JP2015535422A - 組換えヒトガラクトセレブロシドβ−ガラクトシダーゼ（ｒｈＧＡＬＣ）の精製 - Google Patents

Abstract

本発明は、細胞培養物から組換えヒトガラクトセレブロシドβ−ガラクトシダーゼ（ｒｈＧＡＬＣ）を精製するプロセスであって、前記細胞培養物のｒｈＧＡＬＣ含有画分を３種の異なる樹脂を用いたクロマトグラフィーに供することを特徴とするプロセスに関する。

Description

本発明は、組換えヒトガラクトセレブロシドβ−ガラクトシダーゼの精製方法および該方法により得られる精製物に関する。

ガラクトセレブロシドβ−ガラクトシダーゼ（ＧＡＬＣ）は、ガラクトセレブロシドを加水分解してガラクトースを遊離させる反応を触媒する酵素である。この酵素が欠損すると、組織中にガラクトセレブロシドが蓄積する。これまでに報告されているＧＡＬＣの精製方法は、肝臓（Ｂｅｎ−Ｙｏｓｅｐｈ，Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ，１９７９）、リンパ球（Ｓａｋａｉら，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９４）、尿（Ｃｈｅｎら，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ ａｃｔａ，１９９３）などの天然検体からヒトＧＡＬＣを部分精製するものであった。ＧＡＬＣは極めて疎水性が高く、含量もわずかであるため、これらの方法はいずれも複雑である。また、回収率も非常に低く、得られる精製物は全長型ＧＡＬＣ（８０ｋＤａ）とその分解物（主に５０ｋＤａおよび３０ｋＤａ）との混合物である。さらに、ＧＡＬＣの精製に関するこれらの過去の報告は、ＧＡＬＣの性状分析を目的とするものであり、ヒトでの酵素補充療法（ＥＲＴ）のための大量生産を目的とするものではなかった。

したがって、ｒｈＧＡＬＣの改善された精製方法によって高純度かつ均質（８０ｋＤａ ｒｈＧＡＬＣ）なｒｈＧＡＬＣがヒトでの使用に適した生理溶液中に得られれば有利である。

動物／ヒト研究用としての品質要件および純度要件を満たした状態の最終精製物が得られる、組換えヒトガラクトセレブロシドβ−ガラクトシダーゼ（ｒｈＧＡＬＣ）の精製プロセスを開発した。このプロセスは３つの主要なクロマトグラフィー工程を含み、必要に応じて限外濾過／透析濾過（ＵＦＤＦ）による１つの製剤化工程をさらに含んでもよい。本研究では、容量２０Ｌの流加バッチ式バイオリアクターから得られた新鮮で清澄化された収穫物を、動物／ヒト研究用のｒｈＧＡＬＣの生産に最適化されたプロセスで精製した。

本発明の精製方法は、作用方式がそれぞれ異なる捕捉工程、中間工程および仕上げ工程の３段階のクロマトグラフィー工程からなる構成に基づいている。いずれの工程も結合方式で実施し、溶出の前に洗浄工程を含むことが好ましい。一実施形態において、捕捉工程はＣａｐｔｏ（登録商標） Ｂｌｕｅを、中間工程はＣａｐｔｏ（登録商標） Ａｄｈｅｒｅを、仕上げ工程はＴｏｙｏｐｅａｒｌ Ｅｔｈｅｒを用いる。本発明の方法のいくつかの実施形態には、２つの専用工程、すなわちウイルス不活性化工程およびウイルス除去工程が含まれる。精製物プールは、滅菌濾過して最終精製物とする前に、ＵＦＤＦで製剤化してもよい。

本発明の最終的な目標は、リソソーム蓄積症の一つであるグロボイド細胞白質ジストロフィー（クラッベ病）の治療を目的とした酵素補充療法に用いるｒｈＧＡＬＣを生産することである。クラッベ病は、酵素であるＧＡＬＣの遺伝子欠損が原因である。ＧＡＬＣの欠損により、スフィンゴ脂質の代謝産物であるガラクトシルスフィンゴシン（プシコシン）の蓄積が進み、脱髄をきたして早期死亡に至る。

したがって、本発明の目的はｒｈＧＡＬＣの精製方法を提供することであり、特に、動物やヒトでの使用性に関する上記の問題を解決する、ｒｈＧＡＬＣの精製方法を提供することである。

したがって、本発明の一態様は、細胞培養物から組換えヒトガラクトセレブロシドβ−ガラクトシダーゼ（ｒｈＧＡＬＣ）を精製するプロセスであって、前記細胞培養物のｒｈＧＡＬＣ含有画分を複数種の樹脂を用いたクロマトグラフィーに供することを特徴とし、
ａ）第１のマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂を用いて前記ｒｈＧＡＬＣの精製を行い、その後必要に応じて、ウイルスの不活性化および／またはイオン分離による精製を行う捕捉工程；
ｂ）第２のマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂を用いて前記ｒｈＧＡＬＣの精製を行い、その後必要に応じて、ウイルスの不活性化および／またはイオン分離による精製を行う中間工程；ならびに
ｃ）マルチモーダルクロマトグラフィー樹脂、陰イオン交換樹脂および疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）樹脂からなる群から選択されるクロマトグラフィー樹脂を用いて前記ｒｈＧＡＬＣの精製を行う仕上げ工程
を含むプロセスに関する。

また本発明は、特定の実施形態において、細胞培養物から組換えヒトガラクトセレブロシドβ−ガラクトシダーゼ（ｒｈＧＡＬＣ）を精製するプロセスであって、前記細胞培養物のｒｈＧＡＬＣ含有画分を複数種の樹脂を用いたクロマトグラフィーに供することを特徴とし、
ａ）前記細胞培養物のｒｈＧＡＬＣ含有画分を得ること；
ｂ）静電性リガンドを含む第１のマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂に前記細胞培養物のｒｈＧＡＬＣ含有画分をロードすること；
ｃ）プロピレングリコールおよび／またはエチレングリコールを少なくとも３０％（ｖ／ｖ）含む第１の溶出バッファーで第１のマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂からｒｈＧＡＬＣを溶出して、第１の溶出物を得ること；
ｄ）陰イオン性の疎水性リガンドを含む第２のマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂に第１の溶出物をロードすること；
ｅ）プロピレングリコールおよび／またはエチレングリコールを少なくとも３０％（ｖ／ｖ）含むｐＨ５．５未満の第２の溶出バッファーで第２のクロマトグラフィー樹脂からｒｈＧＡＬＣを溶出して、第２の溶出物を得ること；
ｆ）疎水性リガンドを有する第３のクロマトグラフィー樹脂に第２の溶出物をロードすること；ならびに
ｇ）水性バッファーで第３のクロマトグラフィー樹脂からｒｈＧＡＬＣを溶出して、第３の溶出物を得ること
を含むプロセスを提供する。

本発明の別の態様はｒｈＧＡＬＣを含む組成物に関する。本発明の組成物は、本発明の精製プロセスで得られるものであってよい。

本発明のさらなる別の態様は、治療薬として使用するための本発明の組成物を提供することである。

本発明のさらなる別の態様は、グロボイド細胞白質ジストロフィー（クラッベ病）の治療に使用するための本発明の組成物を提供することである。

本発明は、さらに別の態様において、グロボイド細胞白質ジストロフィー（クラッベ病）を治療する方法および／またはグロボイド細胞白質ジストロフィー（クラッベ病）に伴う症状を軽減もしくは緩和する方法に関し、該方法は、本発明の精製ｒｈＧＡＬＣを含む組成物を、それを必要とする対象に投与する工程を含む。

ｒｈＧＡＬＣの精製プロセスの概要を示した図である。容量２０Ｌのバイオリアクターからの収穫物をパイロットスケールのクロマトグラフィーに３回に分けて供し、精製した。得られたＥｔｈｅｒ精製物をまとめてプールし、残りの精製プロセスを１サイクルずつ行って最終精製物ＴＧ１１０６を得た。 ３つのクロマトグラフィー工程、ＵＦＤＦ工程および濾過工程における工程毎の各サイクルの収率（％活性）を示した図である。清澄化収穫物から最終精製物に至るまでの総収率を右端に示した。活性の測定に際しては、希釈液を少なくとも２つずつ調製して実験を行い、これを２回繰り返して得られた結果を計算に用いた。ただし、Ｅｔｈｅｒ工程の精製物については、測定は１回のみ行った。 清澄化収穫物から最終精製物までの総残存活性をまとめて示したものである。活性は図２と同様の方法で測定した。 最終精製物ＴＧ１１０６および社内標準物質であるＳｔＧ０２とＳｔＧ０３のウェスタンブロット解析の結果を示した図である。ＧＡＬＣの検出にはＳｔＧ０２に対して作製されたウサギポリクローナル抗体を用いた。 Ｅｔｈｅｒ精製物、ＵＦＤＦ精製物、最終精製物ＴＧ１１０６および社内標準物質ＳｔＧ０３をそれぞれ過剰量ロードした場合のウェスタンブロット解析の結果を示したものである。ＧＡＬＣの検出にはＳｔＧ０２に対して作製されたウサギポリクローナル抗体を用いた。 ＴＧ１１０６および社内標準物質ＳｔＧ０３のｐＨ３〜１０のｐＨ勾配を持つゲルにおける等電点電気泳動の結果である。 最終精製物ＴＧ１１０６およびダウンストリームプロセス中に採取したサンプルについてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ Ｂｌｕｅで染色した結果である。 種々の濃度の最終精製物ＴＧ１１０６およびＳｔＧ０３についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ Ｂｌｕｅで染色した結果である。 種々の濃度の最終精製物ＴＧ１１０６およびＳｔＧ０３についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ Ｂｌｕｅで染色した結果である。 Ｇ２５０で電荷シフトさせたサンプルについて４〜１６％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルを用いて中性のｐＨで非変性ＰＡＧＥを行い、Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ Ｂｌｕｅで染色した結果である。最終精製物ＴＧ１１０６および社内標準物質ＳｔＧ０３の分析結果を示す。

以下、本発明についてさらに詳細に説明する。

＜プロセス＞
本発明の一態様により、細胞培養物から組換えヒトガラクトセレブロシドβ−ガラクトシダーゼ（ｒｈＧＡＬＣ）を精製するプロセスであって、前記細胞培養物のｒｈＧＡＬＣ含有画分を複数種の樹脂を用いたクロマトグラフィーに供することを特徴とし、
ｄ）第１のマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂を用いて前記ｒｈＧＡＬＣの精製を行い、その後必要に応じて、ウイルスの不活性化および／またはイオン分離による精製を行う捕捉工程；
ｅ）第２のマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂を用いて前記ｒｈＧＡＬＣの精製を行い、その後必要に応じて、ウイルスの不活性化および／またはイオン分離による精製を行う中間工程；ならびに
ｆ）マルチモーダルクロマトグラフィー樹脂、陰イオン交換樹脂および疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）樹脂からなる群から選択されるクロマトグラフィー樹脂を用いて前記ｒｈＧＡＬＣの精製を行う仕上げ工程
を含むプロセスが提供される。

本発明のいくつかの実施形態において、前記中間工程は、第２のマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂を用いて前記ｒｈＧＡＬＣの精製を行うことに加え、次いで
ｉ）第１、第２のマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂とは異なるマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂、および
ｉｉ）疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）樹脂
からなる群より選択されるクロマトグラフィー樹脂を用いて前記ｒｈＧＡＬＣの精製を行うことを含む。

本発明のさらなる実施形態において、第１と第２のマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂は異なる樹脂である。

第１のマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂は特に静電性リガンドを含んでいてもよい。

本発明の他の実施形態において、第２のマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂は陰イオン性の疎水性リガンドを含む。

さらなる実施形態において、前記仕上げ工程のクロマトグラフィー樹脂は疎水性リガンドを有する樹脂である。

第１のマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂は、特に、後掲の化学式（ＶＩ）の化合物をリガンドとして含んでいてもよい。

第２のマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂は、特に、後掲の化学式（ＶＩＩＩ）の化合物をリガンドとして含んでいてもよい。

さらなる実施形態において、第１のマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂は、後掲の化学式（ＶＩ）の化合物をリガンドとして含み、第２のマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂は、後掲の化学式（ＶＩＩＩ）の化合物をリガンドとして含む。これらの実施形態において、前記ｒｈＧＡＬＣは、次いで別のクロマトグラフィー樹脂（エーテル樹脂）を用いて精製されることが好ましい。適切なエーテル樹脂の例については後述する。

本発明のいくつかの実施形態において、前記ｒｈＧＡＬＣは、プロピレングリコールおよび／またはエチレングリコールを少なくとも３０％（ｖ／ｖ）含む第１の溶出バッファーによって第１のマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂から溶出される。

本発明の他の実施形態において、前記ｒｈＧＡＬＣは、プロピレングリコールおよび／またはエチレングリコールを少なくとも３０％（ｖ／ｖ）含むｐＨ５．５未満の第２の溶出バッファーによって第２のマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂から溶出される。

本発明における組換えヒトガラクトセレブロシドβ−ガラクトシダーゼ（ｒｈＧＡＬＣ）の精製プロセスは、特に、
ａ）前記細胞培養物のｒｈＧＡＬＣ含有画分を得ること；
ｂ）静電性リガンドを含む第１のマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂に前記細胞培養物のｒｈＧＡＬＣ含有画分をロードすること；
ｃ）プロピレングリコールおよび／またはエチレングリコールを少なくとも３０％（ｖ／ｖ）含む第１の溶出バッファーで第１のマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂からｒｈＧＡＬＣを溶出して、第１の溶出物を得ること；
ｄ）陰イオン性の疎水性リガンドを含む第２のマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂に第１の溶出物をロードすること；
ｅ）プロピレングリコールおよび／またはエチレングリコールを少なくとも３０％（ｖ／ｖ）含むｐＨ５．５未満の第２の溶出バッファーで第２のクロマトグラフィー樹脂からｒｈＧＡＬＣを溶出して、第２の溶出物を得ること；
ｆ）疎水性リガンドを有する第３のクロマトグラフィー樹脂に第２の溶出物をロードすること；ならびに
ｇ）水性バッファーで第３のクロマトグラフィー樹脂からｒｈＧＡＬＣを溶出して、第３の溶出物を得ること
を含んでもよい。

