JP6035427B2 - 組換えヒトガラクトセレブロシドβ−ガラクトシダーゼ(rhGALC)の精製 - Google Patents
組換えヒトガラクトセレブロシドβ−ガラクトシダーゼ(rhGALC)の精製 Download PDFInfo
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- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2220/00—Aspects relating to sorbent materials
- B01J2220/50—Aspects relating to the use of sorbent or filter aid materials
- B01J2220/52—Sorbents specially adapted for preparative chromatography
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Description
a)第1のマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂を用いて前記rhGALCの精製を行い、その後必要に応じて、ウイルスの不活性化および/またはイオン分離による精製を行う捕捉工程;
b)第2のマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂を用いて前記rhGALCの精製を行い、その後必要に応じて、ウイルスの不活性化および/またはイオン分離による精製を行う中間工程;ならびに
c)マルチモーダルクロマトグラフィー樹脂、陰イオン交換樹脂および疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)樹脂からなる群から選択されるクロマトグラフィー樹脂を用いて前記rhGALCの精製を行う仕上げ工程
を含むプロセスに関する。
a)前記細胞培養物のrhGALC含有画分を得ること;
b)静電性リガンドを含む第1のマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂に前記細胞培養物のrhGALC含有画分をロードすること;
c)プロピレングリコールおよび/またはエチレングリコールを少なくとも30%(v/v)含む第1の溶出バッファーで第1のマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂からrhGALCを溶出して、第1の溶出物を得ること;
d)陰イオン性の疎水性リガンドを含む第2のマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂に第1の溶出物をロードすること;
e)プロピレングリコールおよび/またはエチレングリコールを少なくとも30%(v/v)含むpH5.5未満の第2の溶出バッファーで第2のクロマトグラフィー樹脂からrhGALCを溶出して、第2の溶出物を得ること;
f)疎水性リガンドを有する第3のクロマトグラフィー樹脂に第2の溶出物をロードすること;ならびに
g)水性バッファーで第3のクロマトグラフィー樹脂からrhGALCを溶出して、第3の溶出物を得ること
を含むプロセスを提供する。
本発明の一態様により、細胞培養物から組換えヒトガラクトセレブロシドβ−ガラクトシダーゼ(rhGALC)を精製するプロセスであって、前記細胞培養物のrhGALC含有画分を複数種の樹脂を用いたクロマトグラフィーに供することを特徴とし、
d)第1のマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂を用いて前記rhGALCの精製を行い、その後必要に応じて、ウイルスの不活性化および/またはイオン分離による精製を行う捕捉工程;
e)第2のマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂を用いて前記rhGALCの精製を行い、その後必要に応じて、ウイルスの不活性化および/またはイオン分離による精製を行う中間工程;ならびに
f)マルチモーダルクロマトグラフィー樹脂、陰イオン交換樹脂および疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)樹脂からなる群から選択されるクロマトグラフィー樹脂を用いて前記rhGALCの精製を行う仕上げ工程
を含むプロセスが提供される。
i)第1、第2のマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂とは異なるマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂、および
