[0001] A haptoglobina (Hp) é uma proteína de resposta de fase aguda, sintetizada principalmente no fígado. Ela é também sintetizada em outros tecidos tais como as paredes arteriais, o endométrio e o peritônio.
[0002] A função do núcleo da Hp é como uma proteína de ligação da hemoglobina (Hb), necessária para o processamento terminal e a remoção da Hb livre, mormente no sistema reticuloendotelial (RES) do fígado. Este sistema permite que o ferro presente no componente Hb seja conservado.
[0003] A molécula heme (ferroprotoporfirina IX) encontrada na Hb é um elemento indispensável em uma ampla variedade de outros sistemas protéicos (por exemplo, enzimas tais como a ciclooxigenase [COX] e a óxido nítrico sintase [NOS]) que atuam de acordo com as propriedades do(s) polipeptídeo(s) a ela ligados. Entretanto, o excesso de heme livre pode causar dano às células e lesão aos tecidos (por exemplo, nos rins, nos pulmões e no sistema nervoso central - SNC), uma vez que ele catalisa a formação da espécie reativa de oxigênio, a qual por sua vez causa o estresse oxidativo.
[0004] A hemólise intravascular ocorre fisiologicamente, mas também se acelera como uma complicação grave em várias doenças autoimunes, infecciosas (por exemplo, a malária) e herdadas (por exemplo, a célula falciforme). Durante a hemólise, a Hb vascular livre é capturada pela Hp e transportada para o RES do fígado. Algum processamento também pode ocorrer em macrófagos de monócitos. Entretanto, a Hb vascular livre pode ser rapidamente transformada em met-Hb, que facilmente libera o componente heme potencialmente tóxico. O heme vascular livre é capturado pela albumina ou pela hemopexina (Hx) e é transportado para o fígado para degradação no RES. Quando grandes quantidades de heme se acumulam (por exemplo em um coágulo sangüíneo ou deposição vascular), os mecanismos de depuração são dominados completamente ou incapazes de obter acesso ao heme livre, e resulta o dano tecidual. Se a quantidade de lise dos glóbulos vermelhos saturar o sistema de remoção de heme/Hb, a Hb começará a aparecer na urina (filtração glomerular pelos rins).
[0005] A Hp tem uma estrutura tetramérica que compreende duas cadeias α e duas β, ligadas por ligações dissulfeto. A cadeia β (245 aminoácidos) tem uma massa de cerca de 40 kDa (da qual 30 % aproximadamente 30 % p/p são carboidrato) e é compartilhada por todos os fenótipos. A cadeia α existe em duas formas: α1 (83 aminoácidos, 9 kDa) e α2 (142 aminoácidos, 17,3 kDa) e, portanto, a Hp ocorre como três fenótipos, referidos como Hp1-1, Hp2-1 e Hp2-2. O Hp1-1 contém duas cadeias α1, o Hp2-2 contém duas cadeias α2, e o Hp2-1 contém uma cadeia α1 e uma α2. O Hp1-1 tem uma massa molecular de 100 kDa, ou 165 kDa quando complexado com Hb. O Hp1-1 existe como um isoforma único e é também referido como dímero de Hp. O Hp2-1 tem uma massa molecular média de 220 kDa e forma polímeros de revestimento. O Hp2-2 tem uma massa molecular média de 400 kDa e forma polímeros cíclicos. Cada forma polimérica diferente é um isoforma diferente. Uma metodologia de PCR foi delineada (Koch et al. 2002, Clin. Chem. 48: 1377-1382) para estudar o polimorfismo da Hp.
[0006] A Hp foi identificada como um tratamento potencial para os distúrbios renais causados pela hemólise. Ela é potencialmente útil terapeuticamente como um meio de remover a hemoglobina livre; os complexos assim formados tendo benefícios adicionais em potencial como agentes antiinflamatórios, antioxidantes ou angiogênicos. Entretanto, a Hp é considerada difícil de se isolar em grandes quantidades, ao mesmo tempo em que retém sua atividade biológica. Uma variedade de protocolos para o isolamento da Hp foi descrita. Um tema comum é a cromatografia de afinidade. Os ligandos de afinidade usados incluem os anticorpos monoclonais (Katnik e Jadach, 1993, Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warz) Vol. 41: 303-308 e Tseng et al. 2004, Protein Expr. Purif. 33: 265-273), hemoglobina (Liau et al. 2003, J. Chromatogr. Analyt, Technol. Biomed. Life Sci. 790: 209-216 e Chiancone et al. 1995, J. Chromatogr. Biomed. Appl. 664: 89-95) e concanavalina A (Katnik et al. 1995, Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 33: 727-732).
[0007] Não obstante o anticorpo monoclonal com base nos protocolos de ligando de afinidade resultem em produto razoavelmente puro, apenas baixas produções têm sido relatadas. Tais métodos de isolamento também não são bem adequados aos processos de produção em larga escala, como um resultado da necessidade de grandes quantidades de ligando de afinidade. Em particular, Em particular, as quantidades necessárias de anticorpos monoclonais provavelmente serão demasiado dispendiosas, e difíceis de se obter. Os anticorpos monoclonais também padecem do inconveniente potencial de serem seletivos quanto aos vários isoformas da Hp. O uso da Hb como o ligando de afinidade tem obtido mais sucesso. Bons rendimentos de Hp razoavelmente homogênea têm sido obtidos, entretanto, como é o caso com todos os protocolos com base no ligando de afinidade, o incremento do processo é difícil e freqüentemente não interessante quanto ao custo. Um outro inconveniente dos protocolos à base do ligando de afinidade é que, se o produto de Hp for destinado ao uso como um produto farmacêutico, a fonte do ligando de afinidade deve ser controlada. A este respeito, a Hb pode não ser aceitável para reguladores, uma vez que ela é originada dos glóbulos vermelhos. É também necessário monitorar e controlar a lixiviação do ligando, já que a presença do ligando de afinidade no produto pode dar origem a preocupações quanto ao seu uso seguro nos pacientes.
[0008] A precipitação seletiva da Hp por um extrato de raiz de planta foi descrito (Nayak et al. 2002, Pro. Pep. Lett. 9: 503-510). Entretanto, como a cromatografia de afinidade, este protocolo é inadequado para a produção comercial em grande escala.
[0009] As técnicas com base na HPLC (Cromatografia Líquida de Alto Desempenho) também foram utilizadas em um precipitado de sulfato de amônio de soro porcino (Yang e Mao, 1999, J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl., 731: 395-402). Novamente, este protocolo é apenas considerado adequado para o isolamento da Hp em pequena escala.
