KR101783466B1

KR101783466B1 - 재조합 인간 갈락토세레브로사이드 베타-갈락토시다아제(rhGALC)의 정제

Info

Publication number: KR101783466B1
Application number: KR1020157015728A
Authority: KR
Inventors: 옌스 포그; 클라스 앤더슨; 피아 하이덴; 피아 링홀름 굴스타드; 커스틴 룬델; 매그너스 옐트맨
Original assignee: 치에시 파마슈티시 에스.피.아.
Priority date: 2012-11-13
Filing date: 2013-11-13
Publication date: 2017-10-10
Also published as: PL2920198T3; EP2920198B1; CN104854122B; JP6035427B2; HK1213915A1; AU2013347260B2; ES2751369T3; EA201590778A1; US20150284698A1; IL238775B; JP2015535422A; EA032680B1; CA2890358C; CA2890358A1; CN104854122A; KR20150117638A; EP2920198A1; BR112015010796B1; NZ707753A; WO2014075688A1

Abstract

본 발명은 세포 배양물(cell culture)로부터 재조합 인간 갈락토세레브로사이드 베타- 갈락토시다아제(galactocerebroside β- galactosidase: rhGALC)의 정제 방법에 관한 것으로, 상기 rhGALC를 포함하는 세포 배양물의 분획물을 별개의 세 크로마토그래피 수지에 적용한다.

Description

재조합 인간 갈락토세레브로사이드 베타-갈락토시다아제(rhGALC)의 정제 {Purification of Recombinant Human Galactocerebroside β-Galactosidase(rhGALC)}

본 발명은 재조합 인간 갈락토세레브로사이드 베타-갈락토시다아제(Galactocerebroside β- Galactosidase: rhGALC)의 정제 프로토콜 및 상기 방법에 의해 수득될 수 있는 산물(products)에 관한 것이다.

갈락토세레브로사이드 베타- 갈락토시다아제(galactocerebroside β- galactosidase)는 갈락토세레브로사이드로부터 갈락토스의 가수분해 절단을 촉진하는 효소이다. 결핍은 조직에 갈락토세레브로사이드의 축적에 결과이다. 종래에 기술된 방법은 간(Ben-Yoseph, Archives of Biochmistry and Biophysics, 1979), 림프구(Sakai et al, J. Biochem., 1994)및 소변(Chen et al, Biochimica et Biophysica acta, 1993)과 같은, 자연 표본으로부터 인간 GALC의 부분적 정제를 기술한다. 상기 방법은 GALC의 극심한 소수성 및 저과다로 인한 복잡성이 있다. 회수율이 극단적으로 낮게 수득된 산물은 GALC의 전체 길이 (80kDa) 및 프로세싱된 형태(주로 50 및 30 kDa)의 혼합물로 기술되어있다. 또한, 종래의 정제기술 및 목적은 인체의 효소 대체 요법(ERT)을 위한 대량 생산을 할 수 없다는 특성을 갖는다.

따라서, 인간의 사용에 적합한 생리 용액 내에 고순도 균질 생산물(80 kDa rhGALC)인 rhGALC 결과물의 개선된 정제 프로토콜은 이점을 갖는다.

도 1은 rhGALC의 정제를 위한 방법의 개략도를 나타낸다. 20 ℓ 생물반응기로부터 수득한 수득물을 세 가지 필롯(pilot) 규모 크로마토그래피 사이클로 정제하였다. 에테르 산물을 모은 최종 산물 TG1106의 결과물로 상기 과정을 한 사이클 실시하였다.
도 2는 UFDF 및 필터 사이클뿐만 아니라 세 가지 크로마토그래피 사이클 단계 당 수율(% 활성)을 나타낸다. 최종 산물에서 정화된 수득물에 전체 수율을 오른쪽에 나타낸다. 활성은 하나의 실험으로 측정된 산물에 에테르 단계를 제외하고, 계산한 두 개의 실험에서 최소 두 번 희석하여 반복 측정하였다.
도 3은 최종 산물에서 정화된 수득물로부터 총 잔여 활성의 개요를 나타낸다. 활성은 도 2와 같이 측정하였다.
도 4는 최종 산물 TG1106 및 내부 표준 StG02 및 StG03의 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. GALC는 StG02에 대응하여 발생되는 토끼 폴리클로날 항체를 가지고 검출하였다.
도 5는 에테르 산물, UFDF 산물 및 최종 산물 TG1106 및 표준 StG03의 발현하에 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. GALC는 StG02에 대응하여 발생되는 래빗 폴리클로날 항체를 가지고 검출하였다.
도 6은 TG1106 및 인-하우스 표준 StG03을 pH가 3-10인 겔 상에 등전점전기영동을 나타낸다.
도 7은 최종 산물 TG1106 및 다운스트림 진행 시료를 콜로이드 블루(Colloidal Blue)로 염색한 SDS-PAGE를 나타낸다.
도 8 및 도 9는 다양한 농도에 최종 산물 TG1106 및 StG03를 콜로이드 블루로 염색한 SDS-PAGE를 나타낸다.
도 10은 콜로이드 블루로 염색된 중성 pH에 G250 전하 이동(charge shift) 갖는 4-16% Bis-Tris 네이티브 PAGE을 나타낸다. 최종 산물 TG1106 및 인-하우스 표준 StG03의 분석.
본 발명은 하기에서 보다 상세하게 설명된다.

본 발명자들은 동물/인간 연구를 위해 요구되는 최종 산물(product)의 질(quality) 및 순도를 충족하는 재조합 인간 갈락토세레브로사이드 베타- 갈락토시다아제(galactocerebroside ㅯ- galactosidase) 결과물의 정제 방법을 개발하였다. 상기 방법은 세 가지 주요 크로마토그래피 단계 및 선택적인 하나의 UFDF 배합 단계를 포함한다. 본 발명의 연구에서 20 ℓ 유가 배양식(fed batch) 생물반응기로부터 신선하게 정제된 수득물은 동물/인간 연구를 위한 rhGALC 생산에 최적화된 방법으로 정제된다.

본 발명의 최종 목표는 리소좀 효소 저장 질환 글로보이드 세포 백질이영양증(Globoid Cell Leukodystrophy: 크라베 병)의 치료를 위한 효소 대체 요법으로서 rhGALC를 생산하는 것이다. 크라베 병(Krabbe disease)은 효소 GALC의 유전적 결핍에 의해 발생된다. GALC의 결핍은 스핑고지질(sphingolipid) 물질대사 산물 칼락토실스핑고신(galactosylsphingosine: 사이코신(psychosine))의 진보적인 축적, 탈수(demyelination) 및 요절(early death)을 초래한다.

따라서, 본 발명의 목적은 rhGALC에 대한 정제 프로토콜을 제공하는데 있다. 구체적으로, 본 발명의 목적은 동물 및 인간에게 유용하고 상기 언급된 문제점을 해결한 rhGALC에 정제 프로토콜을 제공하는데 있다.

따라서, 본 발명의 일 양태는 세포 배양물(cell culture)로부터 재조합 인간 갈락토세레브로사이드 베타- 갈락토시다아제(galactocerebroside β-galactosidase: rhGALC)의 정제방법에 있어서, rhGALC를 포함하는 상기 세포 배양물의 분획물을 수지상의 크리마토그래피에 적용하며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:

a) 상기 rhGALC를 제1다중 모드(multimodal) 크로마토그래피 수지로 정제하는 캡처(capture) 단계로서, 상기 단계는 선택적으로 바이러스 불활성 및/또는 이온 분리에 의한 정제 과정이 후속적으로 실시되며;

b) 상기 rhGALC를 제2다중 모드 크로마토그래피 수지로 정제하는 중간(intermediate) 단계로서, 상기 단계는 선택적으로 바이러스 불활성 및/또는 이온 분리에 의한 정제 과정이 후속적으로 실시되며;

c) 상기 rhGALC를 다중 모드 크로마토그래피 수지, 음이온 교환 수지 및 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 수지로 구성된 그룹으로부터 선택된 크로마토그래피 수지로 정제하는 폴리싱(polishing) 단계.

특정 구현예에서, 본 발명은 또한 세포 배양물로부터 재조합 인간 갈락토세레브로사이드 베타- 갈락토시다아제(rhGALC)의 정제방법에 있어서, rhGALC를 포함하는 상기 세포 배양물의 분획물을 수지상의 크리마토그래피에 적용하며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:

a) rhGALC를 포함하는 상기 세포 배양물의 분획물을 제공하는 단계;

b) 정전기적 리간드를 포함하는 제1다중 모드 크로마토그래피 수지에 상기 세포 배양물의 분획물을 로딩하는 단계;

c) 최소 30%(v/v) 프로필렌 글리콜 및/또는 에틸렌 글리콜을 포함하는 제1 용출 완충액으로 상기 제1다중 모드 크로마토그래피 수지로부터 rhGALC를 용출하며, 이에 의해 제1 용출액을 제공하는 단계;

d) 음이온 및 소수성 리간드를 포함하는 제2다중 모드 크로마토그래피 수지에 상기 제1 용출액을 로딩하는 단계;

e) 최소 30%(v/v) 프로필렌 글리콜 및/또는 에틸렌 글리콜을 포함하고 pH 5.5 이하인 제2 용출 완충액으로 상기 제2다중 모드 크로마토그래피 수지로부터 rhGALC를 용출하며, 이에 의해 제2 용출액을 제공하는 단계;

f) 소수성 리간드를 갖는 제3 크로마토그래피 수지에 상기 제2 용출액을 로딩하는 단계; 및

g) 수용성 완충액으로 제3 크로마토그래피 수지로부터 rhGALC를 용출하며, 이에 의해 제3 용출액을 제공하는 단계.

본 발명의 다른 양태는 rhGALCA를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 본 발명의 정제 방법에 의하여 수득 가능한 하나일 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 의약으로서의 용도를 위하여 본 발명에 따른 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 양태는 글로보이드 세포 백질이영양증(크라베 병)의 치료 용도를 위하여 본 발명의 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 양태는 글로보이드 세포 백질이영양증(크라베 병) 치료 및/또는 글로보이드 세포 백질이영양증(크라베 병)과 관련된 증후군을 감소 또는 완화하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 이를 필요로 하는 대상에게 본 발명에 따라 정제된 rhGALC를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.

방법

본 발명의 일 양태는 세포 배양물로부터 재조합 인간 갈락토세레브로사이드 베타- 갈락토시다아제(rhGALC)의 정제방법에 있어서, rhGALC를 포함하는 상기 세포 배양물의 분획물을 수지상의 크리마토그래피에 적용하며, 상기 방법은 다음의 단계를 포함한다:

d) 상기 rhGALC를 제1다중 모드 크로마토그래피 수지로 정제하는 캡처 단계로서, 상기 단계는 선택적으로 바이러스 불활성 및/또는 이온 분리에 의한 정제 과정이 후속적으로 실시되며;

e) 상기 rhGALC를 제2다중 모드 크로마토그래피 수지로 정제하는 중간 단계로서, 상기 단계는 선택적으로 바이러스 불활성 및/또는 이온 분리에 의한 정제 과정이 후속적으로 실시되며;

f) 상기 rhGALC를 다중 모드 크로마토그래피 수지, 음이온 교환 수지 및 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 수지로 구성된 그룹으로부터 선택된 크로마토그래피 수지로 정제하는 폴리싱 단계.

본 발명의 일부 구현예에 따르면, 상기 중간 단계는 상기 제2다중 모드 크로마토그래피 수지에 상기 rhGALC의 정제를 포함하며, 후속적으로 다음으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 크로마토그래피 수지를 이용한 상기 rhGALC의 정제 과정이 이루어진다:

i) 상기 제1 및 상기 제2다중 모드 크로마토그래피 수지와 상이한, 다중 모드 크로마토그래피 수지; 및

ii) 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 수지이다.

구체적으로는 상기 제1다중 모드 크로마토그래피 수지는 정전기적 리간드를 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 제2다중 모드 크로마토그래피 수지는 음이온 및 소수성 리간드를 포함한다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 폴리싱 단계에 크로마토그래피 수지는 소수성 리간드를 갖는 수지이다.

구체적으로는 상기 제1다중 모드 크로마토그래피 수지는 하기에 명시된 바와 같이 화학식(VI)의 화합물 리간드를 포함할 수 있다.

구체적으로는 상기 제2다중 모드 크로마토그래피 수지는 하기에 명시된 바와 같이 화학식(VIII)의 화합물 리간드를 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예에 따른 상기 제1다중 모드 크로마토그래피 수지는 하기에 명시된 바와 같이 화학식(VI)의 화합물 리간드를 포함하고 상기 제2다중 모드 크로마토그래피 수지는 하기에 명시된 바와 같이 화학식(VIII)의 화합물 리간드를 포함한다. 본 발명의 이러한 구현예에 따라면 rhGALC는 실질적으로 에테르 수지인 크로마토그래피 수지에서 정제된다. 예를 들어 적합한 에테르 수지는 다음과 같다.

본 발명의 몇 개의 구현예에 따르면, 상기 rhGALC는 최소 30%(v/v)의 프로필렌 글리콜 및/또는 에틸렌 글리콜을 포함하는 제1 용출(elution) 완충액으로 상기 제1다중 모드 크로마토그래피의 수지로부터 용출된다.

본 발명의 다른 구현예에서, 상기 rhGALC는 최소 30%(v/v)의 프로필렌 글리콜 및/또는 에틸렌 글리콜을 포함하고 pH 5.5 이하인 제2 용출 완충액으로 상기 제2다중 모드 크로마토그래피의 수지로부터 용출된다.

본 발명에 따른 상기 재조합 인간 갈락토세레브로사이드 베타- 갈락토시다아제(rhGALC) 정제를 위한 방법은 다음의 특정 단계를 포함할 수 있다:

인간 갈락토세레브로사이드 베타- 갈락토시다아제(rhGALC)에 대한 몇 개의 동의어가 존재한다. 가장 일반적으로 사용되는 것은 갈락토세레브로시다제(Galactocerebrosidase), 갈락토실세라미다아제(Galactosylceramidase), 갈세라제(Galcerase), 갈락토실세라마이드 베타-갈락토시다제(Galactosylceramide beta-galactosidase)(EC3.2.1.46)이다. 단백질 accession 번호들은 NP_000144.2 및 P45803 이다. 본 발명에 따른 rhGALC은 태그를 포함할 수 있는 것으로 이해된다.

본 발명의 양태 및 구현예에서 상기 용어 인간 갈락토세레브로사이드 베타- 갈락토시다아제(rhGALC)는 또한 기능적으로 동등한 부분 또는 전체 아미노산 서열의 유사체를 포함한다.

rhGALC의 일부 특성은 rhGALC 또는 기능적으로 동등한 부분 또는 이의 유사체의 정제 프로토콜을 세팅할 때 알고하는 것이 중요하다.

- 대략 80 kDa;

- 5 (또는 6) 글리코실화 부위(glycosylation sites);

- 아이소폼(Isoforms) 존재;

- pI theoterical 5.9, found 6.3;

- pH 민감도; pH 6.0-6.6 선호함

- 극도의 소수성;

- 활성 유지를 위해 계면활성제 필수 ;

- 다이머(Dimer), 트라이머(trimer), 콰트로머(quatromer) 형태;

본 명세서에 기재된 본 발명의 양태 및 구현예에서, 상기 rhGALC 또는 상기 기능적으로 동등한 부위 또는 이의 유사체는 다음으로 구성된 그룹으로부터 선택된 핵산 사열을 포함한다:

i) 서열 목록 제2 서열에 기재된 아미노산 서열;

ii) i)에서 정의된 아미노산 서열과 기능적으로 동등한 부위; 및

iii) i) 또는 ii)에서 정의된 아미노산 서열과 기능적으로 동등한 유사체, 상기 유사체의 아미노산 서열은 i) 또는 ii)에서 정의된 아미노산 서열에 최소 75% 일치.

본 발명의 문맥에서 상기 용어 "기능적으로 동등한"은 상기 부위 또는 rhGALC의 유사체가 알락토세레브로시드(alactocerebroside), 갈락토실스핑오신(galactosylsphingosine), 락토실세라마이드(lactosylceramide), 모노갈락토실디글리세라이드(monogalactosyldiglyceride), 및 the 발색 기질(chromogenic substrate ) 2-hexadecanoylamino-4-nitrophenyl-b-D-galactopyranoside(HNG)의 갈락토스 에스테르 결합을 가수분해 할 수 있다는 것을 의미한다. 특정 구현예에서 상기 부위 또는 rhGALC의 유사체는 상기 화합물의 갈락토스 에스테르 결합을 가수분해하기 위한 네이티브(native) 효소(서열목록 제2 서열에 기재된 아미노산 서열을 갖는)의 능력의 최소 50%, 예를 들어 최소 60%, 최소 70%, 최소 80%, 최소 90% 또는 최소 95%를 유지한다.

상기 부위 또는 rhGALC의 유사체의 촉매 특성은 pH 4.5에 2-hexadecanoylamino-4-nitrophenol(HN)에서 2-hexadecanoylamino-4-nitrophenyl-b -D-galactopyranoside(HNG)의 가수분해를 측정하여 결정될 수 있다. pH 10.5, NH 410 nm에 분광으로 결정될 수 있는, 노란색 산물이다. 상기 측정의 분명한 예는 본 발명의 실시예 12에서 제공된다.