ii)疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)樹脂
からなる群より選択されるクロマトグラフィー樹脂を用いて前記rhGALCの精製を行うことを含む。
a)前記細胞培養物のrhGALC含有画分を得ること;
b)静電性リガンドを含む第1のマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂に前記細胞培養物のrhGALC含有画分をロードすること;
c)プロピレングリコールおよび/またはエチレングリコールを少なくとも30%(v/v)含む第1の溶出バッファーで第1のマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂からrhGALCを溶出して、第1の溶出物を得ること;
d)陰イオン性の疎水性リガンドを含む第2のマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂に第1の溶出物をロードすること;
e)プロピレングリコールおよび/またはエチレングリコールを少なくとも30%(v/v)含むpH5.5未満の第2の溶出バッファーで第2のクロマトグラフィー樹脂からrhGALCを溶出して、第2の溶出物を得ること;
f)疎水性リガンドを有する第3のクロマトグラフィー樹脂に第2の溶出物をロードすること;ならびに
g)水性バッファーで第3のクロマトグラフィー樹脂からrhGALCを溶出して、第3の溶出物を得ること
を含んでもよい。
−分子量約80kDa;
−5箇所(または6箇所)の糖鎖付加部位を有する;
−異性体が存在する;
−pI 5.9(理論値)、6.3(実測値);
−pH感受性である;pH6.0〜6.6が好ましい。
−極めて疎水性が高い;
−活性の維持に界面活性剤が必要である;
−二量体、三重体および四量体を形成する;
i)配列番号2に記載のアミノ酸配列;
ii)i)と同等の機能を有する、i)で定義したアミノ酸配列の部分配列;および
iii)i)またはii)と同等の機能を有する、i)またはii)で定義したアミノ酸配列の類似配列であって、i)またはii)で定義したアミノ酸配列と少なくとも75%の同一性を有するアミノ酸配列
からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
i)配列番号1に記載の核酸配列;および
ii)i)で定義した核酸配列と少なくとも75%の同一性を有する核酸配列
からなる群より選択される配列を含む核酸配列の組換え発現により得てもよい。
精製されていないrhGALCを供給する細胞培養物は種々の材料に由来するものであってよい。一実施形態において、細胞培養物はrhGALCを発現させるためのバイオリアクターから供給される。
第1の樹脂は酵素を安定化し、培地の色を除去する。第1のマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂としては、種々のタイプのマルチモーダル樹脂が好適でありうる。したがって、一実施形態において、第1のマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂は少なくとも疎水性相互作用および静電相互作用による結合を形成する。別の実施形態において、第1のマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂は少なくとも芳香環相互作用および静電相互作用による結合を形成する。
第2のマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂としては、種々のタイプのマルチモーダル樹脂が好適でありうる。したがって、一実施形態において、第2のクロマトグラフィー樹脂は、イオン相互作用、水素結合および疎水性相互作用による結合を形成する。別の実施形態において、第2のクロマトグラフィー樹脂は、N−ベンジル−N−メチルエタノールアミンをリガンドとして含む。さらなる一実施形態において、第2のクロマトグラフィー樹脂は、下記式:
本発明のいくつかの実施形態において、中間工程を下記の2段階方式で実施する。
2段階方式における中間工程a)は、本質的には上記と同様に、すなわち第2の樹脂工程/中間工程に関して明記されたマルチモーダル樹脂およびバッファーを用いて実施される。
中間工程b)においては、マルチモーダル樹脂、疎水性樹脂およびエーテル基含有リガンドを含むクロマトグラフィー樹脂などの、種々のタイプの樹脂が好適でありうる。
