CN104854122A - 重组人半乳糖脑苷脂-β-半乳糖苷酶(rhGALC)的纯化 - Google Patents

重组人半乳糖脑苷脂-β-半乳糖苷酶(rhGALC)的纯化 Download PDF

Info

Publication number
CN104854122A
CN104854122A CN201380059392.2A CN201380059392A CN104854122A CN 104854122 A CN104854122 A CN 104854122A CN 201380059392 A CN201380059392 A CN 201380059392A CN 104854122 A CN104854122 A CN 104854122A
Authority
CN
China
Prior art keywords
rhgalc
resin
chromatography resin
multimodal chromatography
arbitrary aforementioned
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201380059392.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104854122B (zh
Inventor
延斯·福格
克拉斯·安德松
皮娅·海登
皮娅·林霍尔姆·古尔斯塔德
谢斯廷·伦德尔
马格纳斯·耶特曼
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Italy Casey Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
ACE Biosciences AS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ACE Biosciences AS filed Critical ACE Biosciences AS
Publication of CN104854122A publication Critical patent/CN104854122A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104854122B publication Critical patent/CN104854122B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/32—Bonded phase chromatography
    • B01D15/325—Reversed phase
    • B01D15/327—Reversed phase with hydrophobic interaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/47—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2), e.g. cellulases, lactases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
    • B01D15/3847—Multimodal interactions
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
    • B01J20/286—Phases chemically bonded to a substrate, e.g. to silica or to polymers
    • B01J20/287—Non-polar phases; Reversed phases
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
    • B01J20/286—Phases chemically bonded to a substrate, e.g. to silica or to polymers
    • B01J20/288—Polar phases
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
    • B01J20/286—Phases chemically bonded to a substrate, e.g. to silica or to polymers
    • B01J20/289—Phases chemically bonded to a substrate, e.g. to silica or to polymers bonded via a spacer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01046—Galactosylceramidase (3.2.1.46)
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/36—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving ionic interaction
    • B01D15/361—Ion-exchange
    • B01D15/363—Anion-exchange
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J2220/00—Aspects relating to sorbent materials
    • B01J2220/50—Aspects relating to the use of sorbent or filter aid materials
    • B01J2220/52—Sorbents specially adapted for preparative chromatography

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种用于从细胞培养物中纯化重组人半乳糖脑苷脂-β-半乳糖苷酶(rhGALC)的方法，其中将所述细胞培养物的包含rhGALC的级分在三种不同的树脂上进行色谱法。