ヒトガラクトセレブロシドβ−ガラクトシダーゼ（ｒｈＧＡＬＣ）には複数の別名がある。よく用いられる名称は、ガラクトセレブロシダーゼ、ガラクトシルセラミダーゼ、ガルセラーゼおよびガラクトシルセラミドβ−ガラクトシダーゼ（ＥＣ３．２．１．４６）である。タンパク質としての登録番号はＮＰ＿０００１４４．２およびＰ４５８０３である。本発明におけるｒｈＧＡＬＣがタグを含んでいてもよいことは理解されるだろう。

本発明におけるいくつかの態様および実施形態において、「ヒトガラクトセレブロシドβ−ガラクトシダーゼ（ｒｈＧＡＬＣ）」には、全長のアミノ酸配列の部分配列または類似配列からなり、全長のｒｈＧＡＬＣと同等の機能を有するものも含まれる。

ｒｈＧＡＬＣには、ｒｈＧＡＬＣまたはｒｈＧＡＬＣと同等の機能を有するｒｈＧＡＬＣの一部もしくは類似体の精製方法を構築する上で知っておくべき重要な特性がある。
−分子量約８０ｋＤａ；
−５箇所（または６箇所）の糖鎖付加部位を有する；
−異性体が存在する；
−ｐＩ ５．９（理論値）、６．３（実測値）；
−ｐＨ感受性である；ｐＨ６．０〜６．６が好ましい。
−極めて疎水性が高い；
−活性の維持に界面活性剤が必要である；
−二量体、三重体および四量体を形成する；

本明細書に記載される本発明のいくつかの態様および実施形態において、ｒｈＧＡＬＣまたはｒｈＧＡＬＣと同等の機能を有するｒｈＧＡＬＣの一部もしくは類似体は、
ｉ）配列番号２に記載のアミノ酸配列；
ｉｉ）ｉ）と同等の機能を有する、ｉ）で定義したアミノ酸配列の部分配列；および
ｉｉｉ）ｉ）またはｉｉ）と同等の機能を有する、ｉ）またはｉｉ）で定義したアミノ酸配列の類似配列であって、ｉ）またはｉｉ）で定義したアミノ酸配列と少なくとも７５％の同一性を有するアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。

本発明において、「同等の機能を有する」とは、前述したｒｈＧＡＬＣの一部または類似体がガラクトセレブロシド、ガラクトシルスフィンゴシン、ラクトシルセラミド、モノガラクトシルジグリセリドおよび発色基質である２−ヘキサデカノイルアミノ−４−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＨＮＧ）のガラクトースエステル結合を加水分解する能力を有することを意味する。特定の実施形態において、前述したｒｈＧＡＬＣの一部または類似体は、上記化合物のガラクトースエステル結合を加水分解する能力に関して、（配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する）天然のｒｈＧＡＬＣの少なくとも５０％、例えば少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の能力を保持する。

前記ｒｈＧＡＬＣの一部または類似体の触媒作用は、ｐＨ４．５における２−ヘキサデカノイルアミノ−４−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＨＮＧ）から２−ヘキサデカノイルアミノ−４−ニトロフェノール（ＨＮ）への加水分解を測定することにより決定してもよい。ＨＮはｐＨ１０．５では黄色を呈するため、分光光度法により４１０ｎｍの吸光度を測定することにより定量してもよい。このような測定の実例を本願の実施例１２に記載する。

特定の実施形態において、ｉｉｉ）に記載の類似体は、ｉ）またはｉｉ）で定義した配列と少なくとも８０％、例えば、ｉ）またはｉｉ）で定義した配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％の同一性を有する。

さらに、ｒｈＧＡＬＣまたはｒｈＧＡＬＣと同等の機能を有するｒｈＧＡＬＣの一部もしくは類似体は、特に、
ｉ）配列番号１に記載の核酸配列；および
ｉｉ）ｉ）で定義した核酸配列と少なくとも７５％の同一性を有する核酸配列
からなる群より選択される配列を含む核酸配列の組換え発現により得てもよい。

ｉｉ）に記載の核酸配列は、ｉ）で定義した配列と少なくとも８０％、例えば、ｉ）で定義した配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％の同一性を有することがさらに好ましい。

「配列同一性」は、２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の相同性の程度を定量的に示したものであり、２つの配列の長さは同じでも異なっていてもよい。比較する２つの配列の長さが異なる場合、それらが最も適合するようにギャップを挿入したり、ポリペプチド配列またはヌクレオチド配列の末端を切断したりして、２つの配列を揃える必要がある。配列同一性は下記式：
により算出できる。式中、Ｎｄｉｆは、２つの配列を揃えた時の異なる残基の総数を示し、Ｎｒｅｆは２つの配列の一方の総残基数を示す。したがって、ＤＮＡの配列ＡＧＴＣＡＧＴＣは、配列ＡＡＴＣＡＡＴＣと７５％の配列同一性を有することになる（Ｎｄｉｆ＝２かつＮｒｅｆ＝８）。ギャップは特定の残基と同一でない残基として計上する。すなわち、ＤＮＡの配列ＡＧＴＧＴＣは、ＤＮＡの配列ＡＧＴＣＡＧＴＣと７５％の配列同一性を有することになる（Ｎｄｉｆ＝２かつＮｒｅｆ＝８）。

＜プレ樹脂工程＞
精製されていないｒｈＧＡＬＣを供給する細胞培養物は種々の材料に由来するものであってよい。一実施形態において、細胞培養物はｒｈＧＡＬＣを発現させるためのバイオリアクターから供給される。

第１のクロマトグラフィー樹脂に導入する前に細胞培養物の画分に変更を加えることは有利かもしれない。したがって、一実施形態において、前記画分が第１のクロマトグラフィー樹脂にロードされる前に、そのｐＨは７未満、例えば３〜７、例えば４〜７、例えば５〜７、例えば６〜７、例えば３〜６、例えば３〜５、または例えば３〜４に調整される。また、ローディング前に細胞を除去するために、細胞培養物を濾過（例えばデプスフィルター、デッドエンドフィルターまたはタンジェンシャルフローフィルターを使用する濾過）または遠心分離することも有利かもしれない。したがって、本発明の別の実施形態において、前記細胞培養物の画分は濾過済み画分である。さらに別の実施形態において、細胞培養物のｒｈＧＡＬＣを含む画分は清澄化された未希釈の収穫物である。

＜第１の樹脂工程／捕捉工程＞
第１の樹脂は酵素を安定化し、培地の色を除去する。第１のマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂としては、種々のタイプのマルチモーダル樹脂が好適でありうる。したがって、一実施形態において、第１のマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂は少なくとも疎水性相互作用および静電相互作用による結合を形成する。別の実施形態において、第１のマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂は少なくとも芳香環相互作用および静電相互作用による結合を形成する。

第１のマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂は、下記の化学式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（Ｖ）、（ＶＩ）または（ＶＩＩ）の化合物をリガンドとして含みうる。

さらに別の実施形態において、第１のマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂は、下記の化学式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の化合物をリガンドとして含む。

第１のマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂は、特に化学式（Ｖ）、（ＶＩ）または（ＶＩＩ）の化合物をリガンドとして含みうる。

（式中、式（ＩＩ）および式（ＩＩＩ）の物質におけるＲは式（ＩＶ）の官能基である。）

さらなる一実施形態において、第１のクロマトグラフィー樹脂は、式ＩＶ、式Ｖ、式ＶＩまたは式ＶＩＩのリガンドを含む。第１の樹脂として、より具体的な樹脂を使用してもよい。したがって、さらに別の実施形態において、第１の樹脂は、「Ｃａｐｔｏ（登録商標）ＭＭＣ」、「Ｃａｐｔｏ（登録商標） Ｂｌｕｅ（Ｃａｐｔｏ（登録商標） Ｂｌｕｅ（ｈｉｇｈ ｓｕｂ）およびＣａｐｔｏ（登録商標） Ｂｌｕｅ（ｌｏｗ））」、「Ｃａｐｔｏ（登録商標） Ａｄｈｅｒｅ」および「Ｂｌｕｅ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標） ｆａｓｔ ｆｌｏｗ」（以上すべてＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅより入手可能）からなる群より選択される。

Ｃａｐｔｏ ＭＭＣはマルチモーダル陽イオン交換体である。Ｃａｐｔｏ ＭＭＣはカルボキシル基を含むため、弱陽イオン交換体とある程度類似した特徴を有する。しかしながら、イオン相互作用だけでなく、その他の複数種の相互作用、例えば水素結合や疎水性相互作用なども関与している。Ｃａｐｔｏ（登録商標） Ｂｌｕｅは、芳香環相互作用および静電相互作用による結合を形成するアフィニティバイオプロセス担体である。Ｃａｐｔｏ ＡｄｈｅｒｅのリガンドであるＮ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミンは、多様な相互作用機能を示す。最も顕著なものはイオン相互作用、水素結合および疎水性相互作用である。

その他の実施形態において、第１の樹脂は、Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販されているＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌ（登録商標）ミックスモードクロマトグラフィー吸着剤からなる群から選択される。ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌ吸着剤は、疎水性電荷誘導クロマトグラフィー（ＨＣＩＣ）とも称されるミックスモードまたはマルチモードのメカニズムで作用する。ＨＣＩＣは、イオン性のデュアルモードリガンドのｐＨ依存性挙動に基づくものである。

特定の実施形態において、第１の樹脂は式（ＶＩ）のリガンドを有する。そのような樹脂の一例として、「Ｃａｐｔｏ（登録商標） Ｂｌｕｅ（Ｃａｐｔｏ（登録商標） Ｂｌｕｅ（ｈｉｇｈ ｓｕｂ））」が挙げられる。

当然のことながら、本発明のプロセスが当業者に公知のいくつかの標準的な工程を含みうることは理解されるだろう。したがって、一実施形態において、第１のクロマトグラフィー樹脂は、ローディング前にコンディショニングされる。別の実施形態において、工程ｂ）の後、第１のクロマトグラフィー樹脂は洗浄バッファーで洗浄される。さらなる一実施形態において、第１のクロマトグラフィー樹脂は、プロピレングリコールおよび／またはエチレングリコールを最大で２０％（ｖ／ｖ）、例えば最大で１５％、例えば最大で１０％、例えば最大で５％、例えば５〜２０％、例えば５〜１５％、または例えば約１０％含む洗浄バッファーで洗浄される。一実施形態において、上記の洗浄バッファーは最大で２０％のプロピレングリコールを含む。別の実施形態において、上記の洗浄バッファーは最大で２０％のエチレングリコールを含む。ｒｈＧＡＬＣは極めて疎水性が高い物質であるため、プロピレングリコールおよび／またはエチレングリコールは好ましい溶離剤である。

第１の溶出バッファーは様々な成分を含みうる。第１の樹脂が「Ｃａｐｔｏ（登録商標） Ｂｌｕｅ」である一実施形態において、第１の溶出バッファーに含まれるプロピレングリコールおよび／またはエチレングリコールの総濃度は４０〜６０％（ｖ／ｖ）、例えば４５〜６０％、例えば５０〜６０％、例えば４０〜５５％、例えば４０〜５０％、または例えば約５０％である。高濃度（ｖ／ｖ）のプロピレングリコールおよび／またはエチレングリコールは、目的の酵素を良好に溶出する上で重要である。

溶出後、バッファー条件を変更してもよい。したがって、一実施形態において、工程ｃ）の後、第１の溶出物中のプロピレングリコールおよび／またはエチレングリコールの総濃度（ｖ／ｖ）を、工程ｄ）の前に３０％未満、例えば２０％未満、例えば１５％未満、または例えば１０％未満に下げる。プロピレングリコールおよび／またはエチレングリコールの濃度を下げることによって、ｒｈＧＡＬＣの酵素としての安定性が維持される。さらなる一実施形態において、工程ｃ）の後、第１の溶出物のｐＨは５〜６．５、例えば５．５〜６．５、例えば５．７〜６．３、または約６．１に調整される。ｒｈＧＡＬＣはｐＨ感受性物質であることから、ｐＨは６．０〜６．６であることが好ましい。さらなる一実施形態において、工程ｃ）の後、第１の溶出物中の界面活性剤の量は０．０１％〜５％、例えば０．５％〜５％、例えば０．５％〜４％、例えば０．５％〜３％、例えば０．５％〜２％、例えば０．５％〜１．５％に調整される。別の実施形態において、前記界面活性剤は、ｔｗｅｅｎ２０、ｔｗｅｅｎ４０、ｔｗｅｅｎ６０またはｔｗｅｅｎ８０などのｔｗｅｅｎ系界面活性剤である。Ｔｗｅｅｎはポリソルベートの名称でも知られている。前記界面活性剤としては、ヒトでの使用が認められているものが好ましいため、例えばクレモフォール（ポリオキシル３５ヒマシ油）やプルロニックＦ−１２７であってもよい。

さらなる一実施形態において、第１の溶出物は、界面活性剤中、例えば室温で５時間〜４８時間、例えば１０時間〜３時間、または例えば１６〜２４時間保存される。特に界面活性剤の濃度が例えば１％などのように高い場合は、第１の溶出物を長い時間保存することにより、この工程はウイルス不活性化工程として機能する。

第１の溶出物は、第２のクロマトグラフィー樹脂にロードされる前にコンディショニングされてもよい。したがって、一実施形態において、工程ｄ）の前に、第１の溶出物は第２のクロマトグラフィー樹脂用のコンディショニングバッファーと混合される。さらに別の実施形態において、上記混合は、第１の溶出物を第２の樹脂用のコンディショニングバッファーに直接回収することによって行ってもよい。

＜第２の樹脂工程／中間工程＞
第２のマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂としては、種々のタイプのマルチモーダル樹脂が好適でありうる。したがって、一実施形態において、第２のクロマトグラフィー樹脂は、イオン相互作用、水素結合および疎水性相互作用による結合を形成する。別の実施形態において、第２のクロマトグラフィー樹脂は、Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミンをリガンドとして含む。さらなる一実施形態において、第２のクロマトグラフィー樹脂は、下記式：