第3のクロマトグラフィー樹脂としては、種々のタイプの樹脂が好適でありうる。したがって、一実施形態において、第3のクロマトグラフィー樹脂は、エーテル基含有リガンドを含む。別の実施形態において、第3の樹脂は疎水性である。さらに別の実施形態において、第3のクロマトグラフィー樹脂は、リガンドとして、[樹脂]−(OCH2CH2)nOH(式中、nは1〜20の整数、例えば1〜10、例えば1〜5、例えば1〜3、または例えば1〜2の整数である)を含む。
ウイルスなどの不要な細胞不純物の量を可能な限り抑えるために、さらなる精製を行ってもよい。したがって、一実施形態において、工程g)の後に、第3の溶出物は、フィルターサイズが0.1μmを超えないフィルターに通される。さらなる一実施形態において、工程g)の後、第3の溶出物は、フィルターサイズが20nmを超えない、例えば15nmを超えないサイズ排除フィルター、例えばPlanova 15Nフィルターに通される。
本発明の精製物の製品としての品質をさらに向上させるために、得られた精製物をイオン分離に供してもよい。限定はされないが、イオン分離は、捕捉工程と中間工程との間で、中間工程と仕上げ工程との間で、または仕上げ工程で得られた溶出物に対して行ってもよい。
本発明の精製rhGALCは、例えば純度、特異的酵素活性、分解物の有無などの点でその他の精製rhGALCと異なる。したがって、一態様において、本発明はrhGALCを含む組成物に関する。
配列番号1
クロマトグラフィーシステム:
−Maximizer 80(BioRad)でアップグレードしたBioLogic DuoFlow
ペリスタルティックポンプ:
−MasterFlex L/S 型式77200−60(Cole−Parker Instrument Company)
タンジェンシャルフロー濾過システム:
−内径6mmのチューブを取り付けたペリスタルティックポンプWatson Marlow SciQ 323と圧力計とを備えたPellicon 2 Mini フィルターホルダー(Millipore)
マグネチックスターラー:
−MR 3001 k(Heidolph)
天秤:
−EA35EDE−I 最大秤量35kg(Sartorius)
−BP1200 最大秤量1200g(Sartorius)
カラム:
−Index 70/500(GE Healthcare)
LAFベンチ:
−Laminar Air(Holten)
収穫物用フィルター:
−Millistak+(登録商標) Pod C0HC 0.054m2(Millipore)
クロマトグラフィー樹脂:
捕捉工程:
−Capto(登録商標) Blue(high sub)(GE Healthcare)
中間工程:
−Capto(登録商標) Adhere(GE Healthcare)
仕上げ工程:
−Toyopearl Ether 650M(Tosoh)
UFDFカセット:
−Pellicon 2 MINI 30K(MWCO:30kDa、Vスクリーン、0.1m2、カタログ番号:P2B030V01、Millipore)
滅菌濾過:
−0.22μm PES、直径75mm(NALGENE、カタログ番号:595−4520)
最終精製物用容器:
−30mL滅菌ボトル(Nalgene)
−1.8mL低温用滅菌バイアル(Nalgene)
バッファーはp.aグレード(微量成分分析において不純物レベルが保証されたグレード)の化学試薬とMilli−Qグレードの水を用いて調製した。調製したバッファーを0.22μmフィルターで濾過し、室温にて最長で5日間保存した。調製処方は各工程の表1〜4に示す。
a)コンディショニング:40mMリン酸ナトリウム、pH6.1±0.1
b)平衡化:20mMリン酸ナトリウム、0.1%(w:w) tween80(t−80)、5%(体積比v:v)グリセロール、pH6.1±0.1
c)洗浄:100mMリン酸ナトリウム、1.5M NaCl、10%(v:v)プロピレングリコール(1,2−プロパンジオール)、5%(v:v)イソプロパノール(IPA)、0.2%(w:w) t−80、pH7.0±0.1
d)洗浄2:平衡化バッファー
e)溶出バッファー:20mMリン酸ナトリウム、50%(v:v)プロピレングリコール、0.5% t−80、1M NaCl、pH6.5±0.1
f)溶出物混合:20mMリン酸ナトリウム、0.15M NaCl、1.3% t−80、pH6.1±0.1
a)平衡化バッファー:20mMリン酸ナトリウム、0.15M NaCl、0.05%(w:w) t−80、pH6.1±0.1
b)洗浄1バッファー:200mM酢酸ナトリウム、1M NaCl、5%(v:v) IPA、0.5%(w:w) t−80、pH4.7±0.1
c)洗浄2バッファー:10mM酢酸ナトリウム、0.1%(w:w) t−80、pH4.7±0.1
