ES2625511T3

ES2625511T3 - Métodos para la purificación de arylsulfatasa A

Info

Publication number: ES2625511T3
Application number: ES12738681.1T
Authority: ES
Inventors: Ying Yang; Yong Wang
Original assignee: Shire Human Genetics Therapies Inc
Current assignee: Shire Human Genetics Therapies Inc
Priority date: 2011-07-08
Filing date: 2012-07-09
Publication date: 2017-07-19
Anticipated expiration: 2032-07-09
Also published as: WO2013009686A3; US10336992B2; US20140205585A1; EP2729566B1; WO2013009686A2; US20200040317A1; EP2729566A2

Abstract

Un método para purificar la arilsulfatasa A (ASA) de una muestra; el método incluye: proporcionar una muestra de ASA, someter la muestra a una primera cromatografía de intercambio iónico que es una cromatografía de intercambio aniónico, someter la muestra a una cromatografía en modo mixto, someter la muestra a una cromatografía de interacción hidrofóbica, y someter la muestra a una segunda cromatografía de intercambio iónico, de manera que la muestra se somete a la cromatografía en modo mixto antes que a la cromatografía de interacción hidrofóbica.

Description

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Metodos para la purificacion de arylsulfatasa A

Descripcion

ANTECEDENTES

La leucodistrofia metacromatica (LMC o MLD, por sus siglas en ingles) se debe a un defecto genetico autosomico y recesivo en la enzima lisosomica arilsulfatasa A (ASA o ARSA), lo que provoca la descomposicion progresiva de las membranas de la vaina de mielina (desmielinizacion) y la acumulacion de galactosil sulfatido (sulfato de cerebrosido) en la materia blanca del sistema nervioso central (SNC o CNS, por sus siglas en ingles) y el sistema nervioso periferico. Los pacientes con leucodistrofia metacromatica pueden tratarse con terapia de sustitucion enzimatica (TSE o ERT, por sus siglas en ingles) utilizando arilsulfatasa A recombinante (rASA).

WO2005/073367 desvela un metodo para depurar o purificar la arilsulfatasa A de una muestra, de manera que el metodo comprende: proporcionar una muestra de arilsulfatasa A; someter la muestra de arilsulfatasa A a una cromatograffa de intercambio anionico, seguida de una cromatograffa de interaccion hidrofobica, seguida de una cromatograffa de intercambio cationico.

RESUMEN

La divulgacion esta relacionada, entre otros, con los metodos para producir arilsulfatasa A. Por ejemplo, la divulgacion proporciona metodos para purificar arilsulfatasa A de una muestra. Los metodos descritos en el presente texto pueden incluir uno o mas pasos de cromatograffa. Los pasos de cromatograffa ejemplares incluyen -pero no se limitan a- la cromatograffa de intercambio ionico (por ejemplo, cromatograffa de intercambio anionico o de intercambio cationico), la cromatograffa en modo mixto y la cromatograffa hidrofobica. Ademas, se desvelan composiciones (por ejemplo, composiciones farmaceuticas) que contienen la arilsulfatasa A y metodos que usan la arilsulfatasa A producida mediante los metodos descritos en el presente texto.

La invencion proporciona un metodo para depurar o purificar la arilsulfatasa A (ASA) de una muestra, el cual comprende: proporcionar una muestra de ASA; someter la muestra a una primera cromatograffa de intercambio ionico, que es una cromatograffa de intercambio anionico; someter la muestra a una cromatograffa en modo mixto; someter la muestra a una cromatograffa de interaccion hidrofobica; y someter la muestra a una segunda cromatograffa de intercambio ionico, de manera que la muestra se somete a la cromatograffa en modo mixto antes de la cromatograffa de interaccion hidrofobica.

En un aspecto, la divulgacion presenta un metodo para purificar arilsulfatasa A de una muestra. El metodo incluye, por ejemplo, proporcionar una muestra de arilsulfatasa A (por ejemplo, arilsulfatasa A recombinante) y someter la muestra a una cromatograffa de intercambio anionico, por ejemplo, la cromatograffa de intercambio anionico que se describe en el presente texto. En algunas realizaciones, la cromatograffa de intercambio anionico incluye una cromatograffa de intercambio anionico de aminas cuaternarias. La cromatograffa de intercambio anionico puede realizarse usando, por ejemplo, Q SEPHAROSE™ (Sefarosa) Fast Flow ('De flujo rapido'), Q SEPHAROSE™ High Performance ('De alto rendimiento'), Q SEPHAROSE™ XL, CAPTO™ Q, DEAE, TOYOPEARL GIGACAP® Q, FRACTOGEL® TMAE, ESHMUNO™ Q, NUVIA™ Q o UNOSPHERE™ Q.

En algunas realizaciones, el proceso de someter la muestra de arilsulfatasa A a una cromatograffa de intercambio anionico incluye: cargar la muestra de arilsulfatasa A en una columna de cromatograffa anionica, lavar la columna de cromatograffa de intercambio anionico y eluir la arilsulfatasa A de la columna.

En algunas realizaciones, para cargar la muestra de arilsulfatasa A en la columna de cromatograffa de intercambio anionico se utiliza un tampon de carga ('loading buffer', en ingles). En una realizacion, el tampon de carga no contiene cloruro de sodio. En otra realizacion, el tampon de carga contiene cloruro de sodio. Por ejemplo, el tampon de carga tiene una concentracion de cloruro de sodio de entre alrededor de 1 mM y alrededor de 25 mM, por ejemplo, de entre alrededor de 1 mM y alrededor de 10 mM, de entre alrededor de 1 mM y alrededor de 5 mM o de entre alrededor de 5 mM y alrededor de 10 mM.

En algunas realizaciones, el proceso de carga de la muestra de arilsulfatasa A en la columna de cromatograffa de intercambio anionico se realiza con un pH de entre alrededor de 5 y alrededor de 9, por ejemplo, de entre alrededor de 6 y alrededor de 8, por ejemplo, de alrededor de 7.

En algunas realizaciones, la muestra de arilsulfatasa A se carga en la columna de cromatograffa de intercambio anionico con una capacidad de enlace o capacidad de union de alrededor de 15 g/L de resina o menos, por ejemplo, de alrededor de 10 g/L de resina o menos, alrededor de 5 g/L de resina o menos, o alrededor de 2 g/L de resina o menos, por ejemplo, entre alrededor de 2 g/L de resina y alrededor de 5 g/L de resina, entre alrededor de 5 g/L de resina y alrededor de 10 g/L de resina, o entre alrededor de 10 g/L de resina y alrededor de 15 g/L de resina.

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En algunas realizaciones, el proceso para lavar la columna de cromatograffa de intercambio anionico se realiza con uno o mas tampones de lavado ('washing buffer', en ingles). Por ejemplo, el lavado de la columna de intercambio anionico puede incluir uno o mas (por ejemplo, un primer y un segundo) pasos de lavado, de manera que cada uno utiliza un tampon de lavado diferente.

En una realizacion, el tampon de lavado no contiene cloruro de sodio. En otra realizacion, el tampon de lavado contiene cloruro de sodio. Por ejemplo, el tampon de lavado tiene una concentracion de cloruro de sodio de entre alrededor de 50 mM y alrededor de 200 mM, por ejemplo, de entre alrededor de 50 mM y alrededor de 150 mM, de entre alrededor de 100 mM y alrededor de 200 mM, de entre alrededor de 100 mM y alrededor de 150 mM, por ejemplo, de alrededor de 80 mM, alrededor de 100 mM, alrededor de 120 mM o alrededor de 140 mM.

En algunas realizaciones, el lavado de la columna de cromatograffa de intercambio anionico se realiza con un pH de entre alrededor de 5 y alrededor de 9, por ejemplo, de entre alrededor de 6 y alrededor de 8, por ejemplo, de alrededor de 7.

En algunas realizaciones, para eluir la arilsulfatasa A de la columna de cromatograffa de intercambio anionico se utiliza un tampon de elucion.

En algunas realizaciones, el tampon de elucion contiene cloruro de sodio. Por ejemplo, el tampon de elucion tiene una concentracion de cloruro de sodio de entre alrededor de 100 mM y alrededor de 500 mM, por ejemplo, de entre alrededor de 100 mM y alrededor de 300 mM, o de entre alrededor de 200 mM y alrededor de 400 mM, por ejemplo, de alrededor de 180 mM, alrededor de 200 mM, alrededor de 220 mM, alrededor de 240 mM, alrededor de 260 mM o alrededor de 280 mM.

En algunas realizaciones, para eluir la arilsulfatasa A de la columna de cromatograffa de intercambio anionico se utiliza un pH de entre alrededor de 5 y alrededor de 9, por ejemplo, de entre alrededor de 6 y alrededor de 8, por ejemplo, de alrededor de 7.