특정 구현예에서 iii)에 상기 유사체는 i) 또는 ii)에서 정의된 서열에 최소 80% 동일하고 또는 i) 또는 ii)에서 정의된 서열에 최소 85%, 예를 들어 최소 90%, 최소 95%, 최소 99%, 또는 최소 99.5% 동일하다.

또한, 상기 rhGALC 또는 상기 기능적으로 동등한 부위 또는 이의 유사체는 구체적으로는 다음으로 구성된 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하는 핵산 서열을 사용하는 재조합 발현에 의해 얻어질 수 있다:

i) 서열목록 제1 서열에 기재된 핵산 서열;

ii) i)에서 정의된 핵산 서열에 최소 75% 동일한 핵산 서열.

ii)에 상기 핵산서열은 i)에 정의된 서열에 최소 80%, i)에 정의된 서열에 예를 들어 최소

85%, 최소 90%, 최소 95%, 최소 98%, 최소 99%, 또는 최소 99.5% 동일 할 수 있다.

상기 용어 "서열 동일성"은 두 아미노산 서열 간의 또는 동일한 또는 동일하지 않은 길이의 두 핵산 간의 상동성 정도의 정량적 측정값을 나타낸다. 비교하는 두 서열이 동일한 길이가 아니라면, 갭(gaps)의 삽입을 허용하거나 또는 대안으로, 폴리펩타이드 서열 또는 뉴클레오타이드 서열의 말단을 절단하여 최대한 비교가 가능하도록 정렬해야한다. 상기 서열 동일성은

으로 계산할 수 있으며, 상기 N_dif는 정렬 시 두 서열에 비-동일 잔기의 총 수이며, 상기 N_ref는 서열 하나의 잔기의 수이다. 따라서, DNA 서열 AGTCAGTC는 서열 AATCAATC과 75%의 서열 동일성을 갖는다(N_dif=2 및 N_ref=8). 갭(gap)은 특정 잔기의 비-동일성으로 계산되며, 즉, DNA 서열 AGTGTC은 DNA 서열 AGTCAGTC과 75%의 서열 동일성을 갖는다(N_dif=2 및 N_ref=8).

수지(resin) 단계-전

비정제된 rhGALC를 제공하는 세포 배양물은 여러 원천으로부터 올 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서 상기 세포 배양물은 rhGALC를 발현하는 세포 반응기로부터 제공된다. 이는 제1 크로마토그래피 수지에 실시하기 전 세포 배양물의 분획물을 조절하는데 유리할 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 구현예에서 분획물의 pH를 제1 크로마토그래피 수지에 로딩하기 전 7 이하인 예를 들어 3-7 범위로, 4-7 범위로, 5-7, 범위로, 6-7 범위로, 3-6 범위로, 3-5 범위로 또는 3-4 범위로 조절한다. 또한 로딩 전 세포를 제거하기 위해 세포 배양물을 원심분리하거나 또는 필터(예컨대, 적층형(depth), 데드 엔드(dead end) 또는 접선 유동(tangential flow) 필터)하는데 유리할 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 구현예에서 상기 세포 배양물의 분획물은 필터된 분획물이다. 본 발명의 또 다른 구현예에서 rhGALC를 포함하는 상기 세포 배양물의 분획물은 정화되어 희석되지 않은 수득물이다.

제1 수지 단계/캡처 단계

제1 수지는 효소를 안정화하고 칼라 매개체(medium)를 제거한다.

다중 모드들의 다른 형태는 제1다중 모드 크로마토그래피의 수지를 위해 적합할 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 구현예에서, 제1다중 모드 크로마토그래피의 수지는 적어도 소수성 및 정전기적 상호작용을 통해 결합한다. 본 발명의 다른 구현예에서, 제1다중 모드 크로마토그래피의 수지는 최소 방향족 및 정전기적 상호작용을 통해 결합한다.

상기 제1다중 모드 크로마토그래피의 수지는 하기 화학식 (I), (II), (III), (V), (VI) or (VII)의 화합물을 리간드로 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에서 제1다중 모드 크로마토그래피의 수지는 하기 화학식 (I), (II) or (III)의 화합물을 리간드로 포함할 수 있다.

구체적으로는, 상기 제1다중 모드 크로마토그래피의 수지는 화학식 (V), (VI) or (VII)의 화합물을 리간드로 포함할 수 있다.

(I)

(II)

(III)

화학식 (II) 및 (III)의 상기 R은 화학식 (IV)의 작용기이다:

(IV)

(V)

(VI)

(VII)

본 발명의 또 다른 구현예에서 제1 크로마토그래피의 수지는 화학식 IV, 화학식 V, 화학식 VI 또는 화학식 VII의 리간드를 포함한다. 또한 보다 특정한 수지를 제1 수지로서 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 구현예에서 제1 수지는 "Capto™ MMC", "Capto™ Blue"(Capto™ Blue(high sub) 및 Capto™ Blue (low)), Capto™ Adhere, 및 "Blue sepharoseTM fast flow"; GE Healthcare로부터 이용되는 모든 수지로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

Capto MMC는 다중 모드 양이온 교환체이다. 이는 카르복실 그룹을 포함하고 따라서 그것의 기능은 부분적으로 약한 양이온 교환체이다. 그러나, 이온성 상호작용 이외의 상호작용의 여러 다른 형태를 포함하고, 수소 결합 및 소수성 상호작용을 포함한다. Capto™ Blue는 방향족 및 정전기적 상호작용을 통해 결합하는 친화성 생물공정 매체이다. 상기 Capto 부착 리간드, N-Benzyl-N-methyl ethanolamine은 상호작용을 위한 많은 기능들을 나타낸다. 가장 두드러진 것은 이온 상호작용, 수소 결합 및 소수성 상호작용이다.

본 발명의 다른 구현예에서 제1 수지는 Pall Corporation으로부터 상업적으로 이용 가능한 MEP HyperCel™ Mixed-Mode Chromatography 흡수제으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 혼합-모드(mixed-mode) 또는 다중-모드(multi-mode) 메카니즘에 의한 MEP HyperCel 흡수제 또한 소수성 전하 유도 크로마토그래피(Hydrophobic Charge Induction Chromatography: HCIC)로 기재되어있다. HCIC는 이온화, 이중-모드 리간드의 pH-의존한 활동을 기반으로 한다.

본 발명의 특정 구현예에서 상기 제1 수지는 화학식(VI)의 리간드를 갖는다. "Capto™ Blue"(Capto™ Blue(high sub)는 상기 수지의 일 예이다.

또한 본 발명의 방법은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 몇 개의 표준 단계들이 포함될 수 있음을 이해하여야 한다. 따라서, 본 발명의 일 구현예에서, 상기 제1 크로마토그래피의 수지는 로딩하기 전 전제조건이 있다. 본 발명의 다른 구현예에서 단계 b) 후에 제1 크로마토그래피의 수지는 최대 20%(v/v)의 프로필렌 글리콜 및/또는 에틸렌 글리콜, 예컨대 최대 15%, 예컨대 최대 10%, 예컨대 최대 5%, 예컨대 최대 5-20%, 예컨대 최대 5-15% 또는 예컨대 약 10%의 프로필렌 글리콜 및/또는 에틸렌 글리콜을 포함하는 세척 완충액으로 세척한다. 본 발명의 일 구현예는 최대 20%의 프로필렌 글리콜 세척 완충액이다. 본 발명의 다른 구현예는 최대 20%의 에틸렌 글리콜 세척 완충액이다. rhGALC는 극심한 소수성 프로필렌 글리콜 및/또는 에틸렌 글리콜이므로 바람직한 용출물이다.

제1 용출 완충액은 다른 구성요소를 가질 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서 상기 제1 수지는 "Capto™ Blue"이며, 제1 용출 완충액은 40-60%, 예컨대 45-60%, 예컨대 50-60%, 예컨대 40-55%, 예컨대 40-50%, 또는 예컨대 약 50%의 프로필렌 글리콜 및/또는 에틸렌 글리콜의 총 농도를 포함한다. 프로필렌 글리콜 및/또는 에틸렌 글리콜(v/v)의 고농도는 효소의 적절한 용출에 중요하다.

다음으로 용출 완충액 조건은 변화될 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 구현예에서 단계 c) 이후에 제1 용출액의 프로필렌 글리콜 및/또는 에틸렌 글리콜의 총 농도는 단계 d) 이전에 30% 이하, 예컨대 20%, 예컨대 15%, 및 예컨대 10%로 낮추어 진다. 프로필렌 글리콜 및/또는 에틸렌 글리콜의 농도를 낮춤으로서 rhGALC의 효소적 안정성이 유지된다. 본 발명의 다른 구현예에서 단계 c) 이후에 제1 용출액의 pH는 5-6.5, 예컨대 5.5-6.5, 예컨대 5.7-6.3 또는 약 6.1의 범위에 pH로 조정된다. rhGALC의 pH 민감성 때문에 pH 6.0-6.5 범위가 바람직하다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 단계 c) 후 제1 용출액에 계면활성제의 레벨은 0.01-5%, 예컨대 0.5-5%, 예컨대 0.5-4%, 예컨대 0.5-3%, 예컨대 0.5-2%, 예컨대 0.5-1.5%로 조정된다. 본 발명의 또 다른 구현예에서 계면활성제는 트윈(tween) 계면활성제 예컨대 트윈 20, 예컨대 트윈 40, 예컨대 트윈 80이다. 트윈(tweens)은 또한 폴리소르베이트(polysorbates)로 알려져 있다. 상기 계면활성제는 사람 용도에 바람직하게 승인되어야 하므로, 상기 계면활성제는 예컨대 크레모포(Cremophor)(폴리옥실 35 피마자유) 및 플루로닉(Pluronic) F-127일 수 있다.

본 발명에 또 다른 구현예에서 제1 용출액은 실온에서 5-48 시간, 예를 들어 10-13 시간, 또는 예컨대 16-24 시간동안 계면활성제 내에 저장된다. 바이러스 불활성으로 기능하는 단계의 장시간 동안 제1 용출액 상에 저장되고 구체적으로 계면활성제의 농도는 예컨대 1%로 높다.

제2 크로마토그래피 수지에 로딩하기 전, 제1 용출액은 전처리될 수 있다. 따라서, 본 발명에 일 구현예에서, 단계 d) 전에 제1 용출액은 제2 크로마토그래피의 수지를 위한 전처리 완충액과 혼합된다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 혼합물은 제2 수지에 대한 전처리 완충액내에 직접적으로 제1 용출액을 놓아둠으로 인해 생성될 수 있도록 한다.

제2 수지 단계/ 중간 단계

다중 모드의 다른 형태는 제2다중 모드 크로마토그래피 수지에 대해 적합할 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 구현예에서 제2 크로마토그래피의 수지는 이온 상호작용, 수소 결합 및 소수성 상호작용을 통해 결합한다. 본 발명의 다른 구현예에서 제2 크로마토그래피의 수지는 리간드로서 N-벤질(Benzyl)-N-메틸(methyl) 에탄올을 포함한다. 본 발명의 또 다른 구현예에서 제2 크로마토그래피의 수지는 다음 화학식의 리간드를 포함한다:

(VIII);

또는 다음 화학식의 리간드;

(IX)

보다 구체적인 구현예에서 상기 제2 크로마토그래피의 수지는 Capto™ Adhere, Biorad로부터 시판 중인 CHT Ceramic Hydroxyapatite Type I (CHT I) 및Pall Corporation로부터 시판 중인 MEP HyperCel™ Mixed-Mode Chromatography 흡수제으로 구성된 그룹으로부터 선택된다. Capto™ Adhere는 멀티 모드 기능성을 갖는 강한 음이온 교환 생물 공정 매개체이다. 멀티 모드에 의한 생체분자와 상호작용하는 세라믹 하이드록시아파타이트(Hydroxyapatite): 양이온 교환은 음이온으로 하전된 인산 그룹이 단백질 아미노 그룹과 상호작용하는 경우 발생한다. 강한 배위(coordination) 복합체는 생체 분자 및 금속 친화성 메카니즘을 통한 CHT 세라믹 하이드로시아파타이트 칼슘 부위 상에 카르복실 클러스트(clustes), 포스포릴 모이어티 또는 둘 사이에서 형성될 수 있다. 혼합 모드 또는 다중-모드 메카니즘에 의한 MEP HyperCel 흡수제는 또한 소수성 전하 유도 크로마토그래피(HCIC)로 기재되어있다. HCIC는 이온성, 이중-모드 리간드의 pH-의존적 작용을 기반으로 한다.

본 발명의 구체적인 구현예에서 상기 제2 수지는 화학식(VIII)의 리간드를 포함한다. Capto™ Adhere는 수지의 한 예이다.

본 발명에 의한 방법은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 몇 개의 표준 단계를 포함할 수 있음을 이해해야 한다. 따라서, 본 발명의 일 구현예에서 제2 크로마토그래피의 수지는 로딩 전 전처리된다. 본 발명의 다른 구현예에서, 단계 d) 후, 상기 제2 크로마토그래피의 수지는 세척 완충액으로 세척한다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 단계 d) 후, 상기 제2 크로마토그래피의 수지는 pH 3-5, 예를 들어 4-5, 또는 예를 들어 4.5-5의 범위에 pH를 갖는 세척 완충액으로 세척한다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 세척 완충액은 아이소프로파놀과 같은 알코올을 추가적으로 포함한다.

상이한 용출 완충액이 제2 크로마토그래피의 수지에 사용될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서 상기 제2 크로마토그래피의 수지는 Capto™ Adhere이며 제2 용출 완충액은 30-50%, 예컨대 30-45%, 예컨대 30-40%, 예컨대 35-50%, 예컨대 40-50%, 또는 예컨대 약 40% 프로필렌 글리콜(v/v)을 포함한다. 앞서 언급한 바와 같이, rhGALC는 극심한 소수성 프로필렌 글로콜 및/또는 에틸렌 글리콜이므로 바람직한 용출액이다. 또한 rhGALC 는 pH에 민감하다. 따라서, 본 발명의 일 구현예에서 제2 용출 완충액은 pH 6 이하, 예컨대 pH 5 이하, 예컨대 3-6, 4-6 또는 4-5 범위를 갖는다. 본 발명의 다른 구현예에서, 단계 f) 전에, 상기 제2 용출액은 제3 크로마토그래피의 수지에 대한 전-처리 완충액과 혼합된다.

가능한 중간 2- 단계 방법

본 발명에 일부의 구현예에서, 중간 단계는 다음에 기재된 2-단계 방법으로 수행된다:

중간 단계 a)

2-단계 방법 상에 중간 단계 a)는 필수적으로 앞서 기재된 바와 같이 수행된다; 즉 제2 수지 단계/중간 단계와 관련하여 정의된 다중-모드 수지 및 완충액 사용.

중간 단계 b)

모달리티(modalities)의 다른 형태는 중간 단계 b)에 적합할 수 있으며, 다중 모드 수지, 소수성 수지 및 에테르 그룹과 리간드를 포함하는 크로마토그래피의 수지를 포함한다.

본 발명의 보다 구체적인 구현예에서 중간 단계 b)에서 사용되는 크로마토그래피 수지는 Tosoh Bioscience에서 시판중인"PPG-600M"및 "Toyopearl Phenyl-650M", "Capto™ Blue"(Capto™ Blue (high sub) and Capto™ Blue (low)), "Capto™ Butyl", Butyl-S Sepharose 6(결합-및-용출 모드 또는 flow-through 모드로 작동), 및 Biorad에서 시판중인 Macro-Prep Methyl HIC(결합-및-용출 모드 또는 flow-through 모드로 작동)으로 구성된 그룹으로부터 선택된다.

Toyopearl Phenyl-650M은 소수성 상호작용 크로마토그리피(HIC) 매개체이다. Capto™ Blue는 방향족 및 정전기적 상호 작용을 통해 결합하는 친화성 생체과정 매개체이다. Capto™ Butyl" 및 Butyl-S Sepharose 6는 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 매체이다. Macro-Prep 메틸 HIC 지지체는 소수성 및 전하를 기반으로 하는 상호작용 메카니즘상에서 작동한다. 메틸 그룹은 약한 소수성이다. 로딩 및 용출 완충액의 pH에 따라 소수성 그룹이 오염물질을 유지하는 동안 카르복실 그룹은 타겟 분자를 밀어내는 이온으로 이용될 수 있다.

당업계에서 통상의 지식을 가진 자들이 인식하는 바와 같이, 상이한 용출 완충액은 제2 크로마토그래피 수지에 사용될 수 있다.

제3 수지 단계/폴리싱(polishing) 단계

모달리티(modalities)의 다른 형태는 제3 크로마토그래피 수지에 대해 적합할 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 구현예에서 제3 크로마토그래피 수지는 에테르 그룹을 포함하는 리간드를 포함한다. 본 발명의 다른 구현예에서 제3 수지는 소수성이다. 본 발명의 또 다른 구현예에서 제3 크로마토그래피 수지는 리간드로서 [수지(resin)]-(OCH₂CH₂)_nOH을 포함하며, 여기서 n은 1-20, 예컨대 1-10, 예컨대 1-5, 예컨대 1-3, 또는 예컨대 1-2 범위 내에 정수이다.

