a quantidade de Tween no produto da etapa de resina Ether, mas uma estimativa foi ~0,003%. O tampão de formulação/UFDF continha 0,0005% de Tween. Após troca de 8 volumes de tampão e concentração de ~7 vezes, a concentração de Tween foi ~0,025%. O produto da UFDF foi facilmente filtrado em filtro de 0,22 μm sem perda de produto no produto final.

[00189] Os dados preliminares indicam que esta concentração de Tween em combinação com os outros componentes do tampão de formulação é ótima para manter a estabilidade de rhGALC durante armazenamento de longo tempo a +5°C, -20°C, -80 C. É possível secar por congelamento o produto, se a concentração de manitol for aumentada para 250 mM.

[00190] SDS-PAGE seguida por coloração com Azul Coloidal mostrou um produto final puro; >99%. As formas de 30 kDa e de 50 kDa processadas de rhGALC puderam ser vistas como bandas menores e foram estimadas em <0,5%. A proteína visualizada mais intensa (~2%) além da forma de rhGALC de 80 kDa foi uma forma de rhGALC de 160 kDa vista apenas se concentração alta de rhGALC foi misturada com o tampão de amostra para SDS-PAGE. A análise por transferência de Western verificou que a proteína continha rhGALC, talvez como dímero, mas não suficientemente dissolvida por SDS sob condições redutoras. Talvez este “dímero” fosse apenas um artefato. Native PAGE, em pH neutro, indicou que rhGALC tem várias formações, desde monômeros até formações de multímeros de rhGALC de ~10 moléculas. A fração mais comum pareceu ser o dímero.

Conclusão e sumário

[00191] GALC recombinante de humano, expressada em células CHO, foram cultivadas em um biorreator de 20 L no Instituto Real de Tecnologia, Estocolmo, Suécia.

[00192] 19,5 L de colheita foram purificados para 17 milhões de Unidades ou 1,0 g de rhGALC pura em um processo posterior consistindo em três etapas cromatográficas; Capto Blue, Capto Adhere e Toyopearl Ether, todas funcionando no modo de ligação. Uma etapa de inativação de vírus consistindo em incubação durante 16 a 24 horas à temperatura com 1% de Tween 80 foi realizada após a etapa de Capto Blue. O produto foi formulado por filtração de fluxo tangencial e esterilmente filtrado para o produto final TG1106.

[00193] A colheita foi estabilizada pela adição de acetato de sódio ao biorreator antes da clarificação por filtração profunda e condicionamento para ligação à coluna de captura, Capto Blue. A colheita condicionada foi carregada na coluna Capto Blue de 730 mL em três ciclos realizados durante 24 horas. O produto foi eluído com um tampão contendo 50% de glicol propilênico 50% para dentro de um tampão de “três propósitos” para reduzir a concentração de glicol propilênico, para aumentar a concentração de Tween como uma etapa de inativação de vírus dedicada e condicionamento para início da etapa seguinte. O início condicionado foi carregado em coluna de Capto Adhere de 730 mL em três ciclos sequenciais. O produto foi eluído com pH ácido e glicol propilênico para dentro de um tampão que reduziu a concentração de glicol propilênico e aumentou o pH para manter a atividade. Após misturação adicional com um tampão contendo acetato de amônio e cloreto de amônio, o início condicionado foi carregado na coluna de Toyopearl Ether de 540 mL em três ciclos sequenciais. O produto foi eluído para dentro de um tampão fosfato contendo cloreto de sódio e uma concentração baixa de Tween. O plano é incluir uma etapa de filtração de vírus após a etapa de refinamento, mas isto foi excluído neste estudo. Os produtos de refinamento foram reunidos, o tampão foi trocado e concentrados por UFDF para um tampão de formulação ideal para armazenamento de longa duração de rhGALC pura. O produto da UFDF foi esterilmente filtrado em produto final.

[00194] O produto final foi analisado por um conjunto de métodos analíticos. A concentração de proteína é2,5 mg/mL e a atividade enzimática é 42,5 kU/mL, resultando em uma atividade específica de 16,9 kU/mg. A pureza estimada é >99%. HCP residuais são 30 ng/mg de rhGALC. O produto final é límpido e incolor.