d)洗浄3バッファー:50%洗浄2バッファー、50%溶出バッファー
e)溶出バッファー:10mM酢酸ナトリウム、300mM NaCl、0.1%(w:w) t−80、5%(v:v) IPA、40%(v:v)プロピレングリコール、pH4.55±0.1
f)溶出物混合バッファー:140mMリン酸ナトリウム、0.0005%(w:w) t−80、pH6.5±0.2
a)コンディショニングバッファー:3.3M NH4Ac、2.6M NH4Cl、0.1%(w:w) t−80、pH6.1±0.1
b)平衡化バッファー:1.6M NH4Ac、1.2M NH4Cl、50mMリン酸ナトリウム、0.0005%(w:w) t−80、pH6.4±0.1
c)洗浄1:3.3M NH4Ac、2.3M NH4Cl、0.5%(w:w) t−80、pH6.5
d)洗浄2:平衡化バッファー
e)洗浄3:70%平衡化バッファー、30%溶出バッファー
f)溶出:50mMリン酸ナトリウム、140mM NaCl、0.0005%(w:w) t−80、pH6.4±0.1
平衡化用および透析濾過用バッファー:3.7mMリン酸ナトリウム、150mM NaCl、5mMグリシン、10mMマンニトール、0.0005%(w:w) tween80、pH6.2±0.15
−洗浄バッファー(Capto Blue用、Capto Adhere用およびUFDF用):1M NaOH
−洗浄バッファー(Toyopearl Ether用):0.5M NaOH
−中和バッファー(全工程共通):140mMリン酸ナトリウム、pH6.6±0.2
−保存バッファー(Blue用、Adhere用およびEther用):20%エタノール
−保存バッファー(UFDFカセット用):0.1M NaOH
酵素活性の測定は、手順65のガラクトセレブロシダーゼ(GALC)分析のためのHNGアッセイにより行った。検量線の作成には、rhGALCの社内標準物質StG01を用いた。
バイオリアクターを閉じた後、バイオリアクター内の収穫物に酢酸ナトリウム、pH5を加えて、酵素の至適pHである7未満に保つ。このようにしてpHを安定化させた収穫物をバイオリアクターから送り出し、デプスフィルターバッファーを通すことにより細胞を除去する。濾過後にフィルターをコンディショニングバッファーですすぐ。収穫物とコンディショニングバッファーの最終混合比は2:1(w:w)程度とすべきである。
各クロマトグラフィー工程の平衡化、ローディングおよび平衡化洗浄は、ペリスタルティックポンプを用いて最大流速100mL/分(150cm/時に相当)で実施する。各工程のその他の部分は、Maximizer 80(BioRad)でアップグレードしたBioLogic DuoFlowを用いて最大流速80mL/分(125cm/時に相当)で実施する。より適切なクロマトグラフィーシステムを用いれば、上記の流速は調整可能であるが、プロピレングリコール(PG)含有バッファーは表示した流速で通液する必要がある。
Capto(登録商標) Blueは、芳香環相互作用および静電相互作用による結合を形成するアフィニティバイオプロセス担体である。
1)rhGALCの酵素安定性が保持されるようPG含量を下げる。
2)ウイルス不活性化専用工程として機能させる。精製物プールにおける界面活性剤の最終濃度は1%であり、この精製物プールを室温で16時間超保存した。
3)DSPで次の工程にあたるCapto Adhereのために、精製物プールをコンディショニングする。
Capto(登録商標) Adhereは、マルチモードの機能性を有する強陰イオン交換バイオプロセス担体であり、イオン相互作用、水素結合および疎水性相互作用による結合を形成する。
Toyopearl Ether 650Mは、機械的安定性および化学的安定性の高いメタクリル酸ポリマー(粒度65μm)である。Etherは、Tosohの疎水性相互作用リガンドの中で最も親水性が高く、極めて疎水性が高いタンパク質の精製に使用される製品である。
生産スケールにおいては、仕上げ工程に続いて、ウイルス除去専用工程としてPlanova 15Nによるナノ濾過を実施する。
3サイクル分の仕上げ工程精製物プールをまとめてプールし、これに対して、分子量カットオフ値30kDaのPelliconポリエーテルスルホンメンブレンを用いたタンジェンシャルフロー濾過(TFF)による限外濾過/透析濾過(UFDF)を1サイクル実施して製剤化を行う。供給側チャネルはオープンチャネルを有するVタイプであり、カセットの面積は0.1m2である。ポンプは230rpmに設定し、膜間差圧(TMP)を0.5bar(入口圧0.6/出口圧0.4)とする。メンブレンを製剤化バッファーで平衡化した後、初期バッファーを、希釈後濃縮(UF)および7倍の透析濾過(DF)処理により交換する。全体で8倍量のバッファーが交換される。
