EA032680B1

EA032680B1 - ОЧИСТКА РЕКОМБИНАНТНОЙ ГАЛАКТОЦЕРЕБРОЗИД-БЕТА-ГАЛАКТОЗИДАЗЫ ЧЕЛОВЕКА (rhGALC)

Info

Publication number: EA032680B1
Application number: EA201590778A
Authority: EA
Inventors: Йенс Фог; Клаэс Андерссон; Пиа Хюден; Пиа Рингхольм Гульстад; Керстин Лунделль; Магнус Эртман
Original assignee: КЬЕЗИ ФАРМАЧЕУТИЧИ С.п.А.
Priority date: 2012-11-13
Filing date: 2013-11-13
Publication date: 2019-07-31
Also published as: CA2890358C; EA201590778A1; AU2013347260B2; BR112015010796A2; JP6035427B2; ZA201502738B; CA2890358A1; PL2920198T3; ES2751369T3; JP2015535422A; WO2014075688A1; EP2920198B1; BR112015010796B1; CN104854122A; KR101783466B1; IL238775A0; EP2920198A1; HK1213915A1; US20150284698A1; AU2013347260A1

Abstract

Изобретение относится к способу очистки рекомбинантной галактоцереброзид-β-галактозидазы человека (rhGALC) из клеточной культуры, при котором фракцию указанной клеточной культуры, содержащей rhGALC, подвергают хроматографии на трех различных смолах.

Description

Изобретение относится к протоколу очистки рекомбинантной галактоцереброзид-в-галактозидазы человека и продуктам, полученным таким способом.

Предшествующий уровень техники

Галактоцереброзид-в-галактозидаза представляет собой фермент, который катализирует гидролитическое отщепление галактозы от галактоцереброзида. Дефицит фермента приводит к накоплению галактоцереброзида в тканях. В опубликованных ранее способах описана частичная очистка GALC человека из природного образца, такого как печень (Ben-Yoseph, Archives of Biochemistry and Biophysics, 1979), лимфоциты (Sakai et al., J. Biochem., 1994) и моча (Chen et al., Biochimica et Biophysica acta, 1993). Применение этих способов затруднено вследствие очень высокой гидрофобности и низкого содержания GALC. Выходы чрезвычайно низки, и полученные продукты описываются как смеси полноразмерной GALC (80 кДа) и процессированных форм (главным образом, 50 и 30 кДа). Кроме того, целью этих предыдущих работ по очистке являлось определение характеристик фермента, а не его крупномасштабное производство для применения в заместительной терапии ферментами (ERT) у людей.

Таким образом, будет иметь преимущество протокол улучшенной очистки rhGALC, приводящей к получению гомогенного продукта (rhGALC с молекулярной массой 80 кДа) высокой чистоты в физиологическом растворе, подходящего для применения у людей.

Сущность изобретения

Разработан способ очистки рекомбинантной галактоцереброзид-в-галактозидазы человека (rhGALC), приводящий к получению конечного продукта, удовлетворяющего требованиям по качеству и чистоте для проведения исследований на животных/людях. Данный способ включает три основные хроматографические стадии и возможно одну технологическую стадию с применением ультрафильтрации/диафильтрации (UFDF). В этом исследовании свежесобранную и осветленную среду после культивирования из 20 л биореактора периодического действия с подпиткой очищали, используя оптимизированный способ, с целью получения rhGALC для проведения исследований на животных/людях.

В основе протокола очистки лежит трехстадийный алгоритм, заключающийся в проведении хроматографических стадий с разными принципами действия: стадии захвата (capture step), промежуточной стадии (intermediate step) и стадии тонкой очистки (polishing step). Предпочтительно, все стадии выполняются в режиме связывания и включают стадии промывки перед элюированием. В одном из воплощений на стадии захвата используют смолу Capto™ Blue, на промежуточной стадии Capto™ Adhere, а на стадии тонкой очистки Toyopearl Ether. В воплощения данного способа включены две стадии, предназначенные для инактивации/удаления вирусов. Чтобы получить конечный продукт, можно перед стерильной фильтрацией приготовить объединенный продукт (product pool) на стадии с применением UFDF для приготовления композиций.

Конечная цель заключается в получении rhGALC как средства заместительной терапии ферментами для лечения лизосомной болезни накопления, глобоидно-клеточной лейкодистрофии (болезни Краббе). Причиной болезни Краббе является генетически обусловленный дефицит фермента GALC. Дефицит GALC приводит к постепенному накоплению метаболита сфинголипидов галактозилсфингозина (психозина), демиелинизации и ранней смерти.

Таким образом, задача настоящего изобретения относится к разработке протокола очистки rhGALC. В частности, задача настоящего изобретения заключается в предложении протокола очистки rhGALC с решением вышеупомянутых проблем, связанных с возможностью применения на животных и людях.

Таким образом, один из аспектов изобретения относится к способу получения композиции очищенной рекомбинантной галактоцереброзид-в-галактозидазы человека (rhGALC) из клеточной культуры, где фракцию указанной клеточной культуры, содержащую rhGALC, подвергают хроматографии на смолах, включающему:

а) стадию захвата, на которой указанную rhGALC очищают на первой мультимодальной хроматографической смоле, где смола представляет собой Capto™ Blue High Sub или содержит в качестве лиганда соединение формулы (I), (II) или (III)

- 1 032680

где R в соединениях формулы (II) и (III) представляет собой функциональную группу формулы (IV)

б) промежуточную стадию, на которой указанную rhGALC очищают на второй мультимодальной хроматографической смоле, содержащей лиганд формулы (VIII) [СМОЛА]-

или лиганд формулы (IX)

в) стадию тонкой очистки, на которой указанную rhGALC очищают на третьей хроматографической смоле, которая содержит лиганд, содержащий группу простого эфира, выбранной из группы, состоящей из мультимодальной хроматографической смолы, анионообменной смолы и смолы для хроматографии гидрофобных взаимодействий (HIC), где молярное соотношение между полноразмерной rhGALC (80 кДа) и основными процессированными продуктами (50 + 30 кДа) в указанной композиции составляет по меньшей мере 50:2,5.

В одном из воплощений промежуточная стадия включает очистку указанной rhGALC на указанной второй мультимодальной хроматографической смоле с последующей очисткой указанной rhGALC на третьей хроматографической смоле, выбранной из группы, состоящей из:

1) мультимодальной хроматографической смолы, которая отличается от указанной первой и указанной второй мультимодальных хроматографических смол; и

2) смолы для хроматографии гидрофобных взаимодействий (HIC).

В одном из воплощений после по меньшей мере одной из стадии захвата а) и промежуточной стадии б) осуществляют инактивацию вирусов и/или очистку посредством разделения с помощью ионного взаимодействия.

В одном из воплощений rhGALC элюируют с указанной первой мультимодальной хроматографической смолы в первом элюирующем буфере, содержащем по меньшей мере 30% пропиленгликоля и/или этиленгликоля (об./об.).

В одном из воплощений rhGALC элюируют с второй мультимодальной хроматографической смолы во втором элюирующем буфере, содержащем по меньшей мере 30% пропиленгликоля и/или этиленгликоля (об./об.) и имеющем pH ниже 5,5.

В одном из воплощений способ получения композиции rhGALC включает:

а) обеспечение фракции указанной клеточной культуры, содержащей rhGALC;

б) загрузку фракции указанной клеточной культуры на первую мультимодальную хроматографиче скую смолу;

в) элюирование rhGALC с первой мультимодальной хроматографической смолы в первом элюирующем буфере, содержащем по меньшей мере 30% пропиленгликоля и/или этиленгликоля (об./об.), с получением тем самым первого элюата;

г) загрузку первого элюата на вторую мультимодальную хроматографическую смолу;

- 2 032680

д) элюирование rhGALC со второй мультимодальной хроматографической смолы во втором элюирующем буфере, содержащем по меньшей мере 30% пропиленгликоля и/или этиленгликоля (об./об.) и имеющем pH ниже 5,5, с получением тем самым второго элюата;

е) загрузку второго элюата на третью хроматографическую смолу, имеющую гидрофобные лиганды; и

ж) элюирование rhGALC с третьей хроматографической смолы в водном буфере, с получением тем самым третьего элюата.

В одном из воплощений первую хроматографическую смолу промывают в буфере для промывки, содержащем не более 20% пропиленгликоля и/или этиленгликоля (об./об.).

В одном из воплощений первый элюирующий буфер содержит пропиленгликоль и/или этиленгликоль в общей концентрации 40-60% (об./об.).

Другой аспект настоящего изобретения относится к композиции rhGALC, изготавливаемой способом по настоящему изобретению, где молярное соотношение между полноразмерной rhGALC (80 кДа) и основными процессированными продуктами (50 + 30 кДа) в указанной композиции составляет по меньшей мере 50:2,5.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к применению композиции rhGALC по настоящему изобретению в качестве лекарственного средства для заместительной терапии ферментами.

В одном из воплощений композиция rhGALC применяется в лечении глобоидно-клеточной лейкодистрофии (болезни Краббе).

Еще один аспект настоящего изобретения относится к лекарственному средству для лечения глобоидно-клеточной лейкодистрофии (болезни Краббе), содержащему композицию rhGALC по настоящему изобретению.

Краткое описание графических материалов

На фиг. 1 показано схематичное представление способа очистки rhGALC. Сбор после культивирования из биореактора емкостью 20 л очищали, используя три цикла хроматографии полупромышленного масштаба. Продукты с Ether-смолы объединяли и процесс продолжали, проводя один цикл с получением в результате конечного продукта TG1106;

на фиг. 2 - выход (% активности) на каждой стадии для трех циклов хроматографии, а также циклов UFDF и фильтрации. Общий выход, начиная от осветленного сбора после культивирования до конечного продукта, показан в правой части. Активности измеряли, делая повторы и используя по меньшей мере два разведения в двух экспериментах для одного вычисления, за исключением стадии с применением Ether-смолы, для которой активность продукта измеряли в одном эксперименте;

на фиг. 3 представлена итоговая информация относительно общей оставшейся активности, начиная от осветленного сбора после культивирования и до конечного продукта. Активности измеряли, как на фиг. 2;

на фиг. 4 показан анализ конечного продукта TG1106 и стандартов собственного изготовления StG02 и StG03 методом вестерн-блоттинга. Детекцию GALC выполняли, используя кроличье поликлональное антитело к StG02;

на фиг. 5 - анализ продуктов с Ether-смолы, продукта после UFDF, конечного продукта TG1106 и стандарта собственного изготовления StG03 методом вестерн-блоттинга при избыточной нагрузке. Детекцию GALC выполняли, используя кроличье поликлональное антитело к StG02;

на фиг. 6 - результаты изоэлектрического фокусирования TG1106 и стандарта собственного изготовления StG03 на гелях в градиенте pH 3-10;

на фиг. 7 - результаты электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) с окрашиванием красителем Colloidal Blue для конечного продукта TG1106 и образцов со стадий способа выделения и очистки;

на фиг. 8 и 9 - результаты SDS-PAGE с окрашиванием красителем Colloidal Blue для конечного продукта TG1106 и StG03 в разных концентрациях;

на фиг. 10 - результаты 4-16% Bis-Tris PAGE в нативных условиях с окрашиванием красителем Colloidal Blue, с G250 сдвигом заряда при нейтральных pH. Анализ конечного продукта TG1106 и стандарта собственного изготовления StG03.

Подробное описание изобретения

Способ.

Согласно одному из аспектов настоящего изобретения предложен способ очистки рекомбинантной галактоцереброзид-З-галактозидазы человека (rhGALC) из клеточной культуры, где фракцию указанной клеточной культуры, содержащей rhGALC, подвергают хроматографии на смолах, включающий:

а) стадию захвата, на которой указанную rhGALC очищают на первой мультимодальной хроматографической смоле, возможно с последующей инактивацией вирусов и/или очисткой посредством разделения с помощью ионного взаимодействия;

б) промежуточную стадию, на которой указанную rhGALC очищают на второй мультимодальной хроматографической смоле, возможно с последующей инактивацией вирусов и/или очисткой посредством разделения с помощью ионного взаимодействия;

- 3 032680

в) стадию тонкой очистки, на которой указанную rhGALC очищают на хроматографической смоле, которая выбрана из группы, состоящей из мультимодальной хроматографической смолы, анионообменной смолы и смолы для гидрофобной хроматографии (HIC).

Согласно некоторым воплощениям изобретения указанная промежуточная стадия включает очистку указанной rhGALC на указанной второй мультимодальной хроматографической смоле с последующей очисткой указанной rhGALC на хроматографической смоле, выбранной из группы, состоящей из:

2) смолы для гидрофобной хроматографии (HIC).

Согласно другим воплощениям изобретения указанные первая и вторая мультимодальные хроматографические смолы являются разными смолами.

Указанная первая мультимодальная хроматографическая смола может, в частности, содержать лиганды, создающие электростатическое поле.

Согласно другим воплощениям изобретения указанная вторая мультимодальная хроматографическая смола содержит анионный и гидрофобный лиганд.

В следующих воплощениях хроматографическая смола на указанной стадии тонкой очистки представляет собой смолу, имеющую гидрофобные лиганды.

Указанная первая мультимодальная хроматографическая смола, в частности, может содержать в качестве лиганда соединение формулы (VI), которое приведено ниже.

Указанная вторая мультимодальная хроматографическая смола, в частности, может содержать в качестве лиганда соединение формулы (VIII), которое приведено ниже.

Согласно другим воплощениям указанная первая мультимодальная хроматографическая смола содержит в качестве лиганда соединение формулы (VI), которое приведено ниже, и указанная вторая мультимодальная хроматографическая смола содержит в качестве лиганда соединение формулы (VIII), которое приведено ниже. Согласно этим воплощениям предпочтительно, чтобы указанная rhGALC далее была очищена на хроматографической смоле, представляющей собой смолу, содержащую лиганд с группами простого эфира (ether resin). Примеры подходящих смол, содержащих лиганд с группами простого эфира, приведены ниже.

Согласно некоторым воплощениям изобретения указанную rhGALC элюируют с указанной первой мультимодальной хроматографической смолы в первом элюирующем буфере, содержащем по меньшей мере 30% пропиленгликоля и/или этиленгликоля (об./об.).

В других воплощениях изобретения указанную rhGALC элюируют с указанной второй мультимодальной хроматографической смолы во втором элюирующем буфере, содержащем по меньшей мере 30% пропиленгликоля и/или этиленгликоля (об./об.) и имеющем pH ниже 5,5.

Способ очистки рекомбинантной галактоцереброзид-З-галактозидазы человека (rhGALC) по изобретению может, в частности, включать:

б) загрузку фракции указанной клеточной культуры на первую мультимодальную хроматографическую смолу, содержащую лиганды, создающие электростатическое поле;

г) загрузку первого элюата на вторую мультимодальную хроматографическую смолу, содержащую анионный и гидрофобный лиганд;

д) элюирование rhGALC со второй хроматографической смолы во втором элюирующем буфере, содержащем по меньшей мере 30% пропиленгликоля и/или этиленгликоля (об./об.) и имеющем pH ниже 5,5, с получением тем самым второго элюата;

ж) элюирование rhGALC с третьей хроматографической смолы в водном буфере с получением тем самым третьего элюата.

Существуют несколько синонимов для галактоцереброзид-З-галактозидазы человека (rhGALC). Чаще всего используемыми синонимами являются галактоцереброзидаза, галактозилцерамидаза, галцераза (galcerase), галактозилцерамид-бета-галактозидаза (EC3.2.1.46). Номером(ами) доступа для белка являются NP_000144.2 и P45803. Следует понимать, что rhGALC по настоящему изобретению может содержать метки.

В аспектах и воплощениях изобретения термин галактоцереброзид-З-галактозидаза человека (rhGALC) также включает функционально эквивалентные части или аналоги полноразмерной аминокислотной последовательности.

При разработке протокола очистки rhGALC или функционально эквивалентных частей или их аналогов важно знать некоторые характеристики rhGALC:

приблизительно 80 кДа;

- 4 032680 (или 6) сайтов гликозилирования;

наличие изоформ;

теоретическое значение pl 5,9, обнаруженное 6,3;

чувствительность к pH; предпочтительный диапазон pH составляет 6,0-6,6;

очень высокая гидрофобность;

необходимость детергента для поддержания активности;

образование димеров, тримеров, тетрамеров.