Description

重组人半乳糖脑苷脂-β-半乳糖苷酶(rhGALC)的纯化
技术领域
本发明涉及重组人半乳糖脑苷脂-β-半乳糖苷酶的纯化方法和通过此方法得到的产物。
背景技术
半乳糖脑苷脂-β-半乳糖苷酶是一种能催化半乳糖脑苷脂的半乳糖水解的酶。它的缺乏可以导致组织中半乳糖脑苷脂的蓄积。已经有研究表明，可以从天然标本中，如肝(Ben-Yoseph,Archives of Biochemistry and Biophysics,1979)、淋巴细胞(Sakai et al,J.Biochem.,1994)和尿(Sakai et al,J.Biochem.,1994)，进行人GALC的部分纯化。由于GALC的极端的疏水性和低丰度，所以已知的这些纯化方法很复杂。回收率非常低，只能获得全长GALC(80kDa)和加工片段(主要50和30kDa)的混合物。此外，先前的研究只是针对酶的特性而不是为了人体酶替代疗法(ERT)而进行大规模生产。
因此，产生在适用于人体的生理溶液中具有高纯度的均匀产品(80kDa rhGALC)的改进的rhGALC纯化方法是有利的。
发明内容
开发了一种纯化重组人半乳糖脑苷脂-β-半乳糖苷酶(rhGALC)的方法，其产生满足动物/人类研究对质量和纯度的要求的终产物。所述方法包括三个主要的色谱步骤和一个可选的UFDF制剂步骤。在此研究中，从20升补料分批生物反应器中得到的新鲜和澄清的收获物用最优化的方法纯化来产生用于动物/人类研究的rhGALC。
所述纯化方法基于包括不同作用模式的捕获、中度纯化(intermediate)和精制色谱步骤的三步法。优选地，所有步骤都以结合模式进行，并在洗脱前包括洗涤步骤。在一个具体实施方案中：捕获步骤是用CaptoTM Blue,，中度纯化步骤是用CaptoTM Adhere，精制步骤是用Toyopearl Ether。所述方法的实施方案包括两个专用的病毒失活/去除步骤。可由UFDF制备产物池，然后无菌过滤成最终产物。
最终目的是生产rhGALC作为酶替代疗法用于治疗溶酶体酶贮积病球形细胞脑白质营养不良(Krabbe氏病)。Krabbe病是由酶GALC遗传缺陷引起的。GALC缺乏导致鞘脂类代谢产物半乳糖基鞘氨醇(鞘氨醇半乳糖苷)的逐渐累积、脱髓鞘和过早死亡。
因此，本发明的目的是提供一种纯化rhGALC的方法。特别地，本发明的目的是提供一种纯化rhGALC的方法，其在动物和人类中可用地解决上述问题。
因此，本发明的一个方面涉及一种用于从细胞培养物中纯化重组人半乳糖脑苷脂-β-半乳糖苷酶(rhGALC)的方法，其中将所述细胞培养物的包含rhGALC的级分在树脂上进行色谱法，所述方法包括：
a)捕获步骤：其中将所述rhGALC在第一多峰色谱树脂上纯化，任选地随后通过离子分离进行病毒灭活和/或纯化；
b)中度纯化步骤：其中所述rhGALC在第二多峰色谱树脂上纯化，任选地随后通过离子分离进行病毒灭活和/或纯化；
c)精制步骤：其中所述rhGALC在色谱树脂上纯化，所述树脂选自多峰色谱树脂、阴离子交换树脂和疏水相互作用色谱(HIC)树脂。
在具体的实施方案中，本发明还提供一种用于从细胞培养物中纯化重组人半乳糖脑苷脂(rhGALC)的方法，其中将所述细胞培养物的包含rhGALC的级分在树脂上进行色谱法，所述方法包括：
a)提供所述细胞培养物的包含rhGALC的级分；
b)将所述细胞培养物的级分装载到包含静电配体的第一多峰色谱树脂上；
c)将rhGALC从第一多峰色谱树脂上洗脱到包含至少30％的丙二醇和/或乙二醇(V/V)的第一洗脱缓冲液中；d)将所述第一洗脱液装载到含阴离子和疏水配体的第二多峰色谱树脂上；
e)将rhGALC从第二多峰色谱树脂上洗脱到pH低于5.5、包含至少30％的丙二醇和/或乙二醇(体积/体积)第二洗脱缓冲液中；
f)将所述第二洗脱液装载到有疏水性配体的第三多峰色谱树脂上；和
g)将rhGALC从所述第三多峰色谱树脂上洗脱到水性缓冲液中，藉此得到第三洗脱液。
本发明的另一个方面涉及包含rhGALC的组合物。该组合合物可通过本发明的纯化方法得到。
本发明的又一个方面是提供用作药物的本发明组合物。
本发明的又一个方面是提供用于治疗球形细胞脑白质营养不良(Krabbe氏病)的本发明组合物。
在本发明的又一个方面，本发明涉及治疗球形细胞脑白质营养不良(克拉伯病)和/或减少或减轻与球形细胞脑白质营养不良(克拉伯病)相关的症状的方法，所述方法包括将包含本发明的纯化rhGALC的组合物给予有需要的受试者的步骤。
附图说明
图1
图1示出所述纯化rhGALC的方法的概要。将20升生物反应器的收获物通过三个试验规模的色谱周期进行纯化。将Ether产物汇集，所述方法继续一个周期得到终产物TG1106。
图2
图2示出了三个色谱周期以及UFDF和过滤周期中每个步骤的产率(％活性)。右边显示从澄清收获物到终产物的总收率。活性通过至少两次稀释一式两份进行测定，除了Ether步骤的产物在一次实验中测定。
图3
图3示出从澄清的收获物到终产物的总剩余活性的的概况。活性测量同图2。
图4
图4显示终产物TG1106和内部标准StG02、StG03的Western blot分析。GALC用针对StG02产生的的兔多克隆抗体进行检测。
图5
图5示出Ether产物、UFDF产物和终产物TG1106以及内部标准StG0的Western blot分析3。GALC用针对StG02产生的兔多克隆抗体进行检测。
图6
图6示出TG11063-10和内部标准StG03在pH 3-10凝胶上的等电点聚焦。
图7
图7示出终产物TG1106和下游处理样品的胶体蓝染色的SDS-PAGE。
图8和9
图8和9示出各种浓度的终产物TG1106和StG03的胶体蓝染色的SDS-PAGE。
图10
图10示出终产物TG1106和内部标准StG03的胶体蓝染色的Native PAGE(4-16％Bis-Tris，G250电荷转移，PH7.0)。
下面更加详细地说明本发明。
具体实施方式
方法
本发明的一个方面涉及到一种用于从细胞培养物中纯化重组人半乳糖脑苷脂-β-半乳糖苷酶(rhGALC)的方法，其中将所述细胞培养物的包含rhGALC的级分在树脂上进行色谱法，所述方法包括：
a)捕获步骤：其中所述rhGALC在第一多峰色谱树脂上纯化，任选地随后通过离子分离进行病毒灭活和/或纯化
b)中度纯化步骤：其中所述rhGALC在第二多峰色谱树脂上纯化，任选地随后通过离子分离进行病毒灭活和/或纯化。
c)精制步骤：其中所述rhGALC在色谱树脂上纯化，所述树脂选自多峰色谱树脂、阴离子交换树脂和疏水相互作用色谱(HIC)树脂。
根据本发明的一些实施方案中，所述中度纯化步骤包括在所述第二多峰色谱树脂上纯化所述rhGALC，随后在选自以下的色谱树脂上纯化所述rhGALC：
ⅰ)不同于所述第一和第二多峰色谱树脂的多峰色谱树脂；和
ⅱ)疏水相互作用色谱(HIC)树脂。
根据本发明的其他实施方案，所述第一和第二多峰色谱树脂是不同的树脂。
特别地，所述第一多峰色谱树脂可以包括静电配体。
根据本发明的其它实施方案，所述第二多峰色谱树脂包括阴离子和疏水配体。
在另一些实施方案中，所述精制步骤中的色谱树脂是具有疏水性配体的树脂。
所述第一多峰色谱树脂可特别包含式如下所述的(VI)的配体化合物。
所述第二多峰色谱树脂可特别包含如下所述的式(VIII)的配体化合物。
根据其他实施方案，所述第一多峰色谱树脂特别包含如下所述的式(VI)化合物作为配体。并且所述第二多峰色谱树脂特别包含如下所述的式(VIII)化合物作为配体。根据这些实施方案，优选的是所述rhGALC随后在树脂上纯化，所述树脂为醚树脂。合适的醚树脂的实例在下面给出。
根据本发明的一些实施方案中，将所述rhGALC从所述第一多峰色谱树脂上洗脱到包含至少30％的丙二醇和/或乙二醇(V/V)的第一洗脱缓冲液中；
在本发明的其它实施方案中，将所述rhGALC从所述第二多峰色谱树脂上洗脱到pH低于5.5、包含至少30％的丙二醇和/或乙二醇(v/v)的第二洗脱缓冲液中。
根据本发明，所述纯化重组人半乳糖脑苷脂(rhGALC)的方法可特别地包括：
a)提供所述细胞培养物的包含rhGALC的级分；
b)将所述细胞培养物的级分装载到包含精典配体的第一多峰色谱树脂上；
c)将rhGALC从所述第一多峰树脂上洗脱到包含至少30％的丙二醇和/或乙二醇(V/V)的第一洗脱缓冲液中，藉此得到第一洗脱液；
d)将所述第一洗脱液装载到所述包含阴离子和疏水配体的第二多峰色谱树脂上；
e)将rhGALC从所述第二多峰树脂上洗脱到pH低于5.5、包含至少30％的丙二醇和/或乙二醇(体积/体积)的第二洗脱缓冲液中，藉此得到第二洗脱液；
f)将所述第二洗脱液装载到具有疏水性配体的第二多峰色谱树脂上；和
g)将rhGALC从所述第三多峰色谱树脂上洗脱到水性缓冲液中，藉此得到第三洗脱液。
人半乳糖脑苷脂-β-半乳糖苷酶(rhGALC)有几个同义词存在。最常用的是半乳糖脑苷脂酶，半乳糖(基)神经酰胺酶，人半乳糖脑苷脂酶，半乳糖神经酰胺β-半乳糖苷酶(EC3.2.1.46)。蛋白质登录号是NP_000144.2和P45803。应理解本发明的rhGALC可包含标签。
根据本发明的实施方案，术语人半乳糖脑苷脂-β-半乳糖苷酶还包括功能相同的区域或全长氨基酸序列的类似物。
了解rhGALC的某些特性，对建立纯化rhGALC或功能相同的区域或全长氨基酸序列的类似物的方法很重要。
-大约80kDa的；
-5(或6)个糖基化位点；
-存在异构体；
-PI theoterical5.9，发现6.3；
-pH敏感；首选pH6.0-6.6
-疏水性强；
-需要清洁剂保持活性；
-二聚体，三聚体，四聚物形成。
在如本文所述本发明的实施方案中，所述rhGALC或其功能等效部分或类似物包括选自以下的氨基酸序列：
ⅰ)SEQ ID NO：2的氨基酸序列；
ⅱ)与i)中定义的氨基酸序列的功能相同的部分；和
ⅲ)与i)或ii)中定义的氨基酸序列的功能相同的类似物，所述类似物的序列与i)或ii)中定义的氨基酸序列至少75％相同。
在本发明的上下文中，术语“功能相同”意味着rhGALC的所述部分或类似物能够水解半乳糖基鞘氨醇、乳糖酶基鞘氨醇、单半乳糖酰甘油二酯和显色底物(HNG)2-十六酰胺-:4-硝基苯-Β-D-吡喃半乳糖苷(HNG)的半乳糖酯键。在具体的实施方案中，rhGALC的所述部分或类似物保留至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％或至少95％的天然酶(具有氨基酸序列如SEQ ID NO：2)水解所述化合物的半乳糖酯键的活力。
所述rhGALC的部分或类似物的催化活性可通过测量在pH4.5下2-十六酰胺-:4-硝基苯-Β-D-吡喃半乳糖苷(HNG)到2-十六酰胺-4-硝基苯酚(HN)的水解来确定。在pH10.5，HN是一种黄色产物，可以用分光光度法在410nm测定。这种测量的说明性实例在本申请的实施例12中提供。
在具体的实施方案中，iii)中的类似物与i)或ii)中的序列至少80％相同，例如与i)或ii)中的序列至少85％，至少90％，至少95％，至少98％，至少99％，或例如至少99.5％相同。
此外，所述rhGALC或所述功能等效部分或其类似物可通过使用包括选自以下的序列的核酸序列的重组表达获得：
ⅰ)中所列SEQ ID NO：1的核酸序列；
ⅱ)与i)中定义至少75％相同的核酸序列
可进一步优选的是，ii)的核酸序列与i)中定义的序列至少80％相同，如与i)中定义的序列至少85％、至少90％、至少95％、至少98％至少99％，或者例如至少99.5％相同。
术语“序列同一性”表示等长或不等长的两个氨基酸序列、两个核酸序列之间同源性程度的定量测量。如果要比较的两个序列长度不同，它们必须比对以得到最佳拟合，可插入间隙，或者在多肽序列或核苷酸序列的端部截断。该序列的同一性可以用计算，其中Ndif是两个序列比对时不同残基的总数，并且其中Nref是序列之一的残基数。因此，序列AGTCAGTC与序列AATCAATC的序列相似为75％(Ndif＝2和Nref＝8)。间隙算作具体残基不一致。序列AGTGTC与序列AGTCAGTC的序列序列同一性为75％(Ndif＝2和Nref＝8)。
预先树脂步骤
提供未纯化rhGALC的细胞培养物可来自不同来源。在一个实施方案中，所述细胞培养物来自rhGALC的生物反应器。
这是有利的：修改所述细胞培养物的级分然后应用到所述第一色谱树脂上。因此，在一个实施案中，级分的PH调至低于7，然后装载到所述第一色谱树脂，比如在3-7、4-7、5-7、6-7、3-6、3-5或3-4范围内。这也是有利的：过滤(如深度，死端或切向流过滤器)或离心细胞培养物除去细胞，然后装载。因此，在另一个实施方案中，所述细胞培养物的级分是过滤的级分。在又一个实施方案中，所述的细胞培养物包括rhGALC的级分是澄清的未稀释的产物。
第一树脂步骤/捕获步骤
第一树脂稳定所述酶，并移除媒介物的颜色。不同类型的方法可适用于所述第一多峰色谱树脂。因此，在一个实施方案中，所述第一多峰色谱树脂至少通过疏水和静电相互作用结合。另一个实施方案中，所述第一多峰色谱树脂至少通过芳烃和静电相互作用结合。
所述第一多峰色谱树脂包含以下式(I)、(Ⅱ)、(Ⅲ)、(Ⅴ)、(Ⅵ)或(Ⅶ)的化合物作为配体。