のリガンド、または

下記式：

のリガンドを含む。

より具体的な一実施形態において、第２のクロマトグラフィー樹脂は、Ｃａｐｔｏ（登録商標） Ａｄｈｅｒｅ、Ｂｉｏｒａｄから市販されているＣＨＴセラミックハイドロキシアパタイト タイプＩ（ＣＨＴ Ｉ）、およびＰａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販されているＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌ（登録商標）ミックスモードクロマトグラフィー吸着剤からなる群より選択される。Ｃａｐｔｏ（登録商標） Ａｄｈｅｒｅは、マルチモードの機能性を有する強陰イオン交換バイオプロセス担体であり、イオン相互作用、水素結合および疎水性相互作用による結合を形成する。セラミックハイドロキシアパタイトは、複数の結合様式（マルチモード）により生体分子と相互作用する。セラミックハイドロキシアパタイト中で負に帯電するリン酸基がタンパク質のアミノ基と相互作用することにより、陽イオン交換が起こる。また、金属親和性のメカニズムによって、生体分子内のカルボキシルクラスター、ホスホリル基またはその両方と、ＣＨＴセラミックハイドロキシアパタイトのカルシウム部位とが相互作用して、より強固に結合した配位化合物が形成される。ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌ吸着剤は、疎水性電荷誘導クロマトグラフィー（ＨＣＩＣ）とも称されるミックスモードまたはマルチモードのメカニズムで作用する。ＨＣＩＣは、イオン性のデュアルモードリガンドのｐＨ依存性挙動に基づくものである。

特定の実施形態において、第２の樹脂は式（ＶＩＩＩ）のリガンドを含む。そのような樹脂の一例として、Ｃａｐｔｏ（登録商標） Ａｄｈｅｒｅが挙げられる。

当然のことながら、本発明のプロセスが当業者に公知のいくつかの標準的な工程を含みうることは理解されるだろう。したがって、一実施形態において、第２のクロマトグラフィー樹脂は、ローディング前にコンディショニングされる。別の実施形態において、工程ｄ）の後、第２のクロマトグラフィー樹脂は洗浄バッファーで洗浄される。さらなる一実施形態において、工程ｄ）の後、第２のクロマトグラフィー樹脂はｐＨ３〜５、例えばｐＨ４〜５、または例えばｐＨ４．５〜５の洗浄バッファーで洗浄される。さらなる一実施形態において、上記の洗浄バッファーはイソプロパノールなどのアルコールをさらに含む。

第２のクロマトグラフィー樹脂には、様々な溶離バッファーを使用することができる。第２のクロマトグラフィー樹脂がＣａｐｔｏ（登録商標） Ａｄｈｅｒｅである一実施形態において、第２の溶出バッファーはプロピレングリコールを３０〜５０％（ｖ／ｖ）、例えば３０〜４５％、例えば３０〜４０％、例えば３５〜５０％、例えば４０〜５０％、または例えば約４０％含む。上述した通り、ｒｈＧＡＬＣは極めて疎水性が高い物質であるため、プロピレングリコールおよび／またはエチレングリコールは好ましい溶離剤である。また、ｒｈＧＡＬＣはｐＨ感受性物質でもある。したがって、一実施形態において、第２の溶出バッファーのｐＨは６未満、例えば５未満、例えば３〜６、４〜６または４〜５である。さらなる一実施形態において、工程ｆ）の前に、第２の溶出物は第３のクロマトグラフィー樹脂用のコンディショニングバッファーと混合される。

＜適用可能な２段階方式中間工程＞
本発明のいくつかの実施形態において、中間工程を下記の２段階方式で実施する。

中間工程ａ）
２段階方式における中間工程ａ）は、本質的には上記と同様に、すなわち第２の樹脂工程／中間工程に関して明記されたマルチモーダル樹脂およびバッファーを用いて実施される。

中間工程ｂ）
中間工程ｂ）においては、マルチモーダル樹脂、疎水性樹脂およびエーテル基含有リガンドを含むクロマトグラフィー樹脂などの、種々のタイプの樹脂が好適でありうる。

より具体的な一実施形態において、中間工程ｂ）で使用されるクロマトグラフィー樹脂は、Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから市販されている「ＰＰＧ−６００Ｍ」および「Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｐｈｅｎｙｌ−６５０Ｍ」；「Ｃａｐｔｏ（登録商標） Ｂｌｕｅ（Ｃａｐｔｏ（登録商標） Ｂｌｕｅ（ｈｉｇｈ ｓｕｂ）、Ｃａｐｔｏ（登録商標） Ｂｌｕｅ（ｌｏｗ））」、「Ｃａｐｔｏ（登録商標）Ｂｕｔｙｌ」およびＢｕｔｙｌ−Ｓ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６（結合溶出方式またはフロースルー方式で作用する）；ならびにＢｉｏｒａｄから市販されているＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ Ｍｅｔｈｙｌ ＨＩＣ（結合溶出方式またはフロースルー方式で作用する）からなる群より選択される。

Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｐｈｅｎｙｌ−６５０Ｍは、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）担体である。Ｃａｐｔｏ（登録商標） Ｂｌｕｅは、芳香環相互作用および静電相互作用による結合を形成するアフィニティバイオプロセス担体である。「Ｃａｐｔｏ（登録商標）Ｂｕｔｙｌ」およびＢｕｔｙｌ−Ｓ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）担体である。Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ ｍｅｔｈｙｌ ＨＩＣ担体は、疎水性と電荷に基づく相互作用のメカニズムで作用する。メチル基は弱疎水性である。ローディングバッファーおよび溶出バッファーのｐＨを選択することにより、担体の疎水基で不純物を保持しながら、カルボキシル基のイオン的反発作用を利用して標的分子を分離することができる。

第２のクロマトグラフィー樹脂に様々な溶離バッファーを使用することができることは当業者には理解されるだろう。

＜第３の樹脂工程／仕上げ工程＞
第３のクロマトグラフィー樹脂としては、種々のタイプの樹脂が好適でありうる。したがって、一実施形態において、第３のクロマトグラフィー樹脂は、エーテル基含有リガンドを含む。別の実施形態において、第３の樹脂は疎水性である。さらに別の実施形態において、第３のクロマトグラフィー樹脂は、リガンドとして、［樹脂］−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎＯＨ（式中、ｎは１〜２０の整数、例えば１〜１０、例えば１〜５、例えば１〜３、または例えば１〜２の整数である）を含む。

より具体的な一実施形態において、第３のクロマトグラフィー樹脂はエーテル樹脂からなる群から選択され、エーテル樹脂としては、Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから市販されている６５０Ｍ、６５０Ｓ、５ＰＷ、ＰＰＧ−６００Ｍ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＧｉｇａＣａｐ Ｑ−６５０などのＴｏｙｏｐｅａｒｌ Ｅｔｈｅｒ樹脂；Ｂｉｏｒａｄから市販されているＣＨＴセラミックハイドロキシアパタイト タイプＩ（ＣＨＴ Ｉ）；ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから市販されているＱ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ｑ ＦＦ）；Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販されているＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌ（登録商標）ミックスモードクロマトグラフィー吸着剤；Ｂｉｏｒａｄから市販されているＭａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ Ｍｅｔｈｙｌ ＨＩＣ（結合溶出方式またはフロースルー方式で作用する）；ならびにＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから市販されているＢｕｔｙｌ−Ｓ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６（結合溶出方式またはフロースルー方式で作用する）およびＣａｐｔｏ ＤＥＡＥなどが挙げられる。

セラミックハイドロキシアパタイトは、複数の結合様式（マルチモード）により生体分子と相互作用する。セラミックハイドロキシアパタイト中で負に帯電するリン酸基がタンパク質のアミノ基と相互作用することにより、陽イオン交換が起こる。また、金属親和性のメカニズムによって、生体分子内のカルボキシルクラスター、ホスホリル基またはその両方と、ＣＨＴセラミックハイドロキシアパタイトのカルシウム部位とが相互作用して、さらにより強固に結合した配位化合物が形成される。

Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗは、イオン交換（ＩＥＸ）クロマトグラフィー担体（樹脂）である。ＭＥＰ ＨｙｐｅｒＣｅｌ吸着剤は、疎水性電荷誘導クロマトグラフィー（ＨＣＩＣ）とも称されるミックスモードまたはマルチモードのメカニズムで作用する。ＨＣＩＣは、イオン性のデュアルモードリガンドのｐＨ依存性挙動に基づくものである。Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ＧｉｇａＣａｐ Ｑ−６５０担体は、高容量かつ高分解能の陰イオン交換樹脂であり、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ ｍｅｔｈｙｌ ＨＩＣ担体は、疎水性と電荷に基づく相互作用のメカニズムで作用する。Ｂｕｔｙｌ−Ｓ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ６は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）担体である。

特定の実施形態において、第３のクロマトグラフィー樹脂はエーテル樹脂であり、例えば、前述した６５０Ｍ、６５０Ｓ、５ＰＷなどのＴｏｙｏｐｅａｒｌ Ｅｔｈｅｒ樹脂からなる群から選択されるものであってもよい。この種類の樹脂は、溶出剤としてプロピレン／エチレングリコールを使用する必要がなく、水性の溶出剤を使用できる点で有利である。

当然のことながら、本発明のプロセスが当業者に公知のいくつかの標準的な工程を含みうることは理解されるだろう。したがって、一実施形態において、第３のクロマトグラフィー樹脂は、ローディング前にコンディショニングされる。また、一実施形態において、プレコンディショニングにより、バッファーには１〜２Ｍ ＮＨ_４Ａｃおよび１〜２Ｍ ＮＨ_４Ｃｌが含まれる。別の実施形態において、工程ｆ）の後、第３のクロマトグラフィー樹脂は洗浄バッファーで洗浄される。さらに別の実施形態において、工程ｆ）の後、第３のクロマトグラフィー樹脂はｐＨ３〜５、例えば４〜５、例えば４．５〜５、例えば５．５〜７、または例えば約６．５の洗浄バッファーで洗浄される。ｒｈＧＡＬＣはｐＨ感受性であることから、このような洗浄は有利である。

第３の樹脂には、様々な洗浄バッファーを使用することができる。一実施形態において、工程ｆ）の後、第３のクロマトグラフィー樹脂は、少なくとも１Ｍ、例えば少なくとも２Ｍ、例えば少なくとも３Ｍ、または例えば１〜４ＭのＮＨ_４Ａｃを含む第１の洗浄バッファーで洗浄される。さらに別の実施形態において、第１の洗浄バッファーは少なくとも１Ｍ、例えば少なくとも２Ｍ、例えば少なくとも３Ｍ、または例えば１〜３ＭのＮＨ_４Ｃｌと、少なくとも０．１％、例えば０．１〜２％の界面活性剤とを含む。

一実施形態において、第２の洗浄バッファーに含まれる塩と界面活性剤の濃度は、第１の洗浄バッファーより低い。さらに別の実施形態において、第３の洗浄バッファーの塩濃度は第２の洗浄バッファーより低い。さらなる一実施形態において、溶出バッファーはリン酸ナトリウムバッファーである。

精製ｒｈＧＡＬＣを例えばヒトへの点滴に適した状態で提供するためには、界面活性剤の量は少なくなければならない。したがって、一実施形態において、第３の溶出バッファーの界面活性剤の含有量は１％未満、例えば０．０１％未満、例えば０．００１％未満、例えば０．００１％未満である。さらに別の実施形態において、前記界面活性剤は、ｔｗｅｅｎ８０またはｔｗｅｅｎ２０などのｔｗｅｅｎ系界面活性剤である。別の実施形態において、第３の溶出バッファーのｐＨは５〜７、例えば６〜７、または例えば６．２〜６．８である。

溶出工程の効率を上げるために、溶出バッファーは塩を含んでいてもよい。したがって、さらなる一実施形態において、第３の溶出バッファーは少なくとも１００ｍＭの塩、例えばＮａＣｌおよび／またはＫＣｌを含む。ＮａＣｌおよびＫＣｌは含まれていなくてもよいが、その場合、精製物の純度は幾分か低くなる可能性がある。

さらに別の実施形態において、最終精製物に少なくとも１５０ｍＭのマンニトール、例えば少なくとも２００ｍＭのマンニトール、例えば少なくとも２５０ｍＭ、または例えば２００〜４００ｍＭのマンニトールが含まれるように含量の調整を行う。精製物にマンニトールが含まれることによって、凍結乾燥が可能になる。

＜ポスト樹脂工程＞
ウイルスなどの不要な細胞不純物の量を可能な限り抑えるために、さらなる精製を行ってもよい。したがって、一実施形態において、工程ｇ）の後に、第３の溶出物は、フィルターサイズが０．１μｍを超えないフィルターに通される。さらなる一実施形態において、工程ｇ）の後、第３の溶出物は、フィルターサイズが２０ｎｍを超えない、例えば１５ｎｍを超えないサイズ排除フィルター、例えばＰｌａｎｏｖａ １５Ｎフィルターに通される。

さらに別の実施形態において、第３の溶出物は、分子量カットオフ値（ＭＷＣＯ）５０ｋＤａ未満、例えば３０ｋＤａ未満、例えば１５ｋＤａ未満、または例えば１０ｋＤａ未満のメンブレンを用いたタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）による限外濾過／透析濾過工程に供される。さらなる一実施形態において、前記メンブレンは、Ｐｅｌｌｉｃｏｎポリエーテルスルホンメンブレンなどのポリエーテルスルホンメンブレンである。さらに別の実施形態において、前記メンブレンは再生セルロースメンブレンである。

＜付加的な工程＞
本発明の精製物の製品としての品質をさらに向上させるために、得られた精製物をイオン分離に供してもよい。限定はされないが、イオン分離は、捕捉工程と中間工程との間で、中間工程と仕上げ工程との間で、または仕上げ工程で得られた溶出物に対して行ってもよい。

捕捉工程と中間工程の間、または仕上げ工程後にイオン分離を行う場合、例えばＰａｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから市販されているＭｕｓｔａｎｇ（登録商標） Ｑメンブレンなどの陰イオンフィルターまたは陰イオン樹脂を使用してもよい。Ｍｕｓｔａｎｇ Ｑメンブレンは強陰イオン交換体であり、プラスミドＤＮＡ、負電荷を持つタンパク質、ウイルス粒子と効果的に結合する。

中間工程と仕上げ工程の間、または仕上げ工程後にイオン分離を行う場合、Ｃａｐｔｏ Ｑ、Ｇｉｇａ Ｃａｐ Ｑ、Ｑ ＦＦなどの強陰イオン交換（ＡＩＥＸ）樹脂を使用してイオン分離を行ってもよい。このような実施形態において、上記の樹脂は結合方式で用いられる。また、Ｃａｐｔｏ ＤＥＡＥおよびＤＥＡＥ ＦＦなどの弱陰イオン交換樹脂を使用してもよく、特に仕上げ工程で疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を用いる場合はこのような弱陰イオン交換樹脂を使用してもよい。