[0010] Uma abordagem alternativa para o isolamento da Hp tem sido usar a cromatografia de troca de íons. As US 4.061.735 e US 4.137.307 descreveram o isolamento da Hp através da cromatografia de troca de ânions de precipitados de sulfato de amônio do plasma humano, ou de derivados das frações IV, IV-1 ou IV-4 de Cohn derivadas do plasma humano. A precipitação do sulfato de amônio é estabelecida para remover transferrina, albumina e outras proteínas indesejáveis. É essencial quanto a este método que o substrato de troca de íons seja um substrato de troca de íons forte, tal como o QAE-Sephadex® ou a celulose de GE. Este método é inadequado para o isolamento comercial em grande escala da Hp, por causa das quantidades imensas do sal contaminado (sulfato de amônio) que deveriam ser descartadas. Os métodos de purificação em bateladas com o uso de um trocador de ânions, não são igualmente ideais para o incremento.
[0011] O isolamento da Hp de plasma de coelho precipitado em acetato de sódio-ácido acético com o uso da celulose microgranular DE-52 do substrato de troca de ânions (celulose DEAE) foi relatado (Basler e Burrel, 1983 Inflammation 7(4): 387-400). A Focalização Isoelétrica Preparativa foi necessária para se obter um grau razoável de pureza do produto. Entretanto, embora um rendimento máximo entre 50 e 70 % tenha sido mencionado, a análise dos dados indica que o rendimento foi de fato de 44 % e a purificação foi de apenas três vezes. Este protocolo não é adequado para uso em uma ampla escala comercial por causa da sua complexidade.
[0012] É objetivo da presente invenção melhorar o que correntemente se acha disponível para o isolamento da Hp em um ou mais dos seguintes aspectos: rendimento e/ou pureza da Hp e sua reprodutibilidade, simplicidade do processo e adequabilidade para uso em uma escala ampla e/ou comercial em termos de viabilidade econômica.
[0013] Foi agora observado que a Hp pode ser isolada de uma fração do plasma humano anteriormente desconhecida como uma fonte da Hp com o uso de um substrato de troca de ânions em um método simples que resulta em rendimentos reprodutíveis elevados e que é capaz de uso econômico em uma grande escala. É importante o fato de que o método de isolamento seja capaz de ser usado na purificação da Hp para usos terapêuticos (isto é, o produto final seja suficientemente puro e livre de contaminantes para administração a seres humanos).
[0014] O isolamento dos componentes do plasma humano é bem documentado. Métodos para o isolamento de proteínas tais como a albumina e as imunoglobulinas são conhecidos há muitos anos. Uma primeira etapa comum é o fracionamento do plasma. O método de fracionamento mais comumente usado é o método de Cohn (Cohn, E. J. et al. 1946 J. Am. Chem. Soc. 68: 459) e suas modificações (por exemplo, Kistler e Nitschmann, 1962, Vox Sang, 7, pp. 414-424). Este processo começa com a crioprecipitação para remover alguns dos fatores de coagulação, seguida por tratamento de celita. O lago de plasma resultante é tratado com concentrações crescentes de etanol e a fração de precipitado A+1 (uma combinação de frações, I, II e III) e a fração IV. A redução do pH do sobrenadante da fração IV e a queda da temperatura de -5 °C (± 1 °C) para -10 °C (± 3 °C) causam a precipitação da fração V de Cohn.
[0015] Tradicionalmente a fração V de Cohn tem sido considerada como sendo principalmente uma fonte de albumina. Entretanto, foi agora entendido que a fração V de Cohn é também uma fonte útil de Hp e além disso é uma fonte da qual a Hp pode ser isolada com sucesso e com relativa facilidade.
[0016] Em um primeiro aspecto a presente invenção, portanto, fornece um método para o isolamento da haptoglobina de uma amostra compreendendo a fração V de Cohn, em que referido método compreende a cromatografia de troca de ânions da referida amostra.
[0017] Por “haptoglobina (Hp)” denotam-se todos os fenótipos (incluindo todos os isoformas) da Hp. A Hp isolada com o uso do método da invenção conterá potencialmente todos os isoformas da Hp presente na amostra de partida. A composição exata do isolado finalmente será prescrita pelos fenótipos da fonte. Conseqüentemente, se as amostras de plasma reunido forem usadas, todos os isoformas serão isolados. Uma metodologia foi planejada para se estudar o polimorfismo da Hp (tipagem da haptoglobina com o uso do Phastsystem, Hansson et al., Application Note 373 for the Phastsystem, Amersham Biosciences), e assim a pessoa versada deve ser capaz de determinar quais isoformas se acham presentes no isolado. O método pode ser usado para determinar quais dos vários tamanhos dos isoformas da Hp se acham presentes. O uso de hemoglobina para ligar a haptoglobina e, portanto, fornecer uma atividade de pseudoperoxidase que possa ser detectada em um gel, pode ser substituído pelo Western blotting com detecção de anticorpos (imunomancha).
[0018] Verificou-se, do uso destas técnicas e de outras, como por exemplo a cromatografia de exclusão de tamanho de alto desempenho (ensaio de HPLC-SEC), o ELISA da Hp, o ensaio de ligação da Hb e as leituras turbidimétricas, que as diferentes formas de Hp dão diferentes sinais nos diferentes ensaios. Por exemplo, as formas de Hp de menor peso molecular dão um sinal inferior no ELISA, e um sinal superior por análise turbidimétrica, do que as formas de maior peso molecular. Os ensaios de escolha para comparação das quantidades das diferentes formas são, portanto, os Western blots, a HPLC-SEC e o ensaio de ligação da Hb.
[0019] Pensa-se que os diferentes isoformas da Hp têm diferentes efeitos biológicos, como demonstrado das observações in vitro e dos estudos da população em certos estados de doença. De um estudo destes dados é provável as formas de menor peso molecular isoladas da fração V, tenha um maior efeito antiinflamatório do que as formas de peso molecular mais elevado. É igualmente claro da análise de uma espécie diferente da Hp que a ligação à Hb humana pode bem ser específica da espécie. O conhecimento destas diferenças permitiu a otimização do método de fracionamento, e o acesso aos diferentes isoformas de Hp quanto às pesquisas in vitro e os estudos da eficácia in vivo.
[0020] Por “isolamento” denota-se que, preferivelmente, pelo menos 50 % da Hp presente na amostra de partida da fração V estão presentes no produto do método da invenção. Preferivelmente pelo menos 65 %, e o mais preferível pelo menos 80 % da Hp presente na amostra de partida estão presentes no produto do método da invenção. A Hp obtida com o uso do método da invenção de preferência será pelo menos 70 % pura, mais preferível pelo menos 80 % pura, e o mais preferível 90 % pura. Deve-se observar que, como todos os procedimentos de isolamento, os acréscimos na pureza acham-se freqüentemente associados com os decréscimos no rendimento. Os estágios adicionados para garantir a segurança viral podem também reduzir a recuperação global.