En algunas realizaciones, el proceso para eluir la arilsulfatasa A de la columna de cromatograffa de intercambio anionico incluye uno o mas pasos de extraccion o recogida en el pico de elucion ('elution peak collection', en ingles). Por ejemplo, la recogida en el pico de elucion comienza desde alrededor de 50 mAU (o mUA) en el lado ascendente hasta alrededor de 50 mAU en el lado descendente, por ejemplo, desde alrededor de 100 mAU en el lado ascendente hasta alrededor de 50 mAU en el lado descendente, desde alrededor de 200 mAU en el lado ascendente hasta alrededor de 50 mAU en el lado descendente, desde alrededor de 50 mAU en el lado ascendente hasta alrededor de 100 mAU en el lado descendente, desde alrededor de 50 mAU en el lado ascendente hasta alrededor de 200 mAU en el lado descendente, o desde alrededor de 100 mAU en el lado ascendente hasta alrededor de 100 mAU en el lado descendente, por ejemplo, tal y como se determina mediante una espectrofotometna, por ejemplo, a 280 nM.

El tampon de carga, el tampon de lavado y el tampon de elucion que se describen en el presente texto pueden incluir uno o mas agentes amortiguadores. Por ejemplo, el agente amortiguador puede ser TRIS, HEPES, MOPS, PIPES, SSC, MES, fosfato de sodio, acetato de sodio, o una combinacion de estos compuestos. El agente amortiguador tiene una concentracion de entre alrededor de 1 mM y alrededor de 500 mM, por ejemplo, de entre alrededor de 10 mM y alrededor de 250 mM, de entre alrededor de 20 mM y alrededor de 100 mM, de entre alrededor de 1 mM y 5 mM, de entre alrededor de 5 mM y 10 mM, de entre alrededor de 10 mM y 50 mM, o de entre alrededor de 50 mM y alrededor de 100 mM, por ejemplo, alrededor de 1 mM, alrededor de 5 mM, alrededor de 10 mM, alrededor de 20 mM, alrededor de 30 mM, alrededor de 40 mM o alrededor de 50 mM.

En algunas realizaciones, el proceso de someter la muestra de arilsulfatasa A a una cromatograffa de intercambio anionico se realiza a una temperatura de alrededor de 23° C o menos, alrededor de 18° C o menos, o alrededor de 16° C o menos, por ejemplo, alrededor de 23° C, alrededor de 20° C, alrededor de 18° C o alrededor de 16° C.

En una realizacion, la arilsulfatasa A se depura a pequena escala o escala de laboratorio. En otra realizacion, la arilsulfatasa A se depura a escala de fabricacion.

En algunas realizaciones, el rendimiento de la actividad de la arilsulfatasa A es de al menos alrededor de un 75%, por ejemplo, al menos alrededor de un 85%, por ejemplo, entre alrededor de un 85% y alrededor de un 99%, o entre alrededor de un 90% y alrededor de un 99%.

En algunas realizaciones, el rendimiento proteico (UA, Unidades de Absorbancia o AU, por sus siglas en ingles) es de entre alrededor del 10% y el 50%, por ejemplo, de entre alrededor del 20% y alrededor del 35%, o de entre alrededor del 25% y alrededor del 30%, por ejemplo, tal y como se determina mediante una espectrofotometna, por ejemplo, a 280 nM.

En algunas realizaciones, el valor de reduccion logantmica (LRV, por sus siglas en ingles) de las protemas

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de celulas huesped (HCP, por sus siglas en ingles) es de entre alrededor de 0,5 y alrededor de 1,0, por ejemplo, entre alrededor de 0,6 y 0,9, o entre alrededor de 0,7 y 0,8.

En algunos metodos de la presente invencion, el metodo incluye, ademas, someter la muestra de arilsulfatasa A a una cromatograffa en modo mixto, que puede incluir, por ejemplo, una cromatograffa de hidroxiapatita ceramica (HA), por ejemplo, una cromatograffa de hidroxiapatita de tipo I o de tipo II, por ejemplo, tal y como se describe en el presente texto. En algunas realizaciones, la muestra de arilsulfatasa A se somete a una cromatograffa de intercambio anionico previamente a la cromatograffa en modo mixto.

En algunos metodos de la presente invencion, el metodo incluye, ademas, someter la muestra de arilsulfatasa A a una cromatograffa de interaccion hidrofobica (HIC, por sus siglas en ingles), por ejemplo, una cromatograffa de fenilo, por ejemplo, tal y como se describe en el presente texto. En algunas realizaciones, la muestra de arilsulfatasa A se somete a una cromatograffa de intercambio anionico previamente a la HIC.

En algunas realizaciones, el metodo incluye, ademas, someter la muestra de arilsulfatasa A a una cromatograffa de intercambio cationico, por ejemplo, una cromatograffa de intercambio cationico con sulfopropilo (SP), por ejemplo, tal y como se describe en el presente texto. En algunas realizaciones, la muestra de arilsulfatasa A se somete a una cromatograffa de intercambio anionico previamente a la cromatograffa de intercambio cationico.

En algunas realizaciones, un metodo incluye, adicionalmente, recoger la muestra de arilsulfatasa A, por ejemplo, mediante un metodo que incluye ultrafiltracion de flujo tangencial.

En algunas realizaciones, adicionalmente el metodo incluye someter la muestra de arilsulfatasa A a una filtracion en profundidad, por ejemplo, usando un filtro de profundidad ZETA PLUS®.

En algunas realizaciones, adicionalmente el metodo incluye someter la muestra de arilsulfatasa A a una inactivacion viral. En una realizacion, la inactivacion viral comprende un disolvente y/o un detergente. El disolvente o detergente puede incluir, por ejemplo, polisorbato 80, Tri-n-Butil-Fosfato (TnBP) o ambos. En otra realizacion, la inactivacion viral comprende la filtracion de virus, por ejemplo, usando un filtro PLANOVA™.

En algunas realizaciones, adicionalmente el metodo incluye concentrar y/o filtrar la muestra de arilsulfatasa A, por ejemplo, mediante ultrafiltracion y/o diafiltracion, por ejemplo, mediante ultrafiltracion de flujo tangencial.

En algunas realizaciones, la actividad espedfica de la arilsulfatasa A purificada es de -al menos- entre alrededor de 50 U/mg y alrededor de 140 U/mg, por ejemplo, al menos alrededor de 70 U/mg, al menos alrededor de 90 U/mg, al menos alrededor de 100 U/mg, o al menos alrededor de 120 U/mg, por ejemplo, tal y como se determina mediante un metodo descrito en el presente texto.

En algunas realizaciones, la arilsulfatasa A se purifica hasta al menos alrededor de un 95%, al menos alrededor de un 98%, al menos alrededor de un 99%, al menos alrededor de un 99,5%, al menos alrededor de un 99,6%, al menos alrededor de un 99,7%, al menos alrededor de un 99,8%, o al menos alrededor de un 99,9%. La pureza de la arilsulfatasa A puede medirse, por ejemplo, mediante uno o mas de los siguientes metodos: 'Western blot' de las protemas de celulas huesped (HCP), SDS-PAGE con tincion de Coomasie, SDS-PAGE con tincion con plata, HPLC de fase inversa y HPLC de exclusion de tamano.

En algunas realizaciones, adicionalmente el metodo incluye preparar o formular la arilsulfatasa A purificada. El tampon utilizado para preparar la arilsulfatasa A purificada puede incluir, por ejemplo, cloruro de sodio.

En un aspecto, la divulgacion presenta un metodo para purificar arilsulfatasa A de una muestra, de manera que el metodo incluye, por ejemplo, proporcionar una muestra de arilsulfatasa A (por ejemplo, arilsulfatasa A recombinante) y someter la muestra de arilsulfatasa A a una cromatograffa en modo mixto, por ejemplo, la cromatograffa en modo mixto que se describe en el presente texto; como, por ejemplo, un metodo que incluye una cromatograffa de hidroxiapatita ceramica (HA), por ejemplo, una cromatograffa de hidroxiapatita de tipo I o de tipo II. En algunas realizaciones, la cromatograffa en modo mixto se realiza usando uno o mas de los siguientes: medios o materiales de ceramica de Hidroxiapatita de Tipo I CHTTM, medios o materiales de ceramica de Hidroxiapatita de Tipo II CHTTM, HT Hidroxiapatita de BIO-GEL® y HTP Hidroxiapatita de BIO-GEL®.

En algunas realizaciones, el proceso de someter la muestra de arilsulfatasa A a una cromatograffa en modo mixto incluye: cargar la muestra de arilsulfatasa A en una columna de cromatograffa en modo mixto (por ejemplo, cromatograffa de HA), lavar la columna de la cromatograffa en modo mixto y eluir la arilsulfatasa A de la columna.