본 발명의 보다 구체적인 구현예에서 제3 크로마토그래피의 수지는 650M, 650S 5PW와 같은 Toyopearl Ether 수지, "PPG-600M" 및 Tosoh Bioscience, Biorad에서 시판중인 CHT Ceramic Hydroxyapatite Type I(CHT I), GE Healthcare에서 시판중인 Q Sepharose Fast Flow(Q FF), Pall Corporation로부터 시판중인 MEP HyperCel™ Mixed-Mode Chromatography 흡수제, BioRad로부터 시판중인 Macro-Prep Methyl HIC (operated in bind-and-elute mode or in flow-through mode), 및 Butyl-S Sepharose 6(operated in bind-and-elute mode or in flow-through mode) 및 GE Healthcare로부터 시판중인 Capto DEAE을 포함하는 에테르 수지로 구성된 그룹으로부터 선택된다.

세라믹 하이드록시아파타이트는 다중 모드에 의한 생체분자와 상호작용한다: 양이온 교환은 음이온으로 전하된 포스페이트 그룹이 단백질 아미노 그룹과 상호작용할 경우 발생한다. 매우 강한 배위(coordination) 복합체는 생체 분자 및 금속 친화성 메카니즘을 통한 CHT 세라믹 하이드로시아파타이트 칼슘 부위 상에 카르복실 클러스트(clustes), 포스포릴 모이어티 또는 둘 사이에서 형성될 수 있다.

Q Sepharose Fast Flow는 이온 교환(IEX) 크로마토그래피 매개물(수지)이다. 혼합-모드(mixed-mode) 또는 다중-모드(multi-mode) 메카니즘에 의한 MEP HyperCel 흡수제 또한 소수성 전하 유도 크로마토그래피(Hydrophobic Charge Induction Chromatography: HCIC)로 기재되어있다. HCIC는 이온화, 이중-모드 리간드의 pH-의존한 활동을 기반으로 한다. 매개체(media)는 고용량, 고해상도 음이온 교환 수지이며, Macro-Prep 메틸 HIC 지지체는 소수성 및 전하를 기반으로하는 상호작용 메카니즘상에서 작동한다. 부틸-S Sepharose 6는 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 매개물(medium)이다.

본 발명의 구체적인 구현예에서 제3 크로마토그래피의 수지는 에테르 수지이며, 예컨대 에테르 수지는 650M, 650S 및 5PW을 포함하는, Toyopearl Ether 수지들로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 상기 수지 형태의 이점은 용출액에 프로필렌/에틸렌 글리콜이 필수적이지 않으며 수용성 용출액이 사용될 수 있다.

또한 본 발명의 방법은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 공지된 몇 개의 표준 단계들이 포함될 수 있음을 이해하여야 한다. 따라서, 본 발명의 일 구현예에서 제3 크로마토그래피의 수지는 로딩 전에 전처리된다. 따라서 본 발명의 일 구현예에서 완충액에 전처리된 결과물은 1-2 M NH₄Ac 및 1-2 M NH₄Cl을 포함한다. 본 발명의 다른 구현예에서 제3 크로마토그래피의 수지는 세척 완충액으로 세척한다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 단계 f) 후에, 제3 크로마토그래피의 수지는 pH 3-5, 예컨대 4-5, 예컨대 4.5-5, 예컨대 5.5-7, 예컨대 약 6.5 범위에 pH를 갖는 세척 완충액으로 세척한다. 이는 rhGALC가 pH에 민감한 것에 유리하다.

상이한 세척 완충액은 제3 수지에 이용될 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 단계 f) 후에, 제3 크로마토그래피의 수지는 최소 1 M, 예컨대 최소 2 M, 예컨대 최소 3 M, 예컨대 최소 1-4 M 범위 내에 NH₄Ac을 포함하는 제1 세척 완충액으로 세척한다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 제1 세척 완충액은 최소 1 M, 예컨대 최소 2 M, 예컨대 최소 3 M, 예컨대 최소 1-3 M NH₄Cl 및 0.1% 계면활성제 예컨대 0.1-2% 계면활성제를 포함한다.

본 발명의 일 구현예에서 제2 세척 완충액은 제1 세척 완충액보다 낮은 염 및 계면활성제 농도를 포함한다. 본 발명의 또 다른 구현예에서 제3 세척 완충액은 제2 세척 완충액보다 낮은 염 및 계면활성제 농도를 포함한다. 본 발명의 또 다른 구현예에서 용출 완충액은 소듐 포스페이트 완충액이다.

정제된 rhGALC에 예컨대 인간에 주입이 적합하도록 하기위해서는 계면활성제의 레벨이 낮아야만 한다. 따라서, 본 발명의 일 구현예에서 제3 용출 완충액은 1% 이하 예컨대 0.01% 이하, 예컨대 0.001% 이하, 예컨대 0.0001% 이하 계면활성제를 포함한다. 본 발명의 다른 구현예에서 제3 용출 완충액은 5-7, 예컨대 6-7 또는 예컨대 6.2-6.8 범위에 pH를 갖는다.

용출 단계를 개선하기 위해 용출 완충액에 염이 포함될 수 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 구현예에서 제3 용출 완충액은 최소 100 mM 염, 예컨대 NaCl 및/또는 KCl을 포함한다. NaCl 및 KCl를 제외할 수 있지만, 산물이 다소 덜 순수할 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에서 최종 산물의 함유량은 최소 150 mM 만니톨, 예컨대 최소 200 mM 만니톨, 예컨대 최소 250 mM 만니톨, 예컨대 최소 200-400 mM 범위내에 만니톨을 포함하여 조절된다. 만니톨의 존재는 산물의 동결 건조를 가능하게 한다.

수지 후 단계

예컨대 바이러스 및 다른 원하지 않는 세포 불순물의 레벨을 최소화하기 위해 추가적인 정제가 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 구현예에서, 단계 e) 후에, 제3 용출액을 0.1 ㎛ 사이즈 최대값 필터 장치에 필터하여 이동시켰다. 본 발명의 다른 구현예에서, 단계 g) 후에, 제3 용출액을 20 nm, 예컨대 최대 15nm, 예컨대 Planova 15N 필터기에 필터하여 이동시켰다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 제3 용출액을 50 kDa 이하, 예컨대 30 kDa 이하, 예컨대 15 kDa 이하 또는 예컨대 10 kDa 이하의 분자량 차단(MWCO)을 갖는 막을 사용하여 접선 유동 필터기(tangential flow filtration: TFF)로 울트라필터레이션/디아필터레이션을 통해 이동시켰다. 본 발명의 또 다른 구현예에서 막은 폴리에테르 설폰(polyether sulfone) 막, 예컨대 펠리콘(Pellicon) 폴리에테르 설폰 막이다. 본 발명의 또 다른 구현예에서 막은 재생 셀룰로오스(cellulose) 막이다.

추가 단계

본 발명에 있어서 산물의 추가적인 질적 개선을 위해 이온 분리를 실시할 수 있다. 추가적으로, 이온 분리는 캡처 단계와 중간 단계 사이, 중간 단계와 폴리싱 단계 사이 또는 폴리싱 단계의 용출 단계에서 실시될 수 있다.

캡처 단계와 중간 단계 사이 또는 폴리싱 단계 후에 이온 분리를 실시할 경우, 이온 필터 또는 수지는 Pall Corporation에서 시판 중인, 예컨대 Mustang^TMQ 막이 사용될 수 있다. Mustang^TMQ 막은 효과적으로 플라즈미드 DNA, 음전하 단백질 및 바이러스 입자와 결합하는, 강한 음이온 교환기이다.

중간 단계와 폴리싱 단계 사이 또는 폴리싱 단계 후에 이온 분리를 실시할 경우, 강한 음이온 교환(AIEX) 수지, 예컨대 Capto Q, Giga Cap Q, Q FF와 같은 것으로 실시될 수 있다. 상기 구현예에 따라서, 상기 수지는 결합 모드로 사용된다. 그것은 구체적으로는 폴리싱 단계에 소수성 상호작용(HIC) 크로마토그래피를 사용할 경우, 약한 음이온 교환 수지 예컨대 Capto DEAE 및 DEAE FF을 포함하는 것 또한 가능하다.

본 발명의 다른 구현예에서 이온 분리는 폴리싱 단계 후에 즉시, 예컨대 상기 에테르 수지로부터 용출 후에 즉시 실시될 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에서 상기 이온 분리는 울트라필터레이션/디아필터레이션(UFDF) 단계 후에 실시될 수 있다.

다양한 상이한 완충액들은 이온 분리 동안 사용될 수 있다. 본 발명의 구체적인 구현예에서, 예컨대 폴리싱 단계 후 즉시 막에 이온 분리를 실시할 경우, 에테르 수지, 음이온 필터 또는 수지는 3.7 mM 소듐 포스페이트, 5 mM 글라이신, 10 mM 만니톨, 0.075 M NaCl, 0.0005% tween 80, pH 6.2와 평형화될 수 있다. 상기 산물은 3.7 mM 소듐 포스페이트, 5 mM 글라이신, 10 mM 만니톨, 0.0005% 트윈(tween) 80, pH 6.2 선택적으로 음이온 필터 또는 수지를 통과시키기 전에 0.15 M NaCl를 추가하여 희석할 수 있다.

본 발명의 다른 구현예에서, 예를 들어 UFDF 단계 후 막에 이온 분리를 실시할 경우, 이온 필터 또는 수지는 3.7 mM 소듐 포스페이트, 0.2 M NaCl, 5 mM 글라이신, 10mM 만니톨, 0.0005% 트윈 80, pH 6.2와 평형화될 수 있다. 상기 산물은 음이온 필터 또는 수지를 통과시키기 전에 전도성이 20 mS/cm²(약 1 용량 산물 : 0.2 용량 1 M NaCl)이 될 때까지 1 M NaCl로 희석할 수 있다.

상기 구현예에 따라서 산물은 멸균 필터 전에 제형 완충액, 예컨대 NaCl을 포함하지 않고 15 mS/cm²(0.15 M NaCl)에 전도성을 가지는 제형 완충액으로 희석된다.

조성물

본 발명의 정제된 rhGALC는 다른 정제된 rhGALC의, 예를 들어 순도, 특정 효소 활성 및 프로세싱된 산물의 존재와 상이하다. 따라서, 본 발명의 일 양태는 rhGALC를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

구체적으로 상기 rhGALC는 본 발명의 정제 방법으로 수득될 수 있는 것의 하나이다.

다른 정제된 산물들은 rhGALC의 처리된 산물을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서 조성물에서 전체 길이 rhGALC(80 kDa) 및 주요 프로세싱된 산물(50+30 kDa) 사이에 몰랄 비율은 최소 50:2.5, 예컨대 최소 50:1, 예컨대 최소 100:1, 예컨대 최소 200:1, 또는 예컨대 500:1 이다. 본 발명의 다른 구현예에서 조성물에서 전체 길이 rhGALC(80 kDa) 및 2 가지의 주요 프로세싱된 산물(50+30 kDa) 사이에 비율은 최소 50:2.5, 예컨대 최소 100:1, 예컨대 최소 200:1, 예컨대 500:1 이다. 상기 rhGALC의 처리된 30 및 50 kDa 형태들은 작은 밴드로 나타날 수 있으며 <0.5%로 추정된다(실시예 부분 및 도 5 참조).

본 발명의 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 매우 적은 숙주 세포 단백질을 포함한다. 당업계 기술자들은 숙주 세포 단백질 및 다른 오염물질의 함유량을 결정하기 위한 적절한 방법을 알고 있을 것이다. 구체적으로는, 숙주 세포 단백질의 레벨은 ELISA에 의해 결정될 수 있다. 일반적으로, 숙주 세포 단백질의 함유량이 500 ng/mg 또는 이하일 경우 만족한다. 본 발명의 일부 구현예에서, 숙주 세포 단백질의 함유량은 450 ng/mg 또는 이하, 예컨대 300 ng/mg 또는 이하, 또는 예컨대 250ng/mg 또는 이하이다. 본 발명의 다른 구현예에서 숙주 세포 단백질의 양은 조성물에 200 ng/mg 이하 예컨대 rhGALC의 100 ng/mg 이하, 예컨대 rhGALC의 40 ng/mg 이하 또는 예컨대 rhGALC의 30 ng/mg 이하이다. 실시예 부분에 참조된 것과 같이 불순물은 ELISA에 의해 약 30 ng HCP/rhGALC mg으로 측정되었다.

본 발명의 일부 구현예에서, 숙주 세포 단백질의 함유량은 20 ng/mg 또는 이하 이다.

본 발명의 다른 구현예에서 조성물에 효소 활성은 최소 15 kU/㎖ 또는 예컨대 최소 30 kU/㎖이다. 실시예 부분에 참조된 것과 같이 최종 산물에 효소 활성은 42.5 kU/㎖으로 측정되었다.

본 발명의 조성물은 그것의 특성 중 하나로서, 단량체(80 kDa) rhGALC의 매우 높은 함유량 및 응집체(rhGALC의 다이머 및 멀티머)의 매우 낮은 함유량을 갖는다. 오히려, 응집체의 양은 검출, 예컨대 육안 검사에 의한 검출의 경우 최소 레벨 이하이다. 본 발명의 조성물은 선명하고 탁하지 않다.

택일적으로, 응집체의 형성 및 응집체의 레벨은 580 nm(T580) 투과율에 의해 측정될 수 있다. 이러한 방법을 사용하여 투과율 >95% 예컨대 >96%, >96.5%, >97%, >98% 또는 >99% 이상은 응집체의 만족스런 레벨을 나타낸다. 일반적으로 사용되는 다른 방법은 SEC(크기 배제 크로마토그래피)이다.

당업계의 기술자들은 동적 광산란 입자(dynamic light scattering)와 서브비주얼 입자(subvisual particles) 방법(서브비주얼 입자 수)를 포함하는 단백질 응집체의 레벨을 측정/분석하기 위한 적절한 방법을 알고 있을 것이다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 상기 조성물에 rhGALC의 1.5%(w/w) 이하 예컨대 1%(w/w) 이하, 예를 들어 0.5%(w/w) 이하, 0.25%(w/w) 이하, 0.2%(w/w) 이하, 0.1%(w/w) 이하, 0.05%(w/w) 이하 또는 0.01%(w/w) 이하 이다. 단량체(80 kDa) rhGALC의 함유량은 최소 95%(w/w), 예컨대 최소 96%(w/w), 또는 예컨대 최소 97%(w/w), 예를 들어 최소 98%(w/w), 바람직하게 최소 98.5%(w/w), 최소 99.5%((w/w), 또는 99%(w/w) 이다.

상기 본 발명의 조성물에 약제로서 용도를 찾을 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 양태는 약제로서의 용도를 위한 본 발명의 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 다른 양태는 글로보이드 세포 백질이영양증(Globoid Cell Leukodystrophy: 크라베 병)에 용도를 위한 본 발명의 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 양태는 글로보이드 세포 백질이영양증(크라베 병)의 치료 및/또는 글로보이드 세포 백질이영양증(크라베 병)에 나타나는 증후군을 감소 또는 완화시키는 방법에 관한 것이며, 이를 필요로 하는 대상에게 본 발명에 따라 정제된 rhGALC를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 상기 방법에 관한 것이다.