В аспектах и воплощениях настоящего изобретения, которые изложены в данном описании, rhGALC или указанная функционально эквивалентная часть или их аналог содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из:

1) аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 2;

2) функционально эквивалентной части аминокислотной последовательности, определенной в 1); и

3) функционально эквивалентного аналога аминокислотной последовательности, определенной в 1) или 2), при этом аминокислотная последовательность указанного аналога по меньшей мере на 75% идентична аминокислотной последовательности, определенной в 1) или 2).

В контексте настоящего изобретения термин функционально эквивалентный означает, что указанная часть или указанный аналог rhGALC способны гидролизовать сложноэфирные связи между остатком галактозы и остальной частью молекул галактоцереброзида, галактозилсфингозина, лактозилцерамида, моногалактозилдиглицерида и хромогенного субстрата 2-гексадеканоиламино-4-нитрофенил-ЬO-галактопиранозида (HNG). В конкретных воплощениях указанная часть или указанный аналог rhGALC сохраняют по меньшей мере 50%, как, например, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% способности нативного фермента (имеющего аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 2) гидролизовать сложноэфирные связи между остатком галактозы и остальной частью молекул указанных соединений.

Каталитические свойства указанной части или указанного аналога rhGALC можно определить, оценивая гидролиз 2-гексадеканоиламино-4-нитрофенил-b-D-галактопиранозида (HNG) с образованием 2гексадеканоиламино-4-нитрофенола (HN) при pH 4,5. При pH 10,5 HN представляет собой окрашенный в желтый цвет продукт, который можно определить спектрофотометрически при 410 нм. Иллюстративный пример таких измерений приведен в настоящей заявке в примере 12.

В конкретных воплощениях аналог в 3) по меньшей мере на 80% идентичен последовательности, определенной в 1) или 2), как, например, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или, например, по меньшей мере на 99,5% идентичен последовательности, определенной в 1) или 2).

Кроме того, указанная rhGALC или ее указанные функционально эквивалентные часть или аналог могут быть, в частности, получены методом экспрессии рекомбинантной ДНК с использованием нуклеиновокислотной последовательности, содержащей последовательность, выбранную из группы, состоящей из

1) нуклеиновокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1;

2) нуклеиновокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 75% идентична нуклеиновокислотной последовательности, определенной в 1).

Также может быть предпочтительно, чтобы последовательность кислоты в 2) была по меньшей мере на 80% идентична последовательности, определенной в 1), как, например, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99% или, например, по меньшей мере на 99,5% идентична последовательности, определенной в 1).

Термин идентичность последовательностей означает количественную меру степени гомологии между двумя аминокислотными последовательностями или между двумя нуклеиновокислотными последовательностями равной или неравной длины. Если длина двух сравниваемых последовательностей неодинакова, они должны быть выровнены с достижением наиболее возможной подгонки, для чего допустимо внесение разрывов или, альтернативно, укорочение на концах полипептидных последовательностей или нуклеотидных последовательностей. Идентичность последовательностей можно рассчитать по формуле (Nref -Ndif)100

Nref где Ndif представляет собой общее число неидентичных остатков в этих двух последовательностях при их выравнивании и где Nref представляет собой число остатков в одной из последовательностей.

Таким образом, последовательность AGTCAGTC в ДНК будет иметь идентичность последовательности 75% с последовательностью ААТСААТС (N_dif составляет 2, и N_ref составляет 8). Неидентичность конкретного(ых) остатка(ов) рассматривается как разрыв, т.е. последовательность AGTGTC в ДНК будет иметь идентичность последовательности 75% с последовательностью AGTCAGTC в ДНК (N_dif составляет 2, и N_ref составляет 8).

Стадии, предваряющие очистку на смолах.

- 5 032680

Клеточная культура, из которой получают неочищенную rhGALC, может происходить из разных источников. В одном из воплощений клеточную культуру получают из биореактора, в котором осуществляется экспрессия rhGALC.

Перед нанесением на первую хроматографическую смолу может быть целесообразно провести некоторые изменения в отношении фракции клеточной культуры. Таким образом, в одном из воплощений pH фракции перед загрузкой на первую хроматографическую смолу подводят до значения ниже 7, как, например, до значения в диапазоне 3-7, например в диапазоне 4-7, например в диапазоне 5-7, например в диапазоне 6-7, например в диапазоне 3-6, например в диапазоне 3-5 или, например в диапазоне 3-4. Также может быть целесообразно проведение фильтрования (например, глубинного, тупикового или тангенциально-поточного фильтрования) или центрифугирования клеточной культуры перед загрузкой с целью удаления клеток. Таким образом, в другом воплощении фракция указанной клеточной культуры представляет собой подвергнутую фильтрованию фракцию. В еще одном воплощении указанная фракция клеточной культуры, содержащей rhGALC, представляет собой осветленный неразбавленный сбор после культивирования.

Стадии с применением первой смолы/стадии захвата.

На первой смоле осуществляется стабилизация фермента и устранение окраски среды. Для первой мультимодальной хроматографической смолы могут быть приемлемы разные типы мультимодальности. Таким образом, в одном из воплощений связывание с первой мультимодальной хроматографической смолой осуществляется, по меньшей мере, посредством гидрофобных и электростатических взаимодействий. В другом воплощении связывание с первой мультимодальной хроматографической смолой осуществляется, по меньшей мере, посредством взаимодействий по ароматическим группировкам и посредством электростатических взаимодействий.

Указанная первая мультимодальная хроматографическая смола может содержать в качестве лиганда соединение формулы (I), (II), (III) или (VI), как показано ниже.

В еще одном воплощении первая мультимодальная хроматографическая смола содержит в качестве лиганда соединение формулы (I), (II) или (III), как показано ниже.

В частности, указанная первая мультимодальная хроматографическая смола может содержать в качестве лиганда соединение формулы (VI)

В следующем воплощении первая хроматографическая смола содержит лиганд формулы IV или формулы VI. Также в качестве первой смолы можно использовать более специфические смолы. Таким образом, в еще одном воплощении первая смола выбрана из группы, состоящей из Capto™ MMC, Capto™ Blue (Capto™ Blue (high sub)) и Blue Sepharose™ Fast Flow; все они поставляются GE Healthcare.

Capto MMC представляет собой мультимодальный катионообменник. Он содержит карбоксильную

- 6 032680 группу и поэтому по своим свойствам частично похож на слабый катионообменник. Однако помимо ионных взаимодействий участвуют несколько других типов взаимодействий, в том числе взаимодействие посредством водородных связей и гидрофобное взаимодействие. Capto™ Blue представляет собой аффинный носитель BioProcess, связывание с которым осуществляется посредством взаимодействий по ароматическим группировкам и посредством электростатических взаимодействий.

В конкретных воплощениях первая смола имеет лиганды формулы (VI). Capto™ Blue (Capto™ Blue (high sub)) представляет собой пример такой смолы.

Конечно, следует понимать, что способ по изобретению также может включать несколько стандартных стадий, известных специалисту. Так, в одном из воплощений первую хроматографическую смолу подвергают предварительной обработке перед загрузкой. В другом воплощении после стадии б) первую хроматографическую смолу промывают в буфере для промывки. В следующем воплощении первую хроматографическую смолу промывают в буфере для промывки, содержащем не более 20% пропиленгликоля и/или этиленгликоля (об./об.), например не более 15%, например не более 10%, например не более 5%, как, например, в диапазоне 5-20%, например 5-15% или, например, около 10% пропиленгликоля и/или этиленгликоля. В одном из воплощений буфер для промывки содержит не более 20% пропиленгликоля. В другом воплощении буфер для промывки содержит не более 20% этиленгликоля. Поскольку rhGALC обладает очень высокой гидрофобностью, предпочтительными элюентами являются пропиленгликоль и/или этиленгликоль.

Первый элюирующий буфер может содержать разные компоненты. В одном из воплощений, где первая смола представляет собой Capto™ Blue, первый элюирующий буфер содержит пропиленгликоль и/или этиленгликоль в общей концентрации (об./об.) 40-60%, как, например, 45-60%, например 5060%, например 40-55%, например 40-50% или, например, около 50%. Высокая концентрация пропиленгликоля и/или этиленгликоля (об./об.) важна для надлежащего элюирования фермента.

После элюирования характеристики буфера могут быть изменены. Так, в одном из воплощений после стадии (в) общую концентрацию пропиленгликоля и/или этиленгликоля (об./об.) в первом элюате снижают до уровня ниже 30% перед стадией (г), например ниже 20%, например ниже 15% или, например, ниже 10%. Благодаря снижению концентрации пропиленгликоля и/или этиленгликоля сохраняется стабильность фермента rhGALC. В следующем воплощении после стадии (в) pH первого элюата подводят до pH в диапазоне 5-6,5, например 5,5-6,5, например 5,7-6,3 или до примерно 6,1. Вследствие чувствительности rhGALC к pH предпочтительное значение pH лежит в диапазоне 6,0-6,6. В еще одном воплощении после стадии (в) уровень детергента в первом элюате подводят до 0,01-5%, например 0,5-5%, например 0,5-4%, например 0,5-3%, например 0,5-2%, например 0,5-1,5%. В другом воплощении детергент представляет собой детергент твин, такой как твин 20, твин 40, твин 60 или твин 80. Твины также известны как полисорбаты. Предпочтительно, чтобы детергенты были одобрены к применению на людях, такой детергент также может представлять собой, например, кремофор (полиоксил 35 касторовое масло) и плуроник F-127.

В следующем воплощении первый элюат выдерживают в детергенте в течение периода времени от 5 до 48 ч, например от 10 до 3 ч или, например, от 16 до 24 ч, например, при комнатной температуре. При выдерживании первого элюата в течение более длительного периода времени эта стадия выполняет функции стадии инактивации вирусов, особенно, если концентрация детергента является высокой, такой как 1%.

Перед загрузкой на вторую хроматографическую смолу первый элюат может быть подвергнут предварительной обработке. Таким образом, в одном из воплощений перед стадией г) первый элюат смешивают с буфером для предварительной обработки для второй хроматографической смолы. В еще одном воплощении смешивание происходит путем введения первого элюата непосредственно в буфер предварительной обработки для второй смолы.

Стадии с применением второй смолы/промежуточные стадии.

Для второй мультимодальной хроматографической смолы могут быть приемлемы разные типы мультимодальности. Таким образом, в одном из воплощений связывание со второй хроматографической смолой осуществляется посредством ионных взаимодействий, путем образования водородных связей и гидрофобных взаимодействией. В другом воплощении вторая хроматографическая смола содержит Nбензил-Л-метилэтаноламин в качестве лиганда. В следующем воплощении вторая хроматографическая смола содержит лиганд формулы

или лиганд формулы

- 7 032680

В более конкретном воплощении вторая хроматографическая смола выбрана из группы, состоящей из Capto™ Adhere, и хроматографического сорбента смешанного типа MEP HyperCel™, который поставляется Pall Corporation. Capto™ Adhere представляет собой сильный анионообменный носитель BioProcess с мультимодальными функциональными группами.

Связывание с ним осуществляется посредством ионных взаимодействий, взаимодействия посредством водородных связей и гидрофобного взаимодействия. Сорбент MEP HyperCel работает по механизму смешанного типа или мультимодального типа, также описанному как гидрофобная хроматография с индукцией заряда (HCIC). В основе HCIC лежит pH-зависимое поведение ионизируемых двумодальных лигандов.

В конкретных воплощениях вторая смола содержит лиганд формулы (VIM). Capto™ Adhere представляет собой пример такой смолы.

Конечно, следует понимать, что способ по изобретению также может включать несколько стандартных стадий, известных специалисту. Таким образом, в одном из воплощений вторую хроматографическую смолу предварительно обрабатывают перед загрузкой. В другом воплощении после стадии (г) вторую хроматографическую смолу промывают в буфере для промывки. В следующем воплощении после стадии (г) вторую хроматографическую смолу промывают буфером для промывки с pH в диапазоне 3-5, например 4-5 или, например, 4,5-5. В еще одном воплощении буфер для промывки дополнительно содержит спирт, такой как изопропанол.

Для второй хроматографической смолы могут быть использованы разные элюирующие буферы. В одном из воплощений, где вторая хроматографическая смола представляет собой Capto™ Adhere, второй элюирующий буфер содержит пропиленгликоль в диапазоне 30-50% (об./об.), например 30-45%, например 30-40%, например 35-50%, например 40-50% или, например, около 40%. Как упомянуто ранее, поскольку rhGALC обладает очень высокой гидрофобностью, предпочтительными элюентами являются пропиленгликоль и/или этиленгликоль. Кроме того, rhGALC также является чувствительной к pH. Таким образом, в одном из воплощений второй элюирующий буфер имеет pH ниже 6, например ниже 5, как, например, в диапазоне 3-6, 4-6 или 4-5. В следующем воплощении перед стадией (е) второй элюат смешивают с буфером предварительной обработки для третьей хроматографической смолы.

Возможная промежуточная 2-стадийная методика.

В некоторых воплощениях по изобретению промежуточную стадию осуществляют в виде 2стадийной методики, как описано ниже.

Промежуточная стадия а).

Промежуточную стадию (а) в этой 2-стадийной методике осуществляют, по существу, так, как описано выше; т.е. используя мультимодальную смолу и буферы, которые определены в части, касающейся стадий с применением второй смолы/промежуточных стадий.

Промежуточная стадия б).

На промежуточной стадии (б) могут быть приемлемы смолы с разными типами модальности, включая мультимодальные смолы, гидрофобные смолы и хроматографические смолы, содержащие лиганд с группой простого эфира.

В более конкретном воплощении хроматографическая смола, применяемая на промежуточной стадии (б), выбрана из группы, состоящей из PPG-600M и Toyopearl Phenyl-650M, которые поставляются Tosoh Bioscience, Capto™ Blue (Capto™ Blue (high sub) и Capto™ Blue (low)), Capto™ Butyl, ButylS Sepharose 6 (работающей в режиме связывания и элюирования или в режиме проходящего потока) и смолы для HIC Macro-Prep Methyl (работающей в режиме связывания и элюирования или в режиме проходящего потока), которая поставляется Biorad.

Toyopearl Phenyl-650M представляет собой носитель для гидрофобной хроматографии (HIC). Capto™ Blue представляет собой аффинный носитель BioProcess, связывание с которым осуществляется посредством взаимодействий по ароматическим группировкам и посредством электростатических взаимодействий. Capto™ Butyl и Butyl-S Sepharose 6 представляют собой носители для гидрофобной хроматографии (HIC). Носитель для HIC Macro-Prep Methyl работает согласно механизму взаимодействия, основанному на гидрофобности и заряде. Метильные группы являются умеренно гидрофобными. В зависимости от pH загрузочных и элюирующих буферов карбоксильные группы могут быть использованы для отталкивания ионов целевых молекул, тогда как гидрофобные группы для удержания примесей.

Специалисту будет очевидно, что для второй хроматографической смолы можно использовать разные элюирующие буферы.

Стадии с применением третьей смолы/стадии тонкой очистки.

Для третьей хроматографической смолы могут быть приемлемы разные типы модальности. Таким образом, в одном из воплощений третья хроматографическая смола имеет лиганд, содержащий группу простого эфира. В другом воплощении третья смола является гидрофобной. В еще одном воплощении

- 8 032680 третья хроматографическая смола содержит [смола]-(ОСН₂СН₂)пОН в качестве лиганда, где n представляет собой целое число в диапазоне 1-20, например 1-10, например 1-5, например 1-3 или, например, 1-2.

В более конкретном воплощении третья хроматографическая смола выбрана из группы, состоящей из смол, содержащих лиганд с группами простого эфира, включая смолы Toyopearl Ether, такие как 650M, 650S, 5PW, PPG-600M и Toyopearl GigaCap Q-650, которые поставляются Tosoh Bioscience, керамического гидроксиапатита, тип I (CHT I), который поставляется Biorad, Q-Sepharose Fast Flow (Q FF), которая поставляется GE Healthcare, хроматографического сорбента смешанного типа MEP HyperCel™, который поставляется Pall Corporation, смолы для HIC Macro-Prep Methyl (работающей в режиме связывания и элюирования или в режиме проходящего потока), которая поставляется Biorad, и Butyl-S Sepharose 6 (работающей в режиме связывания и элюирования или в режиме проходящего потока) и Capto DEAE, две последние поставляются GE Healthcare.

Взаимодействие керамического гидроксиапатита с биомолекулами осуществляется по механизму мультимодального типа: катионный обмен происходит тогда, когда отрицательно заряженные фосфатные группы взаимодействуют с аминогруппами белка. Много более сильные координационные комплексы могут образовываться между карбоксильными кластерами, фосфорильными группировками или ими обоими, присутствующими на биомолекулах, и участками, содержащими ионы кальция, входящего в состав керамического гидроксиапатита CHT, благодаря механизму, обусловленному сродством к ионам металлов.