[00195] Concluindo, o novo processo posterior DSP otimizado teve a escala aumentada com sucesso para a escala piloto resultando em um rendimento de 74%, com base na atividade. O produto final TG1106 atende às exigências de qualidade para estudos em animais.

Exemplo 9 Exemplos com separação iônica:

[00196] A separação iônica foi testada conforme descrito abaixo com resultados satisfatórios. 1). “Mustang Q (MQ)” é uma membrana descartável com suporte aniônico. Foi testada em comparação com o processo atual no modo de fluxo direto (impurezas como DNA e proteínas de célula hospedeira se ligam à membrana e GALC flui diretamente). Foi testada quer antes da etapa de resina Ether quer após a etapa de UFDF (etapa de formulação). Também foi testada em linha com Capto Blue, também no modo de fluxo direto. a) quando incluída após a etapa de resina Ether: Equilibração de MQ foi realizada com fosfato de sódio 3,7mM, glicina 5mM, manitol 10mM, NaCl 0,075 M, Tween 80 0,0005%, pH 6,2. O produto foi diluído 1:1 (v:v) com fosfato de sódio 3,7mM, glicina 5mM, manitol 10mM, Tween 80 0,0005%, pH 6,2 (ou o mesmo tampão com NaCl 0,15 M) antes de sua passagem através de MQ. b) quando incluída após a etapa de UFDF. MQ foi equilibrada com fosfato de sódio 3,7mM, NaCl 0,2 M, glicina 5mM, manitol 10mM, Tween 80 0,0005%, pH 6,2. O produto foi eluído com NaCl 1 M até que a condutividade fosse 20 mS/cm (aproximadamente 1 volume de produto : 0,2 volume de NaCl 1 M) antes que o produto passasse através de MQ. Antes da filtração esterilizante o produto foi diluído com o tampão de formulação sem NaCl para trazer a condutividade de volta para 15 mS/cm (NaCl 0,15 M).

[00197] Esboço do processo: Colheita clarificada Capto Blue Inativação de vírus Capto Adhere Toyopearl Ether Alternativa a) Mustang Q UFDF Alternativa b) Mustang Q filtro de 0,22 μm 2) Uma resina de troca aniônica forte (AIEX), como Capto Q, Giga Cap Q, Q FF, pode ser incluída no processo posterior no modo de ligação. Também é possível incluir uma resina de troca aniônica fraca como Capto DEAE e DEAE FF mas foi verificado que as impurezas restantes são elevadas. Pode ser usada antes ou depois da etapa de refinamento (interação hidrofóbica (HIC)).

[00198] Procedimento 1: Esboço do processo: Colheita clarificada Capto Blue Inativação de vírus a) A inativação de vírus com 15% de IPA e 1% de t-80. Observação: alguma inativação quando IPA é usado. Capto Adhere Macroprep Methyl a) Equilibrada (Eq) com (NH4)2SO4 0,4-0,6 M, glicerol 5%, Tween 80 (t-80) 0,1%, pH 6,5. Produto aderido condicionado com NaPi 20 mM, glicerol 5%, (NH4)2SO4 0,8-1,2 M, pH 6,5 (1:1) e carregamento. b) Lavagem 1: NaPi 0,6 M, t-80 0,1%, pH 6,5. c) Lavagem 2: NaPi 20 mM, NaCl 15 mM, t-80 0,1%, Giga Cap Q a) Equilibrada com MES 40 mM, NaCl 15 mM, glicerol 5%, t- 80 0,1%, pH 6,5. Carregado produto da etapa de Macroprep Methyl (sem condicionamento) e lavado com tampão de equalização. Eluição: MES 40 mM, NaCl 0,7 M, glicerol 5% UFDF Procedimento 2: Esboço do processo: Colheita clarificada Capto Blue Inativação de vírus Capto Adhere Giga Q a) Equilibrada com MES 40 mM, NaCl 15 mM, t-80 0,1%, pH 6,5. Capto Adhere condicionada com NaPi 20 mM, t-80 0,1%, pH 6,5 para condutividade ~7 mS/cm. Carregada e lavada com tampão de equalização. Ether UFDF

Exemplo 10

[00199] As seguintes resinas multimodais foram testadas com resultados satisfatórios: 1) . MMC Capture (experimentos muito iniciais)

[00200] Início: pH de colheita foi ajustado para 5,6 - 6,0 com Na-Pi 400 mM (ácido). Tampão de equilibração usado: Na-Pi 20 mM, pH 5,6 - 6,0 + 0,NaCl 1 M + Tween 80 0,05% (t-80)

[00201] Tampão de lavagem usado: Na-Ac 0,95 M pH 4,9 + IPA 5%

[00202] Tampão de eluição usado: Tris-HCl 50 mM pH 9,0 + NaCl 1,0M + Glicol Propilênico 40 % + t-80 0,1%.