서열

서열목록 제1 서열

ggctactctc ggcttcctgg caacgccgag cgaaagctat gactgcggcc gcgggttcgg 60

cgggccgcgc cgcggtgccc ttgctgctgt gtgcgctgct ggcgcccggc ggcgcgtacg 120

tgctcgacga ctccgacggg ctgggccggg agttcgacgg catcggcgcg gtcagcggcg 180

gcggggcaac ctcccgactt ctagtaaatt acccagagcc ctatcgttct cagatattgg 240

attatctctt taagccgaat tttggtgcct ctttgcatat tttaaaagtg gaaataggtg 300

gtgatgggca gacaacagac ggcactgagc cctcccacat gcattatgca ctagatgaga 360

attatttccg aggatacgag tggtggttga tgaaagaagc taagaagagg aatcccaata 420

ttacactcat tgggttgcca tggtcattcc ctggatggct gggaaaaggt ttcgactggc 480

cttatgtcaa tcttcagctg actgcctatt atgtcgtgac ctggattgtg ggcgccaagc 540

gttaccatga tttggacatt gattatattg gaatttggaa tgagaggtca tataatgcca 600

attatattaa gatattaaga aaaatgctga attatcaagg tctccagcga gtgaaaatca 660

tagcaagtga taatctctgg gagtccatct ctgcatccat gctccttgat gccgaactct 720

tcaaggtggt tgatgttata ggggctcatt atcctggaac ccattcagca aaagatgcaa 780

agttgactgg gaagaagctt tggtcttctg aagactttag cactttaaat agtgacatgg 840

gtgcaggctg ctggggtcgc attttaaatc agaattatat caatggctat atgacttcca 900

caatcgcatg gaatttagtg gctagttact atgaacagtt gccttatggg agatgcgggt 960

tgatgacggc ccaagagcca tggagtgggc actacgtggt agaatctcct gtctgggtat 1020

cagctcatac cactcagttt actcaacctg gctggtatta cctgaagaca gttggccatt 1080

tagagaaagg aggaagctac gtagctctga ctgatggctt agggaacctc accatcatca 1140

ttgaaaccat gagtcataaa cattctaagt gcatacggcc atttcttcct tatttcaatg 1200

tgtcacaaca atttgccacc tttgttctta agggatcttt tagtgaaata ccagagctac 1260

aggtatggta taccaaactt ggaaaaacat ccgaaagatt tctttttaag cagctggatt 1320

ctctatggct ccttgacagc gatggcagtt tcacactgag cctgcatgaa gatgagctgt 1380

tcacactcac cactctcacc actggtcgca aaggcagcta cccgcttcct ccaaaatccc 1440

agcccttccc aagtacctat aaggatgatt tcaatgttga ttacccattt tttagtgaag 1500

ctccaaactt tgctgatcaa actggtgtat ttgaatattt tacaaatatt gaagaccctg 1560

gcgagcatca cttcacgcta cgccaagttc tcaaccagag acccattacg tgggctgccg 1620

atgcatccaa cacaatcagt attataggag actacaactg gaccaatctg actataaagt 1680

gtgatgttta catagagacc cctgacacag gaggtgtgtt cattgcagga agagtaaata 1740

aaggtggtat tttgattaga agtgccagag gaattttctt ctggattttt gcaaatggat 1800

cttacagggt tacaggtgat ttagctggat ggattatata tgctttagga cgtgttgaag 1860

ttacagcaaa aaaatggtat acactcacgt taactattaa gggtcatttc gcctctggca 1920

tgctgaatga caagtctctg tggacagaca tccctgtgaa ttttccaaag aatggctggg 1980

ctgcaattgg aactcactcc tttgaatttg cacagtttga caactttctt gtggaagcca 2040

cacgctaata cttaacaggg catcatagaa tactctggat tttcttccct tctttttggt 2100

tttggttcag agccaattct tgtttcattg gaacagtata tgaggctttt gagactaaaa 2160

ataatgaaga gtaaaagggg agagaaattt atttttaatt taccctgtgg aagattttat 2220

tagaattaat tccaagggga aaactggtga atctttaaca ttacctggtg tgttccctaa 2280

cattcaaact gtgcattggc cataccctta ggagtggttt gagtagtaca gacctcgaag 2340

ccttgctgct aacactgagg tagctctctt catcttattt gcaagcggtc ctgtagatgg 2400

cagtaacttg atcatcactg agatgtattt atgcatgctg accgtgtgtc caagtgagcc 2460

agtgtcttca tcacaagatg atgctgccat aatagaaagc tgaagaacac tagaagtagc 2520

tttttgaaaa ccacttcaac ctgttatgct ttatgctcta aaaagtattt ttttattttc 2580

ctttttaaga tgatactttt gaaatgcagg atatgatgag tgggatgatt ttaaaaacgc 2640

ctctttaata aactacctct aacactattt ctgcggtaat agatattagc agattaattg 2700

ggttatttgc attatttaat ttttttgatt ccaagttttg gtcttgtaac cactataact 2760

ctctgtgaac gtttttccag gtggctggaa gaaggaagaa aacctgatat agccaatgct 2820

gttgtagtcg tttcctcagc ctcatctcac tgtgctgtgg tctgtcctca catgtgcact 2880

ggtaacagac tcacacagct gatgaatgct tttctctcct tatgtgtgga aggaggggag 2940

cacttagaca tttgctaact cccagaattg gatcatctcc taagatgtac ttacttttta 3000

aagtccaaat atgtttatat ttaaatatac gtgagcatgt tcatcatgtt gtatgattta 3060

tactaagcat taatgtggct ctatgtagca aatcagttat tcatgtaggt aaagtaaatc 3120

tagaattatt tataagaatt actcattgaa ctaattctac tatttaggaa tttataagag 3180

tctaacatag gcttagctac agtgaagttt tgcattgctt ttgaagacaa gaaaagtgct 3240

agaataaata agattacaga gaaaattttt tgttaaaacc aagtgatttc cagctgatgt 3300

atctaatatt ttttaaaaca aacattatag aggtgtaatt tatttacaat aaaatgttcc 3360

tactttaaat atacaattca gtgagttttg ataaattgat atacccatgt aaccaacact 3420

ccagtcaagc ttcagaatat ttccatcacc ccagaaggtt ctcttgtata cctgctcagt 3480

cagttccttt cactcccaat tgttggcagc cattgatagg aattctatca ctataggtta 3540

gttttctttg ttccagaaca tcatgaaagc ggcgtcatgt actgtgtatt cttatgaatg 3600

gtttctttcc atcagcataa tgatttgaga ttggtccatg ttgtgtgatt cagtggtttg 3660

ttccttctta tttctgaaga gttttccatt gtatgaatat accacaattt gtttcctccc 3720

caccagtttc tgatactaca attaaaactg tctacattta c 3761

서열목록 제2 서열

Met Thr Ala Ala Ala Gly Ser Ala Gly Arg Ala Ala Val Pro Leu Leu

Leu Cys Ala Leu Leu Ala Pro Gly Gly Ala Tyr Val Leu Asp Asp Ser

Asp Gly Leu Gly Arg Glu Phe Asp Gly Ile Gly Ala Val Ser Gly Gly

Gly Ala Thr Ser Arg Leu Leu Val Asn Tyr Pro Glu Pro Tyr Arg Ser

Gln Ile Leu Asp Tyr Leu Phe Lys Pro Asn Phe Gly Ala Ser Leu His

Ile Leu Lys Val Glu Ile Gly Gly Asp Gly Gln Thr Thr Asp Gly Thr

Glu Pro Ser His Met His Tyr Ala Leu Asp Glu Asn Tyr Phe Arg Gly

Tyr Glu Trp Trp Leu Met Lys Glu Ala Lys Lys Arg Asn Pro Asn Ile

Thr Leu Ile Gly Leu Pro Trp Ser Phe Pro Gly Trp Leu Gly Lys Gly

Phe Asp Trp Pro Tyr Val Asn Leu Gln Leu Thr Ala Tyr Tyr Val Val

Thr Trp Ile Val Gly Ala Lys Arg Tyr His Asp Leu Asp Ile Asp Tyr

Ile Gly Ile Trp Asn Glu Arg Ser Tyr Asn Ala Asn Tyr Ile Lys Ile

Leu Arg Lys Met Leu Asn Tyr Gln Gly Leu Gln Arg Val Lys Ile Ile

Ala Ser Asp Asn Leu Trp Glu Ser Ile Ser Ala Ser Met Leu Leu Asp

Ala Glu Leu Phe Lys Val Val Asp Val Ile Gly Ala His Tyr Pro Gly

Thr His Ser Ala Lys Asp Ala Lys Leu Thr Gly Lys Lys Leu Trp Ser

Ser Glu Asp Phe Ser Thr Leu Asn Ser Asp Met Gly Ala Gly Cys Trp

Gly Arg Ile Leu Asn Gln Asn Tyr Ile Asn Gly Tyr Met Thr Ser Thr

Ile Ala Trp Asn Leu Val Ala Ser Tyr Tyr Glu Gln Leu Pro Tyr Gly

Arg Cys Gly Leu Met Thr Ala Gln Glu Pro Trp Ser Gly His Tyr Val

Val Glu Ser Pro Val Trp Val Ser Ala His Thr Thr Gln Phe Thr Gln

Pro Gly Trp Tyr Tyr Leu Lys Thr Val Gly His Leu Glu Lys Gly Gly

Ser Tyr Val Ala Leu Thr Asp Gly Leu Gly Asn Leu Thr Ile Ile Ile

Glu Thr Met Ser His Lys His Ser Lys Cys Ile Arg Pro Phe Leu Pro

Tyr Phe Asn Val Ser Gln Gln Phe Ala Thr Phe Val Leu Lys Gly Ser

Phe Ser Glu Ile Pro Glu Leu Gln Val Trp Tyr Thr Lys Leu Gly Lys

Thr Ser Glu Arg Phe Leu Phe Lys Gln Leu Asp Ser Leu Trp Leu Leu

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Thr Leu Ser Leu His Glu Asp Glu Leu Phe

Thr Leu Thr Thr Leu Thr Thr Gly Arg Lys Gly Ser Tyr Pro Leu Pro

Pro Lys Ser Gln Pro Phe Pro Ser Thr Tyr Lys Asp Asp Phe Asn Val

Asp Tyr Pro Phe Phe Ser Glu Ala Pro Asn Phe Ala Asp Gln Thr Gly

Val Phe Glu Tyr Phe Thr Asn Ile Glu Asp Pro Gly Glu His His Phe

Thr Leu Arg Gln Val Leu Asn Gln Arg Pro Ile Thr Trp Ala Ala Asp

Ala Ser Asn Thr Ile Ser Ile Ile Gly Asp Tyr Asn Trp Thr Asn Leu

Thr Ile Lys Cys Asp Val Tyr Ile Glu Thr Pro Asp Thr Gly Gly Val

Phe Ile Ala Gly Arg Val Asn Lys Gly Gly Ile Leu Ile Arg Ser Ala

Arg Gly Ile Phe Phe Trp Ile Phe Ala Asn Gly Ser Tyr Arg Val Thr

Gly Asp Leu Ala Gly Trp Ile Ile Tyr Ala Leu Gly Arg Val Glu Val

Thr Ala Lys Lys Trp Tyr Thr Leu Thr Leu Thr Ile Lys Gly His Phe

Ala Ser Gly Met Leu Asn Asp Lys Ser Leu Trp Thr Asp Ile Pro Val

Asn Phe Pro Lys Asn Gly Trp Ala Ala Ile Gly Thr His Ser Phe Glu

Phe Ala Gln Phe Asp Asn Phe Leu Val Glu Ala Thr Arg

실시예

동물 실험을 위해 요구되는 질(quality) 및 순도(purity)를 충족하는 최종 산물 재조합 인간 갈락토세레브로사이드 베타- 갈락토시다아제(rhGALC) 결과물의 정제를 위한 다운스트림 방법(DSP)을 발전시키고 필롯(pilot) 규모 상에서 시험하였다. 상기 방법은 세 개의 크로마토그래피의 단계 및 하나의 UFDF 배합 단계로 구성된다. 20 ℓ 공급 배치 생물반응기로부터 본 연구에 신선하고 명확한 수득물을 필롯 규모 상에 최적화된 방법으로 정제하여 동물 실험 및 예컨대 인간 투여 프로토콜을 위한 rhGALC 생산하였다. 상기 프로토콜을 도 1에 요약하였다.

실시예 1

장비, 재료, 완충액 및 방법

장비

크로마토그래피 시스템:

ㅇ Biological Duo-Flow upgraded with a Maximizer 80(BioRad).

연동(peristaltic) 펌프:

ㅇ MasterFlex L/S model 77200-60(Cole-Parker Instrument Company)

접선 유동(tangential flow) 필터 시스템:

ㅇ Pellicon 2 Mini filter holder with manometers(Millipore) 및 연동펌프 Watson Marlow SciQ 323, tubing with 6 mm Iφ.

마그네틱 교반기:

ㅇ MR 3001 k(Heidolph)

저울(Scales):

ㅇ EA35EDE-Imaximum 35 kg(Sartorius)

ㅇ BP1200 maximum 1200 g(Sartorius)

컬럼:

ㅇ Index 70/500(GE Healthcare)

LAF 벤치(bench):

ㅇ LaminarAir(Holten)

수지(resins), 필터 및 용기

수득(harvest) 필터:

ㅇ Millistak+^TM Pod C0HC 0.054 m²(Millipore)

크로마토그래피 수지:

캡처 단계:

ㅇ Capto™ Blue (high sub)(GE Healthcare)

중간 단계:

ㅇ Capto™ Adhere(GE Healthcare)

폴리싱 단계:

ㅇ Toyopearl Ether-650M (Tosoh)

UFDF 카세트(cassette):

ㅇ Pellicon 2 MINI30K(30kDa MWCO, V-screen, 0.1 m 2, cat.no P2B030V01, Millipore)

무균 필터:

ㅇ 0.22 ㎛ PES, 75 mm 직경, (NALGENE cat. no 595-4520)

최종 산물을 위한 용기:

ㅇ 무균 30 ㎖ 바틀(Nalgene)

ㅇ 무균 1.8 ㎖ cryogenic 바이알(Nalgene)

완충액

완충액을 p.a. 질(quality)의 화합물 및 Milli-Q 질의 물로 제조하였다. 완충액을 0.22 ㎛로 필터링하고 최대 5일 동안 실온에서 보관하였다. 제조 방법은 각 단계 별로 표 1-4에 나타나 있다.

Capto™ Blue 완충액:

a) 조건(Conditioning): 40 mM 소듐 포스페이트, pH 6.1ㅁ0.1

b) 평형(Equilibration): 20 mM 소듐 포스페이트, 0.1% 트윈 80(t-80)(w:w), 5% 글리세롤(v:v), pH 6.1±0.1

c) 세척: 100 mM 소듐 포스페이트, 1.5 M NaCl, 10% 프로필렌 글리콜(1,2-propaneidole)(v:v), 5% 아이소프로파놀(IPA)(v:v), 0.2% t-80(w:w), pH7.0±0.1

d) 세척 2: 평형 완충액

e) 용출(elution) 완충액: 20 mM 소듐 포스페이트, 50% 프로필렌 글리콜 (v:v), 0.5% t-80, 1 M NaCl, pH 6.5±0.1

f) 용출 혼합: 20 mM 소듐 포스페이트, 0.15 M NaCl, 1.3% t-80, pH 6.1±0.1.

캡처 단계를 위한 ℓ당 완충액 제조: Capto Blue(high sub)

완충액	조건	평형	세척	용출	용출 혼합
부피	1 ℓ	1 ℓ	1 ℓ	1 ℓ	1 ℓ
Na₂HPO_{4 ×} 2H₂O 178 g/mol (g)	0.93	0.42	15.1	1.6	0.71
NaH₂PO_{4 ×}ㅧ 2H₂O 156 g/mol (g)	5.43	2.75	2.3	1.72	2.5
NaCl (g)			87.6	58.4	8.8
트윈 80 (g)		1	2	5	13
글리세롤 (g)		62.5
아이소프로파놀 (g)			39.3
H₂O (g)	996	941	818	481	984
프로필렌 글리콜 (g)			104	521
pH	6.1±0.1	6.1±0.1	7.0±0.1	6.5±0.1	6.1±0.1
전도성 (mS/cm)		160±15	75±10	17±3

Capto™ Adhere 완충액:

a) 평형 완충액: 20 mM 소듐 포스페이트, 0.15 M NaCl, 0.05% t-80 (w.w), pH 6.1ㅁ0.1

b) 세척 1 완충액: 200 mM 소듐 아세테이트, 1 M NaCl, 5% IPA(v:v), 0.5% t-80(w:w), pH 4.7±0.1

c) 세척 2 완충액: 10 mM 소듐 아세테이트, 0.1% t-80 (w:w), pH 4.7±0.1

d) 세척 3 완충액: 50% 세척 2 및 50% 용출 완충액

e) 용출 완충액: 10 mM 소듐 아세테이트, 300 mM NaCl, 0.1% t-80 (w:w), 5% IPA(v:v), 40% 프로필렌 글리콜(v:v), pH 4.55±0.1

f) 용출 혼합 완충액: 140 mM 소듐 포스페이트, 0.0005% t-80 (w:w), pH 6.5±0.2

중간 단계를 위한 ℓ당 완충액 제조: Capto Blue Adhere

완충액	평형	세척 1	세척 2	용출	용출 혼합
부피	1 ℓ	1 ℓ	1 ℓ	1 ℓ	1 ℓ
Na₂HPO₄ × 2 H₂O 178 g/mol (g)	0.71				8.7
NaH₂PO₄ × 2 H₂O 156 g/mol (g)	2.5				14.2
NaCl (g)	8.8	58.4		17.53
C₂H₃NaO₂(82 g/mol) (g)		16.4	0.82	0.82
트윈 80 (g)	0.5	5	1	1	0.5% 저장물 1 g
아이소프로파놀 (g)		39		39
H₂O (g)	984	921	996	607	989
빙초산 (g)		6.4	0.4	1.9
프로필렌 글리콜 (g)				415
pH	6.1±0.1	4.7±0.1	4.7±0.1	4.55±0.1	6.5±0.2
전도성 (mS/cm)		75±10	1.5±0.5	8±2	12±2

Toyopearl Ether-650M 완충액:

a) 조건 완충액: 3.3 M NH₄Ac, 2.6 M NH₄Cl, 0.1% t-80(w:w), pH 6.1±0.1

b) 평형 완충액: 1.6 M NH₄Ac, 1.2 M NH₄Cl, 50 mM 소듐 포스페이트, 0.0005% t-80(w:w), pH 6.4±0.1

c) 세척 1: 3.3 M NH₄Ac, 2.3 M NH₄Cl, 0.5% t-80(w:w), pH 6.5

d) 세척 2: 평형 완충액

e) 세척 3: 70% 평형 완충액 30% 용출 완충액

f) 용출: 50 mM 소듐 포스페이트, 140 mM NaCl, 0.0005% t-80(w:w), pH 6.4±0.1

폴리싱 단계를 위한 ℓ당 완충액 제조: Toyopearl Ether-650M

완충액	조건	평형	세척 1	용출
부피	1 ℓ	1 ℓ	1 ℓ	1 ℓ
Na₂HPO₄ × 2 H₂O 178 g/mol (g)				3.5
NaH₂PO₄ × 2 H₂O 156 g/mol (g)		7.8		4.7
NaCl (g)				8.2
NH₄Ac(77 g/mol) (g)	254	123	254
NH₄Cl(53.5 g/mol)	139	64	123
트윈 80 (g)	1	0.5% 저장물 1 g	5	0.5% 저장물 1 g
H₂O (g)	671	849	683	988
빙초산 (g)	14.5		5.3
pH	6.1±0.1	6.4±0.1	6.5±0.1	6.4±0.1
전도성 (mS/cm)	210±20	180±10	210±20	18±2

UFDF 완충액:

평형 및 디아필터레이션 완충액: 3.7 mM 소듐 포스페이트, 150 mM NaCl, 5 mM 글라이신, 10 mM 만니톨, 0.0005%(w:w) 트윈 80, pH 6.2±0.15.