Q Сефароза Fast Flow представляет собой носитель (смолу) для ионообменной (IEX) хроматографии. Сорбент MEP HyperCel работает по механизму смешанного типа или мультимодального типа, также описанному как гидрофобная хроматография с индукцией заряда (HCIC). В основе HCIC лежит pHзависимое поведение ионизируемых двумодальных лигандов. Носитель Toyopearl GigaCap Q-650 представляет собой анионообменную смолу высокого разрешения с высокой емкостью, носитель для HIC Macro-Prep Methyl работает согласно механизму взаимодействия, основанному на гидрофобности и заряде. Butyl-S Sepharose 6 представляет собой носитель для гидрофобной хроматографии (HIC).

В конкретных воплощениях третья хроматографическая смола представляет собой смолу, содержащую лиганд с группами простого эфира, такую как смола, содержащая лиганд с группами простого эфира, выбранная из группы, состоящей из указанных смол Toyopearl Ether, включая 650M, 650S и 5PW. Преимущество этого типа смолы состоит в том, что для нее нет необходимости в использовании пропилен/этиленгликоля в качестве элюента, зато можно применять водный элюент.

Конечно, следует понимать, что способ по изобретению также может включать несколько стандартных стадий, известных специалисту. Таким образом, в одном из воплощений третью хроматографическую смолу подвергают предварительной обработке перед загрузкой. Таким образом, в одном из воплощений предварительную обработку проводят в буфере, содержащем 1-2М NH₄Ac и 1-2М NH₄Cl. В другом воплощении после стадии (е) третью хроматографическую смолу промывают в буфере для промывки. В еще одном воплощении после стадии (е) третью хроматографическую смолу промывают буфером для промывки с pH в диапазоне 3-5, например 4-5, например 4,5-5, например 5,5-7 или, например, около 6,5. В этом заключается преимущество, поскольку rhGALC является чувствительной к pH.

Для промывки третьей смолы можно использовать разные буферы. В одном из воплощений после стадии (е) третью хроматографическую смолу промывают первым буфером для промывки, содержащим по меньшей мере 1М NH₄Ac, как, например, по меньшей мере 2М или, например, по меньшей мере 3М или, например, в диапазоне 1-4М. В еще одном воплощении первый буфер для промывки содержит по меньшей мере 1М NH₄Cl, как, например, по меньшей мере 2М или, например, по меньшей мере 3М или, например, в диапазоне 1-3М, и по меньшей мере 0,1% детергента, например, 0,1-2% детергента.

В одном из воплощений второй буфер для промывки содержит соль и детергент в более низких концентрациях, чем в первом буфере для промывки. В еще одном воплощении третий буфер для промывки содержит соль в более низких концентрациях, чем во втором буфере для промывки. В следующем воплощении элюирующий буфер представляет собой буфер на основе фосфата натрия.

Для того чтобы очищенная rhGALC была приемлема, например, для инфузий в организм человека, уровень детергента должен быть снижен. Таким образом, в одном из воплощений третий элюирующий буфер содержит меньше 1% детергента, например меньше 0,01%, например меньше 0,001%, например меньше 0,001% детергента. В еще одном воплощении детергент представляет собой детергент твин, такой как твин 80 или твин 20. В другом воплощении третий элюирующий буфер имеет pH в диапазоне 57, например 6-7 или, например, 6,2-6,8.

Для улучшения стадии элюирования элюирующий буфер может содержать соль. Таким образом, в следующем воплощении третий элюирующий буфер содержит по меньшей мере 100 мМ соль, такую как NaCl и/или KCl. NaCl и KCl могут быть исключены, но тогда продукт может быть несколько менее чистым.

В еще одном воплощении состав конечного продукта корректируют таким образом, чтобы он содержал по меньшей мере 150 мМ маннит, например по меньшей мере 200 мМ маннит, например по меньшей мере 250 или, например, в диапазоне 200-400 мМ маннит. Присутствие маннита позволяет провести сублимационную сушку продукта.

- 9 032680

Стадии после применения смол.

Для дальнейшей минимизации уровней, например, вирусов и примесей других нежелательных клеток можно использовать дополнительную очистку. Таким образом, в одном из воплощений после стадии (ж) третий элюат пропускают через фильтр с максимальным размером пор фильтра 0,1 мкм. В следующем воплощении после стадии (ж) третий элюат пропускают через фильтр для экслюзионной хроматографии (size exclusion filter) с размером пор фильтра не более 20 нм, например не более 15 нм, такой как фильтр Planova 15N.

В еще одном воплощении третий элюат далее направляют на стадию ультрафильтрации/диафильтрации с применением тангенциально-поточного фильтрования (TFF), где используется мембрана с отсечением по молекулярной массе (MWCO) ниже 50 кДа, например ниже 30 кДа, например ниже 15 кДа или, например, ниже 10 кДа. В следующем воплощении мембрана представляет собой мембрану из полиэфирсульфона (PES), такую как мембрана из полиэфирсульфона для Pellicon. В еще одном воплощении мембрана представляет собой мембрану из регенерированной целлюлозы.

Дополнительные стадии.

Для дальнейшего улучшения качества продукт по настоящему изобретению можно подвергнуть разделению с помощью ионного взаимодействия. Возможно, что разделение с помощью ионного взаимодействия может быть применено между стадией захвата и промежуточной стадией, между промежуточной стадией и стадией тонкой очистки или в отношении элюата со стадии тонкой очистки.

При осуществлении разделения с помощью ионного взаимодействия между стадией захвата и промежуточной стадией или после стадии тонкой очистки можно использовать анионный фильтр или анионную смолу, такие как мембрана Mustang® Q, которая поставляется Pall Corporation. Мембраны Mustang Q являются сильными анионообменниками, которые эффективно связывают плазмидную ДНК, отрицательно-заряженные белки и вирусные частицы.

Разделение с помощью ионного взаимодействия между промежуточной стадией и стадией тонкой очистки или после стадии тонкой очистки может быть выполнено на сильной анионообменной (AIEX) смоле, такой как Capto Q, Giga Cap Q, Q FF. Согласно таким воплощениям смолы используют в режиме связывания. Кроме того, имеется возможность включения слабой анионообменной смолы, такой как Capto DEAE и DEAE FF, в частности, когда на стадии тонкой очистки используют гидрофобную хроматографию (HIC).

В других воплощениях разделение с помощью ионного взаимодействия можно применять сразу после стадии тонкой очистки, например, сразу после элюирования с указанной смолы, содержащей лиганд с группами простого эфира.

В альтернативных воплощениях разделение с помощью ионного взаимодействия можно применять после стадии ультрафильтрации/диафильтрации (UFDF).

При разделении с помощью ионного взаимодействия можно использовать различные буферы. В конкретных воплощениях при применении разделения с помощью ионного взаимодействия, например на мембране Mustang Q сразу после стадии тонкой очистки на смолах, содержащих лиганд с группами простого эфира, анионный фильтр или анионную смолу можно уравновесить смесью, содержащей 3,7 мМ фосфат натрия, 5 мМ глицин, 10 мм маннит, 0,075М NaCl с 0,0005% твина 80, pH 6,2. Продукт можно разбавить 1:1 (об.:об.) смесью, содержащей 3,7 мМ фосфат натрия, 5 мМ глицин, 10 мм маннит, 0,0005% твина 80, pH 6,2, возможно с добавкой 0,15М NaCl, до его пропускания через анионный фильтр или анионную смолу.

В альтернативных воплощениях при применении разделения с помощью ионного взаимодействия, например, на мембране Mustang Q после стадии UFDF, анионный фильтр или анионную смолу можно уравновесить смесью, содержащей 3,7 мМ фосфат натрия, 0,2М NaCl, 5 мМ глицин, 10 мм маннит, 0,0005% твина 80, pH 6,2. Продукт можно разбавить 1М NaCl до получения электропроводности 20 миллисименс/см (мСм/см) (приблизительно 1 об. продукта на 0,2 об. 1М NaCl), после чего пропустить его через анионный фильтр или анионную смолу.

Перед проведением стерильной фильтрации продукт согласно этим воплощениям можно разбавить буфером для композиций (formulation buffer), например буфером для композиций без NaCl, для подведения электропроводности снова к 15 мСм/см (0,15 М NaCl).

Композиции.

Очищенная rhGALC по настоящему изобретению отличается от других очищенных rhGALC, например по чистоте, удельной ферментативной активности и присутствию процессированных продуктов. Таким образом, в одном из аспектов изобретение относится к композиции, содержащей rhGALC.

В частности, rhGALC является такой, которую можно получить способом очистки по настоящему изобретению.

Другие очищенные продукты могут содержать процессированные продукты rhGALC. В одном из воплощений молярное соотношение между полноразмерной rhGALC (80 кДа) и основными процессированными продуктами (50 и 30 кДа) в композиции составляет по меньшей мере 50:2,5, как, например, по меньшей мере 50:1, например по меньшей мере 100:1, например по меньшей мере 200:1 или, например, 500:1. В другом воплощении соотношение между полноразмерной rhGALC (80 кДа) и двумя основными

- 10 032680 процессированными продуктами (30 кДа и 50 кДа) в композиции составляет по меньшей мере 50:2,5, например по меньшей мере 100:1, например по меньшей мере 200:1, например 500:1. Процессированные формы rhGALC с 30 и 50 кДа можно заметить в виде минорных зон, и их содержание оценивалось менее 0,5% (см. раздел примеры и фиг. 5).

В других воплощениях композиция по настоящему изобретению содержит очень незначительное количество белков клетки хозяина. Специалисту будут известны подходящие методы определения содержания белков клетки хозяина и других примесей. В частности, уровень белков клетки хозяина можно определить посредством иммуноферментного твердофазного анализа (ELISA). Как правило, содержание белков клетки хозяина считается удовлетворительным, если оно составляет 500 нг/мг или меньше. В некоторых воплощениях изобретения содержание белков клетки хозяина составляет 450 нг/мг или меньше, например 300 нг/мг или меньше либо, например, 250 нг/мг или меньше. В еще одном воплощении количество белков клетки хозяина в композиции не превышает 200 нг/мг, например составляет ниже 100 нг/мг rhGALC, например ниже 40 нг/мг rhGALC или, например, ниже 30 нг/мг rhGALC. Как можно видеть из раздела Примеры, посредством ELISA содержание примесей было оценено как примерно 30 нг HCP на один мг rhGALC.

В некоторых воплощениях изобретения содержание белков клетки хозяина составляет 20 нг/мг или меньше.

В еще одном воплощении ферментативная активность в композиции составляет по меньшей мере 15 кЕд/мл или, например, по меньшей мере 30 кЕд/мл. Как можно видеть из раздела Примеры, ферментативная активность в конечном продукте по оценкам составляла 42,5 кЕд/мл.

Композиция по настоящему изобретению имеет в качестве одной из своих характеристик очень высокое содержание мономерной (80 кДа) rhGALC и очень низкое содержание агрегатов (димеров и мультимеров rhGALC). Предпочтительно, количества агрегатов оказываются ниже минимального уровня обнаружения, например, при проведении визуального обследования. Тогда композиция по изобретению будет считаться прозрачной и не мутной.

Альтернативно, образование агрегатов и уровни агрегатов можно измерить по пропусканию при 580 нм (T580). С использованием этого метода пропускание более 95%, например более 96%, более 96,5%, более 97%, более 98% или больше, чем более 99%, указывает на удовлетворительные уровни агрегатов. Другим широко используемым методом является гель-проникающая хроматография (SEC).

Специалисту будут известны другие подходящие методы измерения/оценки уровня белковых агрегатов, включая динамическое рассеяние света и метод определения не видимых невооруженным глазом частиц (количество невидимых частиц).

В предпочтительном воплощении менее чем 1,5% (мас./мас.) rhGALC в указанной композиции по изобретению находится в форме агрегатов, например менее 1% (мас./мас.), например менее 0,5% (мас./мас.), менее 0,25% (мас./мас.), менее 0,2% (мас./мас.), менее 0,1% (мас./мас.), менее 0,05% (мас./мас.) или менее 0,01% (мас./мас.). Содержание мономерной (80 кДа) rhGALC составляет по меньшей мере 95% (мас./мас.), например по меньшей мере 96% (мас./мас.) или по меньшей мере 97% (мас./мас.), например по меньшей мере 98% (мас./мас.), предпочтительно по меньшей мере 98,5% (мас./мас.), по меньшей мере 99,5% (мас./мас.) или 99% (мас./мас.).

Композиции по настоящему изобретению могут найти применение в качестве лекарственного средства. Таким образом, один из аспектов настоящего изобретения относится к композиции по настоящему изобретению для применения в качестве лекарственного средства.

В еще одном аспекте изобретение относится к композиции по настоящему изобретению для применения в лечении глобоидно-клеточной лейкодистрофии (болезни Краббе).

В другом аспекте изобретение относится к применению композиции по настоящему изобретению для изготовления лекарственного средства для лечения глобоидно-клеточной лейкодистрофии (болезни Краббе).

В еще одном аспекте изобретение относится к способу лечения глобоидно-клеточной лейкодистрофии (болезни Краббе) и/или ослаблению или облегчению симптомов, ассоциированных с глобоидноклеточной лейкодистрофией (болезнью Краббе), включающему стадию введения субъекту, нуждающемуся в этом, композиции, содержащей очищенную rhGALC по настоящему изобретению.

Последовательности

SEQ ID NO: 1

ggctactctc ggcttcctgg caacgccgag cgaaagctat gactgcggcc gcgggttcgg	60
cgggccgcgc cgcggtgccc ttgctgctgt gtgcgctgct ggcgcccggc ggcgcgtacg	120
tgctcgacga ctccgacggg ctgggccggg agttcgacgg catcggcgcg gtcagcggcg	180

- 11 032680

gcggggcaac ctcccgactt ctagtaaatt acccagagcc ctatcgttct cagatattgg	240
attatctctt taagccgaat tttggtgcct ctttgcatat tttaaaagtg gaaataggtg	300
gtgatgggca gacaacagac ggcactgagc cctcccacat gcattatgca ctagatgaga	360
attatttccg aggatacgag tggtggttga tgaaagaagc taagaagagg aatcccaata	420
ttacactcat tgggttgcca tggtcattcc ctggatggct gggaaaaggt ttcgactggc	480
cttatgtcaa tcttcagctg actgcctatt atgtcgtgac ctggattgtg ggcgccaagc	540
gttaccatga tttggacatt gattatattg gaatttggaa tgagaggtca tataatgcca	600
attatattaa gatattaaga aaaatgctga attatcaagg tctccagcga gtgaaaatca	660
tagcaagtga taatctctgg gagtccatct ctgcatccat gctccttgat gccgaactct	720
tcaaggtggt tgatgttata ggggctcatt atcctggaac ccattcagca aaagatgcaa	780
agttgactgg gaagaagctt tggtcttctg aagactttag cactttaaat agtgacatgg	840
gtgcaggctg ctggggtcgc attttaaatc agaattatat caatggctat atgacttcca	900
caatcgcatg gaatttagtg gctagttact atgaacagtt gccttatggg agatgcgggt	960

tgatgacggc ccaagagcca tggagtgggc actacgtggt agaatctcct gtctgggtat	1020
cagctcatac cactcagttt actcaacctg gctggtatta cctgaagaca gttggccatt	1080
tagagaaagg aggaagctac gtagctctga ctgatggctt agggaacctc accatcatca	1140
ttgaaaccat gagtcataaa cattctaagt gcatacggcc atttcttcct tatttcaatg	1200
tgtcacaaca atttgccacc tttgttctta agggatcttt tagtgaaata ccagagctac	1260
aggtatggta taccaaactt ggaaaaacat ccgaaagatt tctttttaag cagctggatt	1320
ctctatggct ccttgacagc gatggcagtt tcacactgag cctgcatgaa gatgagctgt	1380
tcacactcac cactctcacc actggtcgca aaggcagcta cccgcttcct ccaaaatccc	1440
agcccttccc aagtacctat aaggatgatt tcaatgttga ttacccattt tttagtgaag	1500
ctccaaactt tgctgatcaa actggtgtat ttgaatattt tacaaatatt gaagaccctg	1560
gcgagcatca cttcacgcta cgccaagttc tcaaccagag acccattacg tgggctgccg	1620
atgcatccaa cacaatcagt attataggag actacaactg gaccaatctg actataaagt	1680
gtgatgttta catagagacc cctgacacag gaggtgtgtt cattgcagga agagtaaata	1740
aaggtggtat tttgattaga agtgccagag gaattttctt ctggattttt gcaaatggat	1800
cttacagggt tacaggtgat ttagctggat ggattatata tgctttagga cgtgttgaag	1860
ttacagcaaa aaaatggtat acactcacgt taactattaa gggtcatttc gcctctggca	1920
tgctgaatga caagtctctg tggacagaca tccctgtgaa ttttccaaag aatggctggg	1980
ctgcaattgg aactcactcc tttgaatttg cacagtttga caactttctt gtggaagcca	2040
cacgctaata cttaacaggg catcatagaa tactctggat tttcttccct tctttttggt	2100