En algunas realizaciones, para cargar la muestra de arilsulfatasa A en la columna de cromatograffa en modo mixto se utiliza un tampon de carga. En una realizacion, el tampon de carga contiene fosfato de sodio. Por ejemplo, el tampon de carga tiene una concentracion de fosfato de sodio de entre alrededor de 1 mM y alrededor de 10 mM, por ejemplo, de entre alrededor de 1 mM y alrededor de 5 mM, de entre alrededor de 5 mM y alrededor de 10 mM, por ejemplo, alrededor de 1 mM, alrededor de 2 mM, o alrededor de 5 mM. En otra realizacion, el tampon de

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carga contiene cloruro de sodio. Por ejemplo, el tampon de carga tiene una concentracion de cloruro de sodio de entre alrededor de 100 mM y alrededor de 400 mM, por ejemplo, de entre alrededor de 200 mM y alrededor de 300 mM, por ejemplo, alrededor de 220 mM, alrededor de 240 mM, alrededor de 260 mM, o alrededor de 280 mM.

En algunas realizaciones, el proceso de carga de la muestra de arilsulfatasa A en la columna de cromatograffa en modo mixto se realiza con un pH de entre alrededor de 5 y alrededor de 9, por ejemplo, de entre alrededor de 6 y alrededor de 8, por ejemplo, de alrededor de 7.

En algunas realizaciones, la muestra de arilsulfatasa A se carga en la columna de cromatograffa en modo mixto con una capacidad de enlace o capacidad de union de alrededor de 23 AU/L de resina o menos, por ejemplo, alrededor de 19 Au/L de resina o menos, alrededor de 15 AU/L de resina o menos, o alrededor de 12 AU/L de resina o menos, por ejemplo, entre alrededor de 12 AU/L de resina y alrededor de 15 AU/L de resina, o entre alrededor de 15 AU/L de resina y alrededor de 19 AU/L de resina.

En algunas realizaciones, el proceso para lavar la columna de cromatograffa en modo mixto se realiza con uno o mas tampones de lavado. Por ejemplo, el lavado de la columna de cromatograffa en modo mixto puede incluir uno o mas (por ejemplo, un primer y un segundo) pasos de lavado, de manera que cada uno utiliza un tampon de lavado diferente.

En una realizacion, el tampon de lavado contiene fosfato de sodio. Por ejemplo, el tampon de lavado tiene una concentracion de fosfato de sodio de entre alrededor de 1 mM y alrededor de 10 mM, por ejemplo, de entre alrededor de 1 mM y alrededor de 5 mM, de entre alrededor de 5 mM y alrededor de 10 mM, por ejemplo, de alrededor de 1 mM, alrededor de 5 mM o alrededor de 10 mM. En otra realizacion, el tampon de lavado contiene cloruro de sodio. Por ejemplo, el tampon de lavado tiene una concentracion de cloruro de sodio de entre alrededor de 50 mM y alrededor de 600 mM, por ejemplo, de entre alrededor de 100 mM y alrededor de 500 mM, o de entre alrededor de 200 mM y alrededor de 400 mM, por ejemplo, alrededor de 220 mM, alrededor de 240 mM, alrededor de 260 mM, o alrededor de 280 mM.

En algunas realizaciones, el lavado de la columna de cromatograffa en modo mixto se realiza con un pH de entre alrededor de 5 y alrededor de 9, por ejemplo, de entre alrededor de 6 y alrededor de 8, por ejemplo, de alrededor de 7.

En algunas realizaciones, para eluir la arilsulfatasa A de la columna de cromatograffa en modo mixto se utiliza un tampon de elucion.

En una realizacion, el tampon de elucion contiene fosfato de sodio. Por ejemplo, el tampon de elucion tiene una concentracion de fosfato de sodio de entre alrededor de 20 mM y alrededor de 50 mM, por ejemplo, de entre alrededor de 25 mM y alrededor de 45 mM, por ejemplo, de alrededor de 30 mM, alrededor de 35 mM, o alrededor de 40 mM. En otra realizacion, el tampon de elucion no contiene cloruro de sodio. En otra realizacion, el tampon de elucion contiene cloruro de sodio. Por ejemplo, el tampon de elucion tiene una concentracion de cloruro de sodio de entre alrededor de 200 mM y alrededor de 300 mM, por ejemplo, de entre alrededor de 240 mM y alrededor de 280 mM.

En algunas realizaciones, para eluir la arilsulfatasa A de la columna de cromatograffa en modo mixto se utiliza un pH de entre alrededor de 5 y alrededor de 9, por ejemplo, de entre alrededor de 6 y alrededor de 8, por ejemplo, de alrededor de 7.

En algunas realizaciones, el proceso para eluir la arilsulfatasa A de la columna de cromatograffa en modo mixto incluye uno o mas pasos de recogida en el pico de elucion ('elution peak collection', en ingles). Por ejemplo, la recogida en el pico de elucion comienza desde alrededor de 50 mAU (o mUA) en el lado ascendente hasta alrededor de 50 mAU en el lado descendente, por ejemplo, desde alrededor de 100 mAU en el lado ascendente hasta alrededor de 50 mAU en el lado descendente, desde alrededor de 200 mAU en el lado ascendente hasta alrededor de 50 mAU en el lado descendente, desde alrededor de 50 mAU en el lado ascendente hasta alrededor de 100 mAU en el lado descendente, desde alrededor de 50 mAU en el lado ascendente hasta alrededor de 200 mAU en el lado descendente, o desde alrededor de 100 mAU en el lado ascendente hasta alrededor de 100 mAU en el lado descendente, por ejemplo, tal y como se determina mediante una espectrofotometffa, por ejemplo, a 280 nM.

El tampon de carga, el tampon de lavado y el tampon de elucion que se describen en el presente texto pueden incluir uno o mas agentes amortiguadores. Por ejmeplo, el agente amortiguador puede ser TRIS, HEPES, MOPS, PIPES, SSC, MES, fosfato de sodio, acetato de sodio, o una combinacion de estos compuestos. El agente amortiguador tiene una concentracion de entre alrededor de 1 mM y alrededor de 500 mM, por ejemplo, de entre alrededor de 10 mM y alrededor de 250 mM, de entre alrededor de 20 mM y alrededor de 100 mM, de entre alrededor de 1 mM y 5 mM, de entre alrededor de 5 mM y 10 mM, de entre alrededor de 10 mM y 50 mM, o de entre alrededor de 50 mM y alrededor de 100 mM, por ejemplo, alrededor de 1 mM, alrededor de 5 mM, alrededor de 10 mM, alrededor de 20 mM, alrededor de 30 mM, alrededor de 40 mM o alrededor de 50 mM.

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En algunas realizaciones, el proceso de someter la muestra de arilsulfatasa A a una cromatograffa en modo mixto se realiza a una temperatura de alrededor de 23° C o menos, alrededor de 18° C o menos, o alrededor de 16° C o menos, por ejemplo, alrededor de 23° C, alrededor de 20° C, alrededor de 18° C o alrededor de 16° C.

En algunas realizaciones, el rendimiento de la actividad de la arilsulfatasa A es de al menos alrededor de un 80%, por ejemplo, al menos alrededor de un 90%, por ejemplo, entre alrededor de un 80% y alrededor de un 115%.

En algunas realizaciones, el rendimiento proteico (UA, Unidades de Absorbancia o AU, por sus siglas en ingles) es de entre alrededor del 30% y alrededor del 80%, por ejemplo, de entre alrededor del 35% y alrededor del 75%, o de entre alrededor del 50% y alrededor del 70%, por ejemplo, tal y como se determina mediante una espectrofotometna, por ejemplo, a 280 nm.

En algunas realizaciones, el valor de reduccion logantmica (LRV) de las protemas de celulas huesped (HCP) es de entre alrededor de 0,3 y alrededor de 0,6, por ejemplo, entre alrededor de 0,4 y 0,5.

En algunos metodos de la presente invencion, el metodo incluye, ademas, someter la muestra de arilsulfatasa A a una cromatograffa de interaccion hidrofobica (HIC), por ejemplo, una cromatograffa de fenilo, por ejemplo, tal y como se describe en el presente texto, y la muestra de arilsulfatasa A se somete a una cromatograffa en modo mixto previamente a la HIC.

En otro aspecto, la divulgacion proporciona un metodo para purificar arilsulfatasa A de una muestra, de manera que el metodo incluye, por ejemplo, proporcionar una muestra de arilsulfatasa A (por ejemplo, arilsulfatasa A recombinante), y someter la muestra de arilsulfatasa A a cromatograffa de interaccion hidrofobica (HIC), por ejemplo, la cromatograffa de interaccion hidrofobica que se describe en el presente texto. En una realizacion, la cromatograffa de interaccion hidrofobica incluye una cromatograffa de fenilo. En otras realizaciones, la cromatograffa de interaccion hidrofobica incluye una cromatograffa de butilo o una cromatograffa de octilo.