他の実施形態において、イオン分離は、仕上げ工程直後、例えば前述のエーテル樹脂からの溶出直後に行ってもよい。

別の実施形態において、イオン分離は限外濾過／透析濾過（ＵＦＤＦ）工程の後に行ってもよい。

イオン分離において、種々のバッファーを使用することができる。特定の実施形態において、例えばエーテル樹脂を用いた仕上げ工程の直後にＭｕｓｔａｎｇ Ｑメンブレンを用いてイオン分離を行う場合、陰イオンフィルターまたは陰イオン樹脂を、３．７ｍＭリン酸ナトリウム、５ｍＭグリシン、１０ｍＭマンニトール、０．０７５Ｍ ＮａＣｌ、０．０００５％ ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ６．２で平衡化してもよい。また精製物を陰イオンフィルターまたは陰イオン樹脂に通す前に、３．７ｍＭリン酸ナトリウム、５ｍＭグリシン、１０ｍＭマンニトール、０．０００５％ ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ６．２で、または必要に応じてさらに０．１５Ｍ ＮａＣｌを加えた液を用いて１：１（ｖ：ｖ）で希釈してもよい。

別の実施形態において、例えばＵＦＤＦ工程の後にＭｕｓｔａｎｇ Ｑメンブレンを用いてイオン分離を行う場合、陰イオンフィルターまたは陰イオン樹脂を、３．７ｍＭリン酸ナトリウム、０．２Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭグリシン、１０ｍＭマンニトール、０．０００５％ ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ６．２で平衡化してもよい。また精製物を陰イオンフィルターまたは陰イオン樹脂に通す前に、１Ｍ ＮａＣｌを用いて、導電率が２０ｍＳ／ｃｍ（およそ精製物１容量：１Ｍ ＮａＣｌ０．２容量）になるまで希釈してもよい。

これらの実施形態における精製物は、滅菌濾過前に、導電率を１５ｍＳ／ｃｍ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ）に戻すために、製剤化バッファー（ＮａＣｌを含まない製剤化バッファーなど）で希釈を行ってもよい。

＜組成物＞
本発明の精製ｒｈＧＡＬＣは、例えば純度、特異的酵素活性、分解物の有無などの点でその他の精製ｒｈＧＡＬＣと異なる。したがって、一態様において、本発明はｒｈＧＡＬＣを含む組成物に関する。

特にそのｒｈＧＡＬＣは、本発明の精製プロセスにより得られるものである。

その他の精製ｒｈＧＡＬＣには、ｒｈＧＡＬＣの分解物が含まれている可能性がある。一実施形態において、組成物中の全長型ｒｈＧＡＬＣ（８０ｋＤａ）と主要分解物（５０＋３０ｋＤａ）とのモル比は少なくとも５０：２．５、例えば少なくとも５０：１、例えば少なくとも１００：１、例えば少なくとも２００：１、または例えば５００：１である。別の実施形態において、組成物中の全長型ｒｈＧＡＬＣ（８０ｋＤａ）と２つの主要分解物（３０ｋＤａ＋５０ｋＤａ）との比は少なくとも５０：２．５、例えば少なくとも１００：１、例えば少なくとも２００：１、例えば５００：１である。３０ｋＤａと５０ｋＤａのｒｈＧＡＬＣ分解物は薄いバンドとして確認され、その割合は＜０．５％と推定された（実施例および図５を参照のこと）。

さらなる実施形態において、本発明の組成物は宿主細胞由来タンパク質（ＨＣＰ）をほとんど含んでいない。宿主細胞由来タンパク質などの不純物の含有量を測定する好適な方法は当業者であれば分かるだろう。特に宿主細胞由来タンパク質の量はＥＬＩＳＡで測定してもよい。一般に、宿主細胞由来タンパク質の含有量は５００ｎｇ／ｍｇ以下であれば問題ない。本発明のいくつかの実施形態において、宿主細胞由来タンパク質の含有量は４５０ｎｇ／ｍｇ以下、例えば３００ｎｇ／ｍｇ以下、または例えば２５０ｎｇ／ｍｇ以下である。さらに別の実施形態において、組成物中の宿主細胞由来タンパク質の量は２００ｎｇ／ｍｇ未満であり、例えばｒｈＧＡＬＣ１ｍｇに対して１００ｎｇ未満、例えば４０ｎｇ未満、または例えば３０ｎｇ未満である。実施例から分かるように、ＥＬＩＳＡにより、不純物の量はｒｈＧＡＬＣ１ｍｇ当たりＨＣＰ約３０ｎｇと推定された。

本発明のいくつかの実施形態において、宿主細胞由来タンパク質の含有量は２０ｎｇ／ｍｇ以下である。

さらに別の実施形態において、組成物の酵素活性は少なくとも１５ｋＵ／ｍＬ、または例えば少なくとも３０ｋＵ／ｍＬである。実施例から分かるように、最終精製物の酵素活性は４２．５ｋＵ／ｍＬと推定された。本発明の組成物は、ｒｈＧＡＬＣの単量体（８０ｋＤａ）の含有量が非常に高く、凝集体（ｒｈＧＡＬＣの二量体および多量体）の含有量が非常に低いという特徴がある。この凝集体の量は、例えば目視検査などで検出下限値未満であることが好ましい。そのような場合、本発明の組成物は外観上透明で濁りがない。

また、凝集体の形成の有無や凝集体の量は、５８０ｎｍにおける透過率（Ｔ５８０）として測定することができる。この方法においては、上記の透過率が＞９５％、例えば＞９６％、＞９６．５％、＞９７％、＞９８％、または＞９９％であれば、凝集体の量として問題ないレベルであることを意味する。その他によく用いられる方法はＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）である。

これら以外にも、タンパク質凝集体の量を測定または評価する好適な方法があることは、当業者であれば分かるだろう。そのような方法としては、例えば、動的光散乱法や準可視的粒子（ｓｕｂｖｉｓｕａｌ ｐａｒｔｉｃｌｅ（ＳＶＰ））測定法（ＳＶＰサイズ粒子数測定法）などが挙げられる。

好ましい一実施形態において、本発明の組成物に含まれるｒｈＧＡＬＣの凝集体は、１．５％未満（ｗ／ｗ）、例えば１％（ｗ／ｗ）未満（例えば０．５％（ｗ／ｗ）未満、０．２５％（ｗ／ｗ）未満、０．２％（ｗ／ｗ）未満、０．１％（ｗ／ｗ）未満、０．０５％（ｗ／ｗ）未満、または０．０１％（ｗ／ｗ）未満）である。ｒｈＧＡＬＣの単量体（８０ｋＤａ）の含有量は、少なくとも９５％（ｗ／ｗ）、例えば少なくとも９６％（ｗ／ｗ）、または少なくとも９７％（ｗ／ｗ）、例えば少なくとも９８％（ｗ／ｗ）、好ましくは少なくとも９８．５％（ｗ／ｗ）、少なくとも９９．５％（ｗ／ｗ）、または９９％（ｗ／ｗ）である。

本発明の組成物は治療薬として用いてもよい。したがって、本発明の一態様は、治療薬として使用するための本発明の組成物に関する。さらに別の態様において、本発明は、グロボイド細胞白質ジストロフィー（クラッベ病）の治療に使用するための本発明の組成物に関する。

さらなる一態様において、本発明は、グロボイド細胞白質ジストロフィー（クラッベ病）の治療薬の製造のための本発明の組成物の使用に関する。

本発明は、さらに別の態様において、グロボイド細胞白質ジストロフィー（クラッベ病）を治療する方法および／またはグロボイド細胞白質ジストロフィー（クラッベ病）に伴う症状を軽減もしくは緩和する方法に関し、該方法は、本発明の精製ｒｈＧＡＬＣを含む組成物を、それを必要とする対象に投与する工程を含む。

＜配列＞
配列番号１

配列番号２

本発明の態様のいずれかに記載された実施形態および特徴は本発明の異なる態様にも適用されることに留意されたい。

本願において引用された特許文献および非特許文献はすべて、参照によりその全体が本明細書に援用される。

これより、本発明について以下の実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されない。

動物研究用としての品質要件および純度要件を満たした状態の最終精製物が得られる、組換えヒトガラクトセレブロシドβ−ガラクトシダーゼ（ｒｈＧＡＬＣ）の精製のためのダウンストリームプロセス（ＤＳＰ）を開発し、パイロットスケールで試用した。このプロセスは３つのクロマトグラフィー工程と１つのＵＦＤＦ製剤化工程とからなる。本研究では、容量２０Ｌの流加バッチ式バイオリアクターから得られた新鮮で清澄化された収穫物を、動物研究および例えばヒトの治療プロトコールのためのｒｈＧＡＬＣの生産に最適化されたプロセスを用いてパイロットスケールで精製した。操作手順の概要を図１に示す。

装置、材料、バッファーおよび方法

装置
クロマトグラフィーシステム：
−Ｍａｘｉｍｉｚｅｒ ８０（ＢｉｏＲａｄ）でアップグレードしたＢｉｏＬｏｇｉｃ ＤｕｏＦｌｏｗ
ペリスタルティックポンプ：
−ＭａｓｔｅｒＦｌｅｘ Ｌ／Ｓ 型式７７２００−６０（Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｋｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ）
タンジェンシャルフロー濾過システム：
−内径６ｍｍのチューブを取り付けたペリスタルティックポンプＷａｔｓｏｎ Ｍａｒｌｏｗ ＳｃｉＱ ３２３と圧力計とを備えたＰｅｌｌｉｃｏｎ ２ Ｍｉｎｉ フィルターホルダー（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）
マグネチックスターラー：
−ＭＲ ３００１ ｋ（Ｈｅｉｄｏｌｐｈ）
天秤：
−ＥＡ３５ＥＤＥ−Ｉ 最大秤量３５ｋｇ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）
−ＢＰ１２００ 最大秤量１２００ｇ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）
カラム：
−Ｉｎｄｅｘ ７０／５００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）
ＬＡＦベンチ：
−Ｌａｍｉｎａｒ Ａｉｒ（Ｈｏｌｔｅｎ）

樹脂、フィルターおよび容器
収穫物用フィルター：
−Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋（登録商標） Ｐｏｄ Ｃ０ＨＣ ０．０５４ｍ^２（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）
クロマトグラフィー樹脂：
捕捉工程：
−Ｃａｐｔｏ（登録商標） Ｂｌｕｅ（ｈｉｇｈ ｓｕｂ）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）
中間工程：
−Ｃａｐｔｏ（登録商標） Ａｄｈｅｒｅ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）
仕上げ工程：
−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｅｔｈｅｒ ６５０Ｍ（Ｔｏｓｏｈ）
ＵＦＤＦカセット：
−Ｐｅｌｌｉｃｏｎ ２ ＭＩＮＩ ３０Ｋ（ＭＷＣＯ：３０ｋＤａ、Ｖスクリーン、０．１ｍ^２、カタログ番号：Ｐ２Ｂ０３０Ｖ０１、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）
滅菌濾過：
−０．２２μｍ ＰＥＳ、直径７５ｍｍ（ＮＡＬＧＥＮＥ、カタログ番号：５９５−４５２０）
最終精製物用容器：
−３０ｍＬ滅菌ボトル（Ｎａｌｇｅｎｅ）
−１．８ｍＬ低温用滅菌バイアル（Ｎａｌｇｅｎｅ）

バッファー
バッファーはｐ．ａグレード（微量成分分析において不純物レベルが保証されたグレード）の化学試薬とＭｉｌｌｉ−Ｑグレードの水を用いて調製した。調製したバッファーを０．２２μｍフィルターで濾過し、室温にて最長で５日間保存した。調製処方は各工程の表１〜４に示す。

Ｃａｐｔｏ（登録商標） Ｂｌｕｅバッファー：
ａ）コンディショニング：４０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．１±０．１
ｂ）平衡化：２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１％（ｗ：ｗ） ｔｗｅｅｎ８０（ｔ−８０）、５％（体積比ｖ：ｖ）グリセロール、ｐＨ６．１±０．１
ｃ）洗浄：１００ｍＭリン酸ナトリウム、１．５Ｍ ＮａＣｌ、１０％（ｖ：ｖ）プロピレングリコール（１，２−プロパンジオール）、５％（ｖ：ｖ）イソプロパノール（ＩＰＡ）、０．２％（ｗ：ｗ） ｔ−８０、ｐＨ７．０±０．１
ｄ）洗浄２：平衡化バッファー
ｅ）溶出バッファー：２０ｍＭリン酸ナトリウム、５０％（ｖ：ｖ）プロピレングリコール、０．５％ ｔ−８０、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ６．５±０．１
ｆ）溶出物混合：２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１．３％ ｔ−８０、ｐＨ６．１±０．１

Ｃａｐｔｏ（登録商標） Ａｄｈｅｒｅバッファー：
ａ）平衡化バッファー：２０ｍＭリン酸ナトリウム、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０５％（ｗ：ｗ） ｔ−８０、ｐＨ６．１±０．１
ｂ）洗浄１バッファー：２００ｍＭ酢酸ナトリウム、１Ｍ ＮａＣｌ、５％（ｖ：ｖ） ＩＰＡ、０．５％（ｗ：ｗ） ｔ−８０、ｐＨ４．７±０．１
ｃ）洗浄２バッファー：１０ｍＭ酢酸ナトリウム、０．１％（ｗ：ｗ） ｔ−８０、ｐＨ４．７±０．１
ｄ）洗浄３バッファー：５０％洗浄２バッファー、５０％溶出バッファー
ｅ）溶出バッファー：１０ｍＭ酢酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％（ｗ：ｗ） ｔ−８０、５％（ｖ：ｖ） ＩＰＡ、４０％（ｖ：ｖ）プロピレングリコール、ｐＨ４．５５±０．１
ｆ）溶出物混合バッファー：１４０ｍＭリン酸ナトリウム、０．０００５％（ｗ：ｗ） ｔ−８０、ｐＨ６．５±０．２

Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｅｔｈｅｒ ６５０Ｍバッファー：
ａ）コンディショニングバッファー：３．３Ｍ ＮＨ_４Ａｃ、２．６Ｍ ＮＨ_４Ｃｌ、０．１％（ｗ：ｗ） ｔ−８０、ｐＨ６．１±０．１
ｂ）平衡化バッファー：１．６Ｍ ＮＨ_４Ａｃ、１．２Ｍ ＮＨ_４Ｃｌ、５０ｍＭリン酸ナトリウム、０．０００５％（ｗ：ｗ） ｔ−８０、ｐＨ６．４±０．１
ｃ）洗浄１：３．３Ｍ ＮＨ_４Ａｃ、２．３Ｍ ＮＨ_４Ｃｌ、０．５％（ｗ：ｗ） ｔ−８０、ｐＨ６．５
ｄ）洗浄２：平衡化バッファー
ｅ）洗浄３：７０％平衡化バッファー、３０％溶出バッファー
ｆ）溶出：５０ｍＭリン酸ナトリウム、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０００５％（ｗ：ｗ） ｔ−８０、ｐＨ６．４±０．１

ＵＦＤＦバッファー：
平衡化用および透析濾過用バッファー：３．７ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭグリシン、１０ｍＭマンニトール、０．０００５％（ｗ：ｗ） ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ６．２±０．１５

−定置洗浄バッファー：
−洗浄バッファー（Ｃａｐｔｏ Ｂｌｕｅ用、Ｃａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅ用およびＵＦＤＦ用）：１Ｍ ＮａＯＨ
−洗浄バッファー（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｅｔｈｅｒ用）：０．５Ｍ ＮａＯＨ
−中和バッファー（全工程共通）：１４０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６．６±０．２
−保存バッファー（Ｂｌｕｅ用、Ａｄｈｅｒｅ用およびＥｔｈｅｒ用）：２０％エタノール
−保存バッファー（ＵＦＤＦカセット用）：０．１Ｍ ＮａＯＨ

＜インプロセス分析＞
酵素活性の測定は、手順６５のガラクトセレブロシダーゼ（ＧＡＬＣ）分析のためのＨＮＧアッセイにより行った。検量線の作成には、ｒｈＧＡＬＣの社内標準物質ＳｔＧ０１を用いた。

タンパク質濃度：タンパク質濃度の測定は、手順７５のｒｈＧＡＬＣのタンパク質定量法によりＰｉｅｒｃｅ ６６０ｎｍ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙを用いて行った。検量線の作成には、社内標準物質ＳｔＧ０２の希釈液を用いた。ＳｔＧ０２のタンパク質濃度の測定は、社外（ウプサラ大学アミノ酸分析センター（スウェーデン））にてアミノ酸分析（ＡＡＡ）により行った。情報取得のために、Ａ２８０を測定し、得られた吸光度をヒトＧＡＬＣの理論上の吸光係数２．５で割った値を求めた。

比活性は、酵素活性をｒｈＧＡＬＣのタンパク質濃度で除して算出した。

同一性の分析は、手順７０の組換えヒトガラクトセレブロシダーゼ（ｒｈＧＡＬＣ）のウェスタンブロット解析により行った。検出には、プロテインＡセファロースで精製した、社内標準物質ＳｔＧ０２に対して作製されたポリクローナル抗体を使用した。

等電点電気泳動（ＩＥＦ）は手順７４に従って、ｐＨ３〜１０のｐＨ勾配を持つＮｏｖｅｘ ＩＥＦゲルを用いて行い、これによりｒｈＧＡＬＣの等電点を評価した。最終精製物とｒｈＧＡＬＣの社内標準物質ＳｔＧ０３とを比較し、これを同一性のもう一つの指標とした。

純度分析は、手順６９に従って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＮｕＰＡＧＥ ４〜１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル、ＭＯＰＳバッファー）およびＣｏｌｌｏｉｄａｌ Ｂｌｕｅ染色により行った。

不純物の分析は、手順４３のＣＨＯ宿主細胞由来タンパク質の測定のためのＥＬＩＳＡにより行った。

Ｔｗｅｅｎ濃度の定量は、手順７３に従って、ＲＰ−ＨＰＬＣ法により行った。

非変性ＰＡＧＥは、情報取得のために、ｒｈＧＡＬＣの構成体の指標として行った。非変性ＰＡＧＥの分析は、メーカー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の取扱説明書に従って行った。

浸透圧（Ｖａｐｒｏ製浸透圧計）およびｐＨ（Ｍｅｔｒｏｈｍ）の測定は、最終精製物ＴＧ１１０６に対して行った。

糖組成は、主に指図２５（その他の標準物質希釈液）に従って、２−ＡＡで標識された遊離単糖の蛍光を検出するＨＰＬＣにより求めた。

収穫物：
バイオリアクターを閉じた後、バイオリアクター内の収穫物に酢酸ナトリウム、ｐＨ５を加えて、酵素の至適ｐＨである７未満に保つ。このようにしてｐＨを安定化させた収穫物をバイオリアクターから送り出し、デプスフィルターバッファーを通すことにより細胞を除去する。濾過後にフィルターをコンディショニングバッファーですすぐ。収穫物とコンディショニングバッファーの最終混合比は２：１（ｗ：ｗ）程度とすべきである。

プロセス条件に関する一般的な情報：
各クロマトグラフィー工程の平衡化、ローディングおよび平衡化洗浄は、ペリスタルティックポンプを用いて最大流速１００ｍＬ／分（１５０ｃｍ／時に相当）で実施する。各工程のその他の部分は、Ｍａｘｉｍｉｚｅｒ ８０（ＢｉｏＲａｄ）でアップグレードしたＢｉｏＬｏｇｉｃ ＤｕｏＦｌｏｗを用いて最大流速８０ｍＬ／分（１２５ｃｍ／時に相当）で実施する。より適切なクロマトグラフィーシステムを用いれば、上記の流速は調整可能であるが、プロピレングリコール（ＰＧ）含有バッファーは表示した流速で通液する必要がある。

各クロマトグラフィー工程はすべて結合方式で実施され、それぞれ複数回の洗浄工程を含む。本プロセスの初めの２工程における疎水性のｒｈＧＡＬＣの溶出には高濃度のＰＧが必要である。これらの工程における精製物は、酵素活性が保持されるよう、あらかじめバッファーが充填された容器に回収される。仕上げ工程における溶出には有機溶媒は不要である。

Ｃａｐｔｏ Ｂｌｕｅコンディショニングバッファー以外のバッファーはすべて、界面活性剤（ｔｗｅｅｎ８０）を含むが、これはｒｈＧＡＬＣの酵素活性が保持されるために必要であると考えられる。収穫物の溶媒にはプルロニックが含まれており、Ｃａｐｔｏ Ｂｌｕｅコンディショニングではこれがｔｗｅｅｎの代替的な役割を担っている。また、コンディショニングでｔｗｅｅｎを使用しない理由としては、室温における収穫物の保存時間が約６時間を超えるとｔｗｅｅｎにより収穫物が乳白光を呈する恐れがあるということも挙げられる。

＜Ｃａｐｔｏ Ｂｌｕｅ＞
Ｃａｐｔｏ（登録商標） Ｂｌｕｅは、芳香環相互作用および静電相互作用による結合を形成するアフィニティバイオプロセス担体である。

コンディショニングした収穫物を清澄化した後、２４時間以内にＣａｐｔｏ Ｂｌｕｅカラムにロードする。容量２０Ｌのバイオリアクターを用いた場合、パイロットスケール（７４０ｍＬ）でＣａｐｔｏ Ｂｌｕｅを３サイクル実施する必要がある。カラムを平衡化バッファー、および１０％プロピレングリコール（ＰＧ）と５％イソプロパノール（ＩＰＡ）とを含む洗浄バッファーで洗浄する。５０％のＰＧを含むバッファーを用いて溶出を行い、溶出物をあらかじめバッファーが充填された容器に回収する。溶出物混合バッファー充填容器に回収する目的は３つある。
１）ｒｈＧＡＬＣの酵素安定性が保持されるようＰＧ含量を下げる。
２）ウイルス不活性化専用工程として機能させる。精製物プールにおける界面活性剤の最終濃度は１％であり、この精製物プールを室温で１６時間超保存した。
３）ＤＳＰで次の工程にあたるＣａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅのために、精製物プールをコンディショニングする。

上述した通り、Ｃａｐｔｏ Ｂｌｕｅからの精製物を、溶出物混合バッファー中に回収してもよい。精製物プールのｔｗｅｅｎの最終濃度は１％であり、この精製物プールを室温で１６〜２４時間保存することにより、この工程がウイルス不活性化専用工程として機能する。

＜Ｃａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅ＞
Ｃａｐｔｏ（登録商標） Ａｄｈｅｒｅは、マルチモードの機能性を有する強陰イオン交換バイオプロセス担体であり、イオン相互作用、水素結合および疎水性相互作用による結合を形成する。

Ｃａｐｔｏ Ｂｌｕｅからの精製物を、最長で４日間の待機時間を経た後、Ｃａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅカラムに３サイクル連続してロードする。待機時間においては、まず室温で１８〜２０時間保存し、この工程はウイルス不活性化工程として機能する。待機時間がこれより長くなる場合は、精製物プールを５±３℃の場所に移動する。そして、導入開始の８〜１５時間前に室温条件に戻して、精製物プールの温度を室温に戻しておく。精製物プールをｐＨ６．１でロードする。イオン強度の高い条件下、ＩＰＡで洗浄を行ってｐＨを４．７に急激に低下させた後、イオン強度の低い条件下で洗浄を行う。４０％のＰＧを含むｐＨ４．５５のバッファーを用いて溶出を行い、溶出物をあらかじめバッファーが充填された容器に回収することにより、ｐＨを上げてＰＧ濃度を下げることができるため、ｒｈＧＡＬＣの酵素活性が保持される。

＜Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｅｔｈｅｒ＞
Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｅｔｈｅｒ ６５０Ｍは、機械的安定性および化学的安定性の高いメタクリル酸ポリマー（粒度６５μｍ）である。Ｅｔｈｅｒは、Ｔｏｓｏｈの疎水性相互作用リガンドの中で最も親水性が高く、極めて疎水性が高いタンパク質の精製に使用される製品である。

Ｃａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅからの精製物を、室温で最長で２４時間または５±３℃で最長で４日間保存する。低温で保存した場合は、導入開始の８〜１５時間前に室温条件に戻して、精製物プールの温度を室温に戻しておく。次いで、精製物プールと、酢酸アンモニウム、塩化アンモニウムおよびｔｗｅｅｎをいずれも高濃度で含むＥｔｈｅｒコンディショニングバッファーとを１：２．５（ｗ：ｗ）の割合で混合する（３サイクルとも）。Ｅｔｈｅｒカラムを、含有するｔｗｅｅｎの濃度がコンディショニングを行った導入試料の２００分の１であるバッファーで平衡化する。ローディング後、カラムを平衡化バッファーで洗浄する。次の洗浄工程によって、ｔｗｅｅｎ濃度と塩濃度を上げる。次いで、平衡化バッファーで長時間洗浄して、再びｔｗｅｅｎ濃度を下げた後、平衡化バッファーと溶出バッファーとの混合液で洗浄することにより、アンモニウム塩濃度を下げる。溶出は、低濃度（０．０００５％）のｔｗｅｅｎと塩化ナトリウムとを含むリン酸ナトリウムバッファーを用いてｐＨ６．４で実施する。

＜Ｐｌａｎｏｖａ １５Ｎウイルス濾過＞
生産スケールにおいては、仕上げ工程に続いて、ウイルス除去専用工程としてＰｌａｎｏｖａ １５Ｎによるナノ濾過を実施する。

＜ＵＦＤＦ＞
３サイクル分の仕上げ工程精製物プールをまとめてプールし、これに対して、分子量カットオフ値３０ｋＤａのＰｅｌｌｉｃｏｎポリエーテルスルホンメンブレンを用いたタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）による限外濾過／透析濾過（ＵＦＤＦ）を１サイクル実施して製剤化を行う。供給側チャネルはオープンチャネルを有するＶタイプであり、カセットの面積は０．１ｍ^２である。ポンプは２３０ｒｐｍに設定し、膜間差圧（ＴＭＰ）を０．５ｂａｒ（入口圧０．６／出口圧０．４）とする。メンブレンを製剤化バッファーで平衡化した後、初期バッファーを、希釈後濃縮（ＵＦ）および７倍の透析濾過（ＤＦ）処理により交換する。全体で８倍量のバッファーが交換される。

＜濾過および充填＞
ＵＦＤＦ精製物（濃縮物）を、ＬＡＦベンチ内で無菌条件下、０．２２μｍのＰＥＳフィルターを用いて濾過する。最終精製物を様々な容量（１バイアルまたは１ボトル当たり０．２５〜２０ｍＬ）の滅菌容器に充填する。最終精製物をＴＧ１１０６と命名し、−８０±１０℃で凍結保存する。

結果の概要
容量２０Ｌのバイオリアクターから得られた清澄化収穫物から最終精製物に至るまでのダウンストリームプロセス全体の収率は活性ベースで７４％であった。およそ１９．５Ｌの清澄化収穫物の総活性は２３００万単位であった。最終精製物（ＴＧ１１０６）の総活性は１７００万単位であり、１．０ｇの純粋なｒｈＧＡＬＣが回収された。

＜活性収率および条件＞
総収率（７４％）は、清澄化収穫物から最終精製物に至るまでの収率として算出した。これは、清澄化工程についてはまだ決まっておらず、本研究の一部ではないことが理由である。

各クロマトグラフィー工程は３サイクルずつ実施した。仕上げ工程の３つの精製物をまとめてプールし、ＵＦＤＦを１サイクル実施して製剤化した。ＵＦＤＦ精製物を滅菌濾過して複数の容器に分配した。各工程および各サイクルにおける％活性に基づく収率を図２に示す。清澄化収穫物から最終精製物までの総活性を図３に示す。

捕捉工程（Ｃａｐｔｏ Ｂｌｕｅ）の平均収率は８４±８．１％であった。中間工程（Ｃａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅ）の平均収率は８７±３．５％であった。仕上げ工程（Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｅｔｈｅｒ）の平均収率は７６±０．６％＊であった。ＵＦＤＦ工程の収率は１１７％であった。最終滅菌濾過の収率は１０２％であった。

＜分析結果＞
プロセス中に採取したサンプルおよび最終精製物はそれぞれ、上記に定めた分析方法により分析した。下表は、最終精製物ＴＧ１１０６の分析結果をまとめたものである。