在又一个实施方案中，第一多峰色谱树脂包含以下式：(I)、(Ⅱ)或(Ⅲ)的配体化合物。
特别地，所述第一多峰色谱树脂包含以下式：(I)、(Ⅱ)、(Ⅲ)、(Ⅴ)、(Ⅵ)或(Ⅶ)的配体化合物。
其中式(II)和(III)物质的R是(IV)的功能基团：
在另一个实施方案中，所述第一色谱树脂包括式IV，式V，式VI或式VII的配体。更具体的树脂也可作为第一树脂。因此，在又一个实施方案中，所述第一树脂选自:CaptoTMMMC”,“CaptoTM Blue”(CaptoTM Blue(high sub)and CaptoTM Blue(low)),CaptoTM Adhere和“Blue sepharoseTM fast flow”；这些树脂购自GE Healthcare。
Capto MMC是一种多峰阳离子交换剂。其包含了一个羧酸基团，因此在性质上与弱阳离子交换剂有部分相似。然而，除离子相互作用以外，还存在数种其他类型的相互作用，包括氢键和疏水相互作用。CaptoTM Blue势通过芳香和静电相互作用结合的亲和生物处理介质。Capto adhere配体，N-甲基-N-苄基乙醇胺，表现出许多相互作用的功能。最明显的是离子相互作用，氢键和疏水相互作用。
在其他实施方案中，所述第一树脂选自Pall公司的MEP HyperCelTM Mixed-ModeChromatography Sorbent。MEP HyperCel sorbent通过混合模式或多模式机制工作，所述机制也被描述为疏水电荷诱导色谱(HCIC)。HCIC基于可电离的双模配体的pH值依赖性。
在具体的实施方案中，所述第一树脂具有式(VI)的配体。“CaptoTM Blue”(CaptoTM Blue(high sub)是这种树脂的一个实例。
当然，应理解本发明的方法还可包括一些技术人员已知的标准步骤。因此，在一个实施方式中，上样前对所述第一色谱树脂进行预处理。在另一实施方案,步骤b)之后，将所述第一色谱树脂在洗涤缓冲液中洗涤。在另一实施方案中，所述第一色谱树脂在包含以下的洗涤缓冲液中洗涤：最多20％的丙二醇和/或乙二醇(v/v)，例如最多15％、例如最多10％、例如最多5％、例如5-20％、例如5-15％或例如约10％的丙二醇和/或乙二醇。在一个实施方案中，所述洗涤缓冲液含最多20％的丙二醇。在另一个实施方案中，所述洗涤缓冲液含最多20％的乙二醇。因为rhGALC的疏水性强，所以丙二醇和/或乙二醇是优选的洗脱液。
所述第一洗脱缓冲液可以有不同的成分。在一个实施方案中，其中所述第一树脂是“CaptoTM Blue”，所述第一洗脱缓冲液包含总浓度40-60％的丙二醇和/或乙二醇(v/v)，如45-60％，例如50-60％，例如40-55％，如40-50％，或者如50％左右。高浓度的丙二醇和/或乙二醇(v/v)对所述酶的适当洗脱是重要的。
洗脱后，缓冲液条件可以改变。因此，在一个实施方案中，在步骤c)之后和在步骤d)之前，所述第一洗脱液的丙二醇和/或乙二醇的总浓度降低到30％以下，如低于20％，如低于15％，或者如低于10％。通过降低丙二醇和/或乙二醇的浓度，rhGALC的酶的稳定性得以保持。在另一实施方案中，在步骤c之后将第一洗脱液的pH范围调节到5-6.5，如5.5-6.5，如5.7-6.3或约6.1。由于rhGALC的pH敏感性，优选6.0-6.6范围内的pH。在又一个实施方案中，在步骤c)之后将第一洗脱液中的洗涤剂水平调整到0.01％至5％，例如0.5％至5％，例如0.5至4％，例如0.5％至3％，如0.5％至2％，例如0.5至1.5％。在另一个实施方案中，所述洗涤剂是吐温洗涤剂，例如tween 20,tween 40,tween 60或tween 80。吐温也被称为聚山梨酯。所述洗涤剂优选地被批准用于人，所以所述洗涤剂也可为例如Cremophor(聚氧乙烯醚35蓖麻油)和Pluronic F-127。
在另一实施方案中，所述第一洗脱液在例如室温下在所述洗涤剂中保存5小时至48小时，例如10小时至3小时，或例如16至24小时。通过将第一洗脱物保存更长的时间，此步骤可用作病毒灭活步骤，尤其是当洗涤剂的浓度高(如1％)时。
在装载到所述第二色谱树脂之前，可对所述第一洗脱液进行预处理。因此，在一个实施方案中，在步骤d)之前，所述第一洗脱液与预处理缓冲液混合用于所述第二色谱树脂。在又一个实施方案中，将所述第一洗脱物直接加入预处理缓冲液中得到混合物用于所述第二色谱树脂。
第二树脂步骤/中度纯化步骤
不同类型的方法可适用于所述第二多峰色谱树脂。因此，在一个实施方案中，所述第二色谱树脂通过离子相互作用，氢键和疏水相互作用结合。在另一个实施方案中，所述第二色谱树脂包括N-苄基-N-甲基乙醇胺作为配体。在进一步的实施方案中，所述第二色谱树脂包括下式的配体：
或下式的配体:
在一个更具体的实施方案中，所述第二色谱树脂选自Biorad公司的CaptoTM Adhere、CHTCeramic Hydroxyapatite Type I(CHT I)和Pall公司MEP HyperCelTM Mixed-ModeChromatography Sorbent。CaptoTM Adhere是一种具有多峰功能的强阴离子交换生物处理介质，它通过离子相互作用、氢键和疏水相互作用结合。Ceramic Hydroxyapatite Type与生物分子通过多种模式相互作用：当带负电荷的磷酸基团与蛋白质的氨基发生相互作用时发生阳离子交换。强配位络合物可在生物分子上的羧基簇，磷酸基团或两者与CHT陶瓷羟基磷灰石的钙位点之间通过金属亲和机制形成。MEP HyperCel吸附剂通过混合模式或多模式机制工作，所述机制也被描述为疏水电荷诱导色谱(HCIC)。HCIC基于可电离的双模配体的pH依赖性。
在具体实施方案中，所述第二树脂包含式(VIII)的配体。CaptoTM Adhere是这种树脂的一个实例。
当然，可以理解的是，本发明的方法还包括一些本领域技术人员已知的标准步骤。因此，在一个实施方案中，对第二色谱树脂进行预处理再装载。在另一个实施方案中，步骤d)之后，将所述第二色谱树脂洗涤缓冲液洗涤。在进一步的实施方案中，步骤d)之后，洗涤所述第二色谱树脂的的洗涤缓冲液的pH范围是3-5，如4-5或如4.5-5。在又一个实施方案中，洗涤缓冲液还包含醇，例如异丙醇。
所述第二色谱树脂可用不同的洗脱缓冲液。在一个实施方案中，其中第二色谱树脂是CaptoTM Adhere，所述第二洗脱缓冲液包含30-50％的丙二醇(v/v)，例如30-45％，例如30-40％，例如35-50％，例如40-50％，或例如40％左右。如前面提到的，由于rhGALC的疏水性极强，所以丙二醇和/或乙二醇是其优选的洗脱剂。再者rhGALC也是pH敏感的。因此，在一个实施方案中，第二洗脱缓冲液的pH低于6，例如低于5，例如在3-6，4-6，或4-5的范围内。在另一实施方案中，步骤f)之前，所述第二洗脱液与预处理缓冲液混合用于第三色谱树脂。
可能的两步中度纯化过程
在根据本发明的一些实施方案中，所述中度纯化步骤按照以下两步法进行：
中度纯化步骤a)
该两步法中的中度纯化步骤a)，基本如上述进行；即使用与定义第二树脂的步骤/中度纯化步骤有关的多峰树脂和缓冲液。
中度纯化步骤b)
不同类型的方法可适用于中度纯化步骤b)，包括多峰树脂，疏水性树脂和包含具有醚基团的配体的色谱树脂。
在一个更具体的实施方案中，中度纯化步骤b)中使用的色谱树脂选自：购自TosohBioscience公司的“PPG-600M”和“Toyopearl Phenyl-650M”，购自Biorad公司的“CaptoTM Blue”(CaptoTM Blue(high sub)and CaptoTM Blue(low)),“CaptoTM Butyl”,Butyl-S Sepharose 6(在结合和洗脱模式或在流通模式下工作)和Macro-Prep Methyl HIC(在结合和洗脱模式或在流通模式下工作)。
Toyopearl Phenyl-650M是一种疏水相互作用色谱(HIC)介质。CaptoTM Blue是结合通过芳族和静电相互作用的亲和生物过程的介质。“CaptoTM Butyl”和Butyl-S Sepharose 6是疏水相互作用色谱(HIC)的介质。Macro-Prep methyl HIC支持以基于疏水性和电荷的相互作用的机制工作。甲基基团是轻度疏水性。根据上样和洗脱缓冲液的pH值，利用羧基离子排斥靶分子，而疏水基团可以保留污染物。
本领域技术人员会知晓，不同的洗脱缓冲液可以用于所述第二色谱树脂。
第三步树脂步骤/精制步骤
不同类型的方法可适用于所述第三色谱树脂。因此，在一个实施方案中，所述第三色谱树脂包括含醚基团的配体。在另一个实施方案中，所述第三树脂是疏水性的。在又一个实施方案中，所述第三色谱树脂包含[树脂]-(OCH2CH2)nOH作为配体，其中n是整数，范围为1-20，如1-10，如1-5，如1-3的或如1-2。
在一个更具体的实施方案中，所述第三色谱树脂选自醚树脂，包括Toyopearl Ether树脂，如购自Tosoh Bioscience公司的650M,650S 5PW,“PPG-600M”和Toyopearl GigaCap Q-650，购自Biorad公司的CHT陶瓷羟磷灰石I型(CHT I)，购自GE Healthcare的Q Sepharose FastFlow(Q FF)，购自Pall公司的MEP HyperCelTM Mixed-Mode Chromatography Sorbent，购自BioRad的Macro-Prep Methyl HIC(在结合和洗脱模式或在流通模式下工作)，购自GEHealthcare的BioRad的Butyl-S Sepharose 6(在结合和洗脱模式或在流通模式下工作)和CaptoDEAE。
羟基磷灰石陶瓷通过多种模式与生物分子相互作用：带负电荷的磷酸基团与蛋白质的氨基相互作用时发生阳离子交换。更强的配位络合物可在生物分子的羧基簇，磷基团，或两者与CHT陶瓷羟基磷灰石的钙位点通过金属亲和机制形成。
Q Sepharose Fast Flow是离子交换(IEX)色谱介质(树脂)。MEP HyperCel吸附剂通过混合模式或多模式机制工作，也被描述为疏水电荷诱导色谱(HCIC)。HCIC是基于可电离的双模配体的pH依赖性。Toyopearl GigaCap C-650的介质是一种高容量，高分辨率的阴离子交换树脂，Macro-Prep methyl HIC基质以基于疏水性和电荷相互作用的机制工作。Butyl-SSepharose 6是疏水相互作用色谱(HIC)的介质。
在具体的实施方案中，所述第三色谱树脂是醚树脂，例如选自Toyopearl Ether树脂，包括650M，650S和5PW，的醚树脂。这种类型的树脂的一个优点是它不需要丙烯/乙二醇作为洗脱剂，而是可使用水性洗脱剂。
当然，应根据本发明的方法还可包括一些本领域技术人员已知的标准步骤。因此，在一个实施方案中，预处理所述第三色谱树脂然后加载。因此，在一个实施方案中，预处理的缓冲液包括1-2M NH4Ac和1-2M NH4Cl。在另一个实施方案中，步骤f)之后，用洗涤缓冲液洗涤所述第三色谱树脂。在又一个实施方案中，步骤f)之后，用PH范围4-5，4.5-5，5.5-7或6.5左右的洗涤缓冲液洗涤所述第三色谱树脂。pH敏感性是rhGALC的一个优点。
不同的洗涤缓冲液可用于所述第三树脂。在一个实施方案中，步骤f)后，洗涤所述第一色谱树脂的洗涤缓冲液包含至少1M，至少2M或至少3M，或1-4M的NH4A。在又一个实施方案中，所述第一洗涤缓冲液包含至少1M，至少2M或至少M或1-3M的NH4A和至少0.1％的洗涤剂，如0.1-2％的洗涤剂。
在一个实施方案中，所述第二洗涤缓冲剂中盐和洗涤液的浓度比所述第一洗涤缓冲液中低。在又一个实施方案中，所述第三洗涤缓冲液中盐的浓度比所述第二洗涤缓冲液中低。在又一实施方案中，所述洗脱缓冲液是磷酸钠缓冲液。
对于适合例如人体输注的纯化的rhGALC，洗涤剂的浓度应该是低的。因此，在一个实施方案中，所述第三洗脱缓冲液包含低于1％的洗涤剂，例如低于0.01％，例如低于0.001％，例如低于0.001％的洗涤剂。在又一个实施方案中，所述洗涤剂是吐温洗涤剂，如tween 80或tween 20。在另一个实施方案中，所述第三洗脱缓冲液的pH范围为5-7，例如6-7，或如6.2-6.8。
为了改进洗脱步骤，洗脱缓冲液可包括盐。因此，在另一个实施方案中，第三洗脱缓冲液包含至少100mM的盐，如NaCl和/或KCl。可以不使用NaCl和KCl，但产物的纯度会差些。
在又一个实施方案中，调整终产物使其包含至少150mM甘露醇，例如至少200mM甘露醇，如至少250，或如200-400mM毫甘露醇。甘露醇的存在使得产物可以被冻干。
后树脂步骤
为了进一步减少病毒和其他不需要的细胞杂质，可进行进一步纯化。因此，在一个实施方案中，在步骤g)之后，使所述第三洗脱液通过用最大0.1μm滤径的过滤器。在进一步的实施方案中，在步骤g)之后，使所述第三洗脱液通过尺寸至多20nm，例如最多15nm的尺寸排阻过滤器，例如Planova15N过滤器。