- 12 032680

tttggttcag agccaattct tgtttcattg gaacagtata tgaggctttt gagactaaaa	2160
ataatgaaga gtaaaagggg agagaaattt atttttaatt taccctgtgg aagattttat	2220
tagaattaat tccaagggga aaactggtga atctttaaca ttacctggtg tgttccctaa	2280
cattcaaact gtgcattggc cataccctta ggagtggttt gagtagtaca gacctcgaag	2340
ccttgctgct aacactgagg tagctctctt catcttattt gcaagcggtc ctgtagatgg	2400
cagtaacttg atcatcactg agatgtattt atgcatgctg accgtgtgtc caagtgagcc	2460
agtgtcttca tcacaagatg atgctgccat aatagaaagc tgaagaacac tagaagtagc	2520
tttttgaaaa ccacttcaac ctgttatgct ttatgctcta aaaagtattt ttttattttc	2580
ctttttaaga tgatactttt gaaatgcagg atatgatgag tgggatgatt ttaaaaacgc	2640
ctctttaata aactacctct aacactattt ctgcggtaat agatattagc agattaattg	2700
ggttatttgc attatttaat ttttttgatt ccaagttttg gtcttgtaac cactataact	2760
ctctgtgaac gtttttccag gtggctggaa gaaggaagaa aacctgatat agccaatgct	2820
gttgtagtcg tttcctcagc ctcatctcac tgtgctgtgg tctgtcctca catgtgcact	2880
ggtaacagac tcacacagct gatgaatgct tttctctcct tatgtgtgga aggaggggag	2940
cacttagaca tttgctaact cccagaattg gatcatctcc taagatgtac ttacttttta	3000

aagtccaaat atgtttatat ttaaatatac gtgagcatgt tcatcatgtt gtatgattta	3060
tactaagcat taatgtggct ctatgtagca aatcagttat tcatgtaggt aaagtaaatc	3120
tagaattatt tataagaatt actcattgaa ctaattctac tatttaggaa tttataagag	3180
tctaacatag gcttagctac agtgaagttt tgcattgctt ttgaagacaa gaaaagtgct	3240
agaataaata agattacaga gaaaattttt tgttaaaacc aagtgatttc cagctgatgt	3300
atctaatatt ttttaaaaca aacattatag aggtgtaatt tatttacaat aaaatgttcc	3360
tactttaaat atacaattca gtgagttttg ataaattgat atacccatgt aaccaacact	3420
ccagtcaagc ttcagaatat ttccatcacc ccagaaggtt ctcttgtata cctgctcagt	3480
cagttccttt cactcccaat tgttggcagc cattgatagg aattctatca ctataggtta	3540
gttttctttg ttccagaaca tcatgaaagc ggcgtcatgt actgtgtatt cttatgaatg	3600
gtttctttcc atcagcataa tgatttgaga ttggtccatg ttgtgtgatt cagtggtttg	3660
ttccttctta tttctgaaga gttttccatt gtatgaatat accacaattt gtttcctccc	3720
caccagtttc tgatactaca attaaaactg tctacattta c	3780

SEQ ID NO: 2

Met Thr Ala Ala Ala Gly Ser Ala Gly Arg Ala Ala Val Pro Leu Leu Leu Cys Ala Leu Leu Ala Pro Gly Gly Ala Tyr Val Leu Asp Asp Ser

- 13 032680

Asp Gly Leu Gly Arg Glu Phe Asp Gly lie Gly Ala Val Ser Gly Gly

Gly Ala Thr Ser Arg Leu Leu Val Asn Tyr Pro Glu Pro Tyr Arg Ser

Gin lie Leu Asp Tyr Leu Phe Lys Pro Asn Phe Gly Ala Ser Leu His lie Leu Lys Val Glu lie Gly Gly Asp Gly Gin Thr Thr Asp Gly Thr

Glu Pro Ser His Met His Tyr Ala Leu Asp Glu Asn Tyr Phe Arg Gly

Tyr Glu Trp Trp Leu Met Lys Glu Ala Lys Lys Arg Asn Pro Asn lie

Thr Leu lie Gly Leu Pro Trp Ser Phe Pro Gly Trp Leu Gly Lys Gly

Phe Asp Trp Pro Tyr Val Asn Leu Gin Leu Thr Ala Tyr Tyr Val Val

Thr Trp lie Val Gly Ala Lys Arg Tyr His Asp Leu Asp lie Asp Tyr lie Gly lie Trp Asn Glu Arg Ser Tyr Asn Ala Asn Tyr lie Lys lie

Leu Arg Lys Met Leu Asn Tyr Gin Gly Leu Gin Arg Val Lys lie lie

Ala Ser Asp Asn Leu Trp Glu Ser lie Ser Ala Ser Met Leu Leu Asp

Ala Glu Leu Phe Lys Val Val Asp Val lie Gly Ala His Tyr Pro Gly

Thr His Ser Ala Lys Asp Ala Lys Leu Thr Gly Lys Lys Leu Trp Ser

Ser Glu Asp Phe Ser Thr Leu Asn Ser Asp Met Gly Ala Gly Cys Trp

Gly Arg lie Leu Asn Gin Asn Tyr lie Asn Gly Tyr Met Thr Ser Thr lie Ala Trp Asn Leu Val Ala Ser Tyr Tyr Glu Gin Leu Pro Tyr Gly

Arg Cys Gly Leu Met Thr Ala Gin Glu Pro Trp Ser Gly His Tyr Val

Val Glu Ser Pro Val Trp Val Ser Ala His Thr Thr Gin Phe Thr Gin

Pro Gly Trp Tyr Tyr Leu Lys Thr Val Gly His Leu Glu Lys Gly Gly

Ser Tyr Val Ala Leu Thr Asp Gly Leu Gly Asn Leu Thr lie lie lie

Glu Thr Met Ser His Lys His Ser Lys Cys lie Arg Pro Phe Leu Pro

Tyr Phe Asn Val Ser Gin Gin Phe Ala Thr Phe Val Leu Lys Gly Ser

Phe Ser Glu lie Pro Glu Leu Gin Val Trp Tyr Thr Lys Leu Gly Lys

Thr Ser Glu Arg Phe Leu Phe Lys Gin Leu Asp Ser Leu Trp Leu Leu

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Thr Leu Ser Leu His Glu Asp Glu Leu Phe

Thr Leu Thr Thr Leu Thr Thr Gly Arg Lys Gly Ser Tyr Pro Leu Pro

Pro Lys Ser Gin Pro Phe Pro Ser Thr Tyr Lys Asp Asp Phe Asn Val Asp Tyr Pro Phe Phe Ser Glu Ala Pro Asn Phe Ala Asp Gin Thr Gly Val Phe Glu Tyr Phe Thr Asn lie Glu Asp Pro Gly Glu His His Phe Thr Leu Arg Gin Val Leu Asn Gin Arg Pro lie Thr Trp Ala Ala Asp Ala Ser Asn Thr lie Ser lie lie Gly Asp Tyr Asn Trp Thr Asn Leu Thr lie Lys Cys Asp Val Tyr lie Glu Thr Pro Asp Thr Gly Gly Val Phe lie Ala Gly Arg Val Asn Lys Gly Gly lie Leu lie Arg Ser Ala Arg Gly lie Phe Phe Trp lie Phe Ala Asn Gly Ser Tyr Arg Val Thr Gly Asp Leu Ala Gly Trp lie lie Tyr Ala Leu Gly Arg Val Glu Val Thr Ala Lys Lys Trp Tyr Thr Leu Thr Leu Thr lie Lys Gly His Phe Ala Ser Gly Met Leu Asn Asp Lys Ser Leu Trp Thr Asp lie Pro Val Asn Phe Pro Lys Asn Gly Trp Ala Ala lie Gly Thr His Ser Phe Glu Phe Ala Gin Phe Asp Asn Phe Leu Val Glu Ala Thr Arg.

Следует отметить, что воплощения и признаки, описанные в контексте одного из аспектов настоящего изобретения, также применимы к другим аспектам изобретения.

Все ссылки на патенты и документы, не являющиеся патентами, приведенные в настоящей заявке, включены тем самым посредством ссылки во всей своей полноте.

Теперь изобретение будет описано более подробно в следующих далее неограничивающих примерах.

Примеры

Разработан способ выделения и очистки продукта (DSP; downstream process) с целью очистки рекомбинантной галактоцереброзид-в-галактозидазы человека (rhGALC), приводящий к получению конечного продукта, удовлетворяющего требованиям по качеству и чистоте для проведения исследований на животных, и протестирован в условиях пилотного масштабирования. Способ состоит из трех хроматографических стадий и одной стадии с применением UFDF для приготовления композиций. В этом иссле

- 14 032680 довании свежесобранную и осветленную среду после культивирования из 20 л биореактора периодического действия с подпиткой очищали, используя оптимизированный способ в условиях пилотного масштабирования, с целью получения rhGALC для проведения исследований на животных и, например, для разработки протоколов лечения людей. Краткое содержание протокола приведено на фиг. 1.

Пример 1.

Оборудование, материалы, буферы и методы.

Оборудование.

Хроматографическая система:

Biological Duo-Flow, дополненная Maximizer 80 (BioRad).

Перистальтический насос:

MasterFlex L/S, модель 77200-60 (Cole-Parker Instrument Company). Система для тангенциальнопоточного фильтрования:

Держатель фильтра Pellicon 2 Mini с манометрами (Millipore) и перистальтический насос SciQ 323 от Watson Marlow, подводящие шланги с внутренним диаметром (I0) 6 мм.

Магнитная мешалка:

MR 3001 k (Heidolph).

Весы:

EA35EDE-I, максимально 35 кг (Sartorius),

BP1200, максимально 1200 г (Sartorius).

Колонки:

Index 70/500 (GE Healthcare).

Установка для работы в ламинарном воздушном потоке (LAF):

LaminarAir (Holten).

Смолы, фильтры и контейнеры.

Фильтр для сбора после культивирования:

Millistak+® Pod COHC; 0,054 м² (Millipore).

Хроматографические смолы:

для стадии захвата:

Capto™ Blue (high sub) (GE Healthcare);

для промежуточной стадии:

Capto™ Adhere (GE Healthcare);

для стадии тонкой очистки:

Toyopearl Ether-650M (Tosoh).

Кассета для UFDF:

Pellicon 2, MINI 30 K (MWCO 30 кДа, V-образный сетчатый фильтр, 0,1 м², № по кат. Millipore P2B030V01).

Стерильная фильтрация:

0,22 мкм, PES, диаметр 75 мм (№ по кат. NALGENE 595-4520).

Контейнеры для конечного продукта:

стерильные бутылки емкостью 30 мл (Nalgene), стерильные криогенные флаконы емкостью 1,8 мл (Nalgene).

Буферы.

Буферы готовили из химических реагентов качества для анализа и воды качества Milli-Q. Буферы фильтровали через 0,22 мкм фильтр и хранили при комнатной температуре в течение максимум 5 суток. Прописи для приготовления показаны в табл. 1-4 для соответствующей стадии. Буферы для Capto™ Blue:

а) для предварительной обработки: 40 мМ фосфат натрия, pH 6,1±0,1;

б) уравновешивающий: 20 мМ фосфат натрия, 0,1% твина 80 (t-80) (мас.:мас.), 5% глицерина (объем:объем; об.:об.), pH 6,1±0,1;

в) для промывки: 100 мМ фосфат натрия, 1,5М NaCl, 10% пропиленгликоля (1,2-пропандиола) (об.:об.), 5% изопропанола (IPA) (об.:об.), 0,2% t-80 (мас.:мас.), pH 7,0±0,1;

г) для промывки 2: уравновешивающий буфер;

д) элюирующий буфер: 20 мМ фосфат натрия, 50% пропиленгликоля (об.:об.), 0,5% t-80, 1М NaCl, pH 6,5±0,1;

е) смесь для элюата: 20 мМ фосфат натрия, 0,15М NaCl, 1,3% t-80, pH 6,1±0,1.

- 15 032680

Таблица 1. Приготовление буферов из расчета на один литр для стадии захвата: Capto Blue (high sub)

Буфер	Для предвар. обработки	Уравновешивающий	Для промывки	Элюирующий	Смесь для элюата
Объем	1 л	1 л	1 л	1 л	1 л
Na₂HPO₄ х 2Н₂О, 178 г/моль (г)	0,93	0,42	15,1	1,6	0,71
NaH₂PO₄ х 2Н₂О, 156 г/моль (г)	5,43	2,75	2,3	1,72	2,5
NaCl (г)			87,6	58,4	8,8
Твин 80 (г)		1	2	5	13
Глицерин (г)		62,5
Изопропанол (г)			39,3
Н₂О (г)	996	941	818	481	984
Пропиленгликоль (г)			104	521
pH	6,1±0,1	6,1 ±0,1	7,0±0,1	6,5±0,1	6,1 ±0,1
Электропроводность (мСм/см)		160±15	75±10	17±3

Буферы для Capto™ Adhere:

а) уравновешивающий буфер: 20 мМ фосфат натрия, 0,15М NaCl, 0,05% t-80 (мас.:мас.), pH 6,1±0,1;

б) буфер для промывки 1: 200 мМ ацетат натрия, 1М NaCl, 5% IPA (об.:об.), 0,5% t-80 (мас.:мас.), pH 4,7±0,1;

в) буфер для промывки 2: 10 мМ ацетат натрия, 0,1% t-80 (мас.:мас.), pH 4,7±0,1;

г) буфер для промывки 3: 50% буфера для промывки 2 и 50% элюирующего буфера;

д) элюирующий буфер: 10 мМ ацетат натрия, 300 мМ NaCl, 0,1% t-80 (мас.:мас.), 5% IPA (об.:об.), 40% пропиленгликоля (об.:об.), pH 4,55±0,1;

е) буферная смесь для элюата: 140 мМ фосфат натрия, 0,0005% t-80 (мас.:мас.), pH 6,5±0,2.

Таблица 2. Приготовление буферов из расчета на один литр для промежуточной стадии: Capto Blue Adhere

Буфер	Уравновешивающий	Для промывки 1	Для промывки 2	Элюирующий	Смесь для элюата
Объем	1 л	1 л	1 л	1 л	1 л
Na₂HPO₄ х 2Н₂О, 178 г/моль (г)	0,71				8,7
NaH₂PO₄ х 2Н₂О, 156 г/моль (г)	2,5				14,2
NaCl (г)	8,8	58,4		17,53
C₂H₃NaO₂ (82 г/моль) (г)		16,4	0,82	0,82
Твин 80 (г)	0,5	5	1	1	1 г 0,5%-ного исходного раствора
Изопропанол (г)		39		39
Н₂О (г)	984	921	996	607	989
Ледяная уксусная кислота (г)		6,4	0,4	1,9
Пропиленгликоль (г)				415
pH	6,1±0,1	4,7±0,1	4,7±0,1	4,55±0,1	6,5±0,2
Электропроводность (мСм/см)		75±10	1,5±0,5	8±2	12+2

Буферы для Toyopearl Ether-650M:

а) буфер для предварительной обработки: 3,3М NH₄Ac, 2,6 М NH₄Cl, 0,1% t-80 (мас.:мас.), pH 6,1 ±0,1;

б) уравновешивающий буфер: 1,6М NH4Ac, 1,2М NH4Cl, 50 мМ фосфат натрия, 0,0005% t-80 (мас.:мас.), pH 6,4±0,1;

в) для промывки 1: 3,3 М NH₄Ac, 2,3 М NH₄Cl, 0,5% t-80 (мас.:мас.), Ph 6,5;

г) для промывки 2: уравновешивающий буфер;

д) для промывки 3: 70% уравновешивающего буфера и 30% элюирующего буфера;

е) элюирующий: 50 мМ фосфат натрия, 140 мМ NaCl, 0,0005% t-80 (мас.:мас.), pH 6,4±0,1.