En algunas realizaciones, la cromatograffa de interaccion hidrofobica incluye una cromatograffa de fenilo que utiliza uno o mas de los siguientes compuestos: Phenyl SEPHAROSE™ High Performance, Phenyl

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SEPHAROSE™ 6 Fast Flow ('low sub'), o Phenyl SEPHAROSE™ 6 Fast Flow ('high sub').

En algunas realizaciones, el proceso de someter la muestra de arilsulfatasa A a una cromatograffa de interaccion hidrofobica incluye: cargar la muestra de arilsulfatasa A en la columna de HIC, lavar la columna de HIC y eluir la arilsulfatasa A de la columna.

En algunas realizaciones, para cargar la muestra de arilsulfatasa A en la columna de HIC se utiliza un tampon de carga. En una realizacion, el tampon de carga contiene cloruro de sodio. Por ejemplo, el tampon de carga tiene una concentracion de cloruro de sodio de entre alrededor de 0,5 M y alrededor de 2,5 M, por ejemplo, de alrededor de 1 M o alrededor de 1,5 M. En otra realizacion, el tampon de carga contiene fosfato de sodio. Por ejemplo, el tampon de carga tiene una concentracion de fosfato de sodio de entre alrededor de 10 mM y alrededor de 100 mM, por ejemplo, alrededor de 25 mM, alrededor de 50 mM, o alrededor de 75 mM.

En algunas realizaciones, el proceso de carga de la muestra de arilsulfatasa A en la columna de HIC se realiza con un pH de entre alrededor de 5 y alrededor de 7, por ejemplo, de entre alrededor de 5,5 y alrededor de 6,5, por ejemplo, de alrededor de 5,5, alrededor de 6,0 o alrededor de 6,5.

En algunas realizaciones, la muestra de arilsulfatasa A se carga en la columna de HIC con una capacidad de enlace o capacidad de union de alrededor de 12 AU/L de resina o menos, por ejemplo, alrededor de 10 Au/L de resina o menos, alrededor de 9 AU/L de resina o menos, alrededor de 7 AU/L de resina o menos, o alrededor de 5 AU/L de resina o menos, por ejemplo, entre alrededor de 5 AU/L de resina y alrededor de 9 AU/L de resina, o entre alrededor de 5 AU/L de resina y alrededor de 7 AU/L de resina.

En algunas realizaciones, el proceso para lavar la columna de HIC se realiza con uno o mas tampones de lavado. Por ejemplo, el lavado de la columna de HIC puede incluir uno o mas (por ejemplo, un primer y un segundo) pasos de lavado, de manera que cada uno utiliza un tampon de lavado diferente.

En una realizacion, el tampon de lavado contiene cloruro de sodio. Por ejemplo, el tampon de lavado tiene una concentracion de cloruro de sodio de entre alrededor de 100 mM y alrededor de 1,5 M, por ejemplo, de entre alrededor de 250 mM y alrededor de 1 M, por ejemplo, alrededor de 250 mM, alrededor de 500 mM, alrededor de 750 mM, o alrededor de 1 M. En otra realizacion, el tampon de lavado contiene fosfato de sodio. Por ejemplo, el tampon de carga tiene una concentracion de fosfato de sodio de entre alrededor de 10 mM y alrededor de 100 mM, por ejemplo, de alrededor de 25 mM, alrededor de 50 mM o alrededor de 75 mM.

En algunas realizaciones, el proceso de lavado de la columna de HIC se realiza con un pH de entre alrededor de 5 y alrededor de 7, por ejemplo, de entre alrededor de 5,5 y alrededor de 6,5, por ejemplo, de alrededor de 5,5, alrededor de 6,0 o alrededor de 6,5.

En algunas realizaciones, para eluir la arilsulfatasa A de la columna de HIC se utiliza un tampon de elucion.

En algunas realizaciones, el tampon de elucion contiene cloruro de sodio. Por ejemplo, el tampon de elucion tiene una concentracion de cloruro de sodio de entre alrededor de 30 mM y alrededor de 100 mM, por ejemplo, de entre alrededor de 45 mM y alrededor de 85 mM, por ejemplo, de alrededor de 50 mM, alrededor de 60 mM, alrededor de 70 mM o alrededor de 80 mM.

En algunas realizaciones, para eluir la arilsulfatasa A de la columna de HIC se utiliza un pH de entre alrededor de 5 y alrededor de 9, por ejemplo, de entre alrededor de 6 y alrededor de 8, por ejemplo, de alrededor de 7.

En algunas realizaciones, el proceso para eluir la arilsulfatasa A de la columna de HIC incluye uno o mas pasos de recogida en el pico de elucion ('elution peak collection', en ingles). Por ejemplo, la recogida en el pico de elucion comienza desde alrededor de 50 mAU (o mUA) en el lado ascendente hasta alrededor de 50 mAU en el lado descendente, por ejemplo, desde alrededor de 100 mAU en el lado ascendente hasta alrededor de 50 mAU en el lado descendente, desde alrededor de 200 mAU en el lado ascendente hasta alrededor de 50 mAU en el lado descendente, desde alrededor de 50 mAU en el lado ascendente hasta alrededor de 100 mAU en el lado descendente, desde alrededor de 50 mAU en el lado ascendente hasta alrededor de 200 mAU en el lado descendente, o desde alrededor de 100 mAU en el lado ascendente hasta alrededor de 100 mAU en el lado descendente, por ejemplo, tal y como se determina mediante una espectrofotometna, por ejemplo, a 280 nM.

El tampon de carga, el tampon de lavado y el tampon de elucion que se describen en el presente texto pueden incluir uno o mas agentes amortiguadores. Por ejemplo, el agente amortiguador puede ser TRIS, HEPES, MOPS, PIPES, SSC, MES, fosfato de sodio, acetato de sodio, o una combinacion de estos compuestos. El agente amortiguador tiene una concentracion de entre alrededor de 1 mM y alrededor de 500 mM, por ejemplo, de entre alrededor de 10 mM y alrededor de 250 mM, de entre alrededor de 20 mM y alrededor de 100 mM, de entre alrededor de 1 mM y 5 mM, de entre alrededor de 5 mM y 10 mM, de entre alrededor de 10 mM y 50 mM, o de entre alrededor de 50 mM y alrededor de 100 mM, por ejemplo, alrededor de 1 mM, alrededor de 5 mM, alrededor de 10

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mM, alrededor de 20 mM, alrededor de 30 mM, alrededor de 40 mM o alrededor de 50 mM.

En algunas realizaciones, el proceso de someter la muestra de arilsulfatasa A a una HIC se realiza a una temperature de alrededor de 23° C o menos, alrededor de 18° C o menos, o alrededor de 16° C o menos, por ejemplo, alrededor de 23° C, alrededor de 20° C, alrededor de 18° C o alrededor de 16° C.

En algunas realizaciones, el rendimiento de la actividad de la arilsulfatasa A es de al menos alrededor de un 60%, por ejemplo, al menos alrededor de un 70%, por ejemplo, entre alrededor de un 70% y alrededor de un 100%.

En algunas realizaciones, el rendimiento proteico (UA, Unidades de Absorbancia o AU, por sus siglas en ingles) es de entre alrededor del 45% y alrededor del 100%, por ejemplo, de entre alrededor del 50% y alrededor del 95%, o de entre alrededor del 55% y alrededor del 90%, por ejemplo, tal y como se determina mediante una espectrofotometffa, por ejemplo, a 280 nm.

En algunas realizaciones, el valor de reduccion logafftmica (LRV) de las proternas de celulas huesped (HCP) es de entre alrededor de 0,6 y alrededor de 1,2, por ejemplo, entre alrededor de 0,7 y 0,95.

En algunos metodos de la presente invencion, el metodo incluye, ademas, someter la muestra de arilsulfatasa A a una cromatograffa de intercambio cationico, por ejemplo, una cromatograffa de intercambio cationico con sulfopropilo (SP), por ejemplo, tal y como se describe en el presente texto. En algunas realizaciones, la muestra de arilsulfatasa A se somete a una HIC previamente a la cromatograffa de intercambio cationico.

En algunas realizaciones, adicionalmente el metodo incluye someter la muestra de arilsulfatasa A a una inactivacion (o desactivacion) viral. En una realizacion, la inactivacion viral comprende un disolvente y/o un detergente. El disolvente o detergente puede incluir, por ejemplo, polisorbato 80, Tri-n-Butil-Fosfato (TnBP) o ambos. En otra realizacion, la inactivacion viral comprende la filtracion de virus, por ejemplo, usando un filtro PLANOVA™.