同一性−ウェスタンブロット
得られた精製物がヒトＧＡＬＣであることをウェスタンブロット解析により確認した。

仕上げ工程精製物、ＵＦＤＦ精製物および最終精製物中のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）メンブレンに電気泳動的に転写した。ｒｈＧＡＬＣは、ｒｈＧＡＬＣの社内標準物質ＳｔＧ０２に対して作製された抗ＧＡＬＣウサギポリクローナル抗体を用いて検出した。使用した抗体はプロテインＡセファロースカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製したものである。この抗体は、８０ｋＤａのＧＡＬＣだけでなく、５０ｋＤａや３０ｋＤａのＧＡＬＣ分解物も検出する。転写の確認と見かけの分子量（ＭＷ）の推定を行うために、着色済みのラダー状のタンパク質マーカーを用いた。

図４は、最終精製物中に８０ｋＤａのｒｈＧＡＬＣが検出されたブロッティング像を示したものである。このタンパク質サンプルのローディング量では分解物は検出されなかった。社内標準物質であるＳｔＧ０２およびＳｔＧ０３は、基準物質として分析に用いた。これらの標準物質は、アミノ酸分析を行って実際のアミノ酸組成がヒトＧＡＬＣの理論上の組成に関連していることが確認されている物質である。図５は過剰量のタンパク質をロードした結果であり、８０ｋＤａのｒｈＧＡＬＣ以外に、５０ｋＤａと３０ｋＤａの２つの分解物が薄いバンドとして確認された。さらに、見かけの分子量が１６０ｋＤａのバンドも確認され、これは還元条件下においてＳＤＳで完全には可溶化されずに残ったｒｈＧＡＬＣの二量体であると考えられた。

等電点電気泳動
最終精製物ＴＧ１１０６の等電点は６．３５と算出された。

ＴＧ１１０６および標準物質であるＳｔＧ０３は、ｐＨ３〜１０のｐＨ勾配を持つ等電点電気泳動（ＩＥＦ）ゲル上で電荷に応じて分離された。電気泳動は、低温（氷上）条件下、１００Ｖで１時間、その後２００Ｖで１時間、最後に５００Ｖで２時間実施した。このゲルをＣｏｌｌｏｉｄａｌ Ｂｌｕｅで染色した。染色像を図６に示す。計算による等電点（ｐＩ）は、ＧＡＬＣの理論上のｐＩである５．９より高く、６．３５と推定された。ＴＧ１１０６とＳｔＧ０３の間に差は見られなかった。

純度−ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
最終精製物ＴＧ１１０６の純度は＞９９％と推定された。ｒｈＧＡＬＣの分解物の割合は＜０．５％と推定された。

プロセス中に採取したサンプルを、ＭＯＰＳバッファーとＮｕＰＡＧＥ ４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルとを用いた電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により、主にサイズに応じて分離した。ｒｈＧＡＬＣおよび潜在性の不純物はＣｏｌｌｏｉｄａｌ Ｂｌｕｅで視覚化することにより確認した。Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ Ｂｌｕｅは、タンパク質の種類に依存しない動的線形反応を有する。これは、タンパク質濃度が十分であれば、Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ Ｂｌｕｅ染色法の方が銀染色法より純度の推定に望ましいことを意味する。ｒｈＧＡＬＣの見かけの分子量（ＭＷ）は８０ｋＤａであり、その分解物の見かけの分子量は５０ｋＤａおよび３０ｋＤａである。

図７はプロセス中に採取したサンプルのスキャン結果を示す。図から分かるように、Ｃａｐｔｏ Ｂｌｕｅ工程後およびＣａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅ工程後には不純物が認められるが、Ｅｔｈｅｒ工程後はｒｈＧＡＬＣのみ認められる。１６０ｋＤａ付近のバンドは、ウェスタンブロットでも確認される（図６も参照のこと）ことから、ｒｈＧＡＬＣの二量体と考えられる。図８および図９は、純度を推定するために最終精製物ＴＧ１１０６と社内標準物質ＳｔＧ０３とを比較した図である。ＴＧ１１０６のローディング量が多い場合において、ｒｈＧＡＬＣ以外に、ローディング量が最も少ないＳｔＧ０３のバンドより高強度のバンドは見られなかった。最も高い濃度のＴＧ１１０６では、いずれのゲルでもｒｈＧＡＬＣ二量体の直下に想定外の二重のバンドが見られる。このバンドはローディング量が２番目に多い場合では全く見られないことから、アーチファクトである可能性が高い。ローディング量が最も多い場合にはこの想定外の二重のバンドが存在することから、図１０ではローディング量が２番目に多い場合のデータから純度を算出した。１００％−０．８％（０．１４μｇ／１６μｇ）＝純度９９．２％。過剰量をローディングした場合は、３０ｋＤａと５０ｋＤａのｒｈＧＡＬＣ分解物が低強度のバンドとして確認された。最も低い濃度の標準物質において、８０ｋＤａのバンドより高強度のバンドが見られなかったことから、分解物の割合は＜０．５％であることが示唆される。１６０ｋＤａのバンドはアーチファクトと考えられる。高濃度のｒｈＧＡＬＣにおいては、ｒｈＧＡＬＣの多量体がモノマー化するのに必要なＳＤＳがサンプルバッファー中に十分量存在していなかったということが考えられる（非変性ＰＡＧＥ、７．２．５を参照のこと）。しかし、そうでなければ、ローディング量が１６μｇのＴＧ１１０６における「二量体」の強度は、ローディング量が０．３６μｇのＳｔＧ０３における８０ｋＤａのバンドと同程度であると判断できるため、最終精製物中には二量体が約２％存在すると考えられる。

非変性ＰＡＧＥ
非変性ＰＡＧＥにより、ｒｈＧＡＬＣの主要な構成体は二量体であるものの、最大１０分子のｒｈＧＡＬＣから形成される多量体も存在することが分かる。

非変性ＰＡＧＥは、ｒｈＧＡＬＣの構成体の情報を取得するために中性のｐＨで行った。図１０から分かるように、ｒｈＧＡＬＣはラダー状に示される複数の構成体からなる。最終精製物ＴＧ１１０６とｒｈＧＡＬＣの社内標準物質ＳｔＧ０３とを比較したところ、同様のパターンを示すことが確認された。最下位のバンド（見かけの分子量：８０〜１００ｋＤａ）はｒｈＧＡＬＣ単量体であり、２番目に低い位置にあるバンドはｒｈＧＡＬＣ二量体であり、これらに続いて、ｒｈＧＡＬＣ単量体および／または二量体がさらに付加された構成体が見られる。ゲル上で最大７つの形態のｒｈＧＡＬＣが確認された。ｒｈＧＡＬＣ二量体は、ローディング量に関係なく最も顕著なバンドとして確認された。以前に実施された電子顕微鏡による分析によって、ｒｈＧＡＬＣにおいて複数の形態が存在すること、そしてそのうち主要な形態（ｒｈＧＡＬＣの二量体と考えられる）の粒径は約２０ｎｍであることが確認されている。

不純物−ＨＣＰ ＥＬＩＳＡ
最終精製物ＴＧ１１０６中のｒｈＧＡＬＣ１ｍｇに対するＣＨＯ細胞由来の宿主細胞由来タンパク質（ＨＣＰ）の残留量を定量したところ、３０ｎｇであった。

チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の宿主細胞由来タンパク質（ＨＣＰ）を不純物の指標として分析した。Ｃｙｇｎｕｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから購入したジェネリック抗体をＥＬＩＳＡで用いた。使用した抗体は、ＣＨＯ細胞の細胞内タンパク質（Ｃ００１６−ＰＡ）と、ＣＨＯ細胞から通常分泌される細胞タンパク質（３Ｇ ００１６−ＡＦ）とを用いて作製されたものである。使用した標準物質は、親ＣＨＯ細胞（ＤＧ４４株）を溶解して得られたＨＣＰ１０％と、該細胞から分泌されたＨＣＰ９０％とを用いて調製したものである。ＨＣＰの測定は、Ｅｔｈｅｒ工程後、ＵＦＤＦ工程後および最終精製物において実施した。ｒｈＧＡＬＣの社内標準物質であるＳｔＧ０２およびＴｏｘ ＡＳＡは、基準物質として分析に用いた。表２３から分かるように、精製プロセスによって、最終精製物ＴＧ１１０６中のｒｈＧＡＬＣ１ｍｇに対するＨＣＰの量は３０ｎｇに減少した。Ｅｔｈｅｒ精製物と最終精製物におけるＨＣＰの残留量は同程度であり、このことはＵＦＤＦ工程によってＨＣＰがさらに除去されるわけではないことを示している。

単糖組成
予備分析により、糖鎖付加度は７％と推定され、ｒｈＧＡＬＣ１ｍｏｌあたり２〜３ｍｏｌのマンノース−６−リン酸基が含まれていた。

予備分析は、最終精製物ＴＧ１１０６を対象として１回のみ行った。この分析により、ｒｈＧＡＬＣが約７％（ｗ：ｗ）の糖類を有することが分かる。この糖鎖付加は、マンノース濃度の高い糖鎖付加である可能性が高い。この予備分析のデータによって示される、ｒｈＧＡＬＣ１ｍｏｌ当たりに含まれる各単糖のｍｏｌ数は以下の通りである。
グルコースアミン（ＧＬＣＮ）：９ｍｏｌ／ｍｏｌ
ガラクトサミン（ＧＡＬＮ）：０〜０．３ｍｏｌ／ｍｏｌ
ガラクトース（ＧＡＬ）：１ｍｏｌ／ｍｏｌ
マンノース（ＭＡＮ）：１２ｍｏｌ／ｍｏｌ
マンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）：２〜３ｍｏｌ／ｍｏｌ
フコース（ＦＵＣ）：０〜０．５ｍｏｌ／ｍｏｌ

＜考察＞
３つのクロマトグラフィー工程で構成される本明細書に記載の最適化されたプロセスにより、動物研究用、さらには臨床研究用としての品質要件を満たす純度の高いｒｈＧＡＬＣ精製物が得られた。ＤＮＡ分析は未実施である。

バイオリアクターＢ５：１９からの収率を、清澄化収穫物と最終精製物の酵素活性に基づいて計算したところ、７４％であった。ＧＡＬＣが極めて疎水性の高いタンパク質であることを考えると、これは特に満足すべき結果である。

収穫物の清澄化は、満足できる収率を得られていない唯一の工程である。改善可能な点の検討がまだ行われていないため、ＤＳＰの収率は、清澄化およびコンディショニングを経た収穫物をベースとして算出した。デプスフィルトレーションにより、活性が約２０％失われた。また、過去の研究により、ＴＦＦで清澄化収率が向上したことが示されている。清澄化を含めた場合の総収率は５８％であった。

ＧＡＬＣの理論上のｐＩは５．９であるが、実測のｐＩは６．３であった。ｒｈＧＡＬＣは酸性のＭ６Ｐやシアル酸を含んでいることから、これは意外な結果であった。本研究より前に行われた実験から、ｒｈＧＡＬＣがｐＨ感受性物質であること、また長期保存に際してはｐＩ付近であるｐＨ６．０〜６．６においてのみ安定に保たれることが示されている。理論的には、析出が起こらないように、ＤＳＰではｐＩ付近のｐＨは避けるべきであるが、ｒｈＧＡＬＣのＤＳＰにおいては、ｐＩ付近で維持することが唯一の選択肢である。ＤＳＰのプロセス全体を経て得られた精製物は透明であり、乳白光の傾向は見られなかった。ｐＩが高かったことは、ｔｗｅｅｎとｒｈＧＡＬＣとのミセル形成により露出しているアミノ酸が予想とは異なっていたとすれば説明できる。Ｔｗｅｅｎは、酵素活性の維持を目的として、すべてのＤＳＰバッファー（プルロニックがｔｗｅｅｎの代替的な役割を担うＢｌｕｅのコンディショニングバッファーは除く）に添加されている。安定性を維持するためのｔｗｅｅｎの最小濃度の検討はまだ行われていない。

捕捉工程および中間工程における溶出はいずれも複雑であった。プロピレングリコール（ＰＧ）は両工程の溶出バッファーの必須成分であった。さらに、最適な収量を得るためには、ＰＧ以外の添加物を使用したり、慎重にバッファーの最適化をはかることが必要であった。欠点としては、疎水性の高い不純物がｒｈＧＡＬＣともに溶出する可能性がある点が挙げられる。捕捉工程と中間工程を経た後の不純物として、７０ｋＤａの疎水性タンパク質であるプロサポシンが（サポシンＡ抗体を用いたウェスタンブロットにより）確認された。高濃度のＰＧはｒｈＧＡＬＣの酵素活性に最適な条件ではないため、溶出物はあらかじめバッファーが充填された容器に回収した。

本プロセスに関する工程毎の補足説明：

捕捉工程（Ｃａｐｔｏ（登録商標） Ｂｌｕｅ）により、この工程の目的である、酵素の安定化および培地の色の除去が達成された。溶出バッファーを正確に調製することが収率の面から特に重要であった。溶出バッファーは５０％（ｖ：ｖ）のプロピレングリコールを含有する必要があり、これはバッファー１Ｌ当たり５２１ｇに相当する。

中間工程（Ｃａｐｔｏ（登録商標） Ａｄｈｅｒｅ）により、不純物の大部分が除去された。溶出には酸性条件が必要であり、タンパク質が析出しないように、イオン強度の高いバッファーを用いて、速やかに酸性条件へと変化させることが重要であった。次いで、バッファーをイオン強度の低い酸性バッファーに変えた。この理由としては、さらなる不純物の除去が可能であることが挙げられ、さらに、目的物をイオン強度の低い酸性条件下におくことで、溶出時にｐＨ６．５のバッファーが充填されている容器に回収された際にｐＨを速やかに＞６に戻すことが可能であるということも理由として挙げられる。

Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｅｔｈｅｒにより、ＰＧやＩＰＡなどの有機溶媒を使用せずに水性バッファーを用いて十分な収率を達成できただけでなく、この段階まで残っていた疎水性ＨＣＰを最終的に除去することもできた。利点としては、塩化ナトリウムを含有するリン酸バッファーを用いた溶出で満足できる収率を達成できたことが挙げられる。欠点としては、ｒｈＧＡＬＣの結合に高い塩濃度を要した点が挙げられる。また、大量のコンディショニングバッファーを要したため、ローディング時間が長くなった。この工程は、ｒｈＧＡＬＣをｒｈＧＡＬＣに類似した性質を持つ不純物から分離する手段として有効であった。不純物を十分に除去するために、洗浄・すすぎサイクルにおいてｔｗｅｅｎ濃度と塩濃度を繰り返し変化させることが重要であった。Ｅｔｈｅｒ工程後、プロサポシンは確認されなかった。