[00203] Resultados: A presença de enzimas foi analisada com o uso de método Dot-Blot. A enzima foi detectada em Início (+++) e em Eluição - fração1 (++). Não foi detectada enzima em fluxo direto. Análises por SDS- PAGE e HPLC foram realizadas em frações. 2) Butyl-S como 2a etapa intermediária ou como etapa de refinamento:

[00204] Início: Condicionamento para (NH4)2SO4 0,5-6 M.

[00205] Equilibração: NaPi 20 mM, (NH4)2SO4 0,5 M, glicerol 5%, t - 80 0,1% pH 6,5 Lavagem: tampão de equilibração

[00206] Eluição: NaPi 20 mM, NaAc 0,1 M, IPA 5%, t-80 0,1%, pH 7,8 3) PPG como 2a etapa intermediária (ex teste 44-47)

[00207] Início: Condicionamento para (NH4)2SO4 0,5 M e NaAc 0,5 M, pH 6,3

[00208] Equilibração: NaPi 20 mM, (NH4)2SO4 0,5 M e NaAc 0,5 M, t-80 0,0005%-0,1%, glicerol 5%, pH 6,4

[00209] Lavagem 1: NaAc 1,6 M, t-80 0,1%, pH 7,4

[00210] Lavagem 2: NaPi 0,7 M, pH 6,5

[00211] Eluição: NaPi 20 mM, glicol propilênico 30%, t-80 0,05%, pH 7,8

Exemplo 11

[00212] As seguintes combinações de resinas foram testadas com resultados satisfatórios:

[00213] Teste preliminar: média aproximada 350 ng de HCP/mg de GAL Capto Blue Capto Adhere Capto Butyl Capto DEAE

[00214] Teste 1: 240 ng de HCP/mg de GALC Capto Blue Capto Adhere Butyl-S

[00215] Teste 2: 430 ng de HCP/mg de GALC Capto Blue Capto Adhere Macro-Prep Methyl Giga Cap Q

[00216] Teste 3: 78 ng de HCP/mg de GALC Capto Blue Capto Adhere PPG

[00217] Teste 4: 50 ng de HCP/mg de GALC (mas opalescência devido à inativação de vírus com IPA+Tween)

[00218] Capto Blue Capto Adhere Butyl-S Teste 5: 193 ng de HCP/mg de GALC Filtro de Capto Blue-Mustang Q em linha Capto Adhere Ether

[00219] Teste 6: 79 de ngHCP/mg de GALC Filtro de Capto Blue-Mustang Q em linha Capto Adhere Ether

Exemplo 12 Ensaio de HNG para analisar a atividade de galactocerebrosidase (GALC) Princípio

[00220] Galactocerebrosidase (GALC) é responsável pelo catabolismo lipossomal de galactocerebrosídeo (= galactosilceramida), um lipídeo principal em mielina, células renais e epiteliais. GALC hidrolisa as ligações éster de galactose de galactocerebrosídeo, galactosilesfingosina, lactosilceramida e monogalactosildiglicerídeo. GALC também é capaz de hidrolisar o análogo sintático de galactocerebrosídeo, um substrato cromogênico, 2-hexadecanoilamino-4-nitrofenil-β-D- galactopiranosídeo (HNG). O sal de sódio do produto da reação, 2-hexadecanoilamino-4- nitrofenol (HN), absorve luz a 410 nm. Este princípio é utilizado no método aqui descrito.

[00221] Princípio de análise de GALC. HNG é hidrolisado por GALC em HN (em pH 4,5), um produto de cor amarela (em pH 10,5), que é determinado espectrofotometricamente a 410 nm.