UFDF 단계를 위한 ℓ당 완충액 제조 및 농도

완충액	평형 및 디아필터레이션	농도
부피	1 ℓ
Na₂HPO₄ × 2H₂O 178 g/mol (g)	0.161	0.9 mM
NaH₂PO₄ × 2H₂O 156 g/mol (g)	0.437	2.8 mM
NaCl (g)	8.762	150 mM
트윈 80 (g)	0.5% 저장물 1 g	0.0005 %
H₂O (g)	990
글라이신 (g)	0.375	5
만니톨 (g)	1.822	10
pH	6.2±0.1	6.2±0.1
삼투압(mOsm/kg)	300	300

- 플레이스(place) 완충액 내에서 클리닝(cleaning):

- 클리닝 완충액 Capto Blue, Capto Adhere 및 UFDF: 1 M NaOH

- 클리닝 완충액 Toyopearl Ether: 0.5 M NaOH

- 중화 완충액 모든 단계: 140 mM 소듐 포스페이트, pH 6.6±0.2

- 저장용 완충액 Blue, Adhere, Ether: 20% 에탄올

- 저장용 완충액 UFDF 카세트: 0.1 M NaOH

플레이스에 클리닝 ℓ당 완충액 제조 및 저장용 완충액

완충액	1 M NaOH	0.5 M NaOH	20% EtOH	140 mM 소듐 포스페이트
부피	1 ℓ	1 ℓ	1 ℓ	1 ℓ
소듐 히드록사이드 (g)	40	20
99% 에탄올 (g)			~200
Na₂HPO₄ × 2H₂O 178 g/mol (g)				8.7
NaH₂PO₄ × 2H₂O 156 g/mol (g)				14.2
H₂O (g)	~1000	~1000	~800	1000
pH				6.6±0.2

방법 분석

효소 활성은 방법(procedure) 65; 갈락토세레브로시다아제(galactocerebrosidase: GALC) 분석을 위한 HNG 어세이로 측정하였다. 인-하우스 rhGALC 표준 StG01를 표준 곡선의 준비를 위해 사용하였다.

단백질 농도: 단백질 농도는 방법 75; Pierce 660 nm 단백질 어세이를 사용한 rhGALC의 단백질 검출로 측정하였다. 표준 곡선으로서 내부 표준 StG02의 단백질 농도는 외부적인 아미노산 분석에 의하여 결정되었다(AAA)(아미노산 분석 센터, 웁살라(Uppsala) 대학, 스웨덴).

정보(information) A280을 위하여, 측정하고 인간 GALC의 이론적 흡광 계수 2.5로 관찰된 흡광도를 나누어 계산하였다.

비활성(specific activity)은 rhGALC 단백질 농도로 효소 활성을 나누어 계산하였다.

동정(identity)은 방법 70, 재조합 인간 갈락토세레브로시다아제(rhGALC)의 웨스턴 블롯(Western Blot) 분석으로 분석하였다. 내부 표준 StG02에 대해 생성되어 단백질 A 세파로즈로 정제된 폴리클로날 항체를 검출을 위해 사용하였다.

등전위점(isoelectric focusing: IEF)은 Novex IEF gel pH 3-10을 이용하여 방법(procedure) 75로 분석하여 rhGALC의 등전위점을 분석하였다. 동정의 추가적조치로서 최종 산물을 인-하우스 rhGALC 표준 StG03과 비교하였다.

순도는 콜로이드 블루(Colloidal Blue)로 염색된 SDS-PAGE(4-12% Bis-Tris NuPAGE, MOPS 완충액)를 가지고 방법(procedure) 69로 분석하였다.

불순물은 방법 43; CHO 숙주 세포 단백질의 확인을 위한 ELISA 방법으로 분석하였다.

트윈 농도는 RP-HPLC 방법인 방법 73으로 정량하였다.

네이티브(native) PAGE는 정보를 위한 rhGALC 형성을 측정하여 실시하였다. 분석은 제조사(Invitrogen)로부터 제공된 설명서에 따라 실시하였다.

삼투압(Vapro osmometer) 및 pH(Metrohm)를 최종 산물 TG1106에서 측정하였다.

탄수화물 조성은 HPLC를 이용하여 2-AA 표지된 방출 모노사카라이드의 형광 검출에 의해 instruction 25(표준물질의 다른 희석물들)로 주로 측정되었다.

수득물:

생물반응기를 닫은 후, 효소에 최적화된 pH <7이 유지되는 생물 반응기내 수득물에 pH 5에 소듐 아세테이트를 추가하였다. pH 안정화된 수득물에 세포를 제거하기 위해, 적층형 필터 완충액을 통해 생물반응기로부터 펌핑하였다. 필터는 필터 후 조건 완충액으로 세정하였다. 조건 완충액에 수득물의 최종 혼합은 ~2:1(w:w)로 하여야한다.

방법 조건에 대한 일반적인 정보:

평형, 크로마토그래피 단계의 로딩 및 평형 세척은 150 cm/시간에 해당하는, 최대 유속 100 ㎖/분의 연동 펌프로 실시하였다. 실행의 나머지 부분은 125 cm/시간에 해당하는, 최대 유속 80 ㎖/분의 Maximizer 80이 업그레이드된 Biological Duo-Flow 시스템으로 실시하였다. 유속은 더 적합한 크로마토그래피 시스템이 사용되는 경우에 따라 조정될 수 있다. 그러나, 프로필렌 글리콜을 포함한 완충액은 지정된 유속으로 실시되어야만 한다.

모든 크로마토그래피의 단계는 결합 모드로 실행되며 몇 개의 세척 단계를 포함한다. PG의 고농도는 방법에 제 1 두 단계에 소수성 rhGALC의 용출에 필요하다. 산물에 효소 활성을 유지하기 위해 상기 단계로부터 미리 채워진(prefilled) 용기에 수집이 필요하다. 유기 용매는 폴리싱 단계에 용출에 필요하지 않다.

Capto Blue 조건 완충액을 제외한, 모든 완충액은 rhGALC의 효소 활성 유지를 위해 필수적인, 계면활성제(트윈 80)를 포함한다. 수득물의 매개체(media)는 Capto Blue 조건 완충액에 트윈 대신, 플루론을 포함한다. 조건 완충액에서 트윈을 제거하는 또 다른 이유는 실온에서 저장 ~>6 시간 후 수득물의 유백광(opalescence)을 발생시킬 수 있기 때문이다.

Capto Blue

Capto™ Blue는 방향족 및 정전기적 상호작용을 통해 결합하는 친화성 생물학적 방법 매개체이다.

조건화된 수득물을 정화 24시간 내에 Capto Blue 컬럼상에 로딩하였다. 필롯 규모(pilot scale)(740 mL)에 Capto Blue의 20 ℓ 생물반응기 세 사이클을 필요하다. 컬럼을 평형 완충액 및 10% 프로필렌 글리콜(PG) 및 5% 아이소프로파놀(IPA)를 포함하는 세척 완충액으로 세척하였다. 용출은 미리 채워진(prefilled) 용기에 50% PG를 포함하는 완충액으로 실시하였다. 용출 혼합 완충액으로 채워진 용기 내 수집(collection)은 세 가지 목적을 갖는다:

1) PG 감소에 의한 rhGALC의 효소 안정화 유지.

2) 전용 바이러스 불활성 단계 역할. 계면활성제의 최종 농도는 1%이며 산물 풀(pool)은 실온에서 >16 시간 저장된다.

3) DSP, Capto Adhere상에 다음 단계를 위한 산물 풀(pool) 조절.

상기 기재된 Blue 산물은 용출 혼합 완충액으로 수득될 수 있다. 최종 트윈 농도는 1%이며 풀(pool)은 전용 바이러스 불활성 단계에 따라 실온에서 16-24 시간동안 저장된다.

Capto Adhere

Capto™ Adhere는 다중 모드 기능성을 갖는 강한 음이온 교환 생물학적제법 매개체이다. 이것은 이온 상호작용, 수소 결합 및 소수성 상호작용을 통해 결합한다.

Capto Blue 산물을 Capto Adhere 컬럼에서 최대 4 일 유지시킨 후 세 번의 연속적인 사이클로 로딩하였다. 유지 시간은 바이러스 불활성 단계인 실온에서 18-20 시간으로 시작하였다. 유지 시간이 길어 산물 풀(product pool)을 잔여 시간동안 5ㅁ3℃에서 이동시켰다. 실온에서 축적을 실시하기 전 실온에서 8-15 시간을 다시 이동시켰다.

산물 풀을 pH 6.1에서 로딩하였다. 높은 이온 강도에서 세척하고 이어서 낮은 이온 강도에서 세척하여 pH가 4.7로 빠르게 떨어졌다. rhGALC의 효소 활성을 유지하기 위해 pH를 높이고 PG 농도를 낮춘 미리 채워진(prefilled) 용기 내에 40% PG를 포함하는 pH 4.55에 완충액으로 용출을 실시하였다.

Toyopearl Ether

Toyopearl Ether-650M은 높은 기계적 및 화학적 안정성을 갖는 메타크릴(metacrlic) 폴리머(65 ㎛ 입자 크기)이다. 에테르는 소수성 상호작용 리간드의 Tosoh serie에 초고 소수성을 갖으며 정확히 똑같은 소수성 단백질의 정제를 위하여 디자인되었다. Capto Adhere 산물을 실온에서 최대 24 시간동안 또는 5ㅁ3℃에서 4일 동안 저장하였다. 저온 저장하는 경우 실온에서 축적을 실시하기 전 실온에서 8-15 시간동안 다시 이동시켰다. 산물을 암모늄 아세테이트, 암모늄 클로라이드 및 트윈을 고농도로 포함하는 에테르 조건 완충액(3 사이클)과 1:2.5(w:w)로 혼합하였다. 에테르 컬럼을 시작 조건에 비해 200x 낮은 트윈 농도를 갖는 완충액으로 평형화하였다. 컬럼에 로딩 후 평형 완충액으로 세척하였다. 다음 세척 단계에 트윈 및 염을 증가시켰다. 다시 트윈 농도를 낮춘 평형 완충액으로 오랫동안 세척하였고 평형 완충액 및 용출 완충액을 혼합한 세척 완충액은 암모늄 염을 감소시켰다. 용출은 pH 6.4에 낮은 트윈(0.0005%) 및 소듐 클로라이드를 포함하는 소듐 포스페이트 완충액으로 실시하였다.

플라노바(Planova) 15N 바이러스 필터레이션

생산 규모상의 폴리싱 단계는 전용 바이러스 제거 단계인 플라노바(Planova) 15N을 통한 나노필터레이션을 따라야 한다.

UFDF

세 번째 폴리싱 산물 풀을 모으고 컷오프 분자량 30kDa에 펠리콘 폴리에스테르 설폰(Pellicon polyether sulfone) 막을 사용하는 접선 유동(tangential flow) 필터레이션과 울트라필터레이션/디아필터레이션(UFDF)을 한 사이클로 공식화하였다. 공급 채널(channel)은 열린 채널인 타입 V이고 카세트(cassette)는 0.1 m²이다.

펌프는 230 rpm으로 놓고 이동막 압력(transmembrane pressure: TMP)은 0.5 bar(0.6_in/0.4_out)이다. 상기 막은 제형 완충액과 평형화하고 완충액의 제1 용량은 농도(UF) 및 7회 디아필터레이션(DF) 다음에 희석에 의해 교환되었다. 완충액의 전체 8 용량을 교환하였다.

필터레이션(fitration) 및 필링(filling)

UFDF 산물(잔류물)을 LAF 벤치(bench)내에 무균 조건하에 0.22 ㎛ PES 필터를 통해 필터하였다. 최종 산물을 다양한 용량(0.25-20 ㎖ vial/bottle)의 멸균 용기에 채웠다. 최종 산물을 TG1106이라 명명하고 -80ㅁ10℃에 냉동 저장하였다.

실시예 2

결과의 요약

최종 산물에 20 ℓ 생물반응기로부터 정화된 수득물에 다운스트림 방법의 총 수율은 활성에 74%를 기반으로 하였다.

~19.5 ℓ 정화된 수득물에 총 활성은 23 밀리온 유닛(million Units)이다. 최종 산물, TG1106의 총 수율은 17 밀리온 유닛 또는 1.0 g 정제 rhGALC이다.

활성 수율 및 조건

최종 산물(74%)는 최종 산물에서 정화된 수득물로부터 계산하였다. 그 이유는 정화 방법이 아직 결정되지 않았고 본 발명의 연구의 일부가 아니기 때문이다.

크로마토그래피 단계는 3 사이클로 진행하였다. 세 번째 폴리싱 단계 산물을 모으고 하나의 UFDF에서 공식화하였다. 상기 UFDF 산물은 멸균 필터되고 용기로 나누어졌다. 각 단계 및 사이클에 대한 활성 %를 기반으로 하는, 수율은 도 2에 나타내었다. 최종 산물에서 정화된 수득물에 총 활성은 도 3에 나타내었다.

캡처(capture) 단계, Capto Blue의 평균 수율은 84ㅁ8.1% 이다.

중간 단계, Capto Adhere의 평균 수율은 87ㅁ3.5% 이다.

폴리싱(polishing) 단계, Toyopearl Ether의 평균 수율은 76ㅁ0.6%^* 이다.

UFDF 단계에 수율은 117% 이다.

최종 멸균 필터레이션 수율은 102% 이다.

분석 결과

방법상에 시료 및 최종 산물을 상기 기재된 분석 방법으로 분석하였다. 하기 표에 최종 산물 TG1106에 대한 분석 결과를 요약하였다.

특성	분석	방법	결과
함유량	단백질 농도	660 nm	2.5±0.3 ㎎/㎖
		(A280에 대한 정보/2.5)	(2.7 ㎎/㎖)
		효소 활성	HNG 어세이	42.5±0.8 kU/㎖
	비활성	HNG/660 nm	16.9 kU/㎎
	동정	웨스턴 블롯	rhGALC의 폴리클로날 항체로 검출	80 kDa 밴드 증명
		IEF	pH 3-10	pI= ~6.35 증명
		순도	SDS-PAGE	콜로이드 블루 염색	>99%
	불순물	숙주세포 단백질	HCP ELISA	30 ng/mg rhGALC
기타	트윈 80	RP HPLC	0.025%
	rhGALC 형성물	네이티브 PAGE에 대한 정보	주요 형성물: 다이머 ~ 모노머에서 멀티머까지 다양한 7 가지 형태
	pH	pH meter	6.02
	삼투압	Vapro osmometer	297 mOsm/kg
	투과율	T580	98.5%
	탄수화물	모노사카라이드 조성에 대한 정보	~7% (w:w) 2-3 mol M6P/mol rhGALC ~12 mol MAN/molrhGALC

실시예

확인- 웨스턴 블롯

정제된 산물은 웨스턴 블롯 분석으로 인간 GALC를 확인하였다.

폴리싱 산물에 단백질, UFDF 산물 및 최종 산물을 SDS-PAGE상에서 분리하고 전기영동에 의해 폴리비닐리덴 디플루오라이드(polyvinylidene difluoride: PVDF) 막으로 이동시켰다. rhGALC을 내부 rhGALC 표준 StG02에 대응하여 생성된 폴리클로날 토끼 항 GALC 항체로 검출하였다. 상기 항체는 단백질 A 세파로오스 컬럼(GE Healthcare)상에서 정제하였다. 그것들은 GALC의 프로세싱된 형태 50 kDa 및 30 kDa 뿐만 아니라 80 kDa GALC를 검출한다. 미리 염색된 단백질 래더(ladder)는 이동 상태를 확인하고 가장 눈에 띄는 분자량(MW)을 추산하기 위해 사용하였다.

도 4는 최종 산물로 검출된 80 kDa rhGALC의 블롯을 보여준다. 프로세스(processed) 형태는 상기 단백질 로딩에서 검출되지 않았다. 내부 표준, StG02 및 StG03은 참조로 분석하였다. 상기 표준들을 아미노산 분석에 의해 분석하였고 이들의 아미노산 조성물이 인간 GALC의 조성물과 이론적 상관관계가 있음을 발견하였다. 도 5는 과량의 단백질을 로딩 하였을 때 80 kDa rhGALC 이외에 50 및 30 kDa 프로세스(processed) 형태의 밴드가 약하게 확인되었다. MW 160 kDa에서 나타나는, 추가 밴드는 아마도 환원 조건 하에 SDS에 의해 용해되지 않은 rhGALC의 다이머로 확인된다.