２つの専用工程、すなわちウイルス不活性化工程およびウイルス除去工程は、生産スケールにおけるプロセスの一部である。ウイルス添加試験（スパイク試験）は実施していないが、収率と透過流速（フラックス）の点から、これらの工程は有望であると考えられる。界面活性剤による不活性化工程は、捕捉工程における溶出に合わせて行った。高濃度のｔｗｅｅｎを使用したものの、中間工程カラムへの結合に対する悪影響は見られず、室温で２４時間保存した後も（その後さらに３日間５℃で保存した場合も）酵素活性が保持されていた。ウイルス濾過工程（Ｐｌａｎｏｖａ １５Ｎ）は、Ｅｔｈｅｒ工程後に組み込むことを予定しているが、これは、過去の研究で実現可能であることが示されているため、今回再実験は行わなかった。大規模生産のための予備的検討においては、８０Ｌの精製物を１ｍ^２のＰｌａｎｏｖａ １５Ｎを用いて濾過した場合、およそ５時間で濾過が完了すると概算されている。

ＶスクリーンのＭＷＣＯ３０ｋＤａのフィルターを用いたＵＦＤＦにより、仕上げ工程後の製剤化および濃縮を行った。オープンチャネルを有するＶスクリーンフィルターは、最適化検討に大量の精製物を必要とするパイロットスケール用のもの（０．１ｍ^２）のみ入手可能である。過去の研究で３回行ったＵＦＤＦをベースに、少しずつ条件を修正してきた。ＵＦＤＦの欠点としては、ｔｗｅｅｎの蓄積が挙げられる。Ｅｔｈｅｒ精製物の洗浄および溶出は、ｔｗｅｅｎが０．０００５％しか含まれていないバッファーで行った。Ｅｔｈｅｒ精製物中のｔｗｅｅｎの定量は困難であるが、推定で約０．００３％であった。ＵＦＤＦ／製剤化バッファーのｔｗｅｅｎ濃度は０．０００５％であった。８倍量のバッファー交換で約７倍に濃縮されたことにより、ｔｗｅｅｎの濃度は約０．０２５％となった。ＵＦＤＦ精製物は０．２２μｍのフィルターで容易に濾過されたため、濾過によってロスすることなく最終精製物を得ることができた。

予備データから、製剤化バッファーにおける上記のｔｗｅｅｎ濃度と他の成分との組み合わせは、５℃、−２０℃、−８０℃のいずれの温度で長期保存する場合にもｒｈＧＡＬＣの安定性を保つために最適であることが示唆されている。マンニトールの濃度を２５０ｍＭに上げれば、精製物の凍結乾燥が可能である。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＣｏｌｌｏｉｄａｌ Ｂｌｕｅ染色によって、純度の高い（＞９９％）最終精製物が得られたことが示された。３０ｋＤａと５０ｋＤａのｒｈＧＡＬＣ分解物は薄いバンドとして確認することができ、その割合は＜０．５％であると推定された。８０ｋＤａのｒｈＧＡＬＣ以外で最も顕著に（約２％）確認されたタンパク質は１６０ｋＤａのｒｈＧＡＬＣであり、これは高濃度のｒｈＧＡＬＣをＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーと混合した場合のみ観察された。ウェスタンブロット解析より、このタンパク質はｒｈＧＡＬＣを含むことが確認され、そしておそらく、還元条件下にてＳＤＳで可溶化されなかった二量体である。この「二量体」は単なるアーチファクトであると考えられる。中性のｐＨで行った非変性ＰＡＧＥによって、ｒｈＧＡＬＣは、ｒｈＧＡＬＣの単量体から最大１０分子のｒｈＧＡＬＣで構成される多量体に至る複数の構成体を有することが示された。最も多い構成体は二量体であるように思われる。

＜結論および概要＞
王立工科大学（ストックホルム（スウェーデン））にて、容量２０Ｌのバイオリアクターを１台使用して、組換えヒトＧＡＬＣを発現するＣＨＯ細胞を培養した。１９．５Ｌの収穫物を、Ｃａｐｔｏ Ｂｌｕｅ、Ｃａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｅｔｈｅｒの３つのクロマトグラフィー工程からなるダウンストリームプロセスにより精製し、１７００万単位、すなわち１．０ｇの純粋なｒｈＧＡＬＣを得た。いずれの工程も結合方式で実施した。１％ ｔｗｅｅｎ８０の存在下、室温で１６〜２４時間インキュベーションするウイルス不活性化工程をＣａｐｔｏ Ｂｌｕｅの後に行った。精製物をタンジェンシャルフロー濾過で製剤化し、滅菌濾過して最終精製物ＴＧ１１０６を得た。

バイオリアクターに酢酸ナトリウムを加えることにより収穫物を安定化させた後、デプスフィルトレーションによる清澄化および捕捉工程カラムであるＣａｐｔｏ Ｂｌｕｅへの結合に向けてのコンディショニングを行った。コンディショニング後の収穫物を、２４時間以内に７３０ｍＬのＣａｐｔｏ Ｂｌｕｅカラムに３回に分けてロードした。目的物を５０％プロピレングリコール含有バッファーで溶出して、「３つの目的」を有するバッファーに回収した。「３つの目的」とは、プロピレングリコール濃度を低下させること、ウイルス不活性化専用工程として機能するためにｔｗｅｅｎ濃度を上昇させること、次工程の導入試料のコンディショニングを行うことである。コンディショニング後の導入試料を、７３０ｍＬのＣａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅカラムに３サイクル連続してロードした。目的物を酸性のｐＨでプロピレングリコールを用いて溶出し、活性が保持されるようプロピレングリコールの濃度を下げてｐＨを高くしたバッファーに回収した。さらに、これを酢酸アンモニウムと塩化アンモニウムとを含むバッファーと混合し、このコンディショニングを行った導入試料を、５４０ｍＬのＴｏｙｏｐｅａｒｌ Ｅｔｈｅｒカラムに３サイクル連続してロードした。目的物を、塩化ナトリウムと低濃度のｔｗｅｅｎとを含むリン酸バッファーで溶出した。仕上げ工程後にウイルス濾過工程を組み込むことを予定しているが、今回の研究では組み込まなかった。仕上げ工程精製物をプールし、ＵＦＤＦによるバッファー交換と濃縮とを経て、純粋なｒｈＧＡＬＣの長期保存に最適である製剤化バッファーに回収した。ＵＦＤＦ精製物を滅菌濾過して最終精製物を得た。最終精製物を所与の分析方法により分析した。タンパク質濃度は２．５ｍｇ／ｍＬであり、酵素活性は４２．５ｋＵ／ｍＬであることから、比活性は１６．９ｋＵ／ｍｇとなる。推定純度は＞９９％である。ＨＣＰの残留量は、ｒｈＧＡＬＣ１ｍｇに対して３０ｎｇである。最終精製物は無色透明である。

結論として、新規の最適化ＤＳＰをパイロットスケールにスケールアップすることに成功し、活性ベースで７４％の収率を達成した。最終精製物ＴＧ１１０６は、動物研究用としての品質要件を満たす。

イオン分離の実施例：
下記の通りにイオン分離を試したところ、満足できる結果が得られた。

１）Ｍｕｓｔａｎｇ Ｑ（ＭＱ）は陰イオン担体を用いた使い捨て仕様のメンブレンである。ＭＱを本プロセスと組み合わせて、フロースルー方式（ＤＮＡおよび宿主細胞由来タンパク質などの不純物はメンブレンに結合し、ＧＡＬＣは通過する）で試用した。ＭＱはＥｔｈｅｒ工程前またはＵＦＤＦ工程（製剤化工程）後に試用した。また、ＭＱをＣａｐｔｏ Ｂｌｕｅと連結させる形でもフロースルー方式で試用した。

ａ）Ｅｔｈｅｒ工程後に組み込んだ場合：３．７ｍＭリン酸ナトリウム、５ｍＭグリシン、１０ｍＭマンニトール、０．０７５Ｍ ＮａＣｌ、０．０００５％ ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ６．２を用いて、ＭＱの平衡化を行った。精製物をＭＱに通す前に、３．７ｍＭリン酸ナトリウム、５ｍＭグリシン、１０ｍＭマンニトール、０．０００５％ ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ６．２（または０．１５Ｍ ＮａＣｌをさらに含む同バッファー）を用いて１：１（ｖ：ｖ）で希釈した。
ｂ）ＵＦＤＦ工程後に組み込んだ場合：３．７ｍＭリン酸ナトリウム、０．２Ｍ ＮａＣｌ、５ｍＭグリシン、１０ｍＭマンニトール、０．０００５％ ｔｗｅｅｎ８０、ｐＨ６．２を用いて、ＭＱを平衡化した。精製物をＭＱに通す前に、１Ｍ ＮａＣｌを用いて、導電率が２０ｍＳ／ｃｍ（およそ精製物１容量：１Ｍ ＮａＣｌ０．２容量）になるまで希釈した。精製物を滅菌濾過する前に、ＮａＣｌを含まない製剤化バッファーで希釈して導電率を１５ｍＳ／ｃｍ（０．１５Ｍ ＮａＣｌ）に戻した。

プロセスの概要：
清澄化収穫物
Ｃａｐｔｏ Ｂｌｕｅ
ウイルス不活性化
Ｃａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅ
Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ Ｅｔｈｅｒ
ａ）の場合、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｑ
ＵＦＤＦ
ｂ）の場合、Ｍｕｓｔａｎｇ Ｑ
０．２２μｍフィルター

２）Ｃａｐｔｏ Ｑ、Ｇｉｇａ Ｃａｐ Ｑ、Ｑ ＦＦなどの強陰イオン交換（ＡＩＥＸ）樹脂を結合方式で用いる工程を本発明のダウンストリームプロセスに組み込むことが可能である。Ｃａｐｔｏ ＤＥＡＥ、ＤＥＡＥ ＦＦなどの弱陰イオン交換樹脂を用いる工程も組み込むことは可能だが、この場合、不純物の残留量が高くなることが分かった。仕上げ工程（疎水性相互作用（ＨＩＣ））の前または該工程の後での使用が可能である。

手順１：
プロセスの概要：
清澄化収穫物
Ｃａｐｔｏ Ｂｌｕｅ
ウイルス不活性化
１５％ＩＰＡおよび１％ ｔ８０を用いてウイルスを不活性化させる。注：ＩＰＡを使用した場合、ある程度の失活あり。
Ｃａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅ
Ｍａｃｒｏｐｒｅｐ Ｍｅｔｈｙｌ
０．４〜０．６Ｍ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、５％グリセロール、０．１％ ｔｗｅｅｎ８０（ｔ８０）、ｐＨ６．５で平衡化する。２０ｍＭ ＮａＰｉ、５％グリセロール、０．８〜１．２Ｍ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、ｐＨ６．５を用いて（１：１で）コンディショニングを行ったＡｄｈｅｒｅ精製物をロードする。
洗浄１：０．６Ｍ ＮａＰｉ、０．１％ ｔ８０、ｐＨ６．５
洗浄２：２０ｍＭ ＮａＰｉ、１５ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔ８０
Ｇｉｇａ Ｃａｐ Ｑ
４０ｍＭ ＭＥＳ、１５ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロール、０．１％ Ｔ８０、ｐＨ６．５で平衡化する。Ｍｅｔｈｙｌ精製物（コンディショニングは行わず）をロードし、平衡化バッファーで洗浄する。
溶出：４０ｍＭ ＭＥＳ、０．７Ｍ ＮａＣｌ、５％グリセロール
ＵＦＤＦ

手順２：
プロセスの概要：
清澄化収穫物
Ｃａｐｔｏ Ｂｌｕｅ
ウイルス不活性化
Ｃａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅ
Ｇｉｇａ Ｑ
４０ｍＭ ＭＥＳ、１５ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％ Ｔ８０、ｐＨ６．５で平衡化する。２０ｍＭ ＮａＰｉ、０．１％ ｔ８０、ｐＨ６．５を用いて、導電率が７ｍＳ／ｃｍになるようにＣａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅ精製物のコンディショニングを行う。これをロードして、平衡化バッファーで洗浄する。
Ｅｔｈｅｒ
ＵＦＤＦ

下記の複数のマルチモーダル樹脂を試用したところ、満足できる結果が得られた。

１）ＭＭＣ Ｃａｐｔｕｒｅ（ごく初期段階の実験）
導入試料：収穫物のｐＨを４００ｍＭ Ｎａ−Ｐｉ（酸性）で５．６〜６．０に調整した。
使用した平衡化バッファー：２０ｍＭ Ｎａ−Ｐｉ、ｐＨ５．６〜６．０＋０．１Ｍ ＮａＣｌ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ８０（ｔ８０）
使用した洗浄バッファー：０．９５Ｍ Ｎａ−Ａｃ、ｐＨ４．９＋５％ ＩＰＡ
使用した溶出バッファー：５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０＋１．０Ｍ ＮａＣｌ＋４０％プロピレングリコール＋０．１％ ｔ８０

結果：酵素の有無はドットブロット法により分析した。導入試料（＋＋＋）と溶出−画分１（＋＋）で酵素が検出された。フロースルー画分では酵素は検出されなかった。すべての画分に対して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析およびＨＰＬＣ分析を行った。

２）第２の中間工程または仕上げ工程としてのＢｕｔｙｌ−Ｓ：
導入試料：０．５〜６Ｍ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４になるようにコンディショニングを行う。
平衡化：２０ｍＭ ＮａＰｉ、０．５Ｍ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、５％グリセロール、０．１％ ｔ８０、ｐＨ６．５
洗浄：平衡化バッファー
溶出：２０ｍＭ ＮａＰｉ、０．１Ｍ ＮａＡｃ、５％ ＩＰＡ、０．１％ ｔ８０、ｐＨ７．８

３）第２の中間工程としてのＰＰＧ（実験的試験４４〜４７）：
導入試料：０．５Ｍ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、０．５Ｍ ＮａＡｃ、ｐＨ６．３になるようにコンディショニングを行う。
平衡化：２０ｍＭ ＮａＰｉ、０．５Ｍ （ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、０．５Ｍ ＮａＡｃ、０．０００５〜０．１％ ｔ８０、５％グリセロール、ｐＨ６．４
洗浄：１．６Ｍ ＮａＡｃ、０．１％ ｔ８０、ｐＨ７．４
洗浄２：０．７Ｍ ＮａＰｉ、ｐＨ６．５
溶出：２０ｍＭ ＮａＰｉ、３０％プロピレングリコール、０．０５％ ｔ８０、ｐＨ７．８