在又一个实施方案中，所述第三洗脱液进一步通过用切向流过滤(TFF)的超滤/渗滤步骤，所述TFF使用切割分子量(MWCO)是低于50kDa的，例如低于30kDa，如低于15kDa或如低于10kDa的膜。在进一步的实施方案中，所述膜是聚醚砜膜，如用Pellicon聚醚砜膜。在又一个实施方案中，所述膜为再生纤维素膜。
其他步骤
为进一步提高本发明产物质量，可将其进行离子分离。任选地，所述离子分离可以用于捕获步骤和中度纯化步骤之间，中度纯化步骤和精制步骤之间或用于来自精制步骤的洗脱液。
当在捕获步骤和中度纯化步骤之间或精制步骤之后进行离子分离时，可以用阴离子过滤器或树脂，例如用购自Pall公司的膜。膜是强阴离子交换剂，可以有效地结合质粒DNA，带负电荷的蛋白质和病毒颗粒。
当在中度纯化步骤和精制步骤之间或精制步骤之后进行离子分离时，可以用强阴离子交换(AIEX)树脂，如Capto Q,Giga Cap Q,QFF。根据这样的实施方案中，所述树脂可用结合模式使用。也可以包括弱阴离子交换树脂，如Capto DEAE和DEAE FF，尤其是当精制步骤使用疏水性相互作用(HIC)色谱时。
在其他实施方案中，可在精制步骤后立即使用离子分离，例如在从所述醚树脂洗脱后立即使用。
在替代实施方案中，离子分离可以在超滤/渗滤(UFDF)步骤之后进行。
多种不同的缓冲液可用于所述离子分离过程。在具体实施方案中，当在醚树脂上的精制步骤之后立即在例如Mustang Q膜上进行离子分离时，可用以下平衡阴离子过滤器或树脂：3.7mM磷酸钠，5mM甘氨酸，10mM甘露糖醇，0.075M NaCl，0.0005％tween 80，pH值6.2。该产物可以用以下进行稀释1:1(v:v)：3.7mM磷酸钠，5mM甘氨酸，10mM甘露糖醇，0.0005％tween 80，pH 6.2，任选加入0.15M NaCl，然后通过阴离子过滤器或树脂。
在替代实施方案中，UFDF步骤之后在例如Mustang Q膜上进行离子分离，平衡阴离子过滤器或树脂用的溶液：磷酸3.7mM磷酸钠，0.2M的NaCl，5mM的甘氨酸，10mM的甘露糖醇，0.0005％吐温80，pH值6.2。在产物通过阴离子过滤器或树脂运行它之前，可以用1MNaCl的稀释质其平衡电导率是20mS/cm(约1体积的产物：0.2体积1M NaCl)。
根据这些实施方案，在无菌过滤之前，该产物可以用制剂缓冲液如不含NaCl的制剂缓冲液稀释，使电导率降至15mS/cm(0.15M NaCl)。
组合物
根据本发明纯化的rhGALC的纯度，酶活性，和产物的性质与其它纯化的rhGALC不同，例如由纯度，特定酶活性，和产物的加工。因此，在一个方面，本发明涉及包含rhGALC的组合物。
尤其是通过根据本发明的纯化方法获得的rhGALC。
其它的纯化产物可包括处理rhGALC的产物。在一个实施方案中，组合物中全长rhGALC(80kDa的)和主处理品(50+30kDa的)摩尔比的至少为50：2.5，例如至少50：1，例如至少100：1，如至少200：1，或如500：1。在另一个实施方案中，组合物中全长rhGALC(80kDa的)和主处理品(50+30kDa的)摩尔比的至少为50：2.5，如至少100：1，如至少200：1，如500：1。经处理的30和50kDa的rhGALC形式可见为小带并估计<0.5％(参见实施方案部分和图5)。
在进一步的实施方案中，本发明的组合物包含很少的宿主细胞蛋白质。本领域技术人员知道测定宿主细胞蛋白和其他污染物的含量的合适方法。具体地，用ELISA来测定宿主细胞蛋白质的水平。通常，500ng/mg以下的宿主细胞蛋白质的含量是符合要求的。在本发明的一些实施方案中，宿主细胞蛋白质的含量为450ng/mg以下，例如300ng/mg以下，或如250ng/mg以下。在又一个实施方案中，组合物中宿主细胞蛋白质的量低于200ng/mg，如低于100ng/mg rhGALC，如低于40ng/mg rhGALC或如低于30ng/mg克rhGALC。部分实施案中，通过ELISA测定的杂质量为：每毫克rhGALC含约30纳克的HCP。
本发明的一些实施方案中，宿主细胞蛋白质的含量为20ng/mg以下。
在又一个实施方案中，在组合物中的酶活性为至少15kU/mL或如至少30kU/mL。从实施例部分可以看出，终产物的酶活性估计为42.5kU/mL。根据本发明的组合物有一个特性，单体(80kDa)rhGALC的含量很高，聚集体(rhGALC二聚体和多聚体)的含量很低。优选地，聚集物的量低于最低检测标准，例如通过目测。根据本发明的组合物将显得澄清，不混浊。
可替代地，可以通过测在580nm(T580)的透射率进行测定聚集体的形式和水平。使用这种方法的透射率>95％，如>96％，>96.5％，>97％，>98％或>99％，表明聚集体的水平令人满意。另一种常用的方法是SEC(尺寸排阻色谱法)。
本领域技术人员知道其他测量/评估蛋白质聚集体的水平的适合方法，包括动态光散射和subvisual颗粒方法(subvisual颗粒计数)。
在一个优选的实施方案中，根据本发明，所述组合物中聚集体形式的rhGALC少于1.5％(w/w)，例如少于1％(w/w)，例如少于0.5％(w/w)，少于0.25％(w/w)，少于0.2％(w/w)，少于0.1％(w/w)，少于0.05％(w/w)或少于0.01％(w/w)。单体(80kDa)rhGALC s的含量为至少95％(w/w)，如至少96％(w/w)，或至少97％(w/w)，例如至少98％(w/w)，优选至少98.5％(w/w)，至少99.5％(W/W)，或99％(w/w)。
根据本发明的组合物可用作药物。因此，一个方面，本发明涉及其组合物的药物应用。在又一个方面，本发明涉及其组合物用于治疗球形细胞脑白质营养不良(克拉伯病)。
在进一步的方面，本发明涉及其组合物在生产用于治疗球形细胞脑白质营养不良(克拉伯病)的药物中的用途。
在又一个进一步的方面，本发明涉及治疗球形细胞脑白质营养不良(克拉伯病)的方法和/或减少或减轻球形细胞脑白质营养不良(克拉伯病)相关的症状的方法，所述方法包括将包含纯化的rhGALC的组合物给予有需要的受试者。
序列
SEQ ID NO.:1
SEQ ID NO.:2
应当指出的是，本发明的一个方面的实施方案和上下文中描述的特征在也适用于本发明的其他方面。
本发明中引用的所有专利和非专利参考文献，通过引用整体并入本文。
在以下非限制性实施案中，进一步说明本发明的细节。
实施例
通过重组人半乳糖脑苷脂-β-半乳糖苷酶(rhGALC)纯化的下游工序(DSP)，生产出质量和纯度满足动物研究需要蛋白，并中试规模进行测试。该过程包括三个色谱步骤和一个UFDF制备步骤。在这项研究中，用20补料分批生物反应器，通过优化的方法，中试规模生产用于动物研究和人类疾病治的rhGALC，疗方法。方法总结见图1。
实施例1
设备，材料，缓冲剂和方法
设备
色谱系统：
·Biological Duo-Flow upgraded with a Maximizer 80(伯乐)。
蠕动泵：
·MasterFlex L/S model 77200-60(科尔，帕克仪器公司)
切向流过滤系统：
·Pellicon2微型过滤器支架和压力计(Millipore公司)和蠕动Watson
Marlow SciQ323的，管路与6毫米IO。
磁力搅拌器：
·MR3001K(德国Heidolph)
秤：
·EA35EDE-I，最大秤量值35kg(赛多利斯)
·BP1200最大秤量值1200g(赛多利斯)
柱：
·索引70/500(GE医疗)
LAF实验台：
·LaminarAir(霍尔滕)
Res树脂，过滤器和容器
收获过滤器：
·Pod C0HC 0.054m2(Millipore公司)
色谱树脂：
捕获步骤：
·CaptoTM Blue(high sub))(GE医疗)
中度纯化步骤：
·CaptoTM Adhere(GE医疗)
精制步骤：
·Toyopearl Ether-650M(东曹)
UFDF盒：
·Pellicon 2MINI 30K(30kDa MWCO,V-screen,0.1m2,cat.
P2B030V01，Millipore公司)
无菌过滤：
·0.22μm PES，直径75mm，(NALGENE cat.no 595-4520)
终产物容器：
·30mL无菌瓶(Nalgene)
·1.8mL低温无菌瓶(Nalgene)
缓冲液
缓冲液需要p.a.质量的化学品和Milli-Q质量的水。该缓冲液通过0.22μm
过滤并在室温下最多保存5天。各个步骤制剂配方见于表1-4。
CaptoTM Blue缓冲液：
a)调理：40mM Na2HPO4，pH6.1±0.1
b)平衡：20mM Na2HPO4，0.1％tween 80(t-80)(w:w)，5％甘油(IPA)(v:v)，pH值6.1±0.1
c)洗涤：100mM Na2HPO4，1.5M NaCl，10％的丙二醇(1,2-propaneidole)(v:v)，5％异丙醇(IPA)(v:v))，0.2％tween 80(t-80)(w:w)，pH 7.0±0.1
d)洗涤2：平衡缓冲液
e)洗脱缓冲液：20mM Na2HPO4，50％的丙二醇(v:v)，0.5％t-80，1M NaCl，pH值6.5±0.1
f)洗脱混合物：20mM Na2HPO4，0.15M NaCl，1.3％t-80，pH值6.1±0.1
表1:捕获步骤中1L缓冲液配置:Capto Blue(high sub)
CaptoTM Adhere缓冲液:
a)平衡缓冲液:20mM Na2HPO4,0.15M NaCl,0.05％t-80(w.w)),pH 6.1±0.1
b)洗涤缓冲液1:200mM Na2HPO4,1M NaCl,5％IPA(v:v),0.5％t-80(w:w),pH 4.7±0.1
c)洗涤缓冲液2:10mM NaAc,0.1％t-80(w:w),pH 4.7±0.1
d)洗涤缓冲液3:50％wash 2and 50％洗脱缓冲液。
e)洗脱缓冲液:10mM NaAc,300mM NaCl,0.1％t-80(w:w),5％IPA(v:v),40％丙二醇(v:v),pH 4.55±0.1
f)洗脱混合缓冲液1:140mM Na2HPO4,0.0005％t-80(w:w),pH 6.5±0.2
表2：中度纯化步骤中1L缓冲液配置:Capto Blue Adhere
Toyopearl Ether-650M缓冲液:
a)调节缓冲液:3.3M NH4Ac,2.6M NH4Cl,0.1％t-80(w:w),pH 6.1±0.1
b)平衡缓冲液:1.6M NH4Ac,1.2M NH4Cl,50mM Na2HPO4,0.0005％t-80(w:w),,pH6.4±0.1
c)洗涤缓冲液1:3.3M NH4Ac,2.3M NH4Cl,0.5％t-80(w:w),pH 6.5
d)洗涤缓冲液2:平衡缓冲液
e)洗涤缓冲液3:70％平衡缓冲液30％洗脱缓冲液
f)洗脱缓冲液:50mM Na2HPO4,140mM NaCl,0.0005％t-80(w:w),pH 6.4±0.1
表3:精制步骤中1L缓冲液配置:Toyopearl Ether-650M
UFDF缓冲液:
平衡和渗滤缓冲液:3.7mM Na2HPO4,150mM NaCl,5mM甘油,10mM甘露醇,0.0005％tween 80(w:w),pH 6.2±0.15.
表4:UFDF步骤1L缓冲液配置
-清洁用缓冲液:
-清洁缓冲液Capto Blue,Capto Adhere and UFDF:1M NaOH
-清洁缓冲液Toyopearl Ether:0.5M NaOH
-中和缓冲液(所有步骤):140mM Na2HPO4,pH 6.6±0.2
-保存缓冲液Blue,Adhere,Ether:20％ethanol保存缓冲液UFDF盒:0.1M NaOH
表5:1L清洗和储存缓冲液配置
处理分析
通过步骤65测量酶活性；HNG检测分析半乳糖脑苷脂(GALC)。内部rhGALC标准StG01用于标准曲线的绘制。
蛋白质浓度：蛋白质浓度通过步骤75测量；rhGALC的用Pierce 660nm Protein Assay测定蛋白质。内部标准的StG02稀释液作为标准曲线的。StG02的蛋白质浓度通过氨基酸分析(AAA)(氨基酸分析中心，乌普萨拉大学，瑞典)测定。测量A280的吸光度除以人类GALC的理论消光系数2.5计算蛋白浓度。
比活性通过酶活性除以rhGALC的蛋白质浓度计算。
同一性通过步骤70分析，Western Blot分析重组人半乳糖脑苷脂(rhGALC)。用蛋白质A琼脂糖凝胶纯化的抗内部标准StG02的多克隆抗体。用于检测。检测内部标准StG02。
等电聚焦(IEF)通过步骤74分析，在pH值3-10用NOVEX IEF凝胶电泳测rhGALC的等电点。终产物相比在内部rhGALC标准StG03作为统一性的附加措施。
纯度通过步骤69与染色胶体蓝染色的SDS-PAGE(4-12％的Bis-Tris的NuPAGE，MOPS缓冲液)进行分析。
杂质通过步骤43分析；用ELISA测定CHO宿主细胞蛋白质。
吐温浓度定量方法73用RP-HPLC法。
变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测rhGALC形成物的信息。根据制造商(Invitrogen)的说明书进行分析。