[00222] Galactocerebrosídeo, 2-Hexadecanoilamino-4-nitrofenil-β-D- galactopiranosídeo, (Produto Amarelo), Galactose

Clivagem hidrolítica de 2-hexadecanoilamino-4-nitrofenil-β-D- galactopiranosídeo Preparação da amostra Colheita ou GALC purificada

[00223] Diluições desejadas de amostras foram preparadas com o uso de Triton X-100 0,5%. Pelo menos uma diluição 1:10 foi necessária para a análise. Lisado de células

[00224] Glóbulos de células foram lavados em PBS, globulizadas por centrifugação (400 x g durante 5 min à temperatura ambiente) e lisadas em Triton X-100 0,5%. A determinação de proteína do lisado de células foi realizada com o uso do “BCA Protein Assay Kit Microtiter Plate Protocol” (Pierce).

[00225] Um experimento típico foi realizado com o uso de 1-5 mg de proteínas de lisado de células. Preparação de uma curva padrão e controle de ensaio

[00226] O primeiro padrão local de rhGALC, StG01, foi usado para a preparação de uma curva padrão. Foram preparadas réplicas verdadeiras de cinco diluições (1/400, 1/600, 1/800, 1/1.200 e 1/1.600).

[00227] O segundo padrão de rhGALC, StG02, foi usado para a preparação de um controle de ensaio:

Procedimento de incubação a. 20 μL de diluições de padrão, amostra, controle e branco (Triton X-100 0,5%) foram adicionados a uma placa de 96 cavidades do tipo- U. Foram usados 20 μL de cada réplica das diluições de padrão StG01, controle e amostras (20 μL x 2 se uma diluição única é preparada) e 20 μL x 2 de branco. Quando as cavidades foram carregadas, 20 μL de substrato de ensaio-HNG foram adicionados a todas as cavidades contendo amostra, branco e controle seguido por misturação. A placa foi incubada a 37°C durante 30 min ou 1 h. b. 80 μL de solução STOP para HNG (glicina 0,1 M / NaOH 0,1 M pH 10,5) foi adicionada com o uso de uma multipipeta seguido por misturação em um agitador de placa durante aproximadamente 30 segundos e adição de 160 μL de etanol. A solução foi misturada e 200 μL foram removidos de cada cavidade e transferidos para cavidades de uma placa de filtro de 96 cavidades posicionada sobre uma placa de fundo plano de 96 cavidades. A placa foi centrifugada a 2.000 x g durante 2 min à temperatura ambiente. Medições de A410nm

[00228] As medições foram realizadas com o uso de um leitor de placa Spectra Max Plus ou um leitor de placa BioTek.

Cálculos

[00229] Definição: Uma unidade (1 U) de atividade enzimática foi definida como a hidrólise de 1 nmol de HN por minuto a 37°C, pH 4,5.

[00230] A atividade-HNG média do primeiro padrão local de rhGALC, StG01, foi ajustada para 1.884 U/mL. As atividades usadas para a curva padrão foram calculadas a partir das diluições da atividade-HNG média de StG01:

Cálculo de atividade específica

[00231] A concentração de GALC em amostras misturadas foi determinada com o uso de GALC ELISA. A concentração de proteína em preparações purificadas de GALC foi determinada com o uso de A280 (o coeficiente de absorção específico teórico de rhGALC é 2,5) ou o Ensaio de Proteína a 660 nm.

[00232] Para calcular a atividade específica (Unidades/mg) ou a atividade enzimática por mg de proteína (Unidades/mg de proteína), a atividade HNG foi dividida pela concentração de GALC ou proteína. Originalmente, a atividade de GALC do lisado de células foi definido como nmol de produto hidrolisado por mg por hora (nmol/mg/h). Para converter Unidades/mg para nmol/mg/h multiplicar por 60 (isto é, converter minutos em hora).