En algunas realizaciones, la arilsulfatasa A se purifica hasta al menos alrededor de un 95%, al menos alrededor de un 98%, al menos alrededor de un 99%, al menos alrededor de un 99,5%, al menos alrededor de un 99,6%, al menos alrededor de un 99,7%, al menos alrededor de un 99,8%, o al menos alrededor de un 99,9%. La pureza de la arilsulfatasa A puede medirse, por ejemplo, mediante uno o mas de los siguientes metodos: 'Western blot' de las proternas de celulas huesped (HCP), SDS-PAGE con tincion de Coomasie, SDS-PAGE con tincion con plata, HPLC de fase inversa y HPLC de exclusion de tamano.

En otro aspecto, la divulgacion proporciona un metodo para purificar arilsulfatasa A de una muestra, de manera que el metodo incluye, por ejemplo, proporcionar una muestra de arilsulfatasa A (por ejemplo, arilsulfatasa A recombinante), y someter la muestra a una cromatograffa de intercambio cationico, por ejemplo, la cromatograffa de intercambio cationico que se describe en el presente texto.

En una realizacion, la cromatograffa de intercambio cationico incluye una cromatograffa de intercambio cationico con sulfopropilo (SP). En otra realizacion, la cromatograffa de intercambio cationico es un paso o metodo de pulido. La cromatograffa de intercambio cationico (por ejemplo, cromatograffa de intercambio cationico con sulfopropilo -SP-) puede realizarse utilizando, por ejemplo, uno o mas de los siguientes: TOYOPEARL® SP-650, TOYOPEARL® SP-550, TSKGEL® SP-3PW, TSKGEL® SP-5PW, SP SEPHAROSE™ Fast Flow ('Flujo rapido'), SP SEPHAROSE™ High Performance ('Alto rendimiento'), SP SEPHAROSE™ XL, membrana de SARTOBIND® S, POROS® HS50, UNOSPHERE™ S y MACROCAP™ S.

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En algunas realizaciones, el proceso de someter la muestra de arilsulfatasa A a una cromatograffa de intercambio cationico incluye: cargar la muestra de arilsulfatasa A en una columna de cromatograffa cationica (por ejemplo, una columna de intercambio cationico con sulfopropilo -SP-), lavar la columna de cromatograffa de intercambio cationico y eluir la arilsulfatasa A de la columna.

En algunas realizaciones, para cargar la muestra de arilsulfatasa A en la columna de cromatograffa de intercambio cationico se utiliza un tampon de carga. En una realizacion, el tampon de carga contiene cloruro de sodio. Por ejemplo, el tampon de carga tiene una concentracion de cloruro de sodio de entre alrededor de 1 mM y alrededor de 25 mM, por ejemplo, de entre alrededor de 5 mM y alrededor de 20 mM, por ejemplo, alrededor de 5 mM, alrededor de 10 mM, alrededor de 15 mM o alrededor de 20 mM. En otra realizacion, el tampon de lavado contiene acetato de sodio. Por ejemplo, el tampon de carga tiene una concentracion de acetato de sodio de entre alrededor de 10 mM y alrededor de 100 mM, por ejemplo, alrededor de 20 mM, alrededor de 40 mM o alrededor de 60 mM.

En algunas realizaciones, el proceso de carga de la muestra de arilsulfatasa A en la columna de cromatograffa de intercambio cationico se realiza con un pH de entre alrededor de 3,0 y alrededor de 6,0, por ejemplo, de entre alrededor de 4,0 y alrededor de 5,0, por ejemplo, de alrededor de 4,0, alrededor de 4,3 o alrededor de 4,5.

En algunas realizaciones, la muestra de arilsulfatasa A se carga en la columna de cromatograffa de intercambio cationico con una capacidad de enlace o capacidad de union de alrededor de 15 AU/L de resina o menos, por ejemplo, alrededor de 14 AU/L de resina o menos, o alrededor de 12 AU/L de resina o menos, por ejemplo, entre alrededor de 10 AU/L de resina y alrededor de 14 AU/L de resina, o entre alrededor de 10 AU/L de resina y alrededor de 12 AU/L de resina.

En algunas realizaciones, el proceso para lavar la columna de cromatograffa de intercambio cationico se realiza con uno o mas tampones de lavado. Por ejemplo, el lavado de la columna de intercambio cationico puede incluir uno o mas (por ejemplo, un primer y un segundo) pasos de lavado, de manera que cada uno utiliza un tampon de lavado diferente.

En una realizacion, el tampon de lavado contiene cloruro de sodio. Por ejemplo, el tampon de carga tiene una concentracion de cloruro de sodio de entre alrededor de 1 mM y alrededor de 25 mM, por ejemplo, de entre alrededor de 5 mM y alrededor de 20 mM, o de entre alrededor de 10 mM y alrededor de 15 mM, por ejemplo, alrededor de 5 mM, alrededor de 10 mM, alrededor de 15 mM o alrededor de 20 mM. En otra realizacion, el tampon de lavado contiene acetato de sodio. Por ejemplo, el tampon de carga tiene una concentracion de acetato de sodio de entre alrededor de 10 mM y alrededor de 100 mM, por ejemplo, alrededor de 20 mM, alrededor de 40 mM o alrededor de 60 mM.

En algunas realizaciones, el proceso de lavado de la columna de cromatograffa de intercambio cationico se realiza con un pH de entre alrededor de 3,0 y alrededor de 6,0, por ejemplo, de entre alrededor de 4,0 y alrededor de 5,0, por ejemplo, de alrededor de 4,0, alrededor de 4,3 o alrededor de 4,5.

En algunas realizaciones, para eluir la arilsulfatasa A de la columna de cromatograffa de intercambio cationico se utiliza un tampon de elucion.

En una realizacion, el tampon de elucion contiene cloruro de sodio. Por ejemplo, el tampon de elucion tiene una concentracion de cloruro de sodio de entre alrededor de 25 mM y alrededor de 75 mM, por ejemplo, de entre alrededor de 45 mM y alrededor de 60 mM, por ejemplo, de alrededor de 45 mM, alrededor de 50 mM, alrededor de 55 mM o alrededor de 60 mM. En otra realizacion, el tampon de lavado contiene acetato de sodio. Por ejemplo, el tampon de carga tiene una concentracion de acetato de sodio de entre alrededor de 10 mM y alrededor de 100 mM, por ejemplo, de alrededor de 20 mM, alrededor de 40 mM o alrededor de 60 mM.

En algunas realizaciones, para eluir la arilsulfatasa A de la columna de cromatograffa de intercambio cationico se utiliza un pH de entre alrededor de 3,0 y alrededor de 6,0, por ejemplo, de entre alrededor de 4,0 y alrededor de 5,0, por ejemplo, de alrededor de 4,0, alrededor de 4,3 o alrededor de 4,5.

En algunas realizaciones, el proceso para eluir la arilsulfatasa A de la columna de cromatograffa de intercambio cationico incluye uno o mas pasos de recogida en el pico de elucion ('elution peak collection', en ingles). Por ejemplo, la recogida en el pico de elucion comienza desde alrededor de 50 mAU (o mUA) en el lado ascendente hasta alrededor de 50 mAU en el lado descendente, por ejemplo, desde alrededor de 100 mAU en el lado ascendente hasta alrededor de 50 mAU en el lado descendente, desde alrededor de 200 mAU en el lado ascendente hasta alrededor de 50 mAU en el lado descendente, desde alrededor de 50 mAU en el lado ascendente hasta alrededor de 100 mAU en el lado descendente, desde alrededor de 50 mAU en el lado ascendente hasta alrededor de 200 mAU en el lado descendente, o desde alrededor de 100 mAU en el lado ascendente hasta alrededor de 100 mAU en el lado descendente, por ejemplo, tal y como se determina mediante una espectrofotometffa, por ejemplo, a 280 nM.