测定终产物TG1106的渗透压(VAPRO渗透压计)和pH值(万通)。
碳水化合物组成的测定主要是由指令25(标准稀释)通过过高效液相色谱，用荧光检测2-AA标记的单糖释放。
收获：
闭合的生物反应器，乙酸钠后，生物反应器中使收获pH值为5，以保持pH<7此PH值最适合于酶。将pH稳定的收获通过深度过滤器缓冲器从生物反应器中出，以除去细胞。过滤器过滤后用调理缓冲液冲洗。收获的最终混合调理缓冲液为约2：1(w:w)。
生产过程条件一般说明：
色谱步骤的用蠕动泵以最大流速100mL/min，相当于150cm/hr，进行平衡，上样和平衡洗涤都进行。其余部分的运行用Biological Duo-Flow system，将其Maximizer上至80，以最大流量80mL/min进行，相当于125cm/hr。流速可以，如果应用一个更合的色谱系统可以调整流速。然而，有丙二醇(PG)的缓冲液应与所指示的流速下运行。
所有色谱步骤都以结合模式运行，并包含几个洗涤步骤。高浓度的PG是用来从前两歩洗脱疏水rhGALC。为了保留的酶的活性，这些歩骤的产物需要收集到预填充的容器中。精制阶段的洗脱不需要使用有机溶剂。
为了保持rhGALC的酶活性，除Capto Blue的调理缓冲液外的所有缓冲液含有洗涤剂(tween 80)，嘉实介质包含普兰尼克，它取代吐温在Capto Blue作用。去掉吐温是为了在室温储存>6小时可有蛋白乳光。
Capto Blue
CaptoTM Blue i是通过结合芳香和静电相互租用吸附分子目标的介质。
调节后的收获物在澄清后24小时之内上样到Capto Blue柱。用20升生物反应器的CaptoBlue需要中试规模的(740mL)三个循环。该柱用平衡缓冲液和含有10％丙二醇(PG)和5％异丙醇(IPA)洗涤缓冲液洗涤。洗脱是在使用预填充在容器含有50％的PG的缓冲液中进行。收集到装满混合洗脱缓冲液的容器中的目的有三：
1)降低PG保持rhGALC的酶活性.
2)作为专用病毒灭活步骤。洗涤剂的最终浓度为1％，产物池在室温下储存>16小时。
3)为产物池在DSP,Capto Adhere进行下一步创照条件。
如上所述，收集Blue产物到洗脱混合缓冲液。最终吐温浓度为1％和储存入池16-24小时，在室温下进专用病毒灭进行活步骤。
Capto Adhere
CaptoTM Adhere是一种强符合模式强阴离子交换剂，它通过离子相互作用，氢键和疏水作用结合。
Capto Blue的产物上样到Capto Adhere柱，进行最多4天三个连续循环。在室温保持时间的开始18-20小时作为病毒灭活步骤。产物池变到5±3°则需要更长的时间作为剩余时间。产物被移回至室温8-15小时之前产物池运行累积到室温。该产物池在pH6.1上样。通过在高离子强度下洗涤和IPA后在低离子强度下洗涤，pH快速降快至4.7。洗脱在含有40％的PGpH4.55缓冲液中进行，通过预填充的容器增加pH值和降低的PG浓度来保持rhGALC的酶活性。
Toyopearl Ether
Toyopearl Ether-650M是一个甲基丙烯酸类聚合物(65μm颗粒尺寸)具有高的机械和化学稳定性。Tosoh系列疏水性相互作用配体中醚具有最高的疏水性，所以用它纯化高疏水性蛋白。
经Capto Adhere后的产物可以储存在室温下不超过24个小时，或5±3℃储存4天，产物被移回至室温8-15小时之前产物池运行累积到室温。
它与含有醋酸的高铵，氯化铵和吐温浓度的醚调节缓冲液(三个循环)以1：2.5(w:w)混合。用吐温浓度比开始条件低200x的缓冲液平衡醚柱。上样柱后用平衡缓冲液洗柱子。接下来的清洗步骤加入吐温和盐。其次用平衡缓冲液进行长时间洗涤使吐温浓度再次降低和用平衡和洗脱缓冲液混合洗涤以降低铵盐。用含有低吐温(0.0005％)和NaCl的磷酸钠缓冲液在pH 6.4进行洗脱。
Planova15N病毒过滤
在生产的精制阶段之后，通过Planova15N的纳米过滤清除病毒。
UFDF
在一轮用截留分子量(MWCO)是30kDa的Pellicon聚醚砜滤膜的切向流过滤(TFF)进行的超滤/渗滤(UFDF)中，合并三个精制产物池并制剂。进料通道是V型开放式通道其盒的面积为0.1m2。
设置泵的转速为230rpm，跨膜压力(TMP)为bar(0.6in/0.4out)。膜用制剂缓冲液平衡，通过稀释然后浓缩(超滤)和7倍渗滤(DF)，第一个体积的缓冲液进行交换。共交换八个体积的缓冲液。
过滤和灌装
用LAF实验台，无菌条件下,用0.22微米的PES过滤器过滤该UFDF产物(滞留物)。终产物填充到各种体积的无菌容器中(每个小瓶/瓶0.25-20mL)。终产物是TG1106，在-80±10°C冻存。
实施例2
结果总结
根据酶活，从20升生物反应器生产的澄清收获物到终产物总产率74％。19.5L澄清收获物总活性是2300万Units。终产物TG1106的总收率为1700万Units或1.0克纯rhGALC。
活性收率和条件
根据澄清收获物到终产物计算总收率(74％)的原因是：澄清过程仍然没有明确，而且它不是本研究的一部分。
在色谱步骤在三个周期中运行。在UFDF过程中，精制阶段的产物被合并和制剂。无菌过滤经过UFDF的产物，并进行分装。每一步和周期中，根据酶活力百分比计算的产率示于图2。澄清的收获物到终产物的总活性示于图3。
捕获阶段Capto Blue的平均产率是84±8.1％。
中间阶段Capto Adher平均产率是87±3.5％。
抛光阶段Toyopearl Capto Adhere Ether平均产率是76±0.6％*
该产量为UFDF阶段的产率是117％。
最终无菌过滤的产率是102％。
结果分析
用上述方法分析中间产物和终产物。下表总结了终产物TG1106的分析结果。
实施例3
确认-Western blot
通过免疫印迹分析是比别纯化产物人GALC。
通过SDS-PAGE分离精制产物、UFDF产物和终产物，并电转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用多克隆兔抗GALC抗体抗rhGALC内的StG02检测rhGALC。在蛋白A琼脂糖柱(GEHealthcare)上纯化抗体。此抗体用来检测80kDa、50kDa和30kDa的GALC。用预染蛋白质分子量标准被核实转染和估算分子量(MW)。
图4示出终产物中80kDa的rhGALC的印迹。此蛋白质样品没有检测到加工形式。分析其内部标准StG02和StG03作为参考。该标准已经通过氨基酸分析来分析所述标准，他们的发现它们的氨基酸组成与人类GALC的理论构成相关。图5中上过量的蛋白，除了80kDarhGALC 50和30kDa的加工形式的带很弱。一个分子量为160kDa的附加带，可能是还原条件下通过SDS未完全溶解的rhGALC二聚体。
实施例4
等电聚焦
终产物TG1106的等电点经计算是6.35。
根据pH 3-10时电荷的电(IEF)聚焦凝胶分离TG1106和StG03。100V在冰上电泳1小时，然后200V1小时，最后500V2小时。在图6所示，被染色的胶体蓝染胶。计算的等(pI)的是6.35，比GALC的理论等电点5.9高。TG1106和StG03之间没有差别。
实施例5
纯度-SDS-PAGE
终产物TG1106纯度估计>99％。加工rhGALC估计<0.5％。
该过程的样品中分离，，在NuPAGE 4-12％的Bis-Tris凝胶上，用MOPS缓冲液，通过电泳(SDS-PAGE)，主要是根据大小分离该过程的样品。胶体蓝染色使rhGALC和潜在的杂质显现。与银染相比，胶体蓝具有独立于蛋白质的类型的动态线性响应，也就是说，只要该蛋白质的浓度够大，优选其来估计纯度。rhGALC的表观分子量(MW)为80kDa的，而经处理的形式的表观分子量是50和30kDa。
图7示出了过程中样品的扫描。Capto Blue和Capto Adhere steps步骤之后显现杂质，而只有Ether步骤后出现rhGALC。通过Western印迹识别的160kDa的带，有可能是rhGALC的二聚体(也见图6)。
图8和图9比较终产物TG1106和内标准StG03估算纯度。没有带TG1106的高负荷，除了rhGALC，具有较高的亮度比最低StG03。最高浓度的TG1106，rhGALC二聚体的右下面有一奇怪的双带，见于两种凝胶。这有可能是伪影，因为下一个最高负荷/最多上样中没发现。由于最多上样的奇怪双带，所以在图10中从下一个最高负荷计算纯度；100％-0.8％(0.14μg克/16μg)＝99.2％的纯度。在过大的负荷rhGALC加工形式30和50kDa的可显现为低强度的带。没有这些条带具有更高的强度比80kDa带的最低标准含义的处理为<0.5％。
160kDa的带可能是一种假象。这可能是因为含高浓度rhGALC的样品缓冲液中的SDS不够用于形成rhGALC多聚(Native PAGE，7.2.5)单体(Native PAGE，7.2.5)。也可能因为TG1106二聚体上样16μg的带强度于与类似StG03上样0.36μg的80kDa的带类似，意思是终产物中此产物占2％。
实施例6
Native PAGE
Native PAGE显示rhGALC的形成主要是二聚体，但多聚体却存在高达10rhGALC分子。
中性pH值进行Native PAGE分析rhGALC形成物。如图10示rhGALC有形成物梯度。终产物TG1106与rhGALC内部标准StG03比较，图相似。最低带(表观分子量80-100kDa)是rhGALC单体和其次是rhGALC二聚体，随后有更多形式的rhGALC单体和/或二聚体。多达七种形式rhGALC的显现在凝胶上，其中rhGALC二聚体是最明显的。较早电子显微镜研究已经证实，几种形式存在中的主要形式的直径为约20nm，这与rhGALC二聚体对应。
实施例7
杂质-HCP ELISA
终产物TG1106中定量CHO细胞宿主细胞蛋白(HCP)残留物为30毫ng/mgrhGALC。
杂质定量通过分析中国仓鼠卵巢(CHO)宿主细胞蛋白(HCP)进行。在ELISA中使用抗体从Cygnus Technologies购买。通过细胞蛋白典型分泌(3G 0016-AF)和CHO细胞的胞内蛋白(C0016-PA)生成抗体。通过母CHO(DG44株)细胞10％溶解和90％分泌HCP制备该标准。
Ether和UFDF步骤后在终产物中测量HCP。分析该rhGALC内部标准StG02和弓形虫ASA作为参考。如表23中，此过程使终产物TG1106中HCP降至ng/mg rhGALC。醚产物和在终产物中残余HCP水平相似中，表明UFDF步骤没有去除HCP。
Ether和UFDF步骤后终产物TG1106的HCP水平。StG02，StG03和Tox ASA的参考。
实施例8
单糖组成
初步估计糖基化程度为7％，而每摩尔rhGALC含有2-3摩尔甘露糖-6-磷酸盐残基。
终产物TG1106只进行一次初步分析。rhGALC具有～7％的碳水化合物(w:w)。最有可能的高甘露糖型是糖基化。
初步的数据表明，每摩尔rhGALC含的各种单糖的摩尔数：
葡萄糖胺(GLCN)：9mol/mol
氨基半乳糖(GALN)0-0.3mol/mol
半乳糖(GAL)1mol/mol
甘露(MAN)12mol/mol
甘露糖-6-磷酸(M6P)2-3mol/mol
岩藻糖(FUC)0-0.5mol/mol
讨论
用优化的3歩色谱步骤生产的纯rhGALC产物，可以满足动物研究，甚至临床研究的质量要求。DNA有待分析。
用生物反应器B5：19，从澄清的收获物到终产物基于酶活性的收率为74％。GALC是疏水性很强的蛋白。产物的净化是唯一没有收益率的步骤。可以提高根据澄清和调节后的收获物计算的DSP收率。深度过滤丢失约20％活性。早先的研究表明，TFF可以提高澄清率。包括澄清的总收率，是58％。
GALC的理论等电点为5.9，而实际电点为6.3。这是令人惊讶是rhGALC含有酸M6P和唾液酸。之前的研究表明，rhGALC有高pH敏感性；长期储存稳定在其等电点；pH 6.0-6.6。从理论上讲，在DSP中应避免pH值围绕PI以避免沉淀，但对rhGALC DSP却是唯一的可能。产物的整个DSP过程没有乳光趋势。高PI一种解释是：吐温/rhGALC胶束形成物改变了暴露的氨基酸。为了保持酶活性，所有的DSP缓冲液都包含吐温(除了Blue条件，其中由聚醚取它)。保持稳定性的最小吐温浓度仍有待评估。
捕获和中度纯化步骤的洗脱都复杂。两种洗脱缓冲液都必须有丙二醇(PG)。此外，为最佳产量，需要仔细优化其它添加剂和缓冲液。缺点是高度疏水的污染物可能与rhGALC共产出。蛋白原，一个70kDa的疏水性蛋白，鉴定(用鞘脂激活蛋白A抗体进行western blot)70kDa的疏水性蛋白鞘脂激活蛋白原是捕获和中度纯化步骤后的污染物。高浓度的PG不能最佳保持rhGALC酶活性，因此在预填充的容器中收集。
其他逐步注释：
捕获步骤，CaptoTM Blue的目的是稳定酶和去除介质颜色。正确制备的洗脱缓冲液对产率很关键。它必须含有50％(v:v)的丙二醇，相当于521g/L的缓冲液。