[0021] A pessoa habilitada estará inteirada das técnicas pelas quais a pureza/rendimento de um isolado de Hp da invenção podem ser determinados. Estas devem incluir a análise de cromatografia de HPLC-SEC (para amostras que tenham um nível de pureza maior do que 40 %), um ensaio de ligação de Hp-Hb (com base no método de Katnik et al., 1995, ibid.) ou em combinação com o ensaio de HPLC-SEC, quando a amostra seja suficientemente pura, ou com a espectrofotometria em A280 nm com um coeficiente de extinção médio para as proteínas plasmáticas (Hansson et al., Application Note 373 for the Phastsystem, Amersham Biosciences). A atividade específica do produto pode também ser determinada com o uso do ensaio de ligação da Hb em combinação com a HPLC-SBC e o coeficiente de extinção quando determinado da seqüência de aminoácidos.
[0022] Por “fração V de Cohn” denota-se a fração de plasma designada fração V de Cohn no método de fracionamento de Cohn (Cohn, 1946, ibid.) e qualquer modificação do referido método, incluindo o método modificado de Kistler e Nitschmann (1962, ibid.). A pessoa habilitada deve facilmente entender que a fração é a fração V de Cohn e deve ser capaz de preparar esta fração sem a indevida sobrecarga Resumidamente, este processo pode envolver a crioprecipitação de plasma, o tratamento de celita, depois a exposição em etapas a 19 % de etanol em pH 5,85 e -5 °C, 40 % de etanol em pH 5,85 e -5 °C e, finalmente, 40 % de etanol em pH 4,8 e -8 °C, com o material precipitado sendo removido em cada estágio. O precipitado final é a fração V de Cohn. Quaisquer frações equivalentes em termos de composição à fração V de Cohn obtidas de uma maneira alternativa ou conhecida por uma terminologia alternativa, são consideradas como sendo abrangidas pela invenção. O principal constituinte da fração V é a albumina. A Hp e a transferrina acham-se também presentes em quantidades apreciáveis e a glicoproteína de ácido alfa 1 pode ser detectada em baixos níveis. Quantidades de traço de outras proteínas acham-se também presentes. O plasma pode ser obtido de qualquer fonte biológica adequada, não obstante o plasma de sangue de mamíferos seja preferido. O mais preferido é o plasma do sangue humano.
[0023] Por “amostra compreendendo a fração V de Cohn” denota-se que a maioria do componente proteináceo da amostra é a fração V de Cohn.
[0024] Por “cromatografia de troca de ânions” denota-se um método de cromatografia pelo qual a separação é obtida com base a carga, especificamente carga negativa. A cromatografia de troca de íons utiliza um suporte sólido carregado que ligue as moléculas de uma amostra que seja aplicada ao suporte sólido. As moléculas não ligadas podem ser as moléculas alvo e, assim, a etapa de troca de íons pode ser considerada como sendo semelhante a uma etapa de filtração que remova as moléculas indesejadas. Alternativamente, as moléculas alvo podem ser aqueles que permanecem ligadas, as moléculas não ligadas sendo indesejadas. Esta última é a abordagem mais usual, uma vez que a eluição das moléculas ligadas do suporte sólido pode então ser controlada/seletiva e, assim, uma melhor qualidade do produto pode ser obtida. As técnicas de cromatografia de troca de ânions comumente usam substratos tais como, sem limitação, o dextrano, a celulose e suas modificações que sejam positivamente carregadas. Estes substratos podem compreender parte do suporte sólido (por exemplo, um revestimento) ou podem formar a totalidade do suporte sólido. O suporte sólido pode estar na forma particulada (por exemplo, uma resina), porém suportes não particulados (por exemplo, papéis de filtro ou géis) podem ser usados. Os substratos particulados são tipicamente, embora nem sempre, adensados em colunas.
[0025] Quando o termo “substrato” ou a expressão “substrato de troca de ânions” sejam usados, eles devem ser interpretados como referindo-se a substratos em uma forma adequada para uso nas técnicas de troca de ânions.
[0026] Uma amostra que deva ser submetida a cromatografia de troca de ânions é aplicada ao substrato. Com base nas interações de carga, as moléculas (negativamente carregadas) dentro da amostra se ligam ao substrato. A lavagem do substrato, portanto, remove as moléculas não ligadas ou fracamente ligadas. A eluição controlada/seletiva das moléculas ligadas pode ser obtida pela passagem de soluções de concentração de sal crescente sobre o substrato, uma vez que isto rompe da interações de carga entre o substrato e as moléculas ligadas. O pH da solução de eluição pode também ser alterado para induzir a eluição, tendo em vista que isto alterará a carga presente na molécula ligada e no substrato. Quanto mais fraca a interação de carga entre a molécula e o substrato, menor a concentração de sal necessária para romper a interação e, assim, induzir a eluição daquela molécula do substrato. Mediante controle cuidadoso da concentração de sal, a eluição seletiva das moléculas ligadas pode ser obtida.
[0027] A intensidade da interação de carga pode ser modificada pela escolha do material para o suporte sólido. Por exemplo QAE-Sephadex® ou celulose GE são fortes substratos trocadores de ânions, enquanto a DEAE- celulose e a DEAE-Sephadex® são substratos fracos de troca de ânions.
[0028] A pessoa habilitada na técnica estará bem a par das técnicas e ferramentas da troca de ânions e devem ser capazes de delinear e realizar protocolos específicos para suas necessidades. De particular utilidade no método da invenção são os substratos fracos trocadores de ânions e de excepcional utilidade é a DEAE Sepharose® (Amersham). Sepharose® é o nome comumente usado para as contas de agarose. Outras resinas de troca de ânions adequadas incluem a celulose, o dextrano e as contas de base polimérica.
[0029] Por “fracos” denotam-se substratos trocadores de ânions com uma fraca capacidade de tamponamento. A capacidade de tamponamento de qualquer trocador de ânions particular é facilmente determinada pela titulação de ácido-base do substrato, a curva de titulação resultante indicando a intensidade e a amplitude da capacidade de tamponamento.
[0030] Assim, em uma forma de realização preferida, a invenção fornece um método para o isolamento da haptoglobina de uma amostra compreendendo a fração V de Cohn, em que referido método compreende a cromatografia de troca de ânions da referida amostra com o uso de um substrato de troca de ânions fraco.
[0031] Em uma forma de realização mais preferida, a invenção fornece um método para o isolamento da haptoglobina de uma amostra compreendendo a fração V de Cohn, em que referido método compreende a cromatografia de troca de ânions com o uso de DEAE agarose.
[0032] Tipicamente, a amostra será carregada no substrato de troca de ânions em uma solução de carga adequada. O substrato de troca de ânions e as condições de carga devem ser tais que a Hp seja ligada ao substrato enquanto a albumina, o principal constituinte da fração V de Cohn, permaneça não ligada ou seja apenas fracamente ligada. A albumina pode, então, ser removida do substrato com o uso de um tampão de lavagem adequado, antes da eluição seletiva da Hp. Para facilidade de processamento, o substrato de troca de ânions estará preferivelmente na forma de uma coluna. No entanto, o método da invenção não fica limitado à cromatografia de coluna.