- 16 032680

Таблица 3. Приготовление буферов из расчета на один литр для стадии тонкой очистки: Toyopearl Ether-650M

Буфер	Для предвар. обработки	Уравновешивающий	Для промывки 1	Элюирующий
Объем	1 л	1 л	1 л	1 л
Na₂HPO₄ х 2Н₂О, 178 г/моль (г)				3,5
NaH₂PO₄ х 2Н₂О, 156 г/моль (г)		7,8		4,7
NaCl (г)				8,2
NH₄Ac (77 г/моль) (г)	254	123	254
NH₄CI (53,5 г/моль)	139	64	123
Твин 80 (г)	1	1 г 0,5%-ного исходного раствора	5	1 г 0,5%ного исходного раствора
Н₂О (г)	671	849	683	988
Ледяная уксусная кислота (г)	14,5		5,3
pH	6,1 ±0,1	6,4±0,1	6,5±0,1	6,4±0,1
Электропроводность (мСм/см)	210±20	180±10	210±20	18±2

Буфер для UFDF:

буфер для уравновешивания и диафильтрации: 3,7 мМ фосфат натрия, 150 мМ NaCl, 5 мМ глицин, 10 мМ маннит, 0,0005% твина 80 (мас.:мас.), pH 6,2±0,15.

Таблица 4. Приготовление буферов из расчета на один литр и концентрация для стадии UFDF

Буфер	Для уравновешивания и диафильтрации	Концентрация
Объем	1 л
Na₂HPO₄ х 2Н₂О, 178 г/моль (г)	0,161	0,9 мМ
NaH₂PO₄ х 2Н₂О, 156 г/моль (г)	0,437	2,8 мМ
NaCl (г)	8,762	150 мМ
Твин 80 (г)	1,0 г 0,5%-ного исходного раствора	0,0005%
Н₂О (г)	990
Глицин (г)	0,375	5
Маннит (г)	1,822	10
pH	6,2±0,1	6,2±0,1
Осмоляльность (мОсм/кг)	300	300

Буферы для безразборной мойки:

отмывающий буфер для Capto Blue, Capto Adhere и UFDF: 1M NaOH; отмывающий буфер для Toyopearl Ether: 0,5М NaOH;

нейтрализующий буфер для всех стадий: 140 мМ фосфат натрия, pH 6,6±0,2; буфер для хранения смол Blue, Adhere, Ether: 20%-ный этанол;

буфер для хранения UFDF-кассеты: 0,1М NaOH.

Таблица 5. Приготовление буферов из расчета на один литр буферов для безразборной мойки и буферов для хранения

Буфер	1 м NaOH	0,5 М NaOH	20%-ный EtOH	140 мМ фосфат натрия
Объем	1 л	1 л	1 л	1 л
Гидроксид натрия (г)	40	20
99%-ный этанол (г)			-200
Na₂HPO₄ х 2Н₂О, 178 г/моль (г)				8,7
NaH₂PO₄ х 2Н₂О, 156 г/моль (г)				14,2
Н₂О (г)	до 1000	до 1000	-800	1000
pH				6,6±0,2

Анализ в ходе технологического процесса.

Ферментативную активность измеряли по методике 65; анализ галактоцереброзидазы (GALC) с использованием HNG. Для построения калибровочной кривой используют стандарт rhGALC собственного изготовления, StG01.

Концентрация белка: концентрацию белка измеряли по методике 75; определение белка rhGALC с использованием анализа белков при 660 нм (Pierce). Разведения стандарта собственного изготовления StG02 использовали для построения калибровочной кривой. Концентрацию белка StG02 определяли в сторонней организации с использованием аминокислотного анализа (AAA) (Центр аминокислотного

- 17 032680 анализа (Amino acid Analysis Center), Университет г. Уппсала, Швеция, Uppsala University, Sweden).

С учетом информации относительно A₂₈₀ проводили вычисления путем деления измеренного поглощения на теоретический коэффициент экстинкции, составляющий 2,5 для GALC человека.

Удельную активность рассчитывали путем деления ферментативной активности rhGALC на концентрацию белка.

Идентичность анализировали по методике 70, вестерн-блот-анализу рекомбинантной галактоцереброзидазы человека (rhGALC). Для обнаружения использовали поликлональное антитело к стандарту собственного изготовления StG02, очищенное на сефарозе с иммобилизованным белком A.

Анализ с применением изоэлектрического фокусирования (IEF) проводили по методике 74 на геле Novex для IEF, pH 3-10, с целью определения изоэлектрической точки rhGALC. Конечный продукт сравнивали со стандартом rhGALC собственного изготовления, StG03, использованным в качестве дополнительного средства идентичности.

Анализ чистоты проводили по методике 69, применяя SDS-PAGE (4-12%-ный бис-трис-гель NuPAGE, буфер на основе MOPS (морфолинпропансульфоновая кислота)) с окрашиванием красителем Colloidal Blue.

Анализ примесей проводили по методике 43; методу с применением ELISA для определения белков клеток хозяина CHO (яичников китайского хомячка).

Концентрацию твина количественно определяли по методике 73 с использованием метода обращенно-фазовой высокоэффективной хроматографии (RP-HPLC).

Для информации, чтобы измерить образование агрегатов rhGALC, проводили PAGE в нативных условиях. Анализ проводили в соответствии с инструкциями производителя (Invitrogen).

Осмоляльность (осмометр Vapro) и pH (Metrohm) измеряли в конечном продукте TG1106.

Углеводный состав определяли главным образом по инструкции 25 (с другими разведениями стандарта) посредством HPLC с детекцией флуоресценции высвободившихся моносахаридов, меченных 2аминобензойной кислотой (2-AA).

Сбор после культивирования.

После отключения биореактора к сбору после культивирования в биореакторе добавляют ацетат натрия с pH 5 для поддержания значения pH меньше 7, что является оптимальным для фермента. Стабилизированный по pH сбор после культивирования откачивают из биореактора через промежуточные глубинные фильтры, чтобы удалить клетки. По окончании фильтрования фильтры промывают буфером для предварительной обработки. В конечной смеси соотношение сбора после культивирования и буфера для предварительной обработки должно составлять примерно 2:1 (мас.:мас.).

Общая информация относительно условий способа.

Уравновешивание, загрузку и уравновешивающую промывку на хроматографических стадиях осуществляют, используя перистальтический насос с максимальной скоростью потока 100 мл/мин, соответствующей 150 см/ч. Остальную часть технологического процесса осуществляют, используя систему Biological Duo-Flow, оснащенную Maximizer 80, с максимальной скоростью потока 80 мл/мин, соответствующей 125 см/ч. При использовании более подходящей хроматографической системы скорости потока могут быть скорректированы. Однако, при работе с буферами на основе пропиленгликоля (PG) должна быть выдержана указанная скорость потока.

Все хроматографические стадии проводят в режиме связывания, и они включают несколько стадий промывки. Для элюирования гидрофобной rhGALC на первых двух стадиях способа необходима высокая концентрация PG. Чтобы сохранить ферментативную активность, продукт с этих стадий необходимо собирать в предварительно наполненные контейнеры. Нет никакой необходимости в органическом растворителе при элюировании на стадии тонкой очистки.

Все буферы, за исключением буфера для предварительной обработки Capto Blue, содержат детергент (твин 80), который, по-видимому, необходим для сохранения ферментативной активности rhGALC. Среда сбора после культивирования содержит плуроник, который заменяет твин при предварительной обработке Capto Blue. Другой мотив для исключения твина при предварительной обработке заключается в том, что он может быть причиной опалесценции сбора после культивирования спустя более чем приблизительно 6 часов хранения при комнатной температуре.

Capto Blue.

Capto™ Blue представляет собой аффинный носитель BioProcess, и связывание с ним осуществляется посредством взаимодействий по ароматическим группировкам и посредством электростатических взаимодействий.

Подвергнутый предварительной обработке сбор после культивирования загружают на колонку Capto Blue в пределах 24 ч с момента осветления. Для содержимого биореактора емкостью 20 л необходимо провести три цикла с применением Capto Blue в условиях пилотного масштабирования (740 мл). Колонку промывают уравновешивающим буфером и буфером для промывки, содержащим 10% пропиленгликоля (PG) и 5% изопропанола (IPA). Элюирование осуществляют с использованием буфера, содержащего 50% PG, в предварительно наполненный контейнер. Сбор в контейнер, наполненный буферной смесью для элюата, решает три задачи:

- 18 032680

1) уменьшить концентрацию PG для сохранения стабильности фермента rhGALC;

2) действовать в качестве стадии, предназначенной для инактивации вирусов. Конечная концентрация детергента составляла 1%, и объединенный продукт хранили в течение более 16 ч при комнатной температуре;

3) провести предварительную обработку объединенного продукта для следующей стадии в DSP, стадии Capto Adhere.

Как описано выше, продукт после Capto Blue может быть собран в буферную смесь для элюата. Конечная концентрация твина составляет 1%, и объединенный продукт хранят в течение 16-24 ч при комнатной температуре, в качестве стадии, предназначенной для инактивации вирусов.

Capto Adhere.

Capto™ Adhere представляет собой сильный анионообменный носитель BioProcess с мультимодальными функциональными группами. Связывание с ним осуществляется посредством ионных взаимодействий, взаимодействия посредством водородных связей и гидрофобного взаимодействия.

По окончании времени выдерживания, составляющего максимально 4 суток, продукт после Capto Blue загружают на колонку с Capto Adhere для проведения трех последовательных циклов. Минимальное время выдерживания составляет 18-20 ч при комнатной температуре в качестве стадии инактивации вирусов. В случае более длительного времени выдерживания температуру объединенного продукта понижают до 5±3°C на оставшийся период времени. Температуру снова повышают до комнатной за 8-15 ч с целью достижения комнатной температуры перед началом процесса. Объединенный продукт загружают при pH 6,1. Значение pH быстро уменьшают до 4,7, промывая буфером с большой ионной силой и IPA, после чего осуществляют промывку буфером с низкой ионной силой. Элюирование выполняют, используя буфер при pH 4,55, содержащий 40% PG, в предварительно наполненный контейнер для повышения pH и уменьшения концентрации PG с целью сохранения ферментативной активности rhGALC.

Toyopearl Ether.

Toyopearl Ether-650M представляет собой полимер метакриловой кислоты (размер частиц 65 мкм) с высокой механической прочностью и химической стабильностью. Эта Ether-смола характеризуется самой высокой в серии Tosoh гидрофильностью лигандов, участвующих в гидрофобных взаимодействиях, и разработана для очистки высокогидрофобных белков.

Продукт со смолы Capto Adhere хранят в течение максимально 24 ч при комнатной температуре или 4 суток при 5±3°C. Если хранение осуществляют в холоде, то температуру снова повышают до комнатной температуры за 8-15 ч с целью достижения комнатной температуры перед началом процесса. Его смешивают в соотношении 1:2,5 (мас.:мас.) с буфером для предварительной обработки Ether-смолы (три цикла), содержащим в высокой концентрации ацетат аммония, хлорид аммония и твин. Колонку с Etherсмолой уравновешивают буфером, содержащим твин в 200 раз более низкой концентрации по сравнению с подвергнутым предварительной обработке исходным материалом. После загрузки колонку промывают уравновешивающим буфером. На стадии последующей промывки повышают содержание твина и соли. После этого осуществляют длительную промывку уравновешивающим буфером опять для уменьшения концентрации твина и промывку смесью уравновешивающего и элюирующего буфера для уменьшения содержания солей аммония. Элюирование выполняют, используя буфер на основе фосфата натрия, содержащий твин в низкой концентрации (0,0005%) и хлорид натрия, при pH 6,4.

Фильтрование через Planova 15N для удаления вирусов.

При промышленном масштабировании стадия тонкой очистки будет выполнена с применением нанофильтрации через Planova 15N, в качестве стадии, предназначенной для инактивации вируса.

UFDF.

Объединяют три полученных на стадии тонкой очистки объединенных продукта и для приготовления композиции проводят один цикл ультрафильтрации/диафильтрации (UFDF), используя тангенциально-поточное фильтрование (TFF) с применением Pellicon мембраны из полиэфирсульфона с отсечением по молекулярной массе (MWCO) 30 кДа. Подводящие каналы представляют собой каналы V типа с открытыми каналами и площадь кассеты составляет 0,1 м².

Насос устанавливают на 230 об/мин, и трансмембранное давление (ТМР) составляет 0,5 бар (0,6_{на входе}/0,4_на вы_ходе) (50 кПа). Мембрану уравновешивают буфером для приготовления композиций, и первый объем буфера заменяют путем разбавления с последующим концентрированием (UF) и проведения 7 раз диафильтрации (DF). В целом заменяют восемь объемов буфера.

Фильтрование и розлив.

Продукт после UFDF (ретентат) фильтруют через 0,22 мкм PES-фильтр в асептических условиях в установке для работы в LAF. Конечный продукт разливают в стерильные контейнеры различных объемов (по 0,25-20 мл в один флакон/одну бутылку). Конечному продукту присваивают название TG1106 и хранят в замороженном состоянии при -80±10°C.

Пример 2.

Краткое изложение результатов.

Общий выход в способе выделения и очистки продукта, начиная от осветленного сбора после культивирования из биореактора емкостью 20 л до конечного продукта, составлял 74% из расчета по актив

- 19 032680 ности.

Общая активность примерно в 19,5 л осветленного сбора после культивирования составляла 23 миллиона единиц. Общий выход в конечном продукте, TG1106, составлял 17 миллионов единиц или 1,0 г чистой rhGALC.

Выход по активности и условия.

Общий выход (74%) рассчитывали, начиная от осветленного сбора после культивирования до конечного продукта. Основанием для этого служит то, что способ осветления еще не определен и не является частью этого исследования.

Хроматографические стадии проводили за три цикла. Объединяли три продукта со стадии тонкой очистки и для приготовления композиции проводили один цикл UFDF. Осуществляли стерильную фильтрацию полученного после UFDF продукта и распределяли по контейнерам. Выход, рассчитанный в виде % активности для каждой стадии и каждого цикла, показан на фиг. 2. Изменение общей активности, начиная от осветленного сбора после культивирования до конечного продукта, показано на фиг. 3.

Средний выход для стадии захвата, Capto Blue, составлял 84±8,1%.

Средний выход для промежуточной стадии, Capto Adhere, составлял 87±3,5%.

Средний выход для стадии тонкой очистки, Toyopearl Ether, составлял 76±0,6%*.

Выход для стадии UFDF составлял 117%.

Выход для окончательной стерильной фильтрации составлял 102%.

Результаты анализов.

Анализ образцов со стадий способа и конечного продукта проводили, используя набор аналитических методов, описанных выше. В приведенной ниже таблице суммированы результаты анализов для конечного продукта TG1106

Определение характеристик	Анализ	Метод	Результат
Содержание	Концентрация белка	660 нм	2,5±0,3 мг/мл
(для информации А₂₈₀/2,5)	(2,7 мг/мл)
Ферментативная активность	Анализ с использованием HNG	42,5±0,8 кЕд./мл
Удельная активность	HNG/660 нм	16,9 кЕд/мг
Идентичность	Вестерн-блоттинг	Обнаружение с использованием поликлонального антитела к rhGALC	Зона 80 кДа в соответствии со стандартом
IEF	pH 3-10	pl примерно 6,35 в соответствии со стандартом
Чистота	SDS-PAGE	Окрашивание красителем Colloidal Blue	более 99%

Примеси	Белки клетки хозяина	ELISA для НСР	30 нг/мг rhGALC
Другое	Твин 80	RP HPLC	0,025%
Образование агрегатов rhGALC	PAGE в нативных условиях, для информации	Основная структура: димер; примерно 7 видимых форм от мономера до мультимера
pH	рН-метр	6,02
Осмоляльность	Осмометр Vapro	297 мОсм/кг
Пропускание	Т580	98,5%
Углеводный состав	Моносахаридный состав, для информации	Примерно 7% (масс.:масс.), 2-3 моль МбР/моль rhGALC, примерно12 моль MAN/моль rhGALC

Пример 3.

Идентичность по вестерн-блоттингу.

Очищенный продукт был идентифицирован как GALC человека с использованием вестерн-блотанализа.