실시예 4

등전점전기영동(Isoelectric focusing)

최종 산물 TG1106의 등전점은 6.35로 계산되었다.

TG1106 및 표준 StG03를 pH 3-10 등전점전기영동(isoelectric(IEF) focusing) 겔 상에서 전하에 따라 분리하였다. 전기영동은 차가운(아이스) 상태에서 1 시간동안 100V, 이어서 1 시간동안 200V 그리고 마지막으로 2 시간동안 500V로 실시하였다. 도 6에 나타낸, 상기 겔을 콜로이드 블루(Colloidal Blue)로 염색하였다. 계산된 등전점(PI)는 GALC의 이론상 PI 5.9 보다 높은 6.35로 추산되었다. TG1106과 StG03 간의 차이는 없었다.

실시예 5

순도-SDS-PAGE

최종 산물 TG1106의 순도는 >99%으로 추산되었다. 프로세싱된 rhGALC는 <0.5%로 추산되었다.

프로세스 시료는 MOPS 완충액내에 NuPAGE 4-12% Bis-Tris 겔 상에서 전기영동(SDS-PAGE)에 의해 주요 크기에 따라 분리하였다. rhGALC 및 잠재적인 불순물은 콜로이드 블루로 가시화하였다. 콜로이드 블루는 단백질 형태에 독립적인 동적 선형 반응을 갖으며, 이는 단백질 농도가 충분할 경우에 실버 염색(silver staining)에 비해 콜로이드 블루 염색이 순도 추산에 바람직하다는 것을 의미한다.

rhGALC의 가장 뚜렷한 분자량(MW)은 80 kDa이며, 프로세싱된 형태는 50 및 30 kDa의 분자량을 갖는다.

도 7은 제조 과정 시료의 스캔 결과를 보여준다. 보여지는 불순물들을 Capto 블루 및 Capto Adhere 단계 후에 가시화하였고, rhGALC는 에테르 단계 후에 가시화하였다. rhGALC의 다이머 일 가능성이 있는, ~160 kDa에 밴드 또한 웨스턴 블롯으로 확인하였다(도 6 참조).

도 8 및 도 9는 순도를 추산하기 위하여 최종 산물 TG1106과 내부 표준 StG03을 비교한 결과이다. rhGALC를 제외하고, TG1106에 고 로딩 밴드(high load band)가 없는 것은 그것이 가장 낮은 StG03보다 더 강도가 높기 때문이다. TG1106의 최대 농도에서의 낯선 이중 밴드는 모두 두 겔 상에서 rhGALC 다이머 바로 아래에 나타났다. 그것은 초고 로딩(highest load)에서 모두 나타나지 않는 것으로 보아 인공물일 가능성이 크다. 초고 로딩(highest load)에 낯선 이중 밴드 때문에 순도를 도 10의 초고 로딩 다음부터 계산하였다; 100%-0.8%(0.14 ㎍/16 ㎍)=99.2% 순도. 초고 로딩(excessive load) rhGALC 프로세싱된 형태에 30 및 50 kDa은 저 강도 밴드로 가시화할 수 있다. <0.5% 인 프로세싱을 의미하는 가장 낮은 표준에 대한 80 kDa 밴드보다 더 높은 강도를 갖는 밴드는 없다.

160 kDa 밴드는 인공물일 수 있다. rhGALC 고농도에 해당하는 시료 완충액에 SDS는 rhGALC 멀티머의 모노머를 형성하기에 충분하지 않다(네이티브 PAGE, 7.2.5 참조). 그러나 충분하다면, 추산은 최종 산물에서 형성의 ~2%을 의미하는, StG03 0.36 ㎍ 로딩에 대한 80 kDa 밴드와 유사한 TG1106 16 ㎍ 로eld에 대한 "다이머"의 강도라 할 수 있다.

실시예 6

네이티브 PAGE

네이티브 PAGE는 rhGALC의 주요 형태가 다이머이며, 그러나 최대 10 가지의 rhGALC 분자의 멀티머가 존재한다는 것을 보여준다.

네이티브 PAGE는 중성 pH에서 rhGALC 형성 과정의 정보를 실행한다. 도 10에서 보는 바와 같이 rhGALC는 형성 과정의 래더(ladder)를 갖는다. 최종 산물 TG1106을 rhGALC 내부 표준 StGC3과 비교하면 그 패턴이 유사하다. 가장 낮은 밴드(분명한 MW 80-100 kDa)는 rhGALC 모노머이며 두 번째 밴드는 rhGALC 다이머라 할 수 있으며, 이어서 형성 과정에 rhGALC 모노머 및/또는 다이머가 추가된다. rhGALC의 최대 7 가지 형태를 겔상에 가시화하였다. rhGALC 다이머는 로딩 상에 가장 뚜렷하게 독립적이다. 초기 전자 현미경 연구를 통해 rhGALC 다이머에 해당하는 ~20 nm의 직경을 갖는 주요 형태의 몇 가지 존재 형태를 확인하였다.

실시예 7

불순물-HCP ELISA

잔여물인 CHO 세포의 숙주 세포 단백질(HCP)을 최종 산물 TG1106의 30 ng/mg rhGALC에서 정량화하였다.

중국 햄스터 난소(CHO) 숙주 세포 단백질(HCP)을 불순물의 척도로서 분석하였다. 유전적 항체는 ELISA에서 사용되는 것을 Cygnus Technologies사로부터 구입하였다. 상기 항체는 CHO 세포에 내부세포 단백질(C0016-PA) 뿐만 아니라 일반적으로 분비되는 세포 단백질(3G 0016-AF)로부터 생성된다. 표준(standard)은 부모의 CHO(DG44 균주) 세포로부터 분비되는 HCP 90% 및 라이시스된 HCP 10%로부터 제조하였다.

HCP는 에테르 단계, UFDF 단계 후 및 최종 산물에서 측정하였다. rhGALC 내부 표준 StG02 및 Tox ASA은 참조로서 분석하였다. 표 23에서 보는 바와 같이 상기 방법은 최종 산물 TG1106의 30 ng/mg rhGALC에 HCP 레벨을 감소시킨다. 잔여 HCP 레벨이 에테르 산물 및 최종 산물에서 유사하다는 것은 UFDF 단계에서 추가적으로 HCP를 제거하지 않았다는 것을 나타낸다.

에테르, UFDF 단계 후 및 최종 산물 TG1106, StG02, StG03 및 Tox ASA에 HCP 레벨을 참조하였다.

시료	단백질 660 nm	HCP
	(mg/㎖)	(ng/㎖)	(ng/mg)
T03E	0.47	15	32

T04E	0.48	9	19
T05E	0.56	14	25
T01U	2.66	98	37
TG1106	2.52	79	30
StG02	2.2	75	34
StG03	1.42	172	121
Reference	6.1	68	11

실시예 8

모노사카라이드(monosaccharide) 조성물

글리코실레이션(glycosylation)의 예비도(preliminary degree)는 7%로 추정되며 각 몰에 rhGALC은 2-3 몰 만노스-6-인산(mannose-6-phoshate) 잔기를 포함한다.

단 하나의 예비 분석을 최종 산물 TG1106으로 실시하였다. 그것은 ~7% 카르보하이드로레이트(w:w)임을 나타낸다. 상기 글리코실레이션은 높은 만노스 형태일 가능성이 높다.

예비 결과는 하기에 rhGALC의 몰 대 각 모노사카라이드의 몰로 나타낸다:

글루코스 아민(GLCN): 9 mol/mol

갈락토스 아민(GALN): 0-0.3 mol/mol

갈락토스(GAL): 1 mol/mol

만노스(MAN): 12 mol/mol

만노스-6 인산(M6P): 2-3 mol/mol

푸코스(fucose: FUC) 0-0.5 mol/mol

토의

본 명세서에 기재된 최적화된 세 크로마토그래피 단계의 방법은 동물 연구 및 임상 연구에 대한 질적 요건를 충족하는 정제 rhGALC 산물을 생산한다. DNA는 분석을 위해 남겨둔다. 최종 산물에서 정화된 수득물로부터 효소 활성을 기반으로한, 생물반응기 B5:19로부터의 생산량은 74%이다. GALC가 극도의 소수성 단백질인 것을 특히 중요하게 생각한다.

수득물의 정화는 허용 수율이 없는 유일한 단계이다. 따라서 정화된 그리고 조건화된 수득물로부터 계산되는 DSP 수율 분석에 개선 가능성이 있다. 약 20% 활성이 뎁스(depth) 필터레이션에 의해 소실되었다. 이전 연구에서 TFF가 정화 수율을 향상시키는 것으로 나타났다. 정화 과정을 포함하는, 총 수율은 58%이다.

이론상 GALC의 PI는 5.9이지만, 연구된 PI는 6.3이다. rhGALC가 산 M6P 및 시알산(sialic acid)을 포함하기 때문에 이는 놀라웠다. 본 발명에 앞서, 실험은 rhGALC 이 매우 pH에 민감하다는 것을 보여준다; 장기간 저장동안 그것의 PI 범위에서는 안정; pH 6.0-6.6. 이론적으로, PI 범위에서의 pH는 침전을 방지하기 위해 DSP를 방지해야 하지만, rhGALC DSP는 유일하게 가능하다. 산물은 DSP를 통해 확실해지고 유백광의 성향은 볼 수 없다. 높은 PI에 대한 이유는 트윈/rhGALC 마이셀(micelle) 형성이 예상에서 노출된 아미노산을 변경한 것이라 할 수 있다. 트윈은 효소 활성을 위한 모든 DSP 완충액들(플루로닉(pluronic)으로 대체된, Blue 조건 완충액을 제외하고)에 포함된다. 안정성 유지를 위한 최소한의 트윈 농도를 분석해야 할 일이다.

캡처(capture) 및 중간단계로부터의 용출은 복잡하다. 프로필렌 글리콜(PG)은 모든 용출 완충액을 위한 전제조건이다. 또한, 다른 첨가제 및 완충액의 세심한 최적화는 최적의 수율을 위해 필요하다. 단점은 높은 소수성 오염물질이 rhGALC과 함께 용출(co-elute)될 수 있다는 것이라 할 수 있다. 70 kDa 소수성 단백질, 프로사포신(prosaposin)이 캡처 및 중간 단계 후 오염물질로서 검증되었다(사포신(saposin) A 항체로 웨스턴 블롯). PG의 높은 농도는 rhGALC 효소 활성을 위한 최적의 조건이 아니므로 회수물(collection)은 미리 채워진(prefilled) 용기 내에 있다.

방법상의 단계에 몇 개의 추가 의견:

캡처 단계, Capto™ Blue에 주요 목적은 효소에 안정화 및 매개물 칼라의 제거이다. 수율을 위한 주된 중요성은 완전하게 용리 완충액을 제조하는 것이다. 521 g/ℓ 완충액에 상응하는 50%(v:v) 프로필렌 글리콜을 포함해야한다.

중간 단계, Capto™ Adhere는 대부분의 오염물질을 제거한다. 산성 조건은 용출을 위해 필수적이다. 단백질의 침전을 방지하기 위해 높은 이온 강도와 완충액에 의한 빠른 산성화가 중요하다. 완충액은 낮은 이온 강도와 산성 완충액으로 변화된다. 그 이유는 추가 불순물이 제거되어 용출된 산물에 산성화를 보장하지만, 낮은 이온 강도로 pH 6.5 완충액으로 미리 채워진(prefilled) 용기 내에 수득물에 의해 pH >6으로 다시 빠르게 변화할 수 있다.

소수성 특성과 최종 HCP를 제거할 가능성을 가지며, PG 및 IPA와 같은 어떠한 유기 용매도 포함하지 않는, 수성 완충액 사용에 의한 충분한 수율과 Toyopearl Ether 가 혼합된다. 허용 가능한 수율에 용출이 소듐 클로라이드를 포함한 포스페이트 완충액으로 가능하다는 장점이 있다. 단점은 극단적 염 농도가 rhGALC의 결합에 필수적이라는 것이다. 조건 완충액의 많은 용량은 긴 로딩 시간으로 만들어진다. 상기 단계는 rhGALC와 유사한 특성을 갖는 오염 물질로부터 rhGALC를 분리에 중요하다. 오염물질의 양호한 제거를 위하여 중요한 것은 세척 및 헹굼의 사이클이라 할 수 있는, 트윈 및 염의 농도 둘을 반복해서 변화하는 것이다. 프로사포신(prosaposine)은 에테르 단계 후에 확인할 수 있다.

두 개의 전용 바이러스 불활성/제거 단계는 생산 스케일의 방법상에 한 부분이다. 바이러스 스파이킹(spiking) 실험을 수반하지는 않지만, 단계의 수율 및 유동에 관하여서는 조짐을 보인다.

계면활성제 불활성 단계는 캡처 단계에 용출과 혼합된다. 높은 트윈 농도는 중간단계 컬럼 결합에 유해한 영향을 끼치지 않으며 효소 활성은 24 시간 동안 실온 저장 후에도 계속된다(또는 +5℃에서 3일 저장으로 혼합된다).

상기 계획은 에테르 단계 후, Planova 15N, 바이러스 필터레이션 단계를 갖는 것이다. 이는 이전 연구에서 가능성이 발견되었지만 반복되지는 않았다. 약 80 ℓ로 예상되는 큰 스케일의 추정 값은 ~5 시간에 1 ㎠ Planova 15N으로 필터 할 수 있다.

V-screen 30 kDa MWCO 필터를 포함하는, UFDF은 폴리싱(polishing) 단계 후 형성 및 농도를 위해 사용하였다. 개방 채널을 포함하는, V screen 필터는 최적화된 연구를 위해 많은 양의 산물을 필요로 하는 필롯(pilot) 규모(0.1 ㎠)에서만 사용할 수 있다. 상기 조건들은 종래의 연구에서 실시한 세 가지 UFDF를 기반으로 하여 작은 단계로 변형된다. UFDF에 단점은 트윈이 축적된다는 것이라 할 수 있다. 에테르 산물은 오직 0.0005% 트윈을 포함하는 완충액으로 세척되고 용출된다. 에테르 산물에서 트윈을 정량화하는 것은 어려웠지만, 추정 값은 ~0.003%이다. UFDF/제형 완충액은 0.0005% 트윈을 포함한다. 완충액의 8 용량 교환 및 ~7 배 농축 후 트윈 농도는 ~0.025%이다. UFDF 산물은 최종 산물에서 산물의 손실 없이 용이하게 0.22 ㎛로 필터 된다.

예상 결과는 +5, -20, -80℃에서 장기간 저장동안 rhGALC 안정성을 유지하기 위한 최적화된 제형 완충액의 다른 구성요소를 포함하는 조성물에서의 트윈 농도를 나타낸다. 만니톨이 250 mM로 증가하면 산물을 동결 건조 시킬 수 있다.

콜로이드 블루(Colloidal Blue)로 염색한 SDS-PAGE는 정제된 최종 산물을 보여준다; >99%. rhGALC 의 프로세싱(processed) 30 및 50 kDa 형태는 마이너(minor) 밴드로 보여질 수 있고 <0.5%로 추정된다.

80 kDa rhGALC 형태로부터 떨어져 가장 두드러지게(~2%) 가시화된 단백질은 SDS-PAGE 시료 완충액과 혼합된 rhGALC에서 가장 높은 농도를 나타낸 160 kDa rhGALC 형태이다. 웨스턴 블롯 분석으로 감소된 조건 하에 SDS에 의해 충분히 용해되지 않은 다이머일 수 있는, rhGALC 포함하는 단백질을 확인하였다. 상기 "다이머(dimer)"는 인공물일 수 있다. 중성 pH에서, 네이티브(native) PAGE는 모노머(monomer)에서 ~10 분자들의 rhGALC 멀티머(multimers)의 제형까지, 몇 개의 제형을 갖는다는 것을 나타낸다. 가장 일반적인 제형은 다이머(dimer)로 보여진다.

결과 및 요약

CHO 세포에서 발현된, 재조합 인간 GALC를 oyal Institute of Technology, Stockholm, Sweden에 20 ℓ 생물 반응기내에서 배양하였다. 19.5 ℓ 수득물에서 세 가지의 크로마토그래피 단계로 구성된 다운스트림 방법으로 17 밀리온 유닛(million Units) 또는 1.0 g 정제 rhGALC를 정제하였다; Capto Blue, Capto Adhere 및 Toyopearl Ether, 모든 결합 모드에서 실시한다. 1% 트윈 80으로 실온에서 16-34 시간 배양을 포함하는 바이러스 불활성 단계는 Capto Blue 후에 실시하였다. 산물을 접선 유동 필터레이션에의해 제형화하고 최종 산물 TG1106을 얻기 위하여 멸균 필터 하였다.