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En algunas realizaciones, el proceso de someter la muestra de arilsulfatasa A a una cromatograffa de intercambio cationico se realiza a una temperatura de alrededor de 23° C o menos, alrededor de 18° C o menos, o alrededor de 16° C o menos, por ejemplo, alrededor de 23° C, alrededor de 20° C, alrededor de 18° C o alrededor de 16° C. En algunas realizaciones, el proceso de someter la muestra de arilsulfatasa A a una cromatograffa de intercambio cationico se realiza a una temperatura de entre alrededor de 23° C y alrededor de 16° C, por ejemplo, alrededor de 23° C, alrededor de 20° C, alrededor de 18° C o alrededor de 16° C, y para cargar la muestra de arilsulfatasa A en la columna de cromatograffa de intercambio cationico se utiliza un pH de entre alrededor de 4,5 y alrededor de 4,3, por ejemplo, de alrededor de 4,5, alrededor de 4,4 o alrededor de 4,3. En algunas realizaciones, el proceso de someter la muestra de arilsulfatasa A a la cromatograffa de intercambio cationico se realiza a alrededor de 23° C y el proceso de cargar la muestra de arilsulfatasa A en la columna de cromatograffa de intercambio cationico se realiza con un pH de alrededor de 4,5. En algunas realizaciones, el proceso de someter la muestra de arilsulfatasa A a la cromatograffa de intercambio cationico se realiza a alrededor de 23° C y el proceso de cargar la muestra de arilsulfatasa A en la columna de cromatograffa de intercambio cationico se realiza con un pH de alrededor de 4,3. En algunas realizaciones, el proceso de someter la muestra de arilsulfatasa A a la cromatograffa de intercambio cationico se realiza a alrededor de 18° C y el proceso de cargar la muestra de arilsulfatasa A en la columna de cromatograffa de intercambio cationico se realiza con un pH de alrededor de 4,5. En algunas realizaciones, el proceso de someter la muestra de arilsulfatasa A a la cromatograffa de intercambio cationico se realiza a alrededor de 18° C y el proceso de cargar la muestra de arilsulfatasa A en la columna de cromatograffa de intercambio cationico se realiza con un pH de alrededor de 4,3.

En algunas realizaciones, el rendimiento de la actividad de la arilsulfatasa A es de al menos alrededor de un 75%, por ejemplo, al menos alrededor de un 80%, por ejemplo, entre alrededor de un 80% y alrededor de un 105%.

En algunas realizaciones, el rendimiento proteico (UA, Unidades de Absorbancia o AU, por sus siglas en ingles) es de entre alrededor del 65% y alrededor del 100%, por ejemplo, de entre alrededor del 70% y alrededor del 95%, tal y como se determina mediante una espectrofotometna, por ejemplo, a 280 nm.

En algunas realizaciones, el valor de reduccion logantmica (LRV) de las protemas de celulas huesped (HCP) es de entre alrededor de 1,0 y alrededor de 2,5, por ejemplo, entre alrededor de 1,5 y alrededor de 2,0, o entre alrededor de 1,7 y alrededor de 1,9.

La actividad espedfica de la arilsulfatasa A purificada puede ser de -al menos- entre alrededor de 50 U/mg y alrededor de 140 U/mg, por ejemplo, al menos alrededor de 70 U/mg, al menos alrededor de 90 U/mg, al menos alrededor de 100 U/mg, o al menos alrededor de 120 U/mg, por ejemplo, tal y como se determina mediante un metodo descrito en el presente texto.

En algunas realizaciones, la arilsulfatasa A se purifica hasta al menos alrededor de un 95%, al menos alrededor de un 98%, al menos alrededor de un 99%, al menos alrededor de un 99,5%, al menos alrededor de un 99,6%, al menos alrededor de un 99,7%, al menos alrededor de un 99,8% o al menos alrededor de un 99,9%. La pureza de la arilsulfatasa A puede medirse, por ejemplo, mediante uno o mas de los siguientes metodos: 'Western blot' de las protemas de celulas huesped (HCP), SDS-PAGE con tincion de Coomasie, SDS-PAGE con tincion con plata, HPLC de fase inversa y HPLC de exclusion de tamano.

En algunas realizaciones, el metodo incluye, adicionalmente, recoger la muestra de arilsulfatasa A, por ejemplo, mediante un metodo que incluye ultrafiltracion de flujo tangencial.

En algunas realizaciones, adicionalmente el metodo incluye someter la muestra de arilsulfatasa A a una inactivacion viral, por ejemplo, poniendo en contacto la arilsulfatasa A con un disolvente o un detergente. El disolvente o detergente puede incluir, por ejemplo, polisorbato 80, Tri-n-Butil-Fosfato (TnBP) o ambos.

En algunos metodos de la presente invencion, adicionalmente el metodo incluye someter la muestra de

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arilsulfatasa a una cromatograffa de intercambio anionico, por ejemplo, una cromatograffa de intercambio anionico de aminas cuaternarias, por ejemplo, tal y como se describe en el presente texto. En algunas realizaciones, la muestra de arilsulfatasa A se somete a la cromatograffa de intercambio anionico previamente a la cromatograffa de intercambio cationico.

En algunos metodos de la presente invencion, adicionalmente el metodo incluye someter la muestra de arilsulfatasa A a una cromatograffa en modo mixto, por ejemplo, una cromatograffa de HA, por ejemplo, tal y como se describe en el presente texto. Por ejemplo, la cromatograffa en modo mixto puede incluir una cromatograffa de hidroxiapatita ceramica. En algunas realizaciones, la muestra se somete a la cromatograffa en modo mixto previamente a la cromatograffa de intercambio cationico.

En algunos metodos de la presente invencion, adicionalmente el metodo incluye someter la muestra a una cromatograffa de interaccion hidrofobica (HIC), como una HIC que incluya una cromatograffa de fenilo, por ejemplo, tal y como se describe en el presente texto. En algunas realizaciones, la muestra se somete a la HIC previamente a la cromatograffa de intercambio cationico.

En algunas realizaciones, adicionalmente el metodo incluye concentrar la arilsulfatasa A, por ejemplo, mediante ultrafiltracion, diafiltracion o ambas. En algunas realizaciones, el proceso de concentrar la arilsulfatasa A incluye ultrafiltracion de flujo tangencial.

En algunas realizaciones, adicionalmente el metodo incluye someter la muestra de arilsulfatasa A a una filtracion para eliminar virus, por ejemplo, utilizando un filtro PLANOVa™

En algunas realizaciones, el metodo para purificar la arilsulfatasa A de una muestra incluye proporcionar una muestra de arilsulfatasa A; someter la muestra de arilsulfatasa A a una primera cromatograffa de intercambio ionico; someter la muestra de arilsulfatasa A a una cromatograffa en modo mixto, por ejemplo, tal y como se describe en el presente texto; someter la muestra de arilsulfatasa A a una cromatograffa de interaccion hidrofobica, por ejemplo, tal y como se describe en el presente texto; y someter la muestra de arilsulfatasa A a una segunda cromatograffa de intercambio ionico. La primera cromatograffa de intercambio ionico incluye una cromatograffa de intercambio anionico, por ejemplo, tal y como se describe en el presente texto. La segunda cromatograffa de intercambio ionico puede incluir una cromatograffa de intercambio cationico, por ejemplo, tal y como se describe en el presente texto, como una cromatograffa de intercambio cationico con sulfopropilo (SP).

En una realizacion, el metodo incluye, ademas, someter la muestra de arilsulfatasa A a una filtracion en profundidad, por ejemplo, una filtracion en profundidad que se describe en el presente texto. En otra realizacion, el metodo incluye, ademas, someter la muestra de arilsulfatasa A a una inactivacion viral, por ejemplo, un metodo de inactivacion viral que se describe en el presente texto.

En otra realizacion, el metodo incluye, ademas, concentrar la arilsulfatasa A, por ejemplo, mediante un metodo que se describe en el presente texto, y en otra realizacion, el metodo incluye, ademas, someter el producto de la arilsulfatasa A a una filtracion para eliminar virus, por ejemplo, mediante un metodo que se describe en el presente texto.

En otra realizacion, el metodo incluye, ademas, preparar o formular la arilsulfatasa A purificada.

En un aspecto, la divulgacion presenta un metodo para purificar arilsulfatasa a de una muestra, de manera que el metodo incluye, por ejemplo, proporcionar una muestra de arilsulfatasa A; someter la muestra de arilsulfatasa A a una primera cromatograffa de intercambio ionico (por ejemplo, una cromatograffa de intercambio anionico, por ejemplo, tal y como se describe en el presente texto) para obtener una muestra de cromatograffa de intercambio ionico de arilsulfatasa A; someter la muestra de cromatograffa de intercambio ionico de arilsulfatasa A a una cromatograffa en modo mixto, por ejemplo, tal y como se describe en el presente texto, para obtener una muestra de cromatograffa en modo mixto de arilsulfatasa A; someter la muestra de cromatograffa en modo mixto de arilsulfatasa A a una cromatograffa de interaccion hidrofobica, por ejemplo, tal y como se describe en el presente texto, para obtener una muestra de cromatograffa de interaccion hidrofobica de arilsulfatasa A; y someter la muestra de cromatograffa de interaccion hidrofobica de arilsulfatasa A a una segunda cromatograffa de intercambio ionico (por ejemplo, una cromatograffa de intercambio cationico, por ejemplo, tal y como se describe en el presente texto).

En algunas realizaciones, la primera cromatograffa de intercambio ionico comprende una cromatograffa de intercambio anionico, por ejemplo, tal y como se describe en el presente texto; y la segunda cromatograffa de intercambio ionico incluye una cromatograffa de intercambio cationico -por ejemplo, tal y como se describe en el presente texto- como la cromatograffa de intercambio cationico con sulfopropilo (SP) que se describe en el presente texto.