Белки в продуктах со стадии тонкой очистки в продукте после UFDF и конечном продукте разделяли посредством SDS-PAGE и электрофоретически переносили на мембрану из поливинилидендифторида

- 20 032680 (PVDF). Детекцию rhGALC осуществляли, используя поликлональное кроличье антитело к GALC, полученное против стандарта rhGALC собственного изготовления, StG02. Антитела очищали на колонке с иммобилизованным на сефарозе белком A (GE Healthcare). С их помощью обнаруживали GALC с MW 80 кДа, а также процессированные формы GALC с MW 50 и 30 кДа. Для подтверждения переноса и оценки кажущейся молекулярной массы (MW) использовали набор предварительно окрашенных белковых маркеров.

На фиг. 4 показан блот, где в конечном продукте обнаруживали rhGALC с MW 80 кДа. Никаких процессированных форм для этой белковой загрузки обнаружено не было. В данном анализе в качестве образцов сравнения использовали стандарты собственного изготовления, StG02 и StG03. Стандарты исследовали, используя аминокислотный анализ, и обнаруженные для них аминокислотные составы коррелировали с теоретическим составом GALC человека. На фиг. 5 показаны избыточные нагрузки по белку, и помимо rhGALC c MW 80 кДа идентифицировали обе процессированные формы с MW 50 и 30 кДа в виде слабых зон. Идентифицировали дополнительную зону с кажущейся MW 160 кДа, вероятно соответствующую димеру rhGALC, который не полностью диссоциировал под действием SDS в восстанавливающих условиях.

Пример 4.

Изоэлектрическое фокусирование.

Вычисленная изоэлектрическая точка конечного продукта TG1106 составила 6,35.

TG1106 и стандарт StG03 разделяли по заряду методом изоэлектрического фокусирования (IEF) в геле при pH 3-10. Электрофорез проводили в холоде (на льду) при 100 В в течение 1 ч, затем 200 В в течение 1 ч и в конце 500 В в течение 2 ч. Гель, показанный на фиг. 6, был окрашен красителем Colloidal Blue. Вычисленная изоэлектрическая точка (pl) составила 6,35, что оказалось выше теоретической pl 5,9 для GALC. Между TG1106 и StG03 никакой разницы обнаружено не было.

Пример 5. Чистота согласно SDS-PAGE.

По оценкам чистота в конечном продукте TG1106 составила более 99%. Содержание процессированных форм rhGALC составило менее 0,5%.

Разделение образцов со стадий способа проводили главным образом по размеру, используя электрофорез (SDS-PAGE) на 4-12%-ном бис-трис-геле NuPAGE в буфере на основе MOPS. rhGALC и возможные примеси визуализировали, используя краситель Colloidal Blue. Краситель Colloidal Blue дает динамический линейный ответ, который не зависит от типа белка, и это означает, что поскольку такие концентрации белка являются достаточными, то его применение предпочтительно для оценки степени чистоты в сравнении с окрашиванием серебром. Значение кажущейся молекулярней массы (MW) rhGALC составляет 80 кДа, в то время как процессированные формы имеют значения кажущихся молекулярных масс 50 и 30 кДа.

На фиг. 7 показана сканограмма образцов со стадий способа. Видно, что после стадий с применением Capto Blue и Capto Adhere наблюдались примеси, тогда как после Ether-стадии наблюдали только rhGALC. Зона с MW примерно 160 кДа возможно может соответствовать димеру rhGALC, поскольку также идентифицируется вестерн-блоттингом (см. также фиг. 6).

На фиг. 8 и 9 приведено сравнение конечного продукта TG1106 со стандартом собственного изготовления StG03 на предмет оценки чистоты. В случае высокой нагрузки TG1106 ни у какой зоны, за исключением зоны rhGALC, не было интенсивности выше, чем у самой низкой нагрузки StG03. Для самой высокой концентрации TG1106 можно видеть странную двойную зону прямо под зоной димера rhGALC, заметную на обоих гелях. По всей вероятности это является артефактом, так как она вообще не видна в случае последующей максимальной нагрузки. Из-за наличия этой странной двойной зоны при максимальной нагрузке чистоту рассчитывали с учетом последующей максимальной нагрузки, как показано на фиг. 10: 100 - 0,8% (0,14 мкг/16 мкг) соответствует чистоте 99,2%. При избыточной нагрузке можно было наблюдать процессированные формы rhGALC с MW 30 и 50 кДа в виде зон с низкой интенсивностью. Интенсивность ни у одной из этих зон не превышала интенсивности зоны 80 кДа в случае стандарта с самой низкой нагрузкой, и это означает, что вклад процессированных форм составлял меньше 0,5%.

Зона 160 кДа может быть артефактом. Это может происходить вследствие того, что при высокой концентрации rhGALC количества SDS в буфере для образцов недостаточно для образования мономерных форм мультимеров rhGALC (см. PAGE в нативных условиях, 7.2.5). Но в иных случаях для оценки можно считать, что интенсивность такого димера при нагрузке TG1106, составляющей 16 мкг, аналогична таковой в зоне 80 кДа для нагрузки StG03, составляющей 0,36 мкг, что соответствует примерно 2% этой формы в конечном продукте.

Пример 6.

PAGE в нативных условиях.

PAGE в нативных условиях показывает, что основной формой rhGALC является димер, но присутствуют и мультимеры, в состав которых входит до 10 молекул rhGALC.

Для получения информации относительно форм rhGALC проводили PAGE в нативных условиях при нейтральных pH. Как показано на фиг. 10, rhGALC демонстрировала целую лестницу форм. Конечный продукт TG1106 сравнивали со стандартом rhGALC собственного изготовления, StG03, и карти

- 21 032680 на была аналогичной. Возможно, самая нижняя зона (с кажущейся MW 80-100 кДа) соответствует мономеру rhGALC, а вторая зона димеру rhGALC, за которой следуют формы, состоящие из большего количества мономеров и/или димеров rhGALC. На данном геле было обнаружено до семи форм rhGALC. Независимо от нагрузки самым четко выраженным был димер rhGALC. Проведенное ранее исследование с применением электронной микроскопии подтверждало существование нескольких форм, причем основная форма имеет диаметр примерно 20 нм, что могло бы соответствовать димеру rhGALC.

Пример 7.

ELISA примесных HCP.

Проводили количественное определение оставшихся белков клеток хозяина (HCP), клеток CHO, получая значение 30 нг/мг rhGALC в конечном продукте TG1106.

Проводили анализ белков клетки хозяина (HCP), яичника китайского хомячка (CHO), в качестве меры содержания примесей. В ELISA использовали характерные для данного вида антитела, приобретенные у Cygnus Technologies. Эти антитела были получены к обычно секретируемым клетками белкам (3G 0016-AF), а также к внутриклеточным белкам (C0016-PA) из клеток CHO. Стандарт был приготовлен на основе смеси, состоящей на 10% из полученных после лизиса клеток HCP и на 90% из секретированных HCP из родительских клеток CHO (штамм DG44).

Измерение содержания HCP проводили по окончании Ether-стадий, стадии UFDF и в конечном продукте. В качестве образцов сравнения в анализе использовали стандарт rhGALC собственного изготовления, StG02, и Tox ASA. Как видно из табл. 23, в результате осуществления способа уровни HCP снижались до содержания 30 нг/мг rhGALC в конечном продукте TG1106. В продукте после Ether-стадий и в конечном продукте уровни оставшихся HCP были аналогичны, и это указывает на то, что удаления каких-либо дополнительных HCP на стадии UFDF не происходило.

Уровни HCP после Ether-стадий, после UFDF и в конечном продукте TG1106. StG02, StG03 и Toc

Моносахаридный состав.

Степень гликозилирования по предварительной оценке составила 7%, и каждый моль rhGALC содержал 2-3 моль остатков манноза-6-фосфата.

Проводили только один предварительный анализ конечного продукта TG1106. Его результат указывает на то, что rhGALC имеет примерно 7% углеводов (мас.:мас.). По всей вероятности, гликозилирование соответствует высокоманнозному типу.

Предварительные данные демонстрируют следующее содержание в молях для каждого моносахарида на один моль rhGALC глюкозамин (GLCN) галактозамин (GALN) галактоза (GAL) моль/моль,

0-0,3 моль/моль, моль/моль, манноза (MAN) моль/моль, манноза-6-фосфат (М6Р) фукоза (FUC)

2-3 моль/моль,

0-0,5 моль/моль.

Обсуждение.

В результате осуществления оптимизированного включающего три хроматографические стадии способа, описанного в данной заявке, получали чистый продукт rhGALC, который удовлетворяет требованиям, предъявляемым к качеству в случае проведения исследований на животных и с большой вероятностью также в случае клинических исследований. Остается провести анализ ДНК.

Выход из биореактора B5:19, рассчитанный по ферментативной активности начиная от осветленного сбора после культивирования до конечного продукта, составлял 74%. Учитывая то, что GALC является очень гидрофобным белком, это представляло собой особенно удовлетворительный результат.

Только на стадии осветления сбора после культивирования не было приемлемого выхода. Поскольку существует возможность улучшений, которые могут быть оценены, то выход в DSP рассчитывали,

- 22 032680 исходя из осветленного и подвергнутого предварительной обработке сбора после культивирования. После глубинного фильтрования было потеряно примерно 20% активности. Более раннее исследование показало, что TFF может улучшить выход на этапе осветления. Общий выход, с учетом этапа осветления, составлял 58%.

Теоретическое значение pI для GALC составляет 5,9, тогда как обнаруженное значение pI составляло 6,3. Поскольку rhGALC содержит кислый M6P и сиаловую кислоту, этот факт оказался неожиданным. Эксперименты, проведенные перед этим исследованием, показали высокую чувствительность rhGALC к pH: при длительном хранении она стабильна только вблизи своего pI, pH 6,0-6,6. Теоретически, в DSP следует избегать значений pH вблизи pI, чтобы избежать выпадения в осадок, но в случае DSP для получения rhGALC это является единственной возможностью. Продукт был прозрачным на всем протяжении осуществления DSP, и никакой тенденции к опалесценции не наблюдалось. Объяснением высокого значения pI могло служить то, что в результате образования мицелл твин/rhGALC изменяется теоретически рассчитанное число экспонированных аминокислот. Твин включали во все использованные в DSP буферы (за исключением буфера для предварительной обработки сорбента Blue, где его заменяют на плуроник) для поддержания ферментативной активности. Остается оценить минимальную концентрацию твина, необходимую для сохранения стабильности.

Элюирование как на стадии захвата, так и на промежуточной стадии является сложным процессом. Для обоих элюирующих буферов предварительно оговаривалось обязательное присутствие пропиленгликоля (PG). Помимо этого, для достижения оптимального выхода были необходимы другие вспомогательные вещества и тщательная оптимизация буферов. Недостатком может быть то, что вместе с rhGALC могут элюироваться высокогидрофобные примеси. В качестве примеси после стадии захвата и промежуточной стадии был идентифицирован (вестерн-блоттингом с использованием антитела к сапозину A) просапозин, гидрофобный белок с молекулярной массой 70 кДа. Присутствие PG в высокой концентрации не является оптимальным условием для поддержания ферментативной активности rhGALC, и поэтому сбор осуществляли в предварительно наполненные контейнеры.

Некоторые дополнительные комментарии к способу, постадийно.

На стадии захвата, Capto™ Blue, осуществляли стабилизацию фермента и устранение окраски среды после культивирования, что было ее главной целью. Важное значение с точки зрения выхода имело корректное приготовление элюирующего буфера. Он должен содержать 50% (об.:об.) пропиленгликоля, что соответствует 521 г/л буфера.

На промежуточной стадии, Capto™ Adhere, происходило удаление большей части примесей. Для элюирования были необходимы кислотные условия. Чтобы избежать выпадения белка в осадок, было важно изменить условия в сторону кислотных быстро, используя буфер с высокой ионной силой. Затем буфер заменяли на кислотный буфер с низкой ионной силой. Причины заключались в том, чтобы удалить дополнительные примеси и гарантировать, чтобы элюированный продукт был кислотным, но с низкой ионной силой, дабы иметь возможность быстро изменить pH обратно до значений больше 6 посредством сбора в контейнер, предварительно наполненный буфером с pH 6,5.

Применение смолы Toyopearl Ether сочетало в себе достижение надлежащего выхода в результате использования водных буферов без каких-либо органических растворителей, таких как PG и IPA, с возможностью удаления оставшихся HCP с гидрофобными характеристиками. Преимущество заключалось в том, что элюирование с приемлемым выходом было возможно осуществить с использованием фосфатного буфера, содержащего хлорид натрия. Недостаток заключался в том, что для связывания rhGALC были необходимы очень высокие концентрации соли. Требовался большой объем буфера для предварительной обработки, что удлиняет продолжительность загрузки.

Эта стадия оказалась очень эффективной при отделении rhGALC от примесей с характеристиками, схожими с таковыми у rhGALC. Важное значение для надежного выведения примесей заключалось в повторном изменении концентраций как твина, так и соли, что можно описать как циклы промывки и отмывки. После стадии с применением Ether-смолы никакого количества просапозина не смогли идентифицировать.

Две стадии, предназначенные для инактивации/удаления вирусов, представляют собой часть способа при промышленном масштабировании. Никаких экспериментов по устранению вирусов не проводили, однако в отношении выхода и потока эти стадии выглядят многообещающими.

Стадию инактивации детергентом объединяли с элюированием на стадии захвата. Высокая концентрация твина не оказывала никакого негативного влияния на связывание в колонке на промежуточной стадии, и ферментативная активность сохранялась после выдерживания при комнатной температуре в течение 24 ч (также при хранении в целом в течение 3 суток при +5°C). После стадии с применением Ether-смолы планируется провести стадию фильтрования для удаления вирусов, на Planova 15N. В проведенном ранее исследовании это было признано целесообразным, и это не повторяли. Предварительная приближенная оценка для крупномасштабного эксперимента указывает на то, что через 1 м² Planova 15N можно профильтровать 80 л продукта в течение примерно 5 ч.

Для приготовления композиции и концентрирования после стадии тонкой очистки использовали UFDF с применением V-образного сетчатого фильтра с MWCO 30 кДа. Для исследований по оптимиза

- 23 032680 ции в условиях пилотного масштабирования, которые требуют больших количеств продукта, пригоден только V-образный сетчатый фильтр с открытыми каналами (0,1 м²). С учетом трех циклов UFDF из предшествующего исследования были откорректированы условия для стадий с небольшой загрузкой. Недостатком UFDF может быть накопление твина. Продукты с Ether-смолы промывали и элюировали буфером, содержащим только 0,0005% твина. В продукте с Ether-смолы было трудно определить количество твина, однако по оценкам оно составляло примерно 0,003%. В буфере для UFDF/для приготовления композиций содержалось 0,0005% твина. После замены 8 объемов буфера и концентрирования примерно в 7 раз концентрация твина составляла примерно 0,025%. Продукт после UFDF легко проходил через фильтр с порами 0,22 мкм без какой-либо потери продукта с получением конечного продукта.

Предварительные данные указывают на то, что такая концентрация твина в комбинации с другими компонентами буфера для приготовления композиций является оптимальной для поддержания стабильности rhGALC при долгосрочном хранении при +5, -20, -80°C. Сухой продукт можно подвергнуть замораживанию, если концентрацию маннита увеличить до 250 мМ.

SDS-PAGE с последующим окрашиванием красителем Colloidal Blue показал наличие конечного продукта с чистотой более 99%. Процессированные формы rhGALC с MW 30 и 50 кДа можно заметить в виде минорных зон, и их содержание оценивалось менее 0,5%. Наиболее четко выраженным (примерно 2%) белком помимо формы rhGALC с ММ 80 кДа была форма rhGALC с ММ 160 кДа, заметная только в том случае, если с буфером для SDS-PAGE-образцов смешивали rhGALC в высокой концентрации. Вестерн-блот-анализ подтверждал, что в образце белка rhGALC может содержаться димер, который не до конца диссоциировал под действием SDS в восстанавливающих условиях. Возможно, что этот димер был только артефактом. PAGE в нативных условиях, при нейтральных рН, показал, что для rhGALC зафиксировано несколько видов агрегатов, от мономеров до мультимерных форм rhGALC, состоящих примерно из 10 молекул. Самым распространенным агрегатом, по-видимому, является димер.

Заключение и выводы.

Клетки CHO, экспрессирующие рекомбинантную GALC человека, культивировали в одном из биореакторов емкостью 20 л в Королевском технологическом институте в Стокгольме, Швеция.

Очищали 19,5 л сбора после культивирования с получением 17 миллионов единиц или 1,0 г чистой rhGALC, используя способ выделения и очистки продукта, состоящий из трех хроматографических стадий с применением смол: Capto Blue, Capto Adhere и Toyopearl Ether; все хроматографические процедуры проводили в режиме связывания. Стадию инактивации вирусов, представляющую собой инкубацию в течение 16-24 ч при комнатной температуре с 1%-м твином 80, выполняли после стадии Capto Blue. Продукт обрабатывали с применением тангенциально-поточного фильтрования и проводили стерильную фильтрацию с получением конечного продукта TG1106.