中度纯化步骤，CaptoTM Adhere，除去大多数污染物。洗脱需要酸性条件。避免蛋白质沉淀的重要方法是通过用高离子强度的缓冲液，快速变为酸性条件。然后通过低离子强度将缓冲液变为酸性缓冲液，以便除去额外杂质，确保洗脱产物是酸性的，在低的离子强度条件下，通过收集到缓冲液PH6.5的预填充容器，以便PH能够快速回升至>6。
使用没有任何有机溶剂如PG和IPA的水性缓冲液，除去最后的疏水性HCP，ToyopearlEther阶段的产量很高。优点是，用含NaCl的磷酸盐缓冲液洗脱的产率是可接受的。缺点是需要高盐浓度以便rhGALC结合。需要大体积的调理缓冲液，这使得上样时间长。这一步很大程度上分离rhGALC和与rhGALC性质相似的污染物。污染物的强力去除需要重复的改变吐温和盐的浓度，这可以被描述为洗涤和漂洗循环。没有prosaposine可以在以太步骤之后被识别。Ether步骤后，没有鞘脂激活蛋白原。
两个专用病毒的灭活/去除步骤是生产规模的一部分。已经完成无病毒实验，看好产量和流量的步骤。洗涤剂灭活步骤与捕获步骤洗脱结合。高吐温浓度对结合到中度纯化柱和室温下放置24小时后的酶活性(如果结与在+5℃储存3天结合)没有负影响。Ether步骤之后，用Planova 15N进行病毒过滤步骤。在先前的研究中发现这是可行的，且其不需重复。初步规模估计接近80L产物可以在5小时通过1m2Planova 15N进行过滤。
V屏分子量为30kD过滤器UFDF，用于精制步骤之后的配制和浓缩。只是在需要大量的产物进行优化研究的中试规模(0.1m2)使用有开放的渠道V屏幕过滤器。根据先前的研究的三个UFDF步骤，微调实验条件。UFDF的缺点是吐温积累。用来洗涤和洗脱Ether步骤的产物缓冲液仅含0.0005％吐温。很难将Ether步骤产物的吐温含量量化，估计是～0.003％。该UFDF/制剂缓冲液含有0.0005％吐温。经过8体积缓冲液交换和～7倍浓缩，吐温浓度为0.025～％。该UFDF产物容易进行0.22μm过滤为终产物而无产物损失。
初步数据表明，优化吐温浓度和制剂缓冲液的其它成分，在5，-20，-80℃长期储存稳定的rhGALC。如果甘露醇增加至250mM，可以冻结干燥的产物。
胶体蓝染色的SDS-PAGE结果显示：纯度>99％终产物。估计小带的30和50kDa rhGALC含量<0.5％。最明显(～2％)只有高浓度rhGALC与SDS-PAGE样品缓冲液混合时，可视蛋白除了80kDa的rhGALC还有160kDa的rhGALC。Western blot分析证实，该蛋白质含有rhGALC，也许是还原条件下未被SDS充分溶解的二聚体。也许这个“二聚体”只是一个假象。变性PAGE，在中性pH，表明rhGALC有几形成物，从单体到～10分子rhGALC多聚体的形成。最常见的形成是二聚体。
结论和总结
CHO细胞表达的重组人GALC在，瑞典斯德哥尔摩皇家学院，用20升的生物反应器培养。
19.5L收获物纯化至1700万Units或1.0g纯rhGALC需要三个色谱步骤包括:Capto Blue,Capto Adhere和Toyopearl Ether，以结合模式运行。病毒灭活步骤包括：Capto Blue步骤后，在室温下用1％吐温80孵育16-24小时。产物通过切向流动过滤和无菌过滤形成终产物TG1106。
在通过深过滤和结合到捕获柱Capto Blue澄清前，在生物反应器加入醋酸钠稳定收获。该调节后的收获物上样730mL到Capto Blue柱，24小时之内进行三次循环。该产物用50％的丙二醇缓冲液洗脱后，用“三用”的缓冲液来减少丙二醇，增加吐温可作为专用病毒灭活步骤并为为下一个步骤创造条件。产物用酸性pH和丙二醇洗脱后，用低丙二醇和高pH值缓冲液保持活性。与含乙酸铵和氯化铵的缓冲液混合后，连续三次上样540mL到Toyopearl Ether柱。产物用含NaCl和低吐温浓度的磷酸盐缓冲液洗脱。本文不包括精制阶段后的病毒过滤步骤。通过UFDF精制产物汇集和浓缩后，用制剂缓冲液长期储存纯rhGALC。该UFDF产物经无菌过滤到终产物。终产物由一组分析方法进行分析。蛋白质浓度为2.5mg/mL和酶活性42.5kU/mL，计算出的比活性是16.9KU/mg。估计纯度为>99％。残留HCP 30ng/mgrhGALC。终产物是无色透明的。
总之，新的优化的DSP已成功地在试验规模生产出活性产物的产率是74％。终产物TG1106满足了动物研究的质量要求。
实施例9
使用离子分离的实例：
如下所述，离子分离测试结果令人满意。
1)Mustang Q(MQ)是一次性阴离膜子。结合当前过程通过流动模式(杂质如DNA和宿主细胞蛋白质结合到膜和GALC通过)进行测试。其在Ether步骤前或UFDF步骤(制剂步骤)后测试。其也可在Capto Blue步骤中线上测试。
a)当在Ether歩骤之后进行时：用3.7mM磷酸钠，5mM的甘氨酸，10mM的甘露糖醇，0.075M NaCl 0.0005％吐温80，pH 6.2进行平衡MQ。用3.7mM磷酸钠，5mM的甘氨酸，10mM的甘露糖醇，0.0005％tween 80，pH值6.2(或相同的缓冲液用0.15M NaCl)1:1(v:v)稀释产物。
b)当在UFDF步骤之后进行时：用3.7mM磷酸钠，0.2M NaCl，5mM的甘氨酸，10mM的甘露糖醇，0.0005％吐温80，pH 6.2平衡MQ。产物通过MQ前，用1M的NaCl稀释产物至电导率为20mS/cm(约1体积的产物：0.2体积的1M NaCl的)。无菌过滤之前，产物用不含NaCl的制剂缓冲液稀释至电导为15mS/cm(0.15M NaCl)。
流程概要：
澄清的收获物
Capto Blue
病毒灭活
Capto Adhere
Toyopearl Ether
选择a)Mustang Q
UFDF
选择b)Mustang Q
0.22μm过滤器
2)一种强阴离子交换(AIEX)树脂，如Capto Q,Giga Cap Q,Q FF，可以包括在绑定模式的下游工序中。它也可能包括一个弱阴离子交换树脂如Capto DEAE和DEAE FF，但发现剩余的杂质高一些。它可以在精制步骤之前或之后使用(疏水相互作用(HIC))。
方法1：
流程概要：
澄清的收获物
Capto Blue
病毒灭活
病毒灭活15％IPA和1％T80。注：IPA导致部分失活。
Capto Adhere
Macroprep Methyl
用0.4-0.6M(NH 4)2SO 4，5％甘油，0.1％吐温80(T80)，pH为6.5进行平衡(Eq)。Adhere步骤产物条件为i20mM NAPI，5％甘油，0.8-1.2(NH 4)2SO 4pH为6.5(1：1)和上样。
洗涤1：0.6M的NAPI，0.1％T80，pH值6.5。
洗涤2：0mM NaPi,15mM NaCl,0.1％T80。
Giga Cap Q
用40mM MES，15mM NaCl，5％甘油，0.1％的T80，pH值6.5平衡。加载甲基产物(未调节)并用eq缓冲液洗涤。
洗脱：40mM的MES，0.7M NaCl，5％甘油
方法2:
流程概要：
澄清的收获物
Capto Blue
病毒灭活
Capto Adhere
Giga Q
用40mM MES，15mM NaCl，0.1％的T80，pH值6.5平衡。用20mM NaPi,0.1％t80，pH值6.5调节Capto adhere至电导率为～7mS/cm。上样并用eq缓冲液洗涤。
实施例10
下面对峰树脂进行了测试，结果令人满意：
1)MMC捕获(非常早期的实验)
启动:产物PH调节至5.6–6.0w.400mM Na-Pi(酸性的).
平衡缓冲液:20mM Na-Pi pH 5.6–6.0+0.1M NaCl+0.05％Tween 80(t80)
洗涤缓冲液:0.95M Na-Ac pH 4.9+5％IPA
洗脱缓冲液:50mM Tris-HCl pH 9.0+1.0M NaCl+40％Prop Glycol+0.1％t80。
结果：采用斑点杂交方法分析酶的存在在起始级分中(+++)和在洗脱级分1中(++)检测到酶。在流过中没有检出酶。对级分进行SDS-PAGE电泳和HPLC分析。
2)Butyl-S as 2nd作为中度纯化步骤或精制步骤：
启动:Condition to 0.5-6M(NH4)2SO4.
平衡:20mM NaPi 0.5M(NH4)2SO4.5％甘油,0.1％t80pH 6.5
洗涤:平衡缓冲液
洗脱:20mM NaPi,0.1M NaAc,5％IPA,0.1％t80,pH 7.8
4)PPG as 2nd中度纯化步骤(ex test 44-47)
启动:Condition to 0.5M(NH4)2SO4and 0.5M NaAc,pH 6.3
平衡:20mM NaPi 0.5M(NH4)2SO4and 0.5M NaAc,0.0005-0.1％t80,5％甘油,pH 6.4
洗涤:1.6M NaAc,0.1％t80,pH 7.4
洗涤2:0.7M naPi,pH 6.5
洗脱:20mM NaPi,30％prolyleneglycol,0.05％t80,pH 7.8
实施例11
树脂的以下组合进行了测试，结果令人满意：
初步测试：平均约350ng HCP/mg GALC
Capto Blue
Capto adhere
Capto Butyl
Capto DEAE
测试1:240ng HCP/mg GALC
Capto Blue
Capto adhere
Butyl-S
测试2:430ng HCP/mg GALC
Capto Blue
Capto Adhere
Macro-Prep Methyl
Giga Cap Q
测试3:78ng HCP/mg GALC
Capto Blue
Capto adhere
PPG
测试4:50ng HCP/mg GALC(用IPA+tween灭活病毒的蛋白色光)
Capto Blue
Capto Adhere
Butyl-S
测试5:193ngHCP/mg GALC
Capto Blue-Mustang Q在线路滤波器
Capto adhere
Ether
测试6:79ngHCP/mg GALC
Capto Blue-Mustang Q在线
Capto adhere
Ether
实施例12
HNG实验分析半乳糖脑苷脂酶(GALC)活性。
原理
乳糖脑苷脂酶(GALC)负责半乳糖脑苷脂(＝半乳糖神经酰胺)的溶酶体分解代谢(＝半乳糖神经酰胺)，是髓鞘，肾和上皮细胞的主要脂质。GALC水解半乳糖，半乳糖基鞘氨醇，乳糖苷神经酰胺，以及单半乳糖二酯酰甘油脂的半乳糖酯键。GALC也能够水解半乳糖脑苷脂的合成类似物，显色底物，2-十六烷-4-硝基苯-BD吡喃半乳糖苷(HNG)。该反应中产物的钠盐，2-十六烷-4-硝基苯酚(HN)，吸收光在410nm。本文描述的方法使用这个原理。
GALC作用原理分析。HNG由GALC水解成HN(在pH4.5)，染成黄色的产物(在pH10.5)，在410nm下分光光度测定。
2-十六酰基-4-硝基苯基BD吡喃半乳糖苷水解
样品制备
收获物或纯化的GALC
用0.5％的Triton X-100制备样品稀释液。分析需要至少按1:10稀释。
细胞裂解
细胞沉淀在PBS中洗涤，通过离心沉淀(400×g离心5分钟，RT)并用0.5％的TritonX-100裂解。使用微孔板BCA蛋白测定试剂盒协议(皮尔斯)测定胞裂解液中的蛋白含量。一个典型的实验需要使用1-5mg细胞裂解液蛋白。
标准曲线并测定对照的制备
用第一内部rhGALC标准StG01制备标准曲线。准备五个稀释浓度(1/400，1/600，1/800，1/1200和1/1600)的复制品。
用第二rhGALC标准StG02制备测定对照：
孵育方法
a.20μl的标准稀释，样品，对照和空白(0.5％的Triton X-100)加入到一个U型的96孔板。20μl的StG01标准稀释，对照和样品(20μl单个稀释制备)，使用20μx2的空白。上样20μl HNG-测定底物到含有样品，空白和对照的所有孔中，然后混合。将板在37℃孵育30分钟或1小时。
b.使用multipipette加入80μl HNG终止溶液(0.1M甘氨酸/0.1M NaOH pH 10.5)随后在平板振荡器上大约30秒混合。加入160μl乙醇。将溶液混合，从每个取出200μl孔并转移到96孔过滤板。板在室温下，2000xg离心2分钟。
A410nm测量
用Spectra Max Plus读板器或BioTek的平板读数器进行测量。
计算
定义：1个酶活力单位(1U)规定为：37℃,pH 4.5，每分钟转化1nmol HN所需要的酶量。
设定第一rhGALC内部标准StG01的平均HNG活性为1884U/ml。用StG01平均HNG活性的稀释进行标准曲线的活性计算：
比活性的计算
用GALC ELISA测定混合样品中GALC的浓度。用A280(rhGALC的理论吸收系数为2.5)或660nm的Protein Assay来测定GALC纯化制剂的蛋白质浓度。
用HNG活性除以GALC或蛋白的浓度，来计算比活性(单位/mg)或每毫克蛋白(单位/mg蛋白)的酶活性。
最初，细胞溶解物的GALC活性被定义每小时每毫克水解产物的纳摩尔数(nmol/mg/h)。单位/mg乘以60转换到nmol/mg/h(即将分钟转换到小时)。