[0033] Igualmente para facilidade do processamento, os mesmos componentes são preferivelmente usados em todos os diferentes tampões, com apenas as quantidades ou concentrações dos componentes individuais variando entre os diferentes tampões.
[0034] Assim, em uma forma de realização preferida, a invenção fornece um método para o isolamento da haptoglobina de uma amostra compreendendo a fração V de Cohn em que o referido método compreende: a) carregar referida amostra a um substrato de troca de ânions, e b) seletivamente eluir dela a haptoglobina.
[0035] Uma ou mais etapas de lavagem podem também ser incluídas para reduzir as moléculas indesejáveis no eluato de Hp. O objetivo de uma etapa de lavagem é passar um tampão adequado através do substrato, o qual venha a eluir as moléculas não ligadas, ou muito fracamente ligadas, da amostra (por exemplo, albumina) sem induzir a eluição da molécula alvo (Hp). O mais comumente, uma ou mais etapas de lavagem serão incluídas entre a etapa de carga da amostra contendo a fração V de Cohn no substrato de troca de ânions, e a etapa de eluição da Hp nele contida. Entretanto, as etapas de lavagem podem ser incluídas no meio das distintas etapas de eluição, especialmente se outras moléculas potencialmente úteis tiverem de ser eluídas antes da eluição da Hp.
[0036] Altamente preferível, o substrato de troca de ânions é lavado para remover material não ligado antes que a Hp seja dele eluída.
[0037] Assim, em uma forma de realização preferida, a invenção fornece um método para o isolamento da haptoglobina de uma amostra que compreenda a fração V de Cohn, em que o referido método compreende: a) carregar a amostra a um substrato de troca de ânions, b) lavar o substrato para remover contaminantes não ligados ou fracamente ligados, e c) seletivamente eluir a Hp do substrato de troca de ânions.
[0038] Em outro aspecto, a invenção fornece um método para o isolamento de albumina e de haptoglobina de uma amostra compreendendo a fração V de Cohn, o método compreendendo: a) carregar a amostra a um substrato de troca de ânions, seguido por b) lavar o substrato para seletivamente remover albumina, e seguido por c) seletivamente eluir a haptoglobina do substrato.
[0039] A pessoa habilitada estará a par da carga, lavagem e tampões de carga adequados e será capaz de formular tampões adequados (em termos de constituintes e suas concentrações e pH) para se obter ou carga, lavagem de Hp ligada, ou eluição seletiva da Hp do substrato de carga de ânions particular em uso. A pessoa versada será capaz de otimizar estes parâmetros sem a indevida sobrecarga. As condições de carga, lavagem e eluição devem ser selecionadas de tal modo que nenhum dano desnecessário ocorra à Hp. Carga, lavagem e tampões de eluição típicos compreendem um par de componentes de tampão e um sal. Pares de componentes de tampão adequados incluem, porém sem que fiquem a estes limitados, acetato de sódio e ácido acético, citrato de sódio e ácido cítrico, ácido cítrico e fosfato de sódio, e ácido succínico e hidróxido de sódio. Um par de componentes de tampão preferido é o de acetato de sódio e ácido acético. Sais adequados incluem o cloreto de sódio, o cloreto de potássio e o sulfato de sódio. Um sal preferido é o cloreto de sódio.
[0040] Visto que uma ampla variedade de sais e componentes de tampão pode ser usada, os tampões de carga, de lavagem e de eluição podem ser alternativamente definidos em termos de sua condutividade. A pessoa versada será capaz de formular tampões com quaisquer sais e componentes de tampão adequados contanto que a condutividade correta do tampão seja obtida. A pessoa habilitada deve também observar que a condutividade requerida para cada tipo de tampão pode depender do substrato de troca de ânions usado.
[0041] Os tampões de carga e de lavagem são freqüentemente os mesmos. Entretanto, a pessoa habilitada será capaz de planejar tampões de carga e de lavagem separados, a partir de seu conhecimento geral comum, caso isto venha a ser necessário.
[0042] Quanto à lavagem de um fraco substrato de troca de ânions ao qual a Hp esteja ligada sem causar eluição significativa da Hp, uma condutividade entre 0,1 e 3,0 mS/cm é preferida, mais preferivelmente a condutividade será entre 0,5 e 2,5 mS/cm e, o mais preferível, entre 1,0 e 2,0 mS/cm.
[0043] Para a lavagem da DEAE Sepharose® ligada à Hp sem eluição significativa da Hp, uma condutividade entre 0,7 e 2,7 mS/cm é preferida, mais preferível a condutividade será entre 1,1 e 2,3 mS/cm, e o mais preferível entre 1,2 e 2,2 mS/cm cm.
[0044] Como exemplo, um tampão de lavagem com esta condutividade mais preferida compreende acetato de sódio 5 mM e cloreto de sódio 15 mM ajustados a pH 4,6 com ácido acético.
[0045] Para a eluição da Hp de um fraco substrato de troca de ânions, uma condutividade entre 8,0 e 15,0 mS/cm é preferida, mais preferível a condutividade será entre 9,5 e 13,5 mS/cm e, o mais preferível, entre 10,5 e 12,5 mS/cm.
[0046] Para a eluição da Hp da DEAE Sepharose®, uma condutividade entre 9,0 e 14,0 mS/cm é preferida, mais preferível a condutividade será entre 10,0 e 13,0 mS/cm, e o mais preferível entre 10,5 e 12,5 mS/cm. Como exemplo, um tampão de eluição com esta condutividade mais preferida compreende acetato de sódio 5 mM e cloreto de sódio 113,5 mM ajustado a pH 4,6 com ácido acético.
[0047] O pH dos tampões de carga, lavagem e eluição é também importante. O pH pode alterar a condutividade do tampão, dependendo dos constituintes do tampão usado, e pode também induzir a eluição (desejada ou não) da molécula alvo do substrato. No caso de tampões de lavagem para a lavagem da Hp ligada a um trocador de ânions fraco, uma faixa de pH entre 3 e 7 é preferida. Mais preferido é um pH entre 4 e 6 e, o mais preferível, é um pH entre 4,2 e 5,0. Para um tampão compreendendo acetato de sódio 5 mM e cloreto de sódio 15 mM em uma condutividade de 1,7 ± 0,5 mS/cm, o pH deve ser de 4,6 ± 0,1 (ajustado com ácido acético). No caso de eluição da Hp de um trocador de ânions fraco, uma faixa de pH entre 3 e 7 é preferida. Mais preferido é um pH entre 4 e 6 e o mais preferível é um pH entre 4,2 e 5,0. Para um tampão compreendendo acetato de sódio 5 mM e cloreto de sódio 113,5 mM em uma condutividade de 11,5 ± 1,0 mS/cm, o pH deve ser de 4,6 ± 0,1 (ajustado com ácido acético). O técnico habilitado estará a par do relacionamento entre o pH e a condutividade, e entre o pH e o grau de eluição, e será capaz de predizer as faixas precisas de pH que sejam apropriadas para os tampões e substratos que estejam sendo usados, e a função que estes estejam desempenhando. Além do mais, o conhecimento geral comum possibilitará a otimização dos parâmetros dos tampões sem a indevida sobrecarga.