Проводили стабилизацию сбора после культивирования путем добавления в биореактор ацетата натрия, после чего выполняли осветление посредством глубинного фильтрования и предварительную обработку для последующего связывания с захватывающей колонкой, Capto Blue. Подвергнутый предварительной обработке сбор после культивирования загружали на колонку Capto Blue объемом 730 мл за три цикла, которые выполняли в течение 24 ч. Продукт элюировали буфером на основе 50%-го пропиленгликоля в буфер для решения трех задач (three-purpose buffer): снизить содержание пропиленгликоля, повысить содержание твина до значения, аналогичного таковому на стадии, предназначенной для инактивации вирусов, и подвергнуть предварительной обработке исходный материал для следующей стадии. Подвергнутый предварительной обработке исходный материал загружали на колонку Capto Adhere объемом 730 мл за три последовательных цикла. Продукт элюировали буфером, имеющим кислотный pH и содержащим пропиленгликоль, в буфер, в котором происходило уменьшение содержания пропиленгликоля и повышение pH с целью сохранения активности. После дополнительного перемешивания с буфером, содержащим ацетат аммония и хлорид аммония, подвергнутый предварительной обработке исходный материал загружали на колонку с Toyopearl Ether объемом 540 мл, выполняя три последовательных прогона. Продукт элюировали в фосфатный буфер, содержащий хлорид натрия и твин в низкой концентрации. После стадии тонкой очистки планируется включить стадию фильтрования для удаления вирусов, но в этом исследовании ее не проводили. Продукты после тонкой очистки объединяли, проводили замену буфера и концентрировали с использованием UFDF для переведения в буфер для композиций, оптимальный при долгосрочном хранении чистой rhGALC. Для получения конечного продукта проводили стерильную фильтрацию продуктов со стадии UFDF. Анализ конечного продукта проводили, используя набор аналитических методов. Концентрация белка составляет 2,5 мг/мл, а ферментативная активность 42,5 кЕд/мл, таким образом удельная активность составляет 16,9 кЕд/мг. По оценкам чистота составляет более 99%. Остаточное количество HCP составляет 30 нг/мг rhGALC. Конечный продукт является прозрачным и бесцветным.

В заключение необходимо отметить, что новый оптимизированный DSP был успешно масштабирован к пилотному уровню с получением в результате выхода 74%, рассчитанного по активности. Конечный продукт TG1106 удовлетворяет требованиям по качеству для проведения исследований на животных.

- 24 032680

Пример 9.

Примеры применения разделения с помощью ионного взаимодействия.

Разделение с помощью ионного взаимодействия тестировали так, как описано ниже, с получением удовлетворительных результатов.

1) Mustang Q (MQ) представляет собой одноразовую мембрану с анионной подложкой. Ее тестировали в способе по настоящему изобретению в режиме проходящего потока (примеси, как, например, ДНК и белки клетки хозяина, связываются с мембраной, a GALC проходит через нее). Ее тестирование проводили либо до проведения стадии с применением Ether-смолы, либо после стадии с применением UFDF для приготовления композиций. Ее тестирование также проводили в составе системы с Capto Blue, также в режиме проходящего потока.

а) При включении после стадии с применением Ether-смолы: уравновешивание MQ осуществляли, используя смесь, содержащую 3,7 мМ фосфат натрия, 5 мМ глицин, 10 мМ маннит, 0,075М NaCl, 0,0005% твина 80, pH 6,2. Продукт разбавляли 1:1 (об.:об.), используя смесь, содержащую 3,7 мМ фосфат натрия, 5 мМ глицин, 10 мМ маннит, 0,0005% твина 80, pH 6,2 (или тот же буфер с 0,15 М NaCl), до момента пропускания его через MQ.

б) При включении после стадии UFDF: уравновешивание MQ осуществляли, используя смесь, содержащую 3,7 мМ фосфат натрия, 0,2М NaCl, 5 мМ глицин, 10 мМ маннит, 0,0005% твина 80, pH 6,2. Продукт разбавляли, используя 1М NaCl, до тех пор, пока электропроводность не составляла 20 мСм/см (приблизительно 1 объем продукта на 0,2 объема 1М NaCl), после чего продукт пропускали через MQ. Перед проведением стерильной фильтрации продукт разбавляли буфером для композиций без NaCl для подведения электропроводности снова к 15 мСм/см (0,15М NaCl).

План осуществления способа:

осветленный сбор после культивирования;

Capto Blue;

инактивация вирусов;

Capto Adhere; Toyopearl Ether, альтернативно a) Mustang Q;

UFDF, альтернативно б) Mustang Q;

фильтр, 0,22 мкм.

2) В способе выделения и очистки продукта может быть использована смола, представляющая собой сильный анионообменник (AIEX), такая как Capto Q, Giga Cap Q, Q FF, в режиме связывания. Также может быть использована смола, представляющая собой слабый анионообменник, такая как Capto DEAE и DEAE FF, но содержание оставшихся примесей будет выше. Смолу можно использовать до или после стадии тонкой очистки (с применением гидрофобной хроматографии (HIC)).

Методика 1.

План осуществления способа:

осветленный сбор после культивирования;

Capto Blue;

инактивация вирусов:

инактивация вирусов - 15% IPA и 1% t80. Примечание: при использовании IPA наблюдается некоторая инактивация;

Capto Adhere;

Macroprep Methyl:

уравновешивание смесью, содержащей 0,4-0,6М (NH₄)₂SO₄, 5% глицерина, 0,1% твина 80 (t80), pH 6,5. Проводили предварительную обработку продукта со смолы Capto Adhere смесью, содержащей 20 мМ NaPi, 5% глицерина, 0,8-1,2М (NH₄)₂SO₄, pH 6,5 (1:1) и загружали на колонку.

Промывка 1: 0,6М NaPi, 0,1% t80, pH 6,5.

Промывка 2: 20 мМ NaPi, 15 мМ NaCl, 0,1% T80;

Giga Cap Q:

уравновешивание смесью, содержащей 40 мМ MES, 15 мМ NaCl, 5% глицерина, 0,1% T80, pH 6,5. Загружали продукт со смолы Macroprep Methyl (без предварительной обработки) и промывали уравновешивающим буфером.

Элюирование: 40 мМ MES, 0,7М NaCl, 5% глицерина;

UFDF.

Методика 2.

План осуществления способа:

осветленный сбор после культивирования;

Capto Blue;

инактивация вирусов;

Capto Adhere;

Giga Q:

- 25 032680 уравновешивание смесью, содержащей 40 мМ MES, 15 мМ NaCl, 0,1% T80, pH 6,5. Capto Adhere подвергали предварительной обработке смесью, содержащей 20 мМ NaPi, 0,1% t80, pH 6,5, до значения электропроводности 7 мСм/см. Загружали и промывали уравновешивающим буфером;

смола Ether;

UFDF.

Пример 10.

Проводили тестирование следующих мультимодальных смол с получением удовлетворительных результатов.

1) MMC для стадии захвата (очень ранние эксперименты).

Исходный материал: pH сбора после культивирования подводили до 5,6-6,0, используя 400 мМ NaPi (кислую форму).

Использованный уравновешивающий буфер: 20 мМ Na-Pi, pH 5,6-6,0, + 0,1М NaCl + 0,05% твина 80 (t80).

Использованный буфер для промывки: 0,95М Na-Ac, pH 4,9, + 5% IPA.

Использованный элюирующий буфер: 50 мМ Трис-HCl, pH 9,0, + 1,0М NaCl + 40% пропиленгликоля + 0,1% t80.

Результаты: анализ присутствия фермента проводили, используя дот-блот-метод. Детекцию фермента осуществляли в самом начале (+++) и при элюировании - фракция 1 (++). Никакого фермента в проходящем потоке обнаружено не было. Для фракций выполняли анализы с применением SDS-PAGE и HPLC.

2) Butyl-S для 2-й промежуточной стадии или для стадии тонкой очистки Исходный материал: предварительная обработка до 0,5-6М (NH4)2SO4.

Уравновешивание: 20 мМ NaPi, 0,5М (NH₄)₂SO₄, 5% глицерина, 0,1% t80, pH 6,5.

Промывка: уравновешивающий буфер.

Элюирование: 20 мМ NaPi, 0,1М NaAc, 5% IPA, 0,1% t80, pH 7,8.

3) PPG для 2-й промежуточной стадии (ex test 44-47).

Исходный материал: предварительная обработка до 0,5М (NH₄)₂SO₄ и 0,5М NaAc, pH 6,3.

Уравновешивание: 20 мМ NaPi, 0,5М (NH₄)₂SO₄ и 0,5М NaAc, 0,0005-0,1% t80, 5% глицерина, pH 6,4.

Промывка: 1,6М NaAc, 0,1% t80, pH 7,4.

Промывка 2: 0,7М NaPi, pH 6,5.

Элюирование: 20 мМ NaPi, 30% пропиленгликоля, 0,05% t80, pH 7,8.

Пример 11.

Проводили тестирование следующих комбинаций смол с получением удовлетворительных результатов.

Предварительный тест: в среднем приблизительно 350 нг HCP/мг GALC.

Capto Blue,

Capto Adhere,

Capto Butyl,

Capto DEAE.

Тест 1: 240 нг HCP/мг GALC:

Capto Blue,

Capto Adhere,

Butyl-S.

Тест 2: 430 нг HCP/мг GALC:

Capto Blue,

Capto Adhere,

Macro-Prep Methyl,

Giga Cap Q.

Тест 3: 78 нг HCP/мг GALC:

Capto Blue,

Capto Adhere,

PPG.

Тест 4: 50 нг HCP/мг GALC (но наблюдается опалесценция, обусловленная инактивацией вирусов смесью IPA+твин):

Capto Blue,

Capto Adhere,

Butyl-S.

Тест 5: 193 нг HCP/мг GALC.

Фильтр в составе системы Capto Blue-Mustang Q,

Capto Adhere, смола Ether.

- 26 032680

Тест 6: 79 нг HCP/мг GALC.

В составе системы Capto Blue-Mustang Q,

Capto Adhere, смола Ether.

Пример 12.

Анализ с использованием HNG для определения активности галактоцереброзидазы (GALC). Принцип.

Галактоцереброзидаза (GALC) отвечает за лизосомальный катаболизм галактоцереброзида (синоним: галактозилцерамид), основного липида в клетках миелиновой оболочки, почек и эпителия. GALC гидролизует сложноэфирные связи между остатком галактозы и остальной частью молекул галактоцереброзида, галактозилсфингозина, лактозилцерамида и моногалактозилдиглицерида. GALC также способна гидролизовать синтетический аналог галактоцереброзида, хромогенный субстрат 2гексадеканоиламино-4-нитрофенил-b-D-галактопиранозид (HNG). Натриевая соль продукта реакции, 2гексадеканоиламино-4-нитрофенола (HN), поглощает свет при 410 нм. Этот принцип применен в способе, изложенном в данном описании.

Принцип анализа для GALC. HNG гидролизуется под действием GALC до получения HN (при pH 4,5), продукта желтой окраски (при pH 10,5), который определяют спектрофотометрически при 410 нм.

Гидролитическое расщепление 2-гексадеканоиламино-4-нитрофенил-b-D-галактопиранозида.

Приготовление образцов.

Сбор после культивирования или очищенная GALC.

Желаемые разведения образцов готовили, используя 0,5%-ный тритон X-100. Необходимым разведением для проведения анализа было разведение по меньшей мере 1:10.

Клеточный лизат.

Осадки после центрифугирования клеток промывали в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS), собирали центрифугированием (400*g в течение 5 мин при комнатной температуре (КТ)) и проводили лизис в 0,5%-ном тритоне Х-100. Определение содержания белка в клеточном лизате проводили, используя протокол с применением титрационного микропланшета и набора для анализа белка по BCA (бычий сывороточный альбумин) (Pierce).

Типичный эксперимент проводили, используя 1-5 мг белков клеточного лизата.

Получение калибровочной кривой и контроля для анализа.

Для получения калибровочной кривой использовали первый стандарт rhGALC собственного изготовления, StG01. Готовили точные копии пять точных разведений (1/400, 1/600, 1/800, 1/1200 и 1/1600) в повторах

№ стадии	Образец для разведения	Образец (мкл)	Пипетка №*	0,5%-ный тритон Х-100 (мкл)	Предварит, разведения
1	StG01	10	1	90	1/10
2	Предварительное разведение 1/10	20	2	180	1/100
					Конечные разведения
3	Предварительное разведение 1/100	50	2	150	1/400
3	Предварительное разведение 1/100	30	2	150	1/600
3	Предварительное разведение 1/100	25	2	175	1/800
3	Предварительное разведение 1/100	10	1	110	1/1200
3	Предварительное разведение 1/100	10	1	150	1/1600

Для приготовления контроля для анализа использовали второй стандарт rhGALC, StG02

- 27 032680

№ стадии	Образец, исп. для разведения	Образец (мкл)	Пипетка №*	0,5%-ный тритон Х-100 (мкл)	Предварит, разведения
1	StG02	10	1	90	1/10
2	Предварительное разведение 1/10	10	1	190	1/200
3	Предварительное разведение 1/200	10	1	190	1/4000
					Конечное разведение
4	Предварительное разведение 1/4000	50	2	150	1/16000

Методика инкубирования.

а) По 20 мкл разведений стандарта, образца, контроля и холостой пробы (blank) (0,5% тритона X100) добавляли в 96-луночный планшет с U-образными лунками. Использовали по 20 мкл каждого повтора разведений стандарта StG01, контроля и образцов (20 мкл *2, если делали единственное разведение) и 20 мкл *2 холостой пробы. После внесения проб во все лунки добавляли по 20 мкл раствора HNG в качестве субстрата для анализа во все лунки, содержащие образец, холостую пробу и контроль, после чего выполняли перемешивание. Планшет инкубировали при 37°C в течение 30 мин или 1 ч.

б) Используя многоканальную пипетку, добавляли по 80 мкл раствора, останавливающего реакцию с HNG (0,1М глицин/0,1М NaOH, pH 10,5), затем перемешивали на планшетном шейкере в течение приблизительно 30 с и добавляли 160 мкл этанола. Раствор перемешивали, из каждой лунки отбирали по 200 мкл и переносили в лунки 96-луночного фильтровального планшета, установленого на 96-луночном планшете с лунками с плоским дном. Планшет центрифугировали при 2000*g в течение 2 мин при комнатной температуре.

Измерения Адщнм.

Измерения выполняли, используя планшетный ридер Spectra Max Plus или планшетный ридер BioTek.

Расчеты.

Определение: за одну единицу (1 Ед.) активности принимали количество фермента, гидролизующего субстрат с получением 1 нмоль HN за одну минуту при 37°C, pH 4,5.

По оценкам средняя активность раствора первого стандарта rhGALC собственного изготовления, StG01, определенная с использованием HNG, составляла 1884 ед./мл. Значения активности, используемые для построения калибровочной кривой, рассчитывали с учетом разведений этого раствора StG01 с такой средней активностью, определенной с использованием HNG

№ стандарта	Разведение StG01	Активность разведенного StG01, ед/мл
1	1/400	4,71
2	1/600	3,14
3	1/800	2,355
4	1/1200	1,57
5	1/1600	1,1775

Расчет удельной активности.

Концентрацию GALC в перемешанных образцах определяли, используя ELISA для GALC. Концентрацию белка в очищенных препаратах GALC определяли, используя A280 (теоретический удельный коэффициент поглощения для rhGALC составляет 2,5) или анализ белка при 660 нм.

Чтобы рассчитать удельную активность (единицы/мг) или ферментативную активность на один мг белка (единицы/мг белка), активность, определенную с использованием HNG, делили на концентрацию GALC или белка.

Сначала активность GALC в клеточном лизате была определена как нмоль полученного в результате гидролиза продукта на один мг за один час (нмоль/мг/ч). Чтобы преобразовать единицы/мг в нмоль/мг/ч, необходимо умножить на 60 (т.е. перевести минуты в часы).