UFDF精製物(濃縮物)を、LAFベンチ内で無菌条件下、0.22μmのPESフィルターを用いて濾過する。最終精製物を様々な容量(1バイアルまたは1ボトル当たり0.25〜20mL)の滅菌容器に充填する。最終精製物をTG1106と命名し、−80±10℃で凍結保存する。
容量20Lのバイオリアクターから得られた清澄化収穫物から最終精製物に至るまでのダウンストリームプロセス全体の収率は活性ベースで74%であった。およそ19.5Lの清澄化収穫物の総活性は2300万単位であった。最終精製物(TG1106)の総活性は1700万単位であり、1.0gの純粋なrhGALCが回収された。
総収率(74%)は、清澄化収穫物から最終精製物に至るまでの収率として算出した。これは、清澄化工程についてはまだ決まっておらず、本研究の一部ではないことが理由である。
プロセス中に採取したサンプルおよび最終精製物はそれぞれ、上記に定めた分析方法により分析した。下表は、最終精製物TG1106の分析結果をまとめたものである。
得られた精製物がヒトGALCであることをウェスタンブロット解析により確認した。
最終精製物TG1106の等電点は6.35と算出された。
最終精製物TG1106の純度は>99%と推定された。rhGALCの分解物の割合は<0.5%と推定された。
非変性PAGEにより、rhGALCの主要な構成体は二量体であるものの、最大10分子のrhGALCから形成される多量体も存在することが分かる。
最終精製物TG1106中のrhGALC1mgに対するCHO細胞由来の宿主細胞由来タンパク質(HCP)の残留量を定量したところ、30ngであった。
予備分析により、糖鎖付加度は7%と推定され、rhGALC1molあたり2〜3molのマンノース−6−リン酸基が含まれていた。
グルコースアミン(GLCN):9mol/mol
ガラクトサミン(GALN):0〜0.3mol/mol
ガラクトース(GAL):1mol/mol
マンノース(MAN):12mol/mol
マンノース−6−リン酸(M6P):2〜3mol/mol
フコース(FUC):0〜0.5mol/mol
3つのクロマトグラフィー工程で構成される本明細書に記載の最適化されたプロセスにより、動物研究用、さらには臨床研究用としての品質要件を満たす純度の高いrhGALC精製物が得られた。DNA分析は未実施である。
王立工科大学(ストックホルム(スウェーデン))にて、容量20Lのバイオリアクターを1台使用して、組換えヒトGALCを発現するCHO細胞を培養した。19.5Lの収穫物を、Capto Blue、Capto Adhere、Toyopearl Etherの3つのクロマトグラフィー工程からなるダウンストリームプロセスにより精製し、1700万単位、すなわち1.0gの純粋なrhGALCを得た。いずれの工程も結合方式で実施した。1% tween80の存在下、室温で16〜24時間インキュベーションするウイルス不活性化工程をCapto Blueの後に行った。精製物をタンジェンシャルフロー濾過で製剤化し、滅菌濾過して最終精製物TG1106を得た。
下記の通りにイオン分離を試したところ、満足できる結果が得られた。
b)UFDF工程後に組み込んだ場合:3.7mMリン酸ナトリウム、0.2M NaCl、5mMグリシン、10mMマンニトール、0.0005% tween80、pH6.2を用いて、MQを平衡化した。精製物をMQに通す前に、1M NaClを用いて、導電率が20mS/cm(およそ精製物1容量:1M NaCl0.2容量)になるまで希釈した。精製物を滅菌濾過する前に、NaClを含まない製剤化バッファーで希釈して導電率を15mS/cm(0.15M NaCl)に戻した。
清澄化収穫物
Capto Blue
ウイルス不活性化
Capto Adhere
Toyopearl Ether
a)の場合、Mustang Q
UFDF
b)の場合、Mustang Q
0.22μmフィルター
プロセスの概要:
清澄化収穫物
Capto Blue
ウイルス不活性化
15%IPAおよび1% t80を用いてウイルスを不活性化させる。注:IPAを使用した場合、ある程度の失活あり。
Capto Adhere
Macroprep Methyl
0.4〜0.6M (NH4)2SO4、5%グリセロール、0.1% tween80(t80)、pH6.5で平衡化する。20mM NaPi、5%グリセロール、0.8〜1.2M (NH4)2SO4、pH6.5を用いて(1:1で)コンディショニングを行ったAdhere精製物をロードする。
洗浄1:0.6M NaPi、0.1% t80、pH6.5