캡처 컬럼, Capto Blue에 결합을 위한 조건 및 뎁스(depth) 필터레이션에의해 정화하기 전 생물반응기에 소듐 아세테이트를 추가하여 수득물을 안정화하였다. 조건화된 수득물을 730 ㎖ Capto 블루 컬럼에 로딩하여 24 시간 내에 세 사이클 실시하였다. 프로필렌 글리콜을 감소시키고, 전용 바이러스 불활성 단계에 트윈을 증가시키고 및 다음 단계를 위한 시작 조건을 위한"세 가지-목적"에 50% 프로필렌 글리콜 완충액으로 산물을 용출하였다. 조건화된 시작 수득물을 세 개의 연속적 사이클로 730 ㎖ Capto Adhere 컬럼에 로딩하였다. 활성 유지를 위하여 프로필렌 글리콜을 감소시키고 pH를 증가시키는 산성 pH 및 프로필렌 클리콜 완충액으로 산물을 용출하였다. 조건화된 시작 수득물에 암모늄 아세테이트 및 암모늄 클로라이드를 포함하는 완충액으로 추가 혼합한 후에 세 개의 연속적 실시에 따라 540 ㎖ Toyopearl Ether 컬럼에 로딩하였다. 상기 산물을 소듐 클로라이드 및 낮은 트윈 농도가 포함된 포스페이트 완충액으로 용출하였다. 상기 계획은 폴리싱 단계 후 바이러스 필터레이션 단계를 포함하지만 본 연구에서는 제외시켰다. 모아진 폴리싱 산물에, 완충액을 정제 rhGALC의 장기간 저장을 위하여 최적화된 제형 완충액으로 UFDF에 의해 변화시키고 농축시켰다. UFDF 산물을 최종 산물로 멸균 필터 하였다. 최종 산물은 분석 방법 세트로 분석하였다. 상기 단백질 농도는 2.5 ㎎/㎖, 효소 활성화는 42.5 kU/㎖, 비활성 결과는 16.9 kU/㎎ 이다. 추정된 순도는 >99%이다. 잔여 HCP는 30 ng/㎎ rhGALC이다. 최종 산물은 투명하고 무색이다.

결과적으로, 새롭게 최적화된 DSP는 활성을 기반으로, 74%의 수율을 갖는 필롯 스케일을 위해 성공적으로 스케일 업(scaled up) 하였다. 최종 산물 TG1106은 동물 연구를 위한 요건을 만족하였다.

실시예 9

이온 분리와 실시예:

이온 분리는 만족스러운 결과를 얻도록 하기와 같이 시험하였다.

1) Mustang Q(MQ)는 음이온 지지체를 포함하는 일회용 막(disposable membrane)이다. 모드를 통과하는 현재의 방법으로 조성물을 시험하였다(DNA 및 숙주 세포 단백질과 같은 불순물은 막에 결합하고 GALC는 통과함). 에테르 단계 전에 또는 UFDF 단계(제형 단계) 이후에 시험하였다. 또한 Capto Blue에 맞춰, 또한 모드를 통과하여 시험하였다.

a) 에테르 단계 이후에 포함되는 경우: MQ의 평형은 3.7 mM 소듐 포스페이트, 5 mM 글라이신, 10 mM 만니톨, 0.075 M NaCl 0.0005% 트윈 80, pH 6.2으로 실시하였다. MQ를 통해 처리하기 전 산물을 3.7mM 소듐 포스페이트, 5mM 글라이신, 10mM 만니톨, 0.0005% 트윈 80, pH 6.2 (또는 0.15 M NaCl을 포함하는 동일한 완충액)과 1:1(v:v)로 희석하였다.

b) UFDF 단계 후 포함되는 경우: MQ를 3.7 mM 소듐 포스페이트, 0.2 M NaCl, 5 mM 글라이신, 10 mM 만니톨, 0.0005% 트윈 80, pH 6.2 로 평형화하였다. 산물이 MQ를 통해 처리되기 전 산물을 전도성이 20 mS/cm 일 때까지의 1M NaCl(약 1 용량 산물: 0.2 용량 1 M NaCl)로 희석하였다. 멸균 필터레이션 전 산물은 15 mS/cm으로 떨어진 전도성을 가지는 NaCl(0.15 M NaCl)을 포함하지 않는 제형 완충액으로 희석하였다.

방법의 개요:

정화된 수득물(Clarified harvest)

Capto Blue

바이러스 불활성

Capto Adhere

Toyopearl Ether

대체 a) Mustang Q

UFDF

대체 b) Mustang Q

0.22 ㎛ 필터

2) 강한 음이온 교환(AIEX) 수지, 예컨대 Capto Q, Giga Cap Q, Q FF는 결합 모드에 다운스트림 방법으로 포함될 수 있다. 또한 약한 음이온 교한 수지 예컨대 Capto DEAE 및 DEAE FF이 포함될 가능서이 있지만 남는 불순물이 더 많이 발견된다. 이는 폴리싱 단계(소수성 상호작용(HIC)) 전 또는 후에 사용도리 수 있다.

방법 1:

방법의 개요:

정화된 수득물

Capto Blue

바이러스 불활성

바이러스 불활성 15% IPA 및 1% t80. 참고: IPA를 사용할 경우 일부 불활성.

0.4-0.6 M (NH₄)₂SO₄, 5% 클리세롤, 0.1% 트윈 80 (t80), pH 6.5 로 평형화(Equilibrated: Eq). 부착된 산물(adhered product) 20 mM NaPi , 5% 글리세롤, 0.8-1.2 M (NH₄)₂SO₄ , pH 6.5(1:1)로 조건화(conditioned) 및 로딩(load).

세척 1: 0.6 M NaPi, 0.1% t80, pH 6.5.

세척 2: 20 mM NaPi, 15 mM NaCl, 0.1% T80,

Giga Cap Q

40 mM MES, 15 mM NaCl, 5% glycerol, 0.1% T80, pH 6.5로 평형화. 메틸 산물(조건화되지 않은) 로딩 및 eq 완충액으로 세척.

용출: 40 mM MES, 0.7 M NaCl, 5% 글리세롤

UFDF

방법 2:

방법의 개요:

정화된 수득물

Capto Blue

바이러스 불활성

Capto Adhere

Giga Q

40 mM MES, 15 mM NaCl, 0.1% T80, pH 6.5로 평형화. Capto adhere는 전도성 7 mS/cm, 20 mM NaPi, 0.1% t80, pH 6.5으로 조건화. 로딩 및 완충액으로 세척.

에테르

UFDF

실시예 10

다음의 다중 모드 수지로 만족스러운 결과를 얻도록 시험하였다.

1) MMC 캡처(초기 실험)

시작: 수득물의 pH는 5.6 ?? 6.0 w, 400 mM Na-Pi (산성)으로 조정하였다.

사용된 평형 완충액: 20 mM Na-Pi pH 5.6 ?? 6.0 + 0.1 M NaCl + 0.05% Tween 80 (t80).

사용된 세척 완충액: 0.95 M Na-Ac pH 4.9 + 5% IPA.

사용된 용출 완충액: 50 mM Tris-HCl pH 9.0 + 1.0M NaCl + 40 % Prop Glycol + 0.1% t80.

결과: 효소의 존재를 닷-블롯(Dot-Blot) 방법을 사용하여 분석하였다. 효소를 시작(+++) 및 용출-분획 1(++)로 검출하였다. 효소가 아니면 관통하여 검출된다. SDS-PAGE 및 HPLC은 분획물 상에서 실시하였다.

2) 2^nd중간 단계 또는 폴리싱 단계에 부틸-S:

시작: 0.5-6 M (NH₄)₂SO₄에 조건

평형: 20 mM NaPi, 0.5 M(NH₄)₂SO₄.5% 글리세롤, 0.1% t80 pH 6.5.

세척: 평형 완충액

용출: 20 mM NaPi, 0.1 M NaAc, 5% IPA,0.1% t80, pH 7.8.

3) 2^nd중간 단계에 PPG(ex test 44-47)

시작: 0.5 M (NH₄)₂SO₄ 및 0.5M NaAc, pH 6.3으로 조건.

Eq: 20 mM NaPi, 0.5 M (NH₄)₂SO₄ 및 0.5M NaAc, 0.0005-0.1% t80, 5% 글리세롤, pH 6.4

세척: 1.6 M NaAc, 0.1% t80, pH 7.4

세척 2: 0.7 M naPi, pH 6.5

용출: 20 mM NaPi, 30% 프로필렌 글리콜, 0.05% t80, pH 7.8

실시예 11

다음 수지의 조성물을 만족스러운 결과를 얻도록 시험하였다.

예비 시험: 평균 약 350 ng HCP/㎎ GALC

Capto 블루(blue)

Capto adhere

Capto 부틸

Capto DEAE

시험 1: 240 ng HCP/㎎ GALC

Capto 블루

Capto adhere

부틸-S

시험 2: 430 ng HCP/㎎ GALC

Capto 블루

Capto Adhere

마크로-프렙(prep) 메틸

기가(Giga) Cap Q

시험 3: 78 ng HCP/㎎ GALC

Capto 블루

Capto adhere

PPG

시험 4: 50 ng HCP/㎎ GALC (그러나 IPA+트윈(tween)과 바이러스 불활성으로 유백광)

Capto 블루

Capto Adhere

부틸-S

시험 5: 193 ng HCP/㎎ GALC

라인 필터에서 Capto Blue-Mustang Q

Capto adhere

에테르(ether)

시험 6: 79 ng HCP/㎎ GALC

라인에서 Capto 블루-무스탕(Mustang) Q

Capto adhere

에테르

실시예 12

갈락토세레브로시다제(galactocerebrosidase: GALC) 활성 분석을 위한 HNG 어세이

원리

갈락토세레브로시다제(galactocerebrosidase: GALC)는 미엘린(myelin), 신장 및 상피 세포(epithelial cells)에 주요 지질인, 칼락토세레브로시드(galactocerebroside (=galactosylceramide))의 리소좀 이화작용(catabolism)에 대해 책임이 있다. GALC는 칼락토세레브로시드, 칼락토실스핑오신(galactosylsphingosine), 락토실세라마이드(lactosylceramide), 및 모노갈락토실디클리세라이드(monogalactosyldiglyceride)의 칼락토스 에스테르 결합을 가수 분해한다. GALC는 또한 칼락토세레브로시드의 합성 유사체, 크로모제닉 기질(chromogenic substrate), 2-hexadecanoylamino-4-nitrophenyl-b-D-galactopyranoside(HNG)를 가수 분해 할 수 있다. 반응 산물의 소듐 염, 2-hexadecanoylamino-4-nitrophenol(HN)은 410 nm에서 빛을 흡수한다. 상기 원리는 본 명세서에 기재된 방법에 이용된다.

GALC에 대한 분석 원리. HNG는 분광광도계 410 nm에서 검출되는 노란색 산물(pH 10.5)로 GALC에 의해 NH(pH 4.5)로 가수분해 된다.

2-hexadecanoylamino-4-nitrophenyl-b-D-galactopyranoside(HNG)의 가수분해 절단

시료 준비

수득물(harvest) 또는 정제된 GALC

원하는 시료의 희석을 0.5% Triton X-100을 사용하여 제조하였다. 최소 1:10 희석이 분석을 위해 필요하다.

세포-파쇄

세포-펠렛(pellets)을 PBS로 세척하고, 원심분리(실온에서 5분동안 400 ㅧ g)에 의해 펠렛을 모으고, 0.5% Triton X-100으로 파쇄 하였다. 일반적으로 실험에 1-5 ㎎ 세포-파쇄 단백질을 사용하여 실시하였다.

표준 곡선 및 어세이 컨트롤(control)의 준비

제1 내부 rhGALC 표준 StG01을 표준 곡선 준비를 위해 사용하였다. 다섯 개 희석(1/400, 1/600, 1/800, 1/1200 및 1/1600)의 트루 레플리커(true replicas)를 준비하였다.

단계 번호	희석을 위해 사용된 시료	시료(㎖)	피펫 번호*	0.5% Triton X-100 (㎖)	희석-전
1	StG01	10	1	90	1/10
2	희석-전 1/10	20	2	180	1/100
					최종 희석
3	희석-전 1/100	50	2	150	1/400
3	희석-전 1/100	30	2	150	1/600
3	희석-전 1/100	25	2	175	1/800
3	희석-전 1/100	10	1	110	1/1200
3	희석-전 1/100	10	1	150	1/1600

제2 rhGALC 표준 StG02 어세이 컨트롤(control)의 준비를 위해 사용하였다:

단계 번호	희석을 위해 사용된 시료	시료(㎖)	피펫 번호*	0.5% Triton X-100 (㎖)	희석-전
1	StG02	10	1	90	1/10
2	희석-전 1/10	10	1	190	1/200
3	희석-전 1/200	10	1	190	1/4000
					최종 희석
4	희석-전 1/4000	50	2	150	1/16000

반응 방법

a. 20 ㎖의 표준 희석액, 시료, 컨트롤(control) 및 블랭크(blank)(0.5% Triton X-100)를 U-타입 96-웰 플레이트에 첨가하였다. StG01 표준 희석액, 컨트롤 및 시료의 각 레플리커(replica) 20 ㎖ (단일 희석액을 준비한다면 20 ㎖ ㅧ 2 ) 및 블랭크 20 ㎖ ㅧ 2를 사용하였다. 모든 웰에 20 ㎖ HNG-어세이 기질을 로딩할 경우 혼합한 다음에 시료, 블랭크 및 컨트롤를 포함하는 모든 웰에 추가하였다. 플레이트는 30 분 또는 1 시간동안 37℃에서 반응시켰다.

b. 80 ㎖ HNG 정지(stop) 용액(0.1 M 글라이신/0.1 M NaOH pH 10.5)을 멀티파이펫(multipipette)을 사용하여 첨가한 다음 160 ㎕ 에탄올을 추가하여 약 30 초 동안 플레이트-쉐이커로 혼합하였다. 상기 용액을 혼합하고 200 ㎖을 각 웰로부터 회수하여 바닥이 평평한(flat-bottomed) 96-웰 플레이트 위의 96-웰 필터 플레이트의 웰로 옮겼다. 플레이트를 실온에서 2 분 동안 2000 ㅧ g로 원심분리 하였다.

A410 nm로 측정

측정은 Spectra Max Plus 플레이트 리더기 또는 BioTek 플레이트 리더기를 사용하여 실시하였다.

계산

정의: 효소 활성의 1 유닛(1 U)은 pH 4.5, 37℃에서 1 nmol/분의 가수 분해로 정의하였다.

제1 내부 rhGALC 표준 StG01의 평균 HNG-활성은 1884 U/㎖로 설정하였다. 표준 곡선에 대해 사용된 활성은 평균 StG01 HNG-활성의 희석하여 계산하였다.

표준 번호	StG01의 희석	희석된 StG01의 활성 U/㎖
1	1/400	4.71
2	1/600	3.14
3	1/800	2.355
4	1/1200	1.57
5	1/1600	1.1775

비활성 계산

혼합된 시료에 GALC의 농도는 GALC ELISA를 사용하여 결정하였다. GALC의 정제 과정에 단백질 농도는 A280(rhGALC에 대한 이론상 특이적 흡수 계수는 2.5이다) 또는 660 nm 단백질 어세이를 사용하여 결정하였다.

비활성(유닛(units)/㎎) 또는 효소 활성/㎎ 단백질(유닛/mg 단백질)을 계산하기 위해서, HNG 활성을 GALC 또는 단백질의 농도로 나누었다.

본래, 세포-파쇄물의 GALC 활성은 가수분해된 산물/㎎/시간(nmol/mg/h)으로 정의된다. nmol/mg/h을 units/mg로 변환하기 위하여 60을 곱하였다(즉, 시간을 분으로 변환).