Claims (29)

1.一种用于从细胞培养物中纯化重组人半乳糖脑苷脂(rhGALC)的方法，其中将所述细胞培养物的包含rhGALC的级分在树脂上进行色谱法，所述方法包括：
g)捕获步骤：其中将所述rhGALC在第一多峰色谱树脂上纯化，任选地随后通过离子分离进行病毒灭活和/或纯化；
h)中度纯化步骤：其中将所述rhGALC在第二多峰色谱树脂上纯化，任选地随后通过离子分离进行病毒灭活和/或纯化；
i)精制步骤：其中所述rhGALC在由多峰色谱树脂、阴离子交换树脂和疏水相互作用色谱(HIC)树脂构成的一组树脂中选择出的色谱树脂上纯化。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述中度纯化步骤包括在所述第二多峰色谱树脂上纯化rhGALC，随后在选自以下的色谱树脂上纯化所述rhGALC：
i)不同于所述第一和第二多峰色谱树脂的多峰色谱树脂；和
ii)疏水相互作用色谱(HIC)树脂。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述第一和第二多峰色谱树脂是不同的树脂。
4.根据任一前述权利要求的方法，其中所述第一多峰色谱树脂包含静电配体。
5.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述第二多峰色谱树脂包括阴离子和疏水配体。
6.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述精制步骤中的色谱树脂是具有疏水性配体的树脂。
7.根据任一前述权利要求所述的方法，其中将所述rhGALC从所述第一多峰色谱树脂上洗脱到包含至少30％的丙二醇和/或乙二醇(v/v)的第一洗脱缓冲液中。
8.根据任一前述权利要求的方法，其中将所述rhGALC从所述第二多峰色谱树脂上洗脱到pH低于5.5、包含至少30％的丙二醇和/或乙二醇(v/v)的第二洗脱缓冲液中。
9.根据任一前述权利要求所述的方法，所述方法包括：
a)提供所述细胞培养物的包含rhGALC的级分；
b)将所述细胞培养物的级分装载到包含静电配体的第一多峰色谱树脂上；
c)将所述rhGALC从所述第一多峰色谱树脂上洗脱到包含至少30％的丙二醇和/或乙二醇(v/v)的第一洗脱缓冲液中，得到第一洗脱液；
d)将所述第一洗脱液加载到包含阴离子和疏水配体的第二多峰色谱树脂上；
e)将所述rhGALC从所述第二多峰色谱树脂上洗脱到pH低于5.5、包含至少30％的丙二醇和/或乙二醇(v/v)的第二洗脱缓冲液中，得到第二洗脱液；
f)将所述第二洗脱液加载到包含疏水性配体的第三多峰色谱树脂上；和
g)将所述rhGALC从所述第三多峰色谱树脂上洗脱到水性缓冲液中，得到第三洗脱液。
10.根据任一前述权利要求所述的方法，第一多峰色谱树脂至少通过芳烃和静电相互作用结合。
11.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述第一多峰色谱树脂包含式(I)、(Ⅱ)、(Ⅲ)、(Ⅴ)、(Ⅵ)或(Ⅶ)的化合物作为配体：
其中式(II)和(III)物质的R是式(IV)的功能基团
12.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述第一多峰色谱树脂包含式(VI)的化合物作为配体。
13.根据任一前述权利要求所述的方法，其中第二多峰色谱树脂包含式(VIII)的化合物作为配体。
14.根据任一前述权利要求所述的方法，洗涤所述第一色谱树脂的洗涤缓冲液包含不超过20％的丙二醇和/或乙二醇(v/v)。
15.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述第一洗脱缓冲液包含总浓度40-60％的丙二醇和/或乙二醇(v/v)。
16.根据权利要求9-15所述的方法，其中在步骤c)之后和在步骤d)之前，所述第一洗脱液中的丙二醇和/或乙二醇的总浓度降低到低于30％。
17.根据权利要求9-16所述的方法，其中在步骤c)之后，将所述第一洗脱液中的洗涤剂水平调整至到0.01％至5％
18.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述第二多峰色谱树脂通过离子相互作用、氢键和疏水性相互作用结合。
19.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述第二多峰色谱树脂包括下式的配体：
[RESIN]-
或下式的配体
[RESIN]-
20.根据权利要求9-19所述的方法，其中所述第二洗脱缓冲液包含30-50％的丙二醇和/或乙二醇(v/v)。
21.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述第三多峰色谱树脂包括包含醚基团的配体。
22.根据权利要求9-21所述的方法，其中所述第三多峰色谱树脂包含[resin]-(OCH2CH2)nOH作为配体，其中n是整数，范围为1-20，如1-10，如1-5，如1-3或如1-2。
23.一种包含rhGALC的组合物，其中在所述组合物中，全长rhGALC(80kDa)和主要加工产物(50+30kDa)的摩尔比为至少50：2.5。
24.根据权利要求23的所述方法，其中宿主细胞蛋白质的量低于200ng/mg rhGALC。
25.根据权利要求21或22的所述方法，其中所述酶活性为至少15KU/ml。
26.根据权利要求23-25所述的组合物，其中通过目测确定其中没有聚集体。
27.根据权利要求23-26所述的组合物，其通过任一前述权利要求所述的纯化方法得到。
28.根据权利要求23-27所述的组合物，用作药物。
29.根据权利要求23-27所述的组合物，用于治疗球形细胞脑白质营养不良(克拉伯病)。
CN201380059392.2A 2012-11-13 2013-11-13 重组人半乳糖脑苷脂-β-半乳糖苷酶(rhGALC)的纯化 Active CN104854122B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DKPA201270699 2012-11-13
DKPA201270699 2012-11-13
PCT/DK2013/050378 WO2014075688A1 (en) 2012-11-13 2013-11-13 PURIFICATION OF RECOMBINANT HUMAN GALACTOCEREBROSIDE β-GALACTOSIDASE (rhGALC)