[0048] Em uma forma de realização mais preferida a invenção fornece um método para o isolamento da haptoglobina de uma amostra contendo a fração V de Cohn, em que referido método compreende: a) aplicar a referida amostra a um substrato de troca de ânions de DEAE agarose, b) lavar referido substrato com um tampão de lavagem de acetato de sódio/ácido acético/cloreto de sódio de uma condutividade entre 1,2 e 2,3 mS/cm e um pH entre 4,5 e 4,7, e c) eluir a haptoglobina do referido substrato com um tampão de eluição de acetato de sódio/ácido acético/cloreto de sódio de condutividade entre 10,5 e 12,5 mS/cm e um pH entre 4,5 e 4,7.
[0049] Dependendo dos outros constituintes presentes na amostra, pode ser necessário realizar a eluição em etapas para se obter Hp com um alto grau de pureza. Os contaminantes que se ligam ao substrato menos fortemente do que a Hp, podem ser eluídos primeiro pela escolha adequada das condições de eluição iniciais. De forma semelhante, o tampão de eluição usado para eluir a Hp deve ser escolhido de tal modo que ele não remova contaminante que se liguem ao substrato mais fortemente do que o faz a Hp. Por exemplo, a albumina e a transferrina se ligam à DEAE Sepharose de forma mais fraca do que o faz a Hp, e são eluídas antes da Hp. Por outro lado, a glicoproteína α1- ácida (AAG) foi observada ligar-se mais fortemente à DEAE Sepharose do que o faz a Hp, e pode permanecer ligada à coluna após a Hp ter sido eluída. Em geral, quanto mais negativamente carregada seja uma proteína particular, mais fortemente ela se ligará à resina de troca de ânions, e mais elevada será a concentração de sal necessária para elui-la. Quaisquer proteínas eluídas, outras que não a Hp, podem ser descartadas ou, se elas forem potencialmente úteis, poderão ser retidas para outro processamento.
[0050] O técnico habilitado estará a par das técnicas para monitorar o eluato para possibilitar o progresso da eluição a ser seguida e para apurar o que está sendo eluído nas várias frações. Por exemplo, a espectroscopia UV pode seguir o progresso da eluição em tempo real. Técnicas tais como a cromatografia de HPLC SEC ou a SDS PAGE podem ser usadas para detectar a presença e identidade das impurezas. A espectrometria de massa de tempo- de-vôo de ionização de dessorção a laser auxiliada pela matriz (MALDI-ToF) de frações de HPLC ou bandas de SDS-PAGE pode também ser usada para identificar as proteínas presentes. As proteínas conhecidas podem ser monitoradas com métodos de detecção à base de anticorpos [por exemplo, o ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA), a imunodifusão radial (RID) e as determinações turbidimétricas].
[0051] O método da invenção também pode ser usado para se obter a separação e o isolamento de isoformas particulares da Hp. A separação pode ser obtida com base na carga. Estas diferenças na carga são prováveis de serem um resultado dos padrões variáveis de glicosilação nos diferentes isoformas. Quanto menor a carga negativa de um isoforma, menor a concentração de sal necessária para eluir esse isoforma. Tipicamente as concentrações de sal aumentam no decurso da etapa de eluição e, assim, os isoformas menos negativamente carregados eluem primeiro. Mediante a monitoração do eluato pelas vias normais, o técnico habilitado deve ser capaz de identificar picos discretos de eluição que correspondam aos isoformas discretos e, conseqüentemente, isolar estes isoformas discretos.
[0052] Assim, em outro aspecto, a presente invenção fornece um método para o isolamento dos isoformas individuais da haptoglobina de uma amostra compreendendo a fração V de Cohn, em que referido método compreende a cromatografia de troca de ânions da referida amostra.
[0053] O uso da fração V de Cohn como o material de partida pode também ter um efeito sobre os isoformas da Hp que sejam finalmente isolados. Foi observado que as proporções dos fenótipos da Hp presentes na fração IV e na fração V do processo de fracionamento de Cohn diferem. Portanto, no isolamento da Hp da fração V, um produto de Hp diferente pode ser produzido, que não o produto de Hp produzido com o uso da fração IV. Especificamente, a proporção do isoforma 1-1 foi observada ser maior do que a proporção dos isoformas 2-2 no produto derivado da fração V em comparação com um produto derivado da fração IV. Isto é pressuposto como sendo um resultado da precipitação dos isoformas mais pesados quando o pH é reduzido em concentração elevada de etanol durante o processo de fracionamento.
[0054] As formas de realização anteriormente preferidas da invenção se aplicam, mutatis mutandis, a este aspecto da invenção. Quando da consideração do termo “isolamento” neste aspecto, deve-se ter em mente que qualquer produção deve ser calculada com relação ao isoforma particular.
[0055] Um sério problema dos métodos da técnica anterior quanto ao isolamento da Hp do plasma tem sido sua inadequabilidade para elevação do isolamento até escala ampla/comercial. Como se pode observar dos Exemplos, foi agora observado que a cromatografia de troca de ânions pode ser usada para se obter uma preparação de alto rendimento e alta pureza da Hp da fração V de Cohn, sem a necessidade de outras etapas de processamento, tais como a Focalização Isoelétrica Preparativa. Assim, o método da invenção é capaz de ser utilizado em um escala ampla/comercial e sendo economicamente viável nesse escala.
[0056] Por “escala ampla” denota-se que o isolamento é obtenível dos volumes da amostra de partida, na ordem de milhares de litros. Observada alternativamente, ampla escala refere-se aos tamanhos das bateladas do plasma de partida de pelo menos 1000 litros, mais preferível de pelo menos 3000 litros, e o mais preferível de pelo menos 6000 litros.
[0057] As formas de realização anteriormente preferidas da invenção se aplicam, mutatis mutandis, a este aspecto da invenção. A pessoa habilitada deve ser capaz de aplicar as modalidades anteriormente examinadas à produção em ampla escala sem a indevida sobrecarga.