<110> ACE BioSciences A/S <120> Purification of Recombinant Human Galactocerebroside beta-Galactosidase(rhGALC) <130> PI150013 <150> PCT/DK 2013/050378 <151> 2013-11-13 <150> DK PA2012/70699 <151> 2012-11-13 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 3761 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 1 ggctactctc ggcttcctgg caacgccgag cgaaagctat gactgcggcc gcgggttcgg 60 cgggccgcgc cgcggtgccc ttgctgctgt gtgcgctgct ggcgcccggc ggcgcgtacg 120 tgctcgacga ctccgacggg ctgggccggg agttcgacgg catcggcgcg gtcagcggcg 180 gcggggcaac ctcccgactt ctagtaaatt acccagagcc ctatcgttct cagatattgg 240 attatctctt taagccgaat tttggtgcct ctttgcatat tttaaaagtg gaaataggtg 300 gtgatgggca gacaacagac ggcactgagc cctcccacat gcattatgca ctagatgaga 360 attatttccg aggatacgag tggtggttga tgaaagaagc taagaagagg aatcccaata 420 ttacactcat tgggttgcca tggtcattcc ctggatggct gggaaaaggt ttcgactggc 480 cttatgtcaa tcttcagctg actgcctatt atgtcgtgac ctggattgtg ggcgccaagc 540 gttaccatga tttggacatt gattatattg gaatttggaa tgagaggtca tataatgcca 600 attatattaa gatattaaga aaaatgctga attatcaagg tctccagcga gtgaaaatca 660 tagcaagtga taatctctgg gagtccatct ctgcatccat gctccttgat gccgaactct 720 tcaaggtggt tgatgttata ggggctcatt atcctggaac ccattcagca aaagatgcaa 780 agttgactgg gaagaagctt tggtcttctg aagactttag cactttaaat agtgacatgg 840 gtgcaggctg ctggggtcgc attttaaatc agaattatat caatggctat atgacttcca 900 caatcgcatg gaatttagtg gctagttact atgaacagtt gccttatggg agatgcgggt 960 tgatgacggc ccaagagcca tggagtgggc actacgtggt agaatctcct gtctgggtat 1020 cagctcatac cactcagttt actcaacctg gctggtatta cctgaagaca gttggccatt 1080 tagagaaagg aggaagctac gtagctctga ctgatggctt agggaacctc accatcatca 1140 ttgaaaccat gagtcataaa cattctaagt gcatacggcc atttcttcct tatttcaatg 1200 tgtcacaaca atttgccacc tttgttctta agggatcttt tagtgaaata ccagagctac 1260 aggtatggta taccaaactt ggaaaaacat ccgaaagatt tctttttaag cagctggatt 1320 ctctatggct ccttgacagc gatggcagtt tcacactgag cctgcatgaa gatgagctgt 1380 tcacactcac cactctcacc actggtcgca aaggcagcta cccgcttcct ccaaaatccc 1440 agcccttccc aagtacctat aaggatgatt tcaatgttga ttacccattt tttagtgaag 1500 ctccaaactt tgctgatcaa actggtgtat ttgaatattt tacaaatatt gaagaccctg 1560 gcgagcatca cttcacgcta cgccaagttc tcaaccagag acccattacg tgggctgccg 1620 atgcatccaa cacaatcagt attataggag actacaactg gaccaatctg actataaagt 1680 gtgatgttta catagagacc cctgacacag gaggtgtgtt cattgcagga agagtaaata 1740 aaggtggtat tttgattaga agtgccagag gaattttctt ctggattttt gcaaatggat 1800 cttacagggt tacaggtgat ttagctggat ggattatata tgctttagga cgtgttgaag 1860 ttacagcaaa aaaatggtat acactcacgt taactattaa gggtcatttc gcctctggca 1920 tgctgaatga caagtctctg tggacagaca tccctgtgaa ttttccaaag aatggctggg 1980 ctgcaattgg aactcactcc tttgaatttg cacagtttga caactttctt gtggaagcca 2040 cacgctaata cttaacaggg catcatagaa tactctggat tttcttccct tctttttggt 2100 tttggttcag agccaattct tgtttcattg gaacagtata tgaggctttt gagactaaaa 2160 ataatgaaga gtaaaagggg agagaaattt atttttaatt taccctgtgg aagattttat 2220 tagaattaat tccaagggga aaactggtga atctttaaca ttacctggtg tgttccctaa 2280 cattcaaact gtgcattggc cataccctta ggagtggttt gagtagtaca gacctcgaag 2340 ccttgctgct aacactgagg tagctctctt catcttattt gcaagcggtc ctgtagatgg 2400 cagtaacttg atcatcactg agatgtattt atgcatgctg accgtgtgtc caagtgagcc 2460 agtgtcttca tcacaagatg atgctgccat aatagaaagc tgaagaacac tagaagtagc 2520 tttttgaaaa ccacttcaac ctgttatgct ttatgctcta aaaagtattt ttttattttc 2580 ctttttaaga tgatactttt gaaatgcagg atatgatgag tgggatgatt ttaaaaacgc 2640 ctctttaata aactacctct aacactattt ctgcggtaat agatattagc agattaattg 2700 ggttatttgc attatttaat ttttttgatt ccaagttttg gtcttgtaac cactataact 2760 ctctgtgaac gtttttccag gtggctggaa gaaggaagaa aacctgatat agccaatgct 2820 gttgtagtcg tttcctcagc ctcatctcac tgtgctgtgg tctgtcctca catgtgcact 2880 ggtaacagac tcacacagct gatgaatgct tttctctcct tatgtgtgga aggaggggag 2940 cacttagaca tttgctaact cccagaattg gatcatctcc taagatgtac ttacttttta 3000 aagtccaaat atgtttatat ttaaatatac gtgagcatgt tcatcatgtt gtatgattta 3060 tactaagcat taatgtggct ctatgtagca aatcagttat tcatgtaggt aaagtaaatc 3120 tagaattatt tataagaatt actcattgaa ctaattctac tatttaggaa tttataagag 3180 tctaacatag gcttagctac agtgaagttt tgcattgctt ttgaagacaa gaaaagtgct 3240 agaataaata agattacaga gaaaattttt tgttaaaacc aagtgatttc cagctgatgt 3300 atctaatatt ttttaaaaca aacattatag aggtgtaatt tatttacaat aaaatgttcc 3360 tactttaaat atacaattca gtgagttttg ataaattgat atacccatgt aaccaacact 3420 ccagtcaagc ttcagaatat ttccatcacc ccagaaggtt ctcttgtata cctgctcagt 3480 cagttccttt cactcccaat tgttggcagc cattgatagg aattctatca ctataggtta 3540 gttttctttg ttccagaaca tcatgaaagc ggcgtcatgt actgtgtatt cttatgaatg 3600 gtttctttcc atcagcataa tgatttgaga ttggtccatg ttgtgtgatt cagtggtttg 3660 ttccttctta tttctgaaga gttttccatt gtatgaatat accacaattt gtttcctccc 3720 caccagtttc tgatactaca attaaaactg tctacattta c 3761 <210> 2 <211> 669 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 2 Met Thr Ala Ala Ala Gly Ser Ala Gly Arg Ala Ala Val Pro Leu Leu 1 5 10 15 Leu Cys Ala Leu Leu Ala Pro Gly Gly Ala Tyr Val Leu Asp Asp Ser 20 25 30 Asp Gly Leu Gly Arg Glu Phe Asp Gly Ile Gly Ala Val Ser Gly Gly 35 40 45 Gly Ala Thr Ser Arg Leu Leu Val Asn Tyr Pro Glu Pro Tyr Arg Ser 50 55 60 Gln Ile Leu Asp Tyr Leu Phe Lys Pro Asn Phe Gly Ala Ser Leu His 65 70 75 80 Ile Leu Lys Val Glu Ile Gly Gly Asp Gly Gln Thr Thr Asp Gly Thr 85 90 95 Glu Pro Ser His Met His Tyr Ala Leu Asp Glu Asn Tyr Phe Arg Gly 100 105 110 Tyr Glu Trp Trp Leu Met Lys Glu Ala Lys Lys Arg Asn Pro Asn Ile 115 120 125 Thr Leu Ile Gly Leu Pro Trp Ser Phe Pro Gly Trp Leu Gly Lys Gly 130 135 140 Phe Asp Trp Pro Tyr Val Asn Leu Gln Leu Thr Ala Tyr Tyr Val Val 145 150 155 160 Thr Trp Ile Val Gly Ala Lys Arg Tyr His Asp Leu Asp Ile Asp Tyr 165 170 175 Ile Gly Ile Trp Asn Glu Arg Ser Tyr Asn Ala Asn Tyr Ile Lys Ile 180 185 190 Leu Arg Lys Met Leu Asn Tyr Gln Gly Leu Gln Arg Val Lys Ile Ile 195 200 205 Ala Ser Asp Asn Leu Trp Glu Ser Ile Ser Ala Ser Met Leu Leu Asp 210 215 220 Ala Glu Leu Phe Lys Val Val Asp Val Ile Gly Ala His Tyr Pro Gly 225 230 235 240 Thr His Ser Ala Lys Asp Ala Lys Leu Thr Gly Lys Lys Leu Trp Ser 245 250 255 Ser Glu Asp Phe Ser Thr Leu Asn Ser Asp Met Gly Ala Gly Cys Trp 260 265 270 Gly Arg Ile Leu Asn Gln Asn Tyr Ile Asn Gly Tyr Met Thr Ser Thr 275 280 285 Ile Ala Trp Asn Leu Val Ala Ser Tyr Tyr Glu Gln Leu Pro Tyr Gly 290 295 300 Arg Cys Gly Leu Met Thr Ala Gln Glu Pro Trp Ser Gly His Tyr Val 305 310 315 320 Val Glu Ser Pro Val Trp Val Ser Ala His Thr Thr Gln Phe Thr Gln 325 330 335 Pro Gly Trp Tyr Tyr Leu Lys Thr Val Gly His Leu Glu Lys Gly Gly 340 345 350 Ser Tyr Val Ala Leu Thr Asp Gly Leu Gly Asn Leu Thr Ile Ile Ile 355 360 365 Glu Thr Met Ser His Lys His Ser Lys Cys Ile Arg Pro Phe Leu Pro 370 375 380 Tyr Phe Asn Val Ser Gln Gln Phe Ala Thr Phe Val Leu Lys Gly Ser 385 390 395 400 Phe Ser Glu Ile Pro Glu Leu Gln Val Trp Tyr Thr Lys Leu Gly Lys 405 410 415 Thr Ser Glu Arg Phe Leu Phe Lys Gln Leu Asp Ser Leu Trp Leu Leu 420 425 430 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Thr Leu Ser Leu His Glu Asp Glu Leu Phe 435 440 445 Thr Leu Thr Thr Leu Thr Thr Gly Arg Lys Gly Ser Tyr Pro Leu Pro 450 455 460 Pro Lys Ser Gln Pro Phe Pro Ser Thr Tyr Lys Asp Asp Phe Asn Val 465 470 475 480 Asp Tyr Pro Phe Phe Ser Glu Ala Pro Asn Phe Ala Asp Gln Thr Gly 485 490 495 Val Phe Glu Tyr Phe Thr Asn Ile Glu Asp Pro Gly Glu His His Phe 500 505 510 Thr Leu Arg Gln Val Leu Asn Gln Arg Pro Ile Thr Trp Ala Ala Asp 515 520 525 Ala Ser Asn Thr Ile Ser Ile Ile Gly Asp Tyr Asn Trp Thr Asn Leu 530 535 540 Thr Ile Lys Cys Asp Val Tyr Ile Glu Thr Pro Asp Thr Gly Gly Val 545 550 555 560 Phe Ile Ala Gly Arg Val Asn Lys Gly Gly Ile Leu Ile Arg Ser Ala 565 570 575 Arg Gly Ile Phe Phe Trp Ile Phe Ala Asn Gly Ser Tyr Arg Val Thr 580 585 590 Gly Asp Leu Ala Gly Trp Ile Ile Tyr Ala Leu Gly Arg Val Glu Val 595 600 605 Thr Ala Lys Lys Trp Tyr Thr Leu Thr Leu Thr Ile Lys Gly His Phe 610 615 620 Ala Ser Gly Met Leu Asn Asp Lys Ser Leu Trp Thr Asp Ile Pro Val 625 630 635 640 Asn Phe Pro Lys Asn Gly Trp Ala Ala Ile Gly Thr His Ser Phe Glu 645 650 655 Phe Ala Gln Phe Asp Asn Phe Leu Val Glu Ala Thr Arg 660 665

Claims

다음의 단계를 포함하는, 세포 배양물(cell culture)로부터 재조합 인간 갈락토세레브로사이드 베타- 갈락토시다아제(galactocerebroside β-galactosidase: rhGALC)를 정제하는 방법에 있어서, rhGALC를 포함하는 상기 세포 배양물의 분획물을 수지상의 크로마토그래피에 적용하는 것을 특징으로 하는 방법:
A) 상기 rhGALC를 제1다중 모드(multimodal) 크로마토그래피 수지로 정제하는 캡처(capture) 단계로서, 상기 단계는 선택적으로 바이러스 불활성 및 이온 분리에 의한 정제 과정이 후속적으로 실시되며;
B) 상기 rhGALC를 제2다중 모드 크로마토그래피 수지로 정제하는 중간(intermediate) 단계로서, 상기 단계는 선택적으로 바이러스 불활성 및 이온 분리에 의한 정제 과정이 후속적으로 실시되며;
C) 상기 rhGALC를 다중 모드 크로마토그래피 수지, 음이온 교환 수지 및 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 수지로 구성된 그룹으로부터 선택된 제3 크로마토그래피 수지로 정제하는 폴리싱(polishing) 단계;
여기에서 상기 제1다중 모드 크로마토그래피 수지는 하기 화학식 (I), (II), 또는 (III)의 화합물을 리간드로 포함하는 것을 특징으로 하고:

(I),

(II), 및

(III);
상기 화학식 (II) 및 (III)의 R은 하기 화학식 (IV)를 작용기로 가지며:

(IV);
상기 제2다중 모드 크로마토그래피 수지는 다음 화학식의 리간드를 포함하는 것을 특징으로 한다:

(VIII)
또는

(IX).
제 1 항에 있어서, 상기 중간 단계는 상기 제2다중 모드 크로마토그래피 수지를 이용한 상기 rhGALC의 정제 과정을 포함하며, 후속적으로 다음으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나의 크로마토그래피 수지를 이용하여 상기 rhGALC의 정제 과정이 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법:
i) 상기 제1 및 상기 제2다중 모드 크로마토그래피 수지와 상이한 다중 모드 크로마토그래피 수지; 및
ii) 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 수지.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 제1 및 제2다중 모드 크로마토그래피 수지는 서로 상이한 수지인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 폴리싱 단계에서 상기 크로마토그래피 수지는 소수성 리간드를 갖는 수지인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 rhGALC는 최소 30%(v/v)의 프로필렌 글리콜 또는 에틸렌 글리콜을 포함하는 제1 용출(elution) 완충액으로 상기 제1다중 모드 크로마토그래피의 수지로부터 용출되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 rhGALC는 최소 30%(v/v)의 프로필렌 글리콜 또는 에틸렌 글리콜을 포함하고 pH 5.5 이하인 제2 용출 완충액으로 상기 제2다중 모드 크로마토그래피의 수지로부터 용출되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 방법은 다음의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
a) rhGALC를 포함하는 상기 세포 배양물의 분획물을 제공하는 단계;
b) 정전기적 리간드를 포함하는 제1다중 모드 크로마토그래피 수지에 상기 세포 배양물의 분획물을 로딩하는 단계;
c) 최소 30%(v/v) 프로필렌 글리콜 또는 에틸렌 글리콜을 포함하는 제1 용출 완충액으로 상기 제1다중 모드 크로마토그래피 수지로부터 rhGALC를 용출하며, 이에 의해 제1 용출액을 제공하는 단계;
d) 음이온 및 소수성 리간드를 포함하는 제2다중 모드 크로마토그래피 수지에 상기 제1 용출액을 로딩하는 단계;
e) 최소 30%(v/v) 프로필렌 글리콜 또는 에틸렌 글리콜을 포함하고 pH 5.5 이하인 제2 용출 완충액으로 상기 제2다중 모드 크로마토그래피 수지로부터 rhGALC를 용출하며, 이에 의해 제2 용출액을 제공하는 단계;
f) 소수성 리간드를 갖는 제3 크로마토그래피 수지에 상기 제 2 용출액을 로딩하는 단계; 및
g) 수용성 완충액으로 제3 크로마토그래피 수지로부터 rhGALC를 용출하며, 이에 의해 제3 용출액을 제공하는 단계.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 제1다중 모드 크로마토그래피 수지는 적어도 소수성 및 정전기적 상호작용을 통해 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 제1 크로마토그래피 수지는 최대 20%(v/v)의 프로필렌 글리콜 또는 에틸렌 글리콜을 포함하는 세척 완충액으로 세척되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 제1 용출 완충액은 총 농도 40-60%(v/v)의 프로필렌 글리콜 또는 에틸렌 글리콜을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 7 항에 있어서, 상기 단계 c) 이후에 상기 제1 용출액의 프로필렌 글리콜 또는 에틸렌 글리콜(v/v)의 총 농도는 단계 d) 이전에 30% 이하로 낮추어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제 7 항에 있어서, 상기 단계 c) 이후에 제1 용출액의 계면활성제의 농도는 0.01-5%로 조절되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 제2다중 모드 크로마토그래피 수지는 이온 상호작용, 수소 결합 및 소수성 상호작용을 통해 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 7 항에 있어서, 상기 제2 용출 완충액은 30-50%(v/v) 프로필렌 글리콜 또는 에틸렌 글리콜을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 제3 크로마토그래피의 수지는 에테르 그룹을 포함하는 리간드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 7 항에 있어서, 상기 제3 크로마토그래피 수지는 리간드로 [수지(resin)]-(OCH₂CH₂)_nOH을 포함하며, 여기에서 n은 1-20 범위 내의 정수인 것을 특징으로 하는 방법.
rhGALC를 포함하는 글로보이드 세포 백질이영양증(Globoid Cell Leukodystrophy: 크라베 병)의 치료용 조성물에 있어서, 전체 길이(full length) rhGALC(80 kDa)와 주요 프로세싱된 산물(50 + 30 kDa) 사이의 몰 비율이, 주요 프로세싱된 산물 2.5에 대하여 전체 길이 rhGALC가 적어도 50인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 17 항에 있어서, 숙주 세포 단백질의 양은 200 ng/mg rhGALC 이하인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 17 항 또는 제 18 항에 있어서, rhGALC 효소의 효소 활성은 최소 15 kU/㎖인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 17 항 또는 제 18 항에 있어서, 상기 조성물은 육안 검사(visual inspection)에 의해 확인된 응집체(aggregates)가 없는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 17 항 또는 제 18 항에 있어서, 상기 조성물은 제 1 항 또는 제 2항의 정제 방법에 의해 수득되는 것을 특징으로 하는 조성물.
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