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En una realizacion, adicionalmente el metodo incluye someter la muestra de arilsulfatasa A a una filtracion en profundidad, por ejemplo, mediante un metodo que se describe en el presente texto. En otra realizacion, adicionalmente el metodo comprende someter la muestra a inactivacion viral, por ejemplo, mediante un metodo que se describe en el presente texto.

En una realizacion, adicionalmente el metodo incluye concentrar la arilsulfatasa A, por ejemplo, mediante un metodo que se describe en el presente texto. En otra realizacion, el metodo incluye someter el producto de la arilsulfatasa A a una filtracion para eliminar virus, por ejemplo, mediante un metodo que se describe en el presente texto.

En otra realizacion, adicionalmente el metodo incluye preparar o formular la arilsulfatasa A purificada.

En un aspecto, la divulgacion presenta un metodo para preparar o formular arilsulfatasa A purificada por medio de un metodo descrito en el presente texto. Por ejemplo, la arilsulfatasa A purificada se prepara para administrarse directamente al sistema nervioso central (CNS, por sus siglas en ingles), por ejemplo, por via intratecal o intracerebral, o para administrarse por otros medios, por ejemplo, por via intravenosa (IV), o ambas, ya sea de manera simultanea, de manera secuencial o de cualquier otra forma combinada, de acuerdo con un paradigma de tratamiento determinado por un medico para cada paciente, con el objetivo de tratar una enfermedad que se describe en el presente texto, por ejemplo, la leucodistrofia metacromatica (MLD).

En otro aspecto, la divulgacion presenta una composicion farmaceutica que contiene arilsulfatasa A purificada por medio de un metodo descrito en el presente texto, por ejemplo, para administrarse directamente al sistema nervioso central (CNS), por ejemplo, por via intratecal o intracerebral, o para administrarse por otros medios, por ejemplo, por via intravenosa (IV), o ambas, ya sea de manera simultanea, de manera secuencial o de cualquier otra forma combinada, de acuerdo con un paradigma de tratamiento determinado por un medico para cada paciente, con el objetivo de tratar una enfermedad que se describe en el presente texto, por ejemplo, la leucodistrofia metacromatica (MLD).

En otro aspecto, la divulgacion presenta el uso de una composicion que contiene arilsulfatasa A purificada por medio de un metodo descrito en el presente texto, por ejemplo, para administrarse directamente al sistema nervioso central (CNS), por ejemplo, por via intratecal o intracerebral, o para administrarse por otros medios, por ejemplo, por via intravenosa (IV), o ambas, ya sea de manera simultanea, de manera secuencial o de cualquier otra forma combinada, de acuerdo con un paradigma de tratamiento determinado por un medico para cada paciente, con el objetivo de tratar una enfermedad que se describe en el presente texto, por ejemplo, la leucodistrofia metacromatica (MLD).

En otro aspecto, la invencion presenta un metodo para administrar una composicion farmaceutica que contiene arilsulfatasa A purificada por medio de un metodo que se describe en el presente texto, por ejemplo, para tratar una enfermedad que se describe en el presente texto, por ejemplo, la leucodistrofia metacromatica (MLD).

DESCRIPCION DETALLADA

Arilsulfatasa A

La arilsulfatasa A (ASA, ARSA o cerebrosido-sulfatasa) es una enzima que descompone el cerebrosido 3- sulfato (o sulfatido) en cerebrosido y sulfato. Mas espedficamente, el galactosil sulfatido se metaboliza normalmente mediante la hidrolisis del enlace o ligamiento ('linkage', en ingles) del 3-O-sulfato para formar galactocerebrosido por medio de la accion combinada de la enzima lisosomica arilsulfatasa A (EC 3.1.6.8) (Austin et al. Biochem J.; 1964, 93, 15C-17C) y una protema activadora de esfingolfpidos llamada saposina B. La deficiencia de arilsulfatasa A se da en todos los tejidos de pacientes que presentan la forma infantil tardfa, juvenil y adulta de la leucodistrofia metacromatica (MLD). Tal y como se utilizan en el presente texto, la protema arilsulfatasa A se denominara 'ASA' o 'ARSA' y la saposina B se denominara 'Sap-B'.

La arilsulfatasa A es una glicoprotema acida con un punto isoelectrico bajo. Por encima de un pH de 6.5, la enzima existe como un monomero con un peso molecular aproximado de 100 kDa. La arilsulfatasa A experimenta una polimerizacion dependiente del pH y forma un dfmero en un pH de 4.5. En la orina humana, la enzima se compone de dos subunidades no identicas de 63 y 54 kDa (Laidler PM et al. Biochim Biophys Acta. 1985, 827, 7383). La arilsulfatasa A purificada del hngado humano, la placenta y los fibroblastos tambien se compone de dos subunidades cuyo tamano es ligeramente diferente y vana entre 55 y 64 kDa (Draper RK et al. Arch Biochemica Biophys. 1976, 177, 525-538; Waheed A et al. Hoppe Seylers Z Physiol Chem. 1982, 363, 425-430; Fujii T et al. Biochim Biophys Acta. 1992, 15 1122, 93-98). Como en el caso de otras enzimas lisosomicas, la arilsulfatasa A se sintetiza en los ribosomas ligados a las membranas como un precursor glicosilado. Despues, pasa a traves del retmulo endoplasmatico y el aparato de Golgi, donde sus oligosacaridos N-enlazados ('N-linked', en ingles) se procesan con la formacion de oligosacaridos fosforilados y sulfatados de tipo complejo (Waheed A et al. Biochim Biophys Acta. 1985, 847, 53-61; Braulke T et al. Biochem Biophys Res Commun. 1987, 143, 178-185). En los fibroblastos cultivados normalmente, se produce un polipeptido precursor de 62 kDa, que se desplaza mediante la

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union a un receptor de manosa-6-fosfato (Braulke T et al. J Biol Chem. 1990, 265, 6650-6655) a un endosoma prelisosomico acido (Kelly BM et al. Eur J Cell Biol. 1989, 48, 71-78).

Los metodos que se describen en el presente texto pueden usarse para purificar arilsulfatasa A de cualquier fuente, por ejemplo, de tejidos o celulas cultivadas (por ejemplo, celulas humanas -por ejemplo, fibroblastos- que producen arilsulfatasa A de forma recombinante). Mediante los metodos que se describen en el presente texto, puede producirse arilsulfatasa A de cualquier origen, incluyendo -pero sin limitarse a- humanos y otros animales, como mairnferos.

La longitud (18 aminoacidos) del peptido senal de la arilsulfatasa A humana se basa en la secuencia de consenso y en un sitio de procesamiento espedfico para una secuencia de senal. Por lo tanto, desde el ADNc de ASA humana (EMBL GenBank; numeros de acceso J04593 y X521151) la escision del peptido senal se da en todas las celulas tras el numero de residuo 18 (Ala), lo que produce una forma madura de arilsulfatasa A humana. Tal y como se utiliza en el presente texto, la arilsulfatasa A recombinante se abreviara como 'rASA'. La forma madura de arilsulfatasa A, incluyendo la forma madura de arilsulfatasa A humana, se denominara 'mASA' y la ASA humana recombinante madura se denominara 'mrhASA'.

Se ha probado la existencia de multiples formas de arilsulfatasa A mediante la electroforesis y el enfoque isoelectrico de preparaciones enzimaticas a partir de orina humana (Luijten JAFM et al. J Mol Med. 1978, 3, 213), leucocitos (Dubois et al. Biomedicine. 1975, 23, 116-119; Manowicz P et al. Biochem Med Metab Biol. 1988, 39, 117120), plaquetas (Poretz et al. Biochem J. 1992, 287, 979-983), fibroblastos cultivados (Waheed A et al. Hoppe Seylers Z Physiol Chem. 1982, 363, 425-430; Stevens RL et al. Biochim Biophys Acta. 1976, 445, 661-671; Farrell DF et al. Neurology. 1979, 29, 16-20) e tugado (Stevens RL et al. Biochim Biophys Acta. 1976, 445, 661-671; Farrell DF et al. Neurology. 1979, 29, 16-20; Sarafian TA et al. Biochem Med. 1985, 33, 372-380). El tratamiento con endoglicosidasa H, sialidasa y fosfatasa alcalina reduce el tamano molecular y la complejidad del patron electroforetico, lo que sugiere que gran parte de la heterogeneidad de carga de la arilsulfatasa A se debe a variaciones en el contenido de carbohidratos de la enzima.