[0058] A cromatografia de troca de ânions pode ser usada para isolar uma proporção significativa da Hp na fração V de Cohn. O produto direto da etapa de troca de ânions do método da invenção pode ser submetido a procedimentos para purificá-lo ainda e/ou para concentrar a preparação. A pessoa habilitada deve conhecer e ser capaz de aplicar procedimentos adequados ou delinear alternativas. Exemplos de procedimentos adequados incluem, sem limitar, a diafiltração, a ultrafiltração, a cromatografia de fluxo atravessante, a cromatografia de quelato de metal, a cromatografia de hidroxiapatita, e os procedimentos dedicados de inativação/redução viral.
[0059] Se a Hp for destinada ao uso farmacêutico, o isolado e/ou a Ap purificada podem necessitar submeterem-se a outro processamento para remover quaisquer contaminantes biológicos ou químicos que possam ter permanecido na amostra. Tais procedimentos são bem conhecidos na técnica e a pessoa habilitada deve ser capaz de aplicar seu conhecimento geral comum e realizar os testes de rotina para permitir que ele formule a Hp isolada/purificada que seja adequada para uso farmacêutico.
[0060] Por exemplo, um método eficaz de ainda purificar a Hp foi observado ser mediante o uso de sorventes da cromatografia de interação hidrofóbica (HIC). Vários sorventes da HIC, tais como a sefarose fenílica (alto substituída, baixo substituída e alto desempenho), a sefarose butílica e a sefarose octílica, foram pesquisados. Em todos os casos, a Hp foi observada ligar-se menos fortemente do que os contaminantes. A pessoa versada deve ser capaz de escolher um ligando de HIC adequado para as suas necessidades, e deve saber que, mediante a modificação da intensidade iônica da alimentação e dos tampões de equilíbrio, as moléculas com diferentes afinidades quanto a um ligando de HIC devem ser coletadas em diferentes frações. Por exemplo, pode ser preferível escolher condições em que a Hp atravesse enquanto os contaminantes ficam ligados, enquanto em outras situações o contrário possa ser verdadeiro. A pessoa habilitada deve também estar informada dos fatores que afetam a purificação da HIC, tal como o pH e o tempo de permanência. O tempo de permanência é especialmente crítico nos casos em que o produto esteja no fluxo atravessante. Isto é porque os tempos de permanência mais curtos podem possibilitar que os contaminantes atravessem, assim contaminando o produto.
[0061] Tampões de HIC adequados têm uma concentração de sulfato de amônio entre 0,5 M e 1,5 M, preferivelmente entre 0,8 M e 1,2 M, e o mais preferível entre 0,9 M e 1,1 M, e um pH entre 5 e 9, preferivelmente entre 6 e 8 e, o mais preferível, entre 6,5 e 7,5. As velocidades de fluxo adequadas para a HIC devem ser de não mais do que 10 cm/minuto, preferivelmente entre 0,5 e 5 cm/minuto, e o mais preferível entre 1 e 3 cm/minuto.
[0062] A diafiltração pode ser usada para ajustar a concentração de sal ou o pH para que sejam adequados ao uso farmacêutico. Os contaminantes biológicos tais como os vírus e os príons podem ser removidos pelas técnicas conhecidas de filtração de vírus, pelas técnicas conhecidas de desinfecção química (inativação viral) e/ou pelas técnicas de pasteurização ou tratamento térmico conhecidas. Por exemplo, nós observamos que a remoção e/ou a inativação viral em grande escala, de uma solução contendo Hp, são possíveis com o uso do tratamento de detergente solvente como delineado na EP-A 0131740, contanto que a Hp seja tratada em um pH na faixa de pH 5 a 9. É igualmente possível filtrar a Hp produzida pelos métodos de purificação aqui descritos através de um ou mais filtros virais adequados, por exemplo filtros com tamanhos de poros de cerca de 20 nm, e assim, teoricamente, assegurar a remoção dos vírus potencialmente patogênicos. Se o tratamento de detergente solvente for usado para inativar os vírus, uma etapa adicional pode ser incluída no método para remover os reagentes de detergentes solventes. A pessoa habilitada deve ser versada em tais métodos. Como exemplo, a cromatografia de troca de ânions pode ser usada. Uma etapa de cromatografia de troca de ânions adequada deve ser a mesma idêntica àquelas aqui examinadas em relação à purificação inicial da Hp. Mais especificamente, uma etapa de remoção de reagente de detergente solvente deve compreender diluir a amostra tratada com detergente solvente apropriadamente para manter a condutividade abaixo de 3 mS/cm, carregando-se a amostra tratada sobre um substrato de troca de ânions (por exemplo, um substrato de DEAE agarose), lavando-se o substrato para seletivamente remover os contaminantes não ligados ou fracamente ligados, e seletivamente eluindo-se a Hp do substrato de troca de ânions. O uso da cromatografia de troca de ânions para a remoção dos reagentes de detergente solvente, pode também levar à pureza melhorada do produto final.
[0063] Se a pasteurização ou tratamento térmico for usado, o uso de estabilizadores é considerado. Os estabilizadores devem incluir, porém sem limitar, açúcares, álcoois de açúcar, ácido ascórbico e aminoácidos. Os métodos para remover os estabilizadores,se necessário, são bem conhecidos na técnica. Se um desinfetante químico (por exemplo, solvente/detergente) for usado, será igualmente provável a necessidade de remoção. Métodos para remoção de desinfetantes químicos são bem conhecidos na técnica. A ordem particular dos procedimentos acima mencionados não é considerada importante, porém ordens específicas podem ser mais vantajosas do que outras, em termos de conveniência e custo. Por exemplo, pode ser preferível realizar a pasteurização com estabilizadores ou realizar uma etapa de desinfecção química antes de uma etapa de filtração ou de diálise, que poderia ser programada para remover os estabilizadores ou agentes de desinfecção. Os produtos de sangue para uso como produtos farmacêuticos preferivelmente serão submetidos a pelo menos duas etapas de inativação viral. A Hp pode ser subseqüentemente formulada para uso clínico.
[0064] Em uma formulação da Hp adequada para uso farmacêutico, a Hp deve ser substancialmente livre de contaminantes químicos e biológicos, até o ponto em que os níveis na formulação não sejam considerados nocivos a um paciente. De forma ideal, os níveis de quaisquer contaminantes serão substancialmente menores do que os níveis mínimos requeridos pelos Órgãos Reguladores em relação a produtos farmacêuticos.
[0065] Por “contaminantes biológicos” denotam-se entidades biológicas capazes de induzir patologias em um paciente. Essas entidades incluem, sem porém limitar, vírus, príons, bactérias, fungos, esporos e células.
[0066] Por “contaminantes químicos” denotam-se moléculas que devem induzir reações adversas se administradas aos pacientes.
[0067] Em ainda outro aspecto, a invenção fornece produtos obtidos por qualquer um, e por todos, os métodos da invenção aqui anteriormente descritos.