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104854122A true CN104854122A (zh) 2015-08-19
CN104854122B CN104854122B (zh) 2021-10-08

Family

ID=54209221

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380059392.2A Active CN104854122B (zh) 2012-11-13 2013-11-13 重组人半乳糖脑苷脂-β-半乳糖苷酶(rhGALC)的纯化

Country Status (16)

Country Link
US (1) US20150284698A1 (zh)
EP (1) EP2920198B1 (zh)
JP (1) JP6035427B2 (zh)
KR (1) KR101783466B1 (zh)
CN (1) CN104854122B (zh)
AU (1) AU2013347260B2 (zh)
BR (1) BR112015010796B1 (zh)
CA (1) CA2890358C (zh)
EA (1) EA032680B1 (zh)
ES (1) ES2751369T3 (zh)
HK (1) HK1213915A1 (zh)
IL (1) IL238775B (zh)
NZ (1) NZ707753A (zh)
PL (1) PL2920198T3 (zh)
WO (1) WO2014075688A1 (zh)
ZA (1) ZA201502738B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20150275195A1 (en) * 2012-10-24 2015-10-01 Genzyme Corporation Elution of biomolecules from multi-modal resins using mes and mops as mobile phase modifiers
CN108176386B (zh) * 2018-01-16 2020-11-06 武汉轻工大学 一种三聚氰胺键合色谱固定相及其制备方法和金属离子改性三聚氰胺键合色谱固定相
CN113101909B (zh) * 2021-05-11 2023-07-18 博格隆(浙江)生物技术有限公司 一种层析介质及其制备方法
EP4234695A1 (en) * 2022-02-24 2023-08-30 Sartorius BIA Separations d.o.o. Methods for the selective removal of contaminants during a process of purifying biologic agents

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101410408A (zh) * 2006-04-04 2009-04-15 希尔制药爱尔兰有限责任公司 用于浓缩多肽的方法
CN101597614A (zh) * 2008-11-24 2009-12-09 中国农业科学院生物技术研究所 编码β-半乳糖苷酶的基因及其表达和应用
CN102027110A (zh) * 2008-01-18 2011-04-20 生物马林药物股份有限公司 制备活性高度磷酸化人溶酶体硫酸酯酶及其应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX2008012748A (es) * 2006-04-04 2009-01-07 Shire Pharmaceuticals Ireland Un proceso para la concentracion de un polipeptido.
WO2008073620A2 (en) * 2006-11-02 2008-06-19 Neose Technologies, Inc. Manufacturing process for the production of polypeptides expressed in insect cell-lines
WO2011163651A2 (en) * 2010-06-25 2011-12-29 Shire Human Genetic Therapies, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR CNS DELIVERY OF β-GALACTOCEREBROSIDASE

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101410408A (zh) * 2006-04-04 2009-04-15 希尔制药爱尔兰有限责任公司 用于浓缩多肽的方法
CN102027110A (zh) * 2008-01-18 2011-04-20 生物马林药物股份有限公司 制备活性高度磷酸化人溶酶体硫酸酯酶及其应用
CN101597614A (zh) * 2008-11-24 2009-12-09 中国农业科学院生物技术研究所 编码β-半乳糖苷酶的基因及其表达和应用

Also Published As

Publication number Publication date
BR112015010796B1 (pt) 2022-08-02
IL238775B (en) 2019-02-28
KR20150117638A (ko) 2015-10-20
BR112015010796A2 (zh) 2017-08-22
AU2013347260A1 (en) 2015-05-21
WO2014075688A1 (en) 2014-05-22
CN104854122B (zh) 2021-10-08
IL238775A0 (en) 2015-06-30
AU2013347260B2 (en) 2016-07-28
JP2015535422A (ja) 2015-12-14
US20150284698A1 (en) 2015-10-08
EP2920198B1 (en) 2019-09-25
NZ707753A (en) 2019-07-26
JP6035427B2 (ja) 2016-11-30
PL2920198T3 (pl) 2020-03-31
KR101783466B1 (ko) 2017-10-10
CA2890358C (en) 2020-02-11
ES2751369T3 (es) 2020-03-31
EP2920198A1 (en) 2015-09-23
CA2890358A1 (en) 2014-05-22
ZA201502738B (en) 2019-09-25
EA201590778A1 (ru) 2016-01-29
EA032680B1 (ru) 2019-07-31
HK1213915A1 (zh) 2016-07-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TW516962B (en) A human TNFR1-IgG1 preparation
US7544784B2 (en) Increased recovery of active proteins
US20080255342A1 (en) Protein purification method
KR100390325B1 (ko) 높은 특이활성을 가진 에리트로포이에틴
CN104854122A (zh) 重组人半乳糖脑苷脂-β-半乳糖苷酶(rhGALC)的纯化
AU2002255600A1 (en) Efficient recovery of correctly refolded proteins
CN102858797A (zh) 纯化生长因子蛋白的方法
ES2652330T3 (es) Proceso para la producción y purificación de alfa-manosidasa lisosómica recombinante
CN109354621A (zh) 一种天然凝血酶调节蛋白的纯化方法
TWI654991B (zh) 包含長效紅血球生成素之組成物
CN103635201B (zh) 人gdnf的变体
EP2558580A2 (en) Method for the manufacture of recombinant dspa alpha1
US20140219988A1 (en) Rrecombinant human saposin b protein containing phosphorylated glucose ring and use thereof
US20180112202A1 (en) PURIFICATION OF RECOMBINANT HUMAN GALACTOCEREBROSIDE B-GALACTOSIDASE (rhGALC)
FI92832C (fi) Yleinen syöpään liittyvä SCM-tunnistustekijä, menetelmä sen valmistamiseksi ja sen käyttö
CN103814137A (zh) 处理凝血因子的方法
CN106749589A (zh) 肽聚糖识别蛋白‑sa及其制备方法、模式识别功能及应用
RU2355770C2 (ru) Способ производства извлеченного из нематоды противосвертывающего белка (nap)
CN107151267A (zh) 载脂蛋白-ⅲ及其功能、制备方法和应用
Ly Analysis of the uptake of native versus modified albumin by renal tubular epithelial cells

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
EXSB Decision made by sipo to initiate substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20160226

Address after: Italy Parma

Applicant after: Italy Casey Pharmaceutical Co., Ltd.

Address before: Hillerod, Denmark

Applicant before: Ace Biosciences AS

REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 1213915

Country of ref document: HK

GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: WD

Ref document number: 1213915

Country of ref document: HK