洗浄2:20mM NaPi、15mM NaCl、0.1% T80
Giga Cap Q
40mM MES、15mM NaCl、5%グリセロール、0.1% T80、pH6.5で平衡化する。Methyl精製物(コンディショニングは行わず)をロードし、平衡化バッファーで洗浄する。
溶出:40mM MES、0.7M NaCl、5%グリセロール
UFDF
プロセスの概要:
清澄化収穫物
Capto Blue
ウイルス不活性化
Capto Adhere
Giga Q
40mM MES、15mM NaCl、0.1% T80、pH6.5で平衡化する。20mM NaPi、0.1% t80、pH6.5を用いて、導電率が7mS/cmになるようにCapto Adhere精製物のコンディショニングを行う。これをロードして、平衡化バッファーで洗浄する。
Ether
UFDF
導入試料:収穫物のpHを400mM Na−Pi(酸性)で5.6〜6.0に調整した。
使用した平衡化バッファー:20mM Na−Pi、pH5.6〜6.0+0.1M NaCl+0.05% Tween80(t80)
使用した洗浄バッファー:0.95M Na−Ac、pH4.9+5% IPA
使用した溶出バッファー:50mM Tris−HCl、pH9.0+1.0M NaCl+40%プロピレングリコール+0.1% t80
導入試料:0.5〜6M (NH4)2SO4になるようにコンディショニングを行う。
平衡化:20mM NaPi、0.5M (NH4)2SO4、5%グリセロール、0.1% t80、pH6.5
洗浄:平衡化バッファー
溶出:20mM NaPi、0.1M NaAc、5% IPA、0.1% t80、pH7.8
導入試料:0.5M (NH4)2SO4、0.5M NaAc、pH6.3になるようにコンディショニングを行う。
平衡化:20mM NaPi、0.5M (NH4)2SO4、0.5M NaAc、0.0005〜0.1% t80、5%グリセロール、pH6.4
洗浄:1.6M NaAc、0.1% t80、pH7.4
洗浄2:0.7M NaPi、pH6.5
溶出:20mM NaPi、30%プロピレングリコール、0.05% t80、pH7.8
Capto Blue
Capto Adhere
Capto Butyl
Capto DEAE
Capto Blue
Capto Adhere
Butyl−S
Capto Blue
Capto Adhere
Macro−Prep Methyl
Giga Cap Q
Capto Blue
Capto Adhere
PPG
Capto Blue
Capto Adhere
Butyl−S
Capto Blue−Mustang Q(連結フィルターとして)
Capto Adhere
Ether
Capto Blue−Mustang Q(連結)
Capto Adhere
Ether
ガラクトセレブロシダーゼ(GALC)は、ミエリン、腎臓および上皮細胞の主要な脂質であるガラクトセレブロシド(ガラクトシルセラミド)をリソソーム内で異化する反応に関与する。GALCは、ガラクトセレブロシド、ガラクトシルスフィンゴシン、ラクトシルセラミドおよびモノガラクトシルジグリセリドのガラクトースエステル結合を加水分解する。またGALCは、ガラクトセレブロシドの合成アナログで発色基質である2−ヘキサデカノイルアミノ−4−ニトロフェニル−β−D−ガラクトピラノシド(HNG)を加水分解する能力も有する。この加水分解反応による生成物(2−ヘキサデカノイルアミノ−4−ニトロフェノール(HN))のナトリウム塩は、410nmの光を吸収する。本明細書に記載のHNGアッセイは、この原理を利用したものである。
pH4.5にてGALCで加水分解されたHNGはHNになるが、この化合物はpH10.5では黄色を呈するため、分光光度法により410nmの吸光度を測定することにより定量することができる。
加水分解
収穫物または精製GALC
0.5% Triton X−100を用いて、各サンプルの所望の希釈液を調製した。希釈倍率は、分析上少なくとも1:10とする必要があった。
細胞ペレットをPBSで洗浄した後、遠心(400×g、室温で5分間)によりペレット化し、0.5% Triton X−100で溶解した。細胞溶解液のタンパク質測定は、BCA Protein Assay Kit Microtiter Plate Protocol(ピアス)を用いて行った。1〜5mgのタンパク質を含む細胞溶解液を用いて典型的な実験を行った。
rhGALCの第1の社内標準物質StG01を使用して、検量線を作成した。5種類の希釈液(1/400、1/600、1/800、1/1200および1/1600)を2組準備した。