Claims (14)

1. Processo para purificar galactocerebrosideo-β-galactosidase recombinante de humano (rhGALC) a partir de uma cultura de células, em que uma fração da dita cultura de células que compreende rhGALC é submetida à cromatografia em resinas, caracterizado pelo fato de que o processo compreende: a) uma etapa de captura na qual a dita rhGALC é purificada em uma primeira resina cromatográfica multimodal que liga através de pelo menos interações hidrofóbica e eletrostática e que compreende ligantes eletrostáticos, opcionalmente seguida por inativação de vírus e/ou purificação por separação iônica; b) uma etapa intermediária na qual a dita rhGALC é purificada em uma segunda resina cromatográfica multimodal compreendendo um ligante aniônico e hidrofóbico, opcionalmente seguida por inativação de vírus e/ou purificação por separação iônica; c) uma etapa de refinamento na qual a dita rhGALC é purificada em uma terceira resina cromatográfica, que é selecionada do grupo que consiste em uma resina cromatográfica multimodal, uma resina trocadora de ânions e uma resina cromatográfica de interação hidrofóbica (HIC) e em que a terceira resina cromatográfica compreende um ligante compreendendo um grupo éter.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita etapa intermediária compreende a purificação da dita rhGALC em uma dita segunda resina cromatográfica multimodal, seguida por purificação da dita rhGALC em uma resina cromatográfica selecionada do grupo que consiste em: i) uma resina cromatográfica multimodal que é diferente das ditas primeira e segunda resinas cromatográficas multimodais; e ii) uma resina cromatográfica de interação hidrofóbica (HIC).

3. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que as ditas primeira e segunda resinas cromatográficas multimodais são resinas diferentes.

4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a dita rhGALC é eluída de dita primeira resina cromatográfica multimodal em primeiro tampão de eluição que compreende pelo menos 30% (v/v) de propileno glicol e/ou etileno glicol.

5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a dita rhGALC é eluída de dita segunda resina cromatográfica multimodal em um segundo tampão de eluição que compreende pelo menos 30% (v/v) de propileno glicol e/ou etileno glicol e que tem um pH abaixo de 5,5.

6. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, o dito processo caracterizado pelo fato de compreender: a) fornecer uma fração de dita cultura de células que compreende rhGALC; b) carregar a fração de dita cultura de células em uma primeira resina cromatográfica multimodal que liga através de pelo menos interações hidrofóbicas e eletrostáticas e que compreende ligantes eletrostáticos; c) eluir rhGALC da primeira resina cromatográfica multimodal em um primeiro tampão de eluição que compreende pelo menos 30% (v/v) de propileno glicol e/ou etileno glicol obtendo com isso um primeiro eluato; d) carregar o primeiro eluato em uma segunda resina cromatográfica multimodal que compreende um ligante aniônico e hidrofóbico; e) eluir rhGALC da segunda resina cromatográfica multimodal em um segundo tampão de eluição que compreende pelo menos 30% (v/v) de propileno glicol e/ou etileno glicol e que tem um pH abaixo de 5,5, obtendo com isso um segundo eluato; f) carregar o segundo eluato em uma terceira resina cromatográfica que tem ligantes hidrofóbicos; e g) eluir rhGALC da terceira resina cromatográfica compreendendo um ligante compreendendo um grupo éter, que é selecionado do grupo consistindo de uma resina cromatográfica multimodal, uma resina de troca de ânions e uma resina cromatográfica de interação hidrofóbica (HIC) em um tampão aquoso, obtendo com isso um terceiro eluato.

7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a primeira resina cromatográfica multimodal compreende como ligante um composto da fórmula (I), (II) ou (III):

em que R das substâncias das fórmulas (II) e (III) é um grupo funcional de fórmula (IV):

8. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que a primeira resina cromatográfica é lavada em um tampão de lavagem que compreende no máximo 20% (v/v) de propileno glicol e/ou etileno glicol.

9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o primeiro tampão de eluição compreende uma concentração total de propileno glicol e/ou etileno glicol de 40 a 60% (v/v).

10. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que a segunda resina cromatográfica multimodal compreende um ligante da fórmula (VIII):

ou um ligante da fórmula (IX):

11. Composição, caracterizada pelo fato de compreender rhGALC, em que a razão molar entre rhGALC de comprimento total (80 kDa) e os produtos processados principais (50 kDa + 30 kDa) na dita composição é pelo menos 50:2,5.

12. Composição de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que é obtenível pelo processo de purificação como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 10.

13. Uso da composição como definida em qualquer uma das reivindicações 11 ou 12, caracterizada pelo fato de ser na manufatura de um medicamento.

14. Uso da composição como definida em qualquer uma das reivindicações 11 ou 12, caracterizada pelo fato de ser na manufatura de um medicamento para o tratamento de Leucodistrofia de Células Globoides (doença de Krabbe).

Images