[0068] Qualquer uma e todas as combinações dos aspectos preferidos examinados neste relatório acham-se abrangidas pela invenção, mesmo que não explicitamente exposto. A invenção será ainda descrita com referência às seguintes Figuras, em que:
[0069] A Figura 1 mostra os resultados de um exemplo de uma experiência de isolamento da Hp em escala de laboratório. As três linhas correspondem à condutividade (Cond), ao pH (pH) e à absorbância UV (UV). Os picos da eluição protéica são marcados com albumina R/T, Hapto pico 1, Hapto pico 2 e AAG (glicoproteína al-ácida).
[0070] A Figura 2 mostra a análise de HPLC dos picos de Hp (pico 1 e pico 2) para Hapto011. Figura 2a, pico 1. Figura 2b, pico 2.
[0071] A Figura 3 mostra os resultados de um exemplo de uma experiência de isolamento da Hp em escala comercial (Operação de Produção). As três linhas correspondem à condutividade (Cond), pH (pH) e absorbância UV (UV).
[0072] A Figura 4 mostra a análise de HPLC dos picos de Hp (pico 1 e pico 2) para a Operação de Produção. Figura 4a, pico 1. Figura 4b, pico 2.
EXEMPLO 1
PREPARAÇÃO DA FRAÇÃO V DE COHN
[0073] O plasma foi submetido a um descongelamento controlado em -0,5 °C para 2 °C durante o qual algumas proteínas se precipitaram. O sobrenadante foi coletado, tratado com celita e depois filtrado para remover outras proteínas indesejáveis. O sobrenadante resultante foi ajustado a um pH de 5,85 com tampão de acetato, e 17 a 21 % de etanol v/v foram adicionados. A temperatura foi controlada durante a precipitação decorrente entre -4 °C e - 6 °C. Estas condições são semelhantes àquelas usadas no segundo estágio do processo de Kistler e Nitschmann e, assim, o precipitado incluía a fração 1 e o precipitado A daquele processo. O precipitado foi referido como A+1. O sobrenadante foi ainda fracionado pelo ajuste da concentração de etanol entre 38 e 42 %. As proteínas precipitadas são conhecidas coletivamente como fração IV no processo de Kistler e Nitschmann. O ajuste do pH a 4,85 e da temperatura entre -7 °C e -13 °C, fez com que a fração V se precipitasse.
EXEMPLO 2
COLUNAS DE TROCA DE ÂNIONS E PREPARAÇÃO DE TAMPÕES E SOLUÇÕES
Colunas:
[0074] Exemplos 1 e 2, DEAE Sepharose® (Amersham) 12,5 cm de altura do leito em uma coluna Amersham 16/20 XK.
[0075] Exemplos 3 e 4, coluna DEAE Sepharose® (Amersham) de escala comercial.
[0076] Equilíbrio/tampão de lavagem: acetato de sódio 5 mM, analar (0,68 g/litro de acetato de sódio triidrato). cloreto de sódio 15mM, analar (0,88 g/l) preparado em Água livre de pirogênio (PFW) pH: 4,6 ± 0,1 (pH ajustado com ácido acético glacial,. Analar) Condutividade: 1,7 ± 0,5 mS/cm
[0077] Para 400 litros de tampão de lavagem/equilíbrio, 272 g de acetato de sódio triidrato, 351 kg de cloreto de sódio e 110 g de ácido acético glacial, foram adicionados a um vaso adequado (pelo menos 500 litros de capacidade). Os ingredientes foram dissolvidos e compostos até 400 litros com água adequada. As leituras do pH e da condutividade foram conferidas. A faixa de aceitação pH 4,5 a 4,7. Condutividade: 1 -2 mS/cm. Tampão de eluição HP acetato de sódio 5 mM, analar (0,68 g/litro de acetato de sódio triidrato). cloreto de sódio 113,5 mM, analar (6,63 g/l) pH: 4,6 ± 0,1 Condutividade: 11,5 ± 1 mS/cm
[0078] Para 500 litros de Tampão de Eluição, 340 g de acetato de sódio triidrato, 3,32 kg de cloreto de sódio e 110 g de ácido acético glacial, foram adicionados a um vaso adequado (pelo menos 500 litros de capacidade). Os ingredientes foram dissolvidos e compostos até 500 litros com água adequada. As leituras do pH e da condutividade foram conferidas. A faixa de aceitação pH 4,5 a 4,7. Condutividade: 10,5 a 12,5 mS/cm. Tampão de eluição AAG acetato de sódio 5 mM, analar (0,68 g/litro de acetato de sódio triidrato). cloreto de sódio 212 mM (12,40 g/litro) pH: 4,6 ± 0,1 Condutividade: 19,5 ± 2,5 mS/cm
[0079] Para 400 litros de Tampão de Eluição de AAG, 272 g de acetato de sódio triidrato, 4,96 kg de cloreto de sódio e 110 g de ácido acético glacial, foram adicionados a um vaso adequado (pelo menos 500 litros de capacidade). Os ingredientes foram dissolvidos e compostos até 400 litros com água adequada. As leituras do pH e da condutividade foram conferidas. A faixa de aceitação pH 4,5 a 4,7. Condutividade: 17 a 22 mS/cm.
EXEMPLO 3
ISOLAMENTO EM ESCALA DE LABORATÓRIO DA Hp
[0080] O isolamento da Hp da fração V de Cohn foi realizado em uma escala de laboratório. O substrato de troca de ânions DEAE-Sepharose® Fast Flow foi adensado em uma altura de leito de 12,5 cm em uma coluna de 25 ml alojada em uma coluna Amersham BioSciences 16/20 XK. Essa é uma versão reduzida (1/4000) de uma coluna de escala comercial
[0081] A solução da fração V de Cohn foi carregada na coluna. A carga da fração V de Cohn foi reduzida de 250 ml para 150 ml para economizar o tempo de processamento. Após a carga estar completa, a coluna foi lavada com tampão de equilíbrio. A albumina foi eluída no fluxo atravessante da carga. A eluição da Hp foi então induzida pelo tampão de eluição de desenvolvimento através da coluna. A taxa de fluxo dos tampões foi mantida em 4,0 ml/minuto na totalidade do processo. A Figura 1 mostra a presença da proteína no eluato quando monitorada por absorbância de UV como uma função do volume do tampão desenvolvido através da coluna. A condutividade e o pH do eluato são também mostrados. Como se pode observar, a Hp eluiu como dois picos após a albumina ter sido eluída.
[0082] As amostras correspondentes aos dois picos de Hp foram ainda analisadas por HPLC. A Figura 2 mostra que o Pico 1 (Figura 2a) tinha mais Hp 1-1 do que as outras formas e que o Pico 2 (Figura 2b) ficou mais rica nas formas de Hp mais elevadas (Hp 2-2 e 2-1) do que o Pico 1. Neste exemplo, quanto ao pico 1, o fator de purificação foi de 40 vezes, a pureza foi de 72 % e o rendimento foi de 80 %. O pico 2 teve uma pureza de 40 %.