樹脂を下記の通り組み合わせて試用したところ、満足できる結果が得られた。

予備試験：平均約３５０ｎｇ ＨＣＰ／ｍｇ ＧＡＬＣ
Ｃａｐｔｏ Ｂｌｕｅ
Ｃａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅ
Ｃａｐｔｏ Ｂｕｔｙｌ
Ｃａｐｔｏ ＤＥＡＥ

試験１：２４０ｎｇ ＨＣＰ／ｍｇ ＧＡＬＣ
Ｃａｐｔｏ Ｂｌｕｅ
Ｃａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅ
Ｂｕｔｙｌ−Ｓ

試験２：４３０ｎｇ ＨＣＰ／ｍｇ ＧＡＬＣ
Ｃａｐｔｏ Ｂｌｕｅ
Ｃａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅ
Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ Ｍｅｔｈｙｌ
Ｇｉｇａ Ｃａｐ Ｑ

試験３：７８ｎｇ ＨＣＰ／ｍｇ ＧＡＬＣ
Ｃａｐｔｏ Ｂｌｕｅ
Ｃａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅ
ＰＰＧ

試験４：５０ｎｇ ＨＣＰ／ｍｇ ＧＡＬＣ（ただし、ＩＰＡ＋ｔｗｅｅｎを用いたウイルス不活性化により乳白光を呈する）
Ｃａｐｔｏ Ｂｌｕｅ
Ｃａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅ
Ｂｕｔｙｌ−Ｓ

試験５：１９３ｎｇ ＨＣＰ／ｍｇ ＧＡＬＣ
Ｃａｐｔｏ Ｂｌｕｅ−Ｍｕｓｔａｎｇ Ｑ（連結フィルターとして）
Ｃａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅ
Ｅｔｈｅｒ

試験６：７９ｎｇ ＨＣＰ／ｍｇ ＧＡＬＣ
Ｃａｐｔｏ Ｂｌｕｅ−Ｍｕｓｔａｎｇ Ｑ（連結）
Ｃａｐｔｏ Ａｄｈｅｒｅ
Ｅｔｈｅｒ

ガラクトセレブロシダーゼ（ＧＡＬＣ）活性分析のためのＨＮＧアッセイ

原理
ガラクトセレブロシダーゼ（ＧＡＬＣ）は、ミエリン、腎臓および上皮細胞の主要な脂質であるガラクトセレブロシド（ガラクトシルセラミド）をリソソーム内で異化する反応に関与する。ＧＡＬＣは、ガラクトセレブロシド、ガラクトシルスフィンゴシン、ラクトシルセラミドおよびモノガラクトシルジグリセリドのガラクトースエステル結合を加水分解する。またＧＡＬＣは、ガラクトセレブロシドの合成アナログで発色基質である２−ヘキサデカノイルアミノ−４−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＨＮＧ）を加水分解する能力も有する。この加水分解反応による生成物（２−ヘキサデカノイルアミノ−４−ニトロフェノール（ＨＮ））のナトリウム塩は、４１０ｎｍの光を吸収する。本明細書に記載のＨＮＧアッセイは、この原理を利用したものである。

ＧＡＬＣの分析原理
ｐＨ４．５にてＧＡＬＣで加水分解されたＨＮＧはＨＮになるが、この化合物はｐＨ１０．５では黄色を呈するため、分光光度法により４１０ｎｍの吸光度を測定することにより定量することができる。

２−ヘキサデカノイルアミノ−４−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドの
加水分解

サンプル調製
収穫物または精製ＧＡＬＣ
０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を用いて、各サンプルの所望の希釈液を調製した。希釈倍率は、分析上少なくとも１：１０とする必要があった。

細胞溶解液
細胞ペレットをＰＢＳで洗浄した後、遠心（４００×ｇ、室温で５分間）によりペレット化し、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で溶解した。細胞溶解液のタンパク質測定は、ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ Ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ Ｐｌａｔｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ（ピアス）を用いて行った。１〜５ｍｇのタンパク質を含む細胞溶解液を用いて典型的な実験を行った。

検量線の作成およびアッセイ制御
ｒｈＧＡＬＣの第１の社内標準物質ＳｔＧ０１を使用して、検量線を作成した。５種類の希釈液（１／４００、１／６００、１／８００、１／１２００および１／１６００）を２組準備した。

ｒｈＧＡＬＣの第２の標準物質ＳｔＧ０２を使用して、アッセイ対照を調製した。

インキュベーション操作
ａ．標準物質の希釈液、サンプル、対照およびブランク（０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）をそれぞれ２０μＬずつＵ型９６穴プレートに添加した。標準物質ＳｔＧ０１の希釈液については２組とも２０μＬずつ、対照およびサンプルについては、希釈液が１種類の場合は２０μＬ×２、ブランクについては２０μＬ×２使用した。すべてのウェルへの添加が終了した後、サンプル、ブランクまたは対照が含まれるすべてのウェルに２０μＬのＨＮＧアッセイ基質を添加して混合した。プレートを３７℃で３０分間または１時間インキュベートした。
ｂ．８０μＬのＨＮＧ停止液（０．１Ｍグリシン／０．１Ｍ ＮａＯＨ、ｐＨ１０．５）をマルチピペットを用いて添加した後、プレートシェーカー上で約３０秒間振盪混合し、１６０μＬのエタノールを添加した。液を混合した後、各ウェルから２００μＬを採取して平底９６穴プレートの上に設置されている９６穴フィルタープレートのウェルに移した。プレートを２０００×ｇ、室温で２分間遠心した。

Ａ４１０ｎｍの測定
測定は、Ｓｐｅｃｔｒａ Ｍａｘ ＰｌｕｓプレートリーダーまたはＢｉｏＴｅｋプレートリーダーを用いて行った。

計算
定義：酵素活性の１単位（１Ｕ）は、３７℃、ｐＨ４．５で１分間に１ｎｍｏｌのＨＮを加水分解できる能力と定義した。

ｒｈＧＡＬＣの第１の社内標準物質ＳｔＧ０１の平均ＨＮＧ活性は１８８４Ｕ／ｍｌと設定した。検量線に用いる活性を、ＳｔＧ０１の平均ＨＮＧ活性と希釈倍率とから算出した。

比活性の計算
混合試料中のＧＡＬＣの濃度はＧＡＬＣ ＥＬＩＳＡを用いて測定した。ＧＡＬＣの精製調製物中のタンパク質濃度は、Ａ２８０（ｒｈＧＡＬＣの理論上の比吸光係数：２．５）または６６０ｎｍのタンパク質アッセイを用いて測定した。

ＨＮＧ活性をＧＡＬＣまたはタンパク質の濃度で除して、比活性（単位／ｍｇ）、すなわちタンパク質１ｍｇ当たりの酵素活性（単位／ｍｇタンパク質）を算出した。

もともと細胞溶解液のＧＡＬＣ活性は、１時間につき１ｍｇ当たりの加水分解物のｎｍｏｌ数（ｎｍｏｌ／ｍｇ／時）として定義されている。単位／ｍｇに６０を乗ずれば（すなわち、分を時間に換算）、ｎｍｏｌ／ｍｇ／時に変換することができる。

Claims (29)

1. 細胞培養物から組換えヒトガラクトセレブロシドβ−ガラクトシダーゼ（ｒｈＧＡＬＣ）を精製するプロセスであって、前記細胞培養物のｒｈＧＡＬＣ含有画分を複数種の樹脂を用いたクロマトグラフィーに供することを特徴とし、
   ｇ）第１のマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂を用いて前記ｒｈＧＡＬＣの精製を行い、その後必要に応じて、ウイルスの不活性化および／またはイオン分離による精製を行う捕捉工程；
   ｈ）第２のマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂を用いて前記ｒｈＧＡＬＣの精製を行い、その後必要に応じて、ウイルスの不活性化および／またはイオン分離による精製を行う中間工程；ならびに
   ｉ）マルチモーダルクロマトグラフィー樹脂、陰イオン交換樹脂および疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）樹脂からなる群から選択されるクロマトグラフィー樹脂を用いて前記ｒｈＧＡＬＣの精製を行う仕上げ工程
   を含むプロセス。
2. 前記中間工程が、第２のマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂を用いて前記ｒｈＧＡＬＣの精製を行うことに加え、次いで
   ｉ）第１、第２のマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂とは異なるマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂、および
   ｉｉ）疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）樹脂
   からなる群より選択されるクロマトグラフィー樹脂を用いて前記ｒｈＧＡＬＣの精製を行うことを含む、請求項１に記載のプロセス。
3. 第１と第２のマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂が異なる樹脂である、請求項２に記載のプロセス。
4. 第１のマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂が静電性リガンドを含む、先行する請求項のいずれか１項に記載のプロセス。
5. 第２のマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂が陰イオン性の疎水性リガンドを含む、先行する請求項のいずれか１項に記載のプロセス。
6. 前記仕上げ工程のクロマトグラフィー樹脂が疎水性リガンドを有する樹脂である、先行する請求項のいずれか１項に記載のプロセス。
7. プロピレングリコールおよび／またはエチレングリコールを少なくとも３０％（ｖ／ｖ）含む第１の溶出バッファーで第１のマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂から前記ｒｈＧＡＬＣを溶出する、先行する請求項のいずれか１項に記載のプロセス。
8. プロピレングリコールおよび／またはエチレングリコールを少なくとも３０％（ｖ／ｖ）含むｐＨ５．５未満の第２の溶出バッファーで第２のマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂から前記ｒｈＧＡＬＣを溶出する、先行する請求項のいずれか１項に記載のプロセス。
9. ａ）前記細胞培養物のｒｈＧＡＬＣ含有画分を得ること；
   ｂ）静電性リガンドを含む第１のマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂に前記細胞培養物のｒｈＧＡＬＣ含有画分をロードすること；
   ｃ）プロピレングリコールおよび／またはエチレングリコールを少なくとも３０％（ｖ／ｖ）含む第１の溶出バッファーで第１のマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂からｒｈＧＡＬＣを溶出して、第１の溶出物を得ること；
   ｄ）陰イオン性の疎水性リガンドを含む第２のマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂に第１の溶出物をロードすること；
   ｅ）プロピレングリコールおよび／またはエチレングリコールを少なくとも３０％（ｖ／ｖ）含むｐＨ５．５未満の第２の溶出バッファーで第２のマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂からｒｈＧＡＬＣを溶出して、第２の溶出物を得ること；
   ｆ）疎水性リガンドを有する第３のクロマトグラフィー樹脂に第２の溶出物をロードすること；ならびに
   ｇ）水性バッファーで第３のクロマトグラフィー樹脂からｒｈＧＡＬＣを溶出して、第３の溶出物を得ること
   を含む、先行する請求項のいずれか１項に記載のプロセス。
10. 第１のマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂が少なくとも疎水性相互作用および静電相互作用による結合を形成する、先行する請求項のいずれか１項に記載のプロセス。
11. 第１のマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂が、下記の化学式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（Ｖ）、（ＶＩ）または（ＶＩＩ）の化合物をリガンドとして含む、先行する請求項のいずれか１項に記載のプロセス。
    （式中、式（ＩＩ）および式（ＩＩＩ）の物質におけるＲは式（ＩＶ）の官能基である。）
    
12. 第１のマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂が、化学式（ＶＩ）の化合物をリガンドとして含む、先行する請求項のいずれか１項に記載のプロセス。
13. 第２のマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂が、化学式（ＶＩＩＩ）の化合物をリガンドとして含む、先行する請求項のいずれか１項に記載のプロセス。
14. 第１のクロマトグラフィー樹脂を、プロピレングリコールおよび／またはエチレングリコールを最大で２０％（ｖ／ｖ）含む洗浄バッファーで洗浄する、先行する請求項のいずれか１項に記載のプロセス。
15. 第１の溶出バッファーに含まれるプロピレングリコールおよび／またはエチレングリコールの総濃度が４０〜６０％（ｖ／ｖ）である、先行する請求項のいずれか１項に記載のプロセス。
16. 工程ｃ）の後、第１の溶出物中のプロピレングリコールおよび／またはエチレングリコールの総濃度（ｖ／ｖ）を、工程ｄ）の前に３０％未満に下げる、請求項９〜１５のいずれか１項に記載のプロセス。
17. 工程ｃ）の後、第１の溶出物中の界面活性剤の量を０．０１％〜５％に調整する、請求項９〜１６のいずれか１項に記載のプロセス。
18. 第２のマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂が、イオン相互作用、水素結合および疎水性相互作用による結合を形成する、先行する請求項のいずれか１項に記載のプロセス。
19. 第２のマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂が、下記式：
    のリガンド、または
    下記式：
    のリガンドを含む、先行する請求項のいずれか１項に記載のプロセス。
20. 第２の溶出バッファーがプロピレングリコールおよび／またはエチレングリコールを３０〜５０％（ｖ／ｖ）含む、請求項９〜１９のいずれか１項に記載のプロセス。
21. 第３のクロマトグラフィー樹脂がエーテル基含有リガンドを含む、先行する請求項のいずれか１項に記載のプロセス。
22. 第３のクロマトグラフィー樹脂が、リガンドとして、［樹脂］−（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｎＯＨ（式中、ｎは１〜２０の整数、例えば１〜１０、例えば１〜５、例えば１〜３、または例えば１〜２の整数である）を含む、請求項９〜２１のいずれか１項に記載のプロセス。
23. ｒｈＧＡＬＣを含む組成物であって、該組成物中の全長型ｒｈＧＡＬＣ（８０ｋＤａ）と主要分解物（５０ｋＤａ＋３０ｋＤａ）とのモル比が少なくとも５０：２．５であることを特徴とする組成物。
24. 宿主細胞由来タンパク質の量がｒｈＧＡＬＣ１ｍｇに対して２００ｎｇ未満である、請求項２３に記載の組成物。
25. 酵素活性が少なくとも１５ｋＵ／ｍＬである、請求項２１または２２に記載の組成物。
26. 目視検査で確認される凝集体が一切含まれない、請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の組成物。
27. 先行する請求項のいずれか１項に記載の精製プロセスにより得られる、請求項２３〜２６のいずれか１項に記載の組成物。
28. 治療薬として使用するための、請求項２３〜２７のいずれか１項に記載の組成物。
29. グロボイド細胞白質ジストロフィー（クラッベ病）の治療に使用するための、請求項２３〜２７のいずれか１項に記載の組成物。