- 28 032680

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> ЭЙС БАЙОСАЙЕНСИЗ А/С

Фог, Йенс

Андерссон, Клаэс

Хюден, Пиа

Гульстад, Пиа Рингхольм

Лунделль, Керстин

Эртман, Магнус <120> Получение галактоцереброзидазы <130> 50185dk01 <160> 2 <170> BiSSAP 1.2 <210> 1 <211> 3761 <212> ДНК <213> Homo sapiens <220>

<221> источник <222> 1..3761 <223> /мол._тип=неопределенная ДНК /организм=Homo sapiens <400> 1 ggctactctc cgggccgcgc tgctcgacga gcggggcaac attatctctt gtgatgggca attatttccg ttacactcat cttatgtcaa gttaccatga attatattaa tagcaagtga tcaaggtggt agttgactgg gtgcaggctg caatcgcatg tgatgacggc cagctcatac tagagaaagg ttgaaaccat tgtcacaaca aggtatggta ctctatggct tcacactcac agcccttccc ctccaaactt gcgagcatca atgcatccaa gtgatgttta aaggtggtat cttacagggt ttacagcaaa tgctgaatga ggcttcctgg cgcggtgccc ctccgacggg ctcccgactt taagccgaat gacaacagac aggatacgag tgggttgcca tcttcagctg tttggacatt gatattaaga taatctctgg tgatgttata gaagaagctt ctggggtcgc gaatttagtg ccaagagcca cactcagttt aggaagctac gagtcataaa atttgccacc taccaaactt ccttgacagc cactctcacc aagtacctat tgctgatcaa cttcacgcta cacaatcagt catagagacc tttgattaga tacaggtgat aaaatggtat caagtctctg caacgccgag ttgctgctgt ctgggccggg ctagtaaatt tttggtgcct ggcactgagc tggtggttga tggtcattcc actgcctatt gattatattg aaaatgctga gagtccatct ggggctcatt tggtcttctg attttaaatc gctagttact tggagtgggc actcaacctg gtagctctga cattctaagt tttgttctta ggaaaaacat gatggcagtt actggtcgca aaggatgatt actggtgtat cgccaagttc attataggag cctgacacag agtgccagag ttagctggat acactcacgt tggacagaca cgaaagctat gtgcgctgct agttcgacgg acccagagcc ctttgcatat cctcccacat tgaaagaagc ctggatggct atgtcgtgac gaatttggaa attatcaagg ctgcatccat atcctggaac aagactttag agaattatat atgaacagtt actacgtggt gctggtatta ctgatggctt gcatacggcc agggatcttt ccgaaagatt tcacactgag aaggcagcta tcaatgttga ttgaatattt tcaaccagag actacaactg gaggtgtgtt gaattttctt ggattatata taactattaa tccctgtgaa gactgcggcc ggcgcccggc catcggcgcg ctatcgttct tttaaaagtg gcattatgca taagaagagg gggaaaaggt ctggattgtg tgagaggtca tctccagcga gctccttgat ccattcagca cactttaaat caatggctat gccttatggg agaatctcct cctgaagaca agggaacctc atttcttcct tagtgaaata tctttttaag cctgcatgaa cccgcttcct ttacccattt tacaaatatt acccattacg gaccaatctg cattgcagga ctggattttt tgctttagga gggtcatttc ttttccaaag gcgggttcgg ggcgcgtacg gtcagcggcg cagatattgg gaaataggtg ctagatgaga aatcccaata ttcgactggc ggcgccaagc tataatgcca gtgaaaatca gccgaactct aaagatgcaa agtgacatgg atgacttcca agatgcgggt gtctgggtat gttggccatt accatcatca tatttcaatg ccagagctac cagctggatt gatgagctgt ccaaaatccc tttagtgaag gaagaccctg tgggctgccg actataaagt agagtaaata gcaaatggat cgtgttgaag gcctctggca aatggctggg

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1380

1440

1500

1560

1620

1680

1740

1800

1860

1920

1980

- 29 032680 ctgcaattgg aactcactcc tttgaatttg cacagtttga caactttctt gtggaagcca2040 cacgctaata cttaacaggg catcatagaa tactctggat tttcttccct tctttttggt2100 tttggttcag agccaattct tgtttcattg gaacagtata tgaggctttt gagactaaaa2160 ataatgaaga gtaaaagggg agagaaattt atttttaatt taccctgtgg aagattttat2220 tagaattaat tccaagggga aaactggtga atctttaaca ttacctggtg tgttccctaa2280 cattcaaact gtgcattggc cataccctta ggagtggttt gagtagtaca gacctcgaag2340 ccttgctgct aacactgagg tagctctctt catcttattt gcaagcggtc ctgtagatgg2400 cagtaacttg atcatcactg agatgtattt atgcatgctg accgtgtgtc caagtgagcc2460 agtgtcttca tcacaagatg atgctgccat aatagaaagc tgaagaacac tagaagtagc2520 tttttgaaaa ccacttcaac ctgttatgct ttatgctcta aaaagtattt ttttattttc2580 ctttttaaga tgatactttt gaaatgcagg atatgatgag tgggatgatt ttaaaaacgc2640 ctctttaata aactacctct aacactattt ctgcggtaat agatattagc agattaattg2700 ggttatttgc attatttaat ttttttgatt ccaagttttg gtcttgtaac cactataact2760 ctctgtgaac gtttttccag gtggctggaa gaaggaagaa aacctgatat agccaatgct2820 gttgtagtcg tttcctcagc ctcatctcac tgtgctgtgg tctgtcctca catgtgcact2880 ggtaacagac tcacacagct gatgaatgct tttctctcct tatgtgtgga aggaggggag2940 cacttagaca tttgctaact cccagaattg gatcatctcc taagatgtac ttacttttta3000 aagtccaaat atgtttatat ttaaatatac gtgagcatgt tcatcatgtt gtatgattta3060 tactaagcat taatgtggct ctatgtagca aatcagttat tcatgtaggt aaagtaaatc3120 tagaattatt tataagaatt actcattgaa ctaattctac tatttaggaa tttataagag3180 tctaacatag gcttagctac agtgaagttt tgcattgctt ttgaagacaa gaaaagtgct3240 agaataaata agattacaga gaaaattttt tgttaaaacc aagtgatttc cagctgatgt3300 atctaatatt ttttaaaaca aacattatag aggtgtaatt tatttacaat aaaatgttcc3360 tactttaaat atacaattca gtgagttttg ataaattgat atacccatgt aaccaacact3420 ccagtcaagc ttcagaatat ttccatcacc ccagaaggtt ctcttgtata cctgctcagt3480 cagttccttt cactcccaat tgttggcagc cattgatagg aattctatca ctataggtta3540 gttttctttg ttccagaaca tcatgaaagc ggcgtcatgt actgtgtatt cttatgaatg3600 gtttctttcc atcagcataa tgatttgaga ttggtccatg ttgtgtgatt cagtggtttg3660 ttccttctta tttctgaaga gttttccatt gtatgaatat accacaattt gtttcctccc3720 caccagtttc tgatactaca attaaaactg tctacattta c3761 <210> 2 <211> 669 <212> ПРТ <213> Homo sapiens <400> 2

Met Thr Ala Ala Ala Gly Ser Ala Gly Arg Ala Ala Val Pro Leu Leu

5 1015

Leu Cys Ala Leu Leu Ala Pro Gly Gly Ala Tyr Val Leu Asp AspSer

2530

Asp Gly Leu Gly Arg Glu Phe Asp Gly Ile Gly Ala Val Ser Gly Gly

4045

Gly Ala Thr Ser Arg Leu Leu Val Asn Tyr Pro Glu Pro Tyr Arg Ser

5560

Gln Ile Leu Asp Tyr Leu Phe Lys Pro Asn Phe Gly Ala Ser LeuHis

70 7580

Ile Leu Lys Val Glu Ile Gly Gly Asp Gly Gln Thr Thr Asp GlyThr

9095

Glu Pro Ser His Met His Tyr Ala Leu Asp Glu Asn Tyr Phe Arg Gly

100 105110

Tyr Glu Trp Trp Leu Met Lys Glu Ala Lys Lys Arg Asn Pro Asn Ile

115 120125

Thr Leu Ile Gly Leu Pro Trp Ser Phe Pro Gly Trp Leu Gly Lys Gly

130 135140

Phe Asp Trp Pro Tyr Val Asn Leu Gln Leu Thr Ala Tyr Tyr ValVal

145 150 155160

Thr Trp Ile Val Gly Ala Lys Arg Tyr His Asp Leu Asp Ile AspTyr

165 170175

Ile Gly Ile Trp Asn Glu Arg Ser Tyr Asn Ala Asn Tyr Ile Lys Ile

180 185190

Leu Arg Lys Met Leu Asn Tyr Gln Gly Leu Gln Arg Val Lys Ile Ile

- 30 032680

195

200

205

Ala

Ser

Asp

Asn

Leu

Trp

Glu

Ser

Ile

Ser

Ala

Ser

Met

Leu

Asp

210

215

220

Ala

Glu

Leu

Phe

Lys

Val

Asp

Val

Ile

Gly

Ala

His

Tyr

Pro

Gly

225

230

235

240

Thr

His

Ser

Ala

Lys

Asp

Ala

Lys

Leu

Thr

Gly

Lys

Leu

Trp

Ser

245

250

255

Ser

Glu

Asp

Phe

Ser

Thr

Leu

Asn

Ser

Asp

Met

Gly

Ala

Gly

Cys

Trp

260

265

270

Gly

Arg

Ile

Leu

Asn

Gln

Asn

Tyr

Ile

Asn

Gly

Tyr

Met

Thr

Ser

Thr

275

280

285

Ile

Ala

Trp

Asn

Leu

Val

Ala

Ser

Tyr

Glu

Gln

Leu

Pro

Tyr

Gly

290

295

300

Arg

Cys

Gly

Leu

Met

Thr

Ala

Gln

Glu

Pro

Trp

Ser

Gly

His

Tyr

Val

305

310

315

320

Val

Glu

Ser

Pro

Val

Trp

Val

Ser

Ala

His

Thr

Gln

Phe

Thr

Gln

325

330

335

Pro

Gly

Trp

Tyr

Leu

Lys

Thr

Val

Gly

His

Leu

Glu

Lys

Gly

340

345

350

Ser

Tyr

Val

Ala

Leu

Thr

Asp

Gly

Leu

Gly

Asn

Leu

Thr

Ile

355

360

365

Glu

Thr

Met

Ser

His

Lys

His

Ser

Lys

Cys

Ile

Arg

Pro

Phe

Leu

Pro

370

375

380

Tyr

Phe

Asn

Val

Ser

Gln

Phe

Ala

Thr

Phe

Val

Leu

Lys

Gly

Ser

385

390

395

400

Phe

Ser

Glu

Ile

Pro

Glu

Leu

Gln

Val

Trp

Tyr

Thr

Lys

Leu

Gly

Lys

405

410

415

Thr

Ser

Glu

Arg

Phe

Leu

Phe

Lys

Gln

Leu

Asp

Ser

Leu

Trp

Leu

420

425

430

Asp

Ser

Asp

Gly

Ser

Phe

Thr

Leu

Ser

Leu

His

Glu

Asp

Glu

Leu

Phe

435

440

445

Thr

Leu

Thr

Leu

Thr

Gly

Arg

Lys

Gly

Ser

Tyr

Pro

Leu

Pro

450

455

460

Pro

Lys

Ser

Gln

Pro

Phe

Pro

Ser

Thr

Tyr

Lys

Asp

Phe

Asn

Val

465

470

475

480

Asp

Tyr

Pro

Phe

Ser

Glu

Ala

Pro

Asn

Phe

Ala

Asp

Gln

Thr

Gly

485

490

495

Val

Phe

Glu

Tyr

Phe

Thr

Asn

Ile

Glu

Asp

Pro

Gly

Glu

His

Phe

500

505

510

Thr

Leu

Arg

Gln

Val

Leu

Asn

Gln

Arg

Pro

Ile

Thr

Trp

Ala

Asp

515

520

525

Ala

Ser

Asn

Thr

Ile

Ser

Ile

Gly

Asp

Tyr

Asn

Trp

Thr

Asn

Leu

530

535

540

Thr

Ile

Lys

Cys

Asp

Val

Tyr

Ile

Glu

Thr

Pro

Asp

Thr

Gly

Val

545

550

555

560

Phe

Ile

Ala

Gly

Arg

Val

Asn

Lys

Gly

Ile

Leu

Ile

Arg

Ser

Ala

565

570

575

Arg

Gly

Ile

Phe

Trp

Ile

Phe

Ala

Asn

Gly

Ser

Tyr

Arg

Val

Thr

580

585

590

Gly

Asp

Leu

Ala

Gly

Trp

Ile

Tyr

Ala

Leu

Gly

Arg

Val

Glu

Val

595

600

605

Thr

Ala

Lys

Trp

Tyr

Thr

Leu

Thr

Leu

Thr

Ile

Lys

Gly

His

Phe

610

615

620

Ala

Ser

Gly

Met

Leu

Asn

Asp

Lys

Ser

Leu

Trp

Thr

Asp

Ile

Pro

Val

625

630

635

640

Asn

Phe

Pro

Lys

Asn

Gly

Trp

Ala

Ile

Gly

Thr

His

Ser

Phe

Glu

645

650

655

Phe

Ala

Gln

Phe

Asp

Asn

Phe

Leu

Val

Glu

Ala

Thr

Arg

660

665

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ получения композиции очищенной рекомбинантной галактоцереброзид- β-галактозидазы человека (rhGALC) из клеточной культуры, где фракцию указанной клеточной культуры, содержащую rhGALC, подвергают хроматографии на смолах, включающий:

а) стадию захвата, на которой указанную rhGALC очищают на первой мультимодальной хроматографической смоле, где смола представляет собой Capto™ Blue High Sub или содержит в качестве лиганда соединение формулы (I), (II) или (III) где R в соединениях формулы (II) и (III) представляет собой функциональную группу формулы (IV)

HN н ”=<

_/Z ^N

N С

SO₃H ^х

б) промежуточную стадию, на которой указанную rhGALC очищают на второй мультимодальной хроматографической смоле, содержащей лиганд формулы (VIII) или лиганд формулы (IX)

в) стадию тонкой очистки, на которой указанную rhGALC очищают на третьей хроматографической смоле, которая содержит лиганд, содержащий группу простого эфира, выбранной из группы, состоящей из мультимодальной хроматографической смолы, анионообменной смолы и смолы для хроматографии гидрофобных взаимодействий (HIC), где молярное соотношение между полноразмерной rhGALC (80 кДа) и основными процессированными продуктами (50+30 кДа) в указанной композиции составляет по меньшей мере 50:2,5.

2. Способ по п.1, где указанная промежуточная стадия включает очистку указанной rhGALC на указанной второй мультимодальной хроматографической смоле с последующей очисткой указанной rhGALC на третьей хроматографической смоле, выбранной из группы, состоящей из:

3. Способ по любому из пп.1, 2, где после по меньшей мере одной из указанных стадии захвата а) и промежуточной стадии б) осуществляют инактивацию вирусов и/или очистку посредством разделения с помощью ионного взаимодействия.

4. Способ по любому из пп.1-3, где указанную rhGALC элюируют с указанной первой мультимодальной хроматографической смолы в первом элюирующем буфере, содержащем по меньшей мере 30% пропиленгликоля и/или этиленгликоля (об./об.).

5. Способ по любому из пп.1-4, где указанную rhGALC элюируют с указанной второй мультимодальной хроматографической смолы во втором элюирующем буфере, содержащем по меньшей мере 30% пропиленгликоля и/или этиленгликоля (об./об.) и имеющем pH ниже 5,5.

- 32 032680

6. Способ по любому из пп.1-5, включающий:

б) загрузку фракции указанной клеточной культуры на первую мультимодальную хроматографическую смолу;

7. Способ по любому из пп.1-6, где первую хроматографическую смолу промывают в буфере для промывки, содержащем не более 20% пропиленгликоля и/или этиленгликоля (об./об.).

8. Способ по любому из пп.1-7, где первый элюирующий буфер содержит пропиленгликоль и/или этиленгликоль в общей концентрации 40-60% (об./об.).

9. Композиция rhGALC, полученная способом по любому из пп.1-8, где молярное соотношение между полноразмерной rhGALC (80 кДа) и основными процессированными продуктами (50+30 кДа) в указанной композиции составляет по меньшей мере 50:2,5.

10. Применение композиции по п.9 в качестве лекарственного средства для заместительной терапии ферментами.

11. Применение композиции по п.9 в лечении глобоидно-клеточной лейкодистрофии (болезни Краббе).

12. Лекарственное средство для лечения глобоидно-клеточной лейкодистрофии (болезни Краббе), содержащее композицию rhGALC по п.9.