EXEMPLO 4
ISOLAMENTO DA Hp EM LARGA ESCALA
[0083] O isolamento da Hp da fração V de Cohn foi realizado em uma escala comercial com o uso da coluna de DEAE-Sepharose® na escala de produção completa (coluna de 200 litros). A solução da fração V de Cohn (1100 litros) foi carregada na coluna. Uma vez a carga ter sido completada, a coluna foi lavada com tampão de lavagem. Isto fez com que a albumina fosse eluída. A Hp foi então eluída com tampão de eluição. A velocidade de fluxo dos tampões foi mantida em 14 litros/minuto, o que é equivalente a 4,0 ml/minuto na escala de laboratório. A Figura 3 mostra a presença de proteína no eluato (monitorado por absorbância UV) como uma função do volume do desenvolvimento do tampão através da coluna. O cromatograma começa na extremidade do pico de eluição da albumina. Como pode ser observado, a Hp eluiu como dois picos após a albumina ter sido eluída. A similaridade desta linha em comparação com a experiência em escala de laboratório realçou a adequabilidade do método da invenção quanto à elevação proporcional para o isolamento comercial da Hp.
[0084] As amostras correspondentes aos dois picos de Hp foram ainda analisadas por HPLC. A Figura 4 mostra que o Pico 1 (Figura 4a) tinha mais Hp 1-1 do que as outras formas e que o Pico 2 (Figura 4b) ficou mais rico nas formas de Hp mais elevadas (Hp 2-2 e 2-1) do que o Pico 1. A pureza do pico 1 foi de 67 %, e a do pico 2 foi inferior. O rendimento do pico 1 foi de aproximadamente 74 %. Como apenas uma amostra do pico dois foi tomada, o rendimento deste pico não pôde ser avaliado. Além disso, mediante a comparação dos resultados analíticos da Produção com os resultados analíticos, pode-se observar que a elevação não afeta a qualidade do produto.
EXEMPLO 5
PURIFICAÇÃO DA Hp NA SEFAROSE BUTÍLICA
[0085] A fração de Hp obtida do Exemplo 4 (pico 1) foi ainda purificada em sefarose butílica. Um MiPrep® Butyl ff pré-adensado a 20 ml, foi equilibrado com 180 ml de sulfato de amônio 1,0 M em tampão de Na2HPO4 50 mM, pH 7,0, em uma velocidade de fluxo de 4,5 ml/minuto (135 cm/hora). 40 ml do pico 1 do Exemplo 4 foram então carregados em 3,5 ml/minuto. A coluna foi então lavada com 20 ml do tampão de equilíbrio. O fluxo atravessante e a lavagem (produto de haptoglobina) foram coletados em um vaso. As moléculas ligadas (contaminantes) foram separadas por lavagem da coluna com água deionizada. O fluxo atravessante (Hp) foi analisado por HPLC-SEC. Das áreas dos picos, 98 % de proteína total eram Hp e 67 % eram Hp tendo um peso molecular de cerca de 100 kDa.
[0086] Experiências análogas foram realizadas com o uso de colunas de sefarose fenílica e sefarose octílica de alta substituição, baixa substituição e alto desempenho. A sefarose fenílica de alta substituição deu uma pureza de 99 % e um rendimento de 32 %. Os sorventes remanescentes deram purezas entre 96 % e 97 % e rendimentos entre 32 % e 61 %.
[0087] As experiências de otimização com o uso de HiPrep® Butyl ff mostraram que a) o pH deve ser entre 6 e 8, b) a concentração de sulfato de amônio deve ser entre 0,8 M e 1,2 M, c) a velocidade do fluxo de carga deve situar-se entre 1 e 3 cm/minuto.
EXEMPLO 6
ESTABILIDADE DA Hp
[0088] A Hp produzida pelos métodos da invenção foram mostradas serem resilientes a uma ampla faixa de condições de pH, tornando exeqüíveis outros esquemas de purificação que requeiram condições ácidas ou alcalinas. Em um exemplo, 3 ml de Hp do pico 1 no Exemplo 4 foram incubados com 3 ml de tampão (glicina 200 mM para pH 2, 3 e 4, NH4HCO3 200 mM para pH 11). As amostras foram tomadas em 0, 4, 7, 24, 48 e 72 horas. As amostras foram imediatamente neutralizadas com Tris 1 M-HCl, pH 7,0. As amostras foram então analisadas pela SDS-PAGE manchada de prata e os resultados da análise mostraram que a Hp pode resistir a uma faixa de pH de 4 a 11 por 72 horas. Entretanto, em pH 2 a agregação completa ocorreu dentro de 4 horas e em pH 3 a degradação parcial foi observada (como evidenciado pelas bandas extras sobre a SDS-PAGE).
[0089] Foi também mostrado que a Hp produzida pelos métodos da invenção é estável em 4 °C por períodos além de 18 meses, sem a adição de qualquer excipiente de proteína, monossacarídeo ou dissacarídeo. As temperaturas extremas, especificamente aquelas acima dos 40 °C, produzem agregação da Hp após um curto ou mais longo período, dependendo da temperatura. Por exemplo, a incubação da Hp a 60 °C por 24 horas resultou em completa agregação, como mostrado pela HPLC-SEC.
EXEMPLO 7
TRATAMENTO DE DETERGENTE SOLVENTE DA Hp
[0090] O pico 1 do Exemplo 4 foi tratado com detergente solvente seguindo-se o método da patente número EP-A 0131740. Resumidamente, 4,32 g de polissorbato 20, 1,16 g de tri-n-butilfosfato (TnBP) e 14,52 g de WFI (água para injeção) foram misturados vigorosamente por 15 minutos. 8,7 g desta mistura foram adicionados a 150 ml do pico 1 do Exemplo 4, e incubados em 25 °C por 30 minutos. A amostra foi então diluída a 475 ml com WFI. A amostra diluída foi então carregada em uma coluna de 30 ml de DEAE com tampões conforme o Exemplo 3. As moléculas não ligadas e os reagentes de detergente solvente (SD) foram separadas por lavagem da colina. A Hp foi eluída como no Exemplo 3. A Hp obtida foi analisada por a) SDS- PAGE, que mostrou que a maior parte dos contaminantes foi removida, e pelo ensaio de ligação da hemoglobina, que mostrou que 63 % da Hp ativa foram recuperados no produto. Os remanescentes 37 % foram perdidos durante a etapa de lavagem, assim mostrando que o tratamento de SD não afeta a atividade da Hp.
[0091] É igualmente possível filtrar a Hp produzida pelos métodos de purificação aqui descritos, através de um ou mais filtro(s) de vírus de 20 nm, assim teoricamente garantindo a remoção dos vírus potencialmente patogênicos, incluindo os vírus não revestidos, os quais possam não ter sido inativados pelo tratamento de SD.