a.標準物質の希釈液、サンプル、対照およびブランク(0.5% Triton X−100)をそれぞれ20μLずつU型96穴プレートに添加した。標準物質StG01の希釈液については2組とも20μLずつ、対照およびサンプルについては、希釈液が1種類の場合は20μL×2、ブランクについては20μL×2使用した。すべてのウェルへの添加が終了した後、サンプル、ブランクまたは対照が含まれるすべてのウェルに20μLのHNGアッセイ基質を添加して混合した。プレートを37℃で30分間または1時間インキュベートした。
b.80μLのHNG停止液(0.1Mグリシン/0.1M NaOH、pH10.5)をマルチピペットを用いて添加した後、プレートシェーカー上で約30秒間振盪混合し、160μLのエタノールを添加した。液を混合した後、各ウェルから200μLを採取して平底96穴プレートの上に設置されている96穴フィルタープレートのウェルに移した。プレートを2000×g、室温で2分間遠心した。
測定は、Spectra Max PlusプレートリーダーまたはBioTekプレートリーダーを用いて行った。
定義:酵素活性の1単位(1U)は、37℃、pH4.5で1分間に1nmolのHNを加水分解できる能力と定義した。
混合試料中のGALCの濃度はGALC ELISAを用いて測定した。GALCの精製調製物中のタンパク質濃度は、A280(rhGALCの理論上の比吸光係数:2.5)または660nmのタンパク質アッセイを用いて測定した。
Claims (8)
- 細胞培養物から組換えヒトガラクトセレブロシドβ−ガラクトシダーゼ(rhGALC)を精製するプロセスであって、前記細胞培養物のrhGALC含有画分を複数種の樹脂を用いたクロマトグラフィーに供することを特徴とし、
a)プロピレングリコールおよび/またはエチレングリコールを少なくとも30%(v/v)含む第1の溶出バッファーで第1のマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂から前記rhGALCを溶出することで、前記rhGALCの精製を行い、その後必要に応じて、ウイルスの不活性化および/またはイオン分離による精製を行う捕捉工程;
b)プロピレングリコールおよび/またはエチレングリコールを少なくとも30%(v/v)含むpH5.5未満の第2の溶出バッファーで第2のマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂から前記rhGALCを溶出することで、前記rhGALCの精製を行い、その後必要に応じて、ウイルスの不活性化および/またはイオン分離による精製を行う中間工程;ならびに
c)水性バッファーで疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)樹脂である第3のクロマトグラフィー樹脂から前記rhGALCを溶出することで、前記rhGALCの精製を行い、第3の溶出物を得る仕上げ工程
を含むプロセスであって、
第1のマルチモーダルクロマトグラフィー樹脂が、下記の化学式(I)、(II)または(III)の化合物をリガンドとして含み、
下記式:
- 第1の樹脂が、「Capto(登録商標)MMC」、「Capto(登録商標) Blue(Capto(登録商標) Blue(high sub)およびCapto(登録商標) Blue(low))」、「Capto(登録商標) Adhere」および「Blue sepharose(登録商標) fast flow」からなる群より選択される、請求項1に記載のプロセス。
- 第1のクロマトグラフィー樹脂を、プロピレングリコールおよび/またはエチレングリコールを最大で20%(v/v)含む洗浄バッファーで洗浄する、請求項1又は2に記載のプロセス。
- 第1の溶出バッファーに含まれるプロピレングリコールおよび/またはエチレングリコールの総濃度が40〜60%(v/v)である、請求項1〜3のいずれかに記載のプロセス。
- 第3のクロマトグラフィー樹脂である疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)樹脂がエーテル基含有リガンドを含む、請求項1〜4のいずれかに記載のプロセス。
- rhGALCを含む組成物であって、該組成物中の主要分解物(50kDa+30kDa)が2.5に対して、全長型rhGALC(80kDa)が少なくとも50のモル比であり、組成物の酵素活性が少なくとも15kU/mLであることを特徴とする組成物。
- 治療薬として使用するための、請求項6に記載の組成物。
- グロボイド細胞白質ジストロフィー(クラッベ病)の治療に使用するための、請求項6又は7に記載の組成物。
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