El sitio activo de la arilsulfatasa A contiene un residuo de histidina esencial (Lee GD y Van Etten, Arch Biochem Biophys. 1975, 171, 424-434) y dos o mas residuos de arginina (James GT, Arch Biochem Biophys. 1979, 97, 57-62). Muchos aniones son inhibidores de la enzima en concentraciones de nivel milimolar o inferiores.

Se ha identificado una modificacion proteica en dos sulfatasas eucariotas (arilsulfatasa A y arilsulfatasa B - ASB-) y en el alga verde Volvox carteri (Schmidt B et al. Cell. 1995, 82, 271-278; Selmer T et al. Eur J Biochem. 1996, 238, 341-345). Esta modificacion provoca la conversion de un residuo de cistema -que se mantiene entre las sulfatasas conocidas- en un residuo de acido 2-amino-3-oxopropionico (Schmidt B et al. Cell. 1995, 82, 271-278). El nuevo derivado o derivativo de aminoacidos tambien se conoce como C-formilglicina (Fgly). En la arilsulfatasa A y la arilsulfatasa B derivadas de celulas con MSD (Deficiencia multiple de sulfatasa), se conserva el residuo de Cys-69. Por consiguiente, se sugiere que la conversion de la Cys-69 en FGly-69 es necesaria para producir arilsulfatasa A y arilsulfatasa B catalfticamente activas, y que la deficiencia de esta modificacion proteica es la causa de la MSD. La Cys-69 se remite al precursor arilsulfatasa A, que tiene un peptido senal de 18 residuos. En la arilsulfatasa A madura (mASA), el mencionado residuo de cistema es Cys-51.

Otras investigaciones han demostrado que una secuencia lineal de 16 residuos en los alrededores de la Cys-51 en la arilsulfatasa A madura es suficiente para dirigir la conversion y que la modificacion proteica sucede despues de o en una etapa tardfa de la translocacion de la protema co-traduccional al retmulo endoplasmatico cuando el polipeptido todavfa no esta plegado y no ha adquirido su estructura nativa (Dierks T et al. Proc Natl Acad Sci. 1997, 94, 1193-1196; Wittke, D et al. (2004), Acta Neuropathol. (Berl.), 108, 261-271).

Se ha descrito la estructura del gen de la arilsulfatasa A humana. Tal y como se utiliza en el presente texto, este gen se denominara 'ARSA'. Sin embargo, en algunos casos 'ARSA' tambien puede hacer referencia a la protema arilsulfatasa A. El gen ARSA se encuentra cerca del extremo del brazo largo del cromosoma 22 (22ql3.31 - qter), abarca 3,2 kb (Kreysing et al. Eur J Biochem. 1990, 191, 627-631) y se compone de ocho exones que especifican la unidad enzimatica del aminoacido 507 (Stein et al. J Biol Chem. 1989, 264, 1252-1259). Se han detectado ARNs mensajeros de 2,1, 3,7 y 4,8 kb en celulas de fibroblastos, de manera que, aparentemente, el mensaje de 2,1 kb es el responsable de la mayor parte de la arilsulfatasa A activa generada por la celula (Kreysing et al. Eur J Biochem. 1990, 191, 627-631). La secuencia del ARSA se ha depositado en el GenBank (banco genetico) del EMBL con el numero de acceso X521150. Las diferencias entre el ADNc publicado y la parte de codificacion del ARSA fueron descritas por Kreysing et al. (Eur J Biochem. 1990, 191, 627-631). La secuencia de ADNc descrita originalmente por Stein et al. (J Biol Chem. 1989, 264, 1252-1259) y la secuencia de ADNc descrita por Kreysing et al. (Eur J Biochem. 1990, 191, 627-631) se han depositado en el GenBank del EMBL con los siguientes numeros de acceso: J04593 y X521151, respectivamente.

Se han identificado diversos polimorfismos y mas de 40 mutaciones relacionadas con enfermedades en el gen ARSA (Gieselman et al. Hum Mutat. 1994, 4, 233-242; Barth et al. Hum Mutat. 1995, 6, 170-176; Draghia et al. Hum Mutat. 1997, 9, 234-242). Las mutaciones relacionadas con enfermedades presentes en el gen ARSA pueden

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clasificarse en dos grupos amplios que se correlacionan razonablemente bien con el fenotipo cffnico de la MLD. Un grupo (I) no produce ninguna enzima activa ni ninguna protema inmunorreactiva, y tampoco expresa ninguna actividad de ASA cuando se introduce en lmeas celulares animales de cultivo. El otro grupo (A) genera pequenas cantidades de material de reaccion cruzada y bajos niveles de enzimas funcionales en celulas cultivadas. Los individuos que son homocigoticos con respecto a una mutacion del grupo (I), o que tienen dos mutaciones diferentes de este grupo, muestran MLD infantil de aparicion tardfa. La mayoffa de individuos con una mutacion del grupo (I) y una mutacion del grupo (A) desarrollan la forma juvenil, mientras que aquellos con dos mutaciones del grupo (A) normalmente manifiestan la MLD adulta. Algunas de estas mutaciones se han hallado con relativa frecuencia, mientras que otras solo se han detectado en una familia. Es posible buscar el origen de mutaciones espedficas a traves de los miembros de muchas familias; sin embargo, la deteccion general de los portadores todavfa no es factible.

Ademas de las mutaciones relacionadas con enfermedades que se han descrito previamente, se han identificado diversos polimorfismos en el gen ARSA. Se ha hallado una actividad extremadamente baja de ASA en algunos padres y madres -clmicamente normales- de pacientes con MLD y tambien en la poblacion general. Esta supuesta pseudodeficiencia de ASA se ha relacionado con un polimorfismo habitual del gen ARSA (Gieselmann et al. Dev Neurosci. 1991, 13, 222-227).

Purificacion de arilsulfatasa A

Tal y como se utiliza en el presente texto, un 'contaminante' es un material que es diferente al producto de polipeptidos deseado, por ejemplo, arilsulfatasa A (ASA). El contaminante puede ser una variante o variedad del polipeptido deseado (por ejemplo, una variedad sin amidas o una variedad de amino-aspartato del polipeptido deseado) u otra molecula, por ejemplo, un polipeptido, un acido nucleico o una endotoxina.

Tal y como se utiliza en el presente texto, cuando se 'purifica' (o se 'depura') un polipeptido de una muestra o composicion que comprende el polipeptido y uno o mas contaminantes, quiere decirse que se aumenta el grado de pureza del polipeptido en la muestra o composicion eliminando (completa o parcialmente) al menos un contaminante de la muestra o composicion. Puede haber un 'paso o proceso de purificacion' que forme parte del proceso general de purificacion (o depuracion), de manera que se produzca una composicion que comprende al menos en torno a un 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8% o 99,9% de peso del polipeptido de interes, tomando en cuenta el peso total de la composicion.

El reactivo o material de partida para el proceso de purificacion puede provenir de cualquier fuente, por ejemplo, un tejido o un extracto celular crudo. Normalmente, la ASA es secretada por las celulas y, posteriormente, se purifica del sobrenadante del cultivo celular.

Los metodos de purificacion descritos en el presente texto pueden incluir -pero no se limitan a- uno o mas de los siguientes pasos: filtracion en profundidad (o filtracion profunda), inactivacion viral, cromatograffa de intercambio ionico (por ejemplo, cromatograffa de intercambio anionico y/o cromatograffa de intercambio cationico), cromatograffa en modo mixto, cromatograffa de interaccion hidrofobica, ultrafiltracion/diafiltracion y filtracion para eliminar virus (o filtracion de eliminacion vmca).

En los pasos del proceso de cromatograffa, el volumen de resina adecuado que se ha de usar en una columna de cromatograffa se deduce a partir de las dimensiones de la columna, esto es, el diametro de la columna y la altura de la resina, y vaffa dependiendo de -por ejemplo- la cantidad de protema presente en la solucion aplicada y la capacidad de enlace de la resina utilizada. Sin embargo, esta dentro del alcance de la presente divulgacion aumentar la escala del proceso de produccion, asf como del proceso de purificacion, para lograr una produccion y una purificacion de ASA a escala industrial.

Por consiguiente, algunos parametros como el tamano, el diametro y la tasa de flujo de la columna pueden aumentarse para que se ajusten a la velocidad y la eficiencia de una produccion a tan grande escala. En algunas realizaciones, el diametro de la columna es de entre 50 y 100 mm, el volumen es de entre 100 y 300 ml y la tasa de flujo es de entre 40 y 400 cm/hora (por ejemplo, entre alrededor de 100 cm/hora y 150 cm/hora) o de entre alrededor de 5 y 100 ml.

Filtracion en profundidad

Los metodos de purificacion descritos en el presente texto pueden incluir uno o mas pasos de filtracion en profundidad (o filtracion profunda). Los filtros de profundidad son una variedad de filtros que utilizan un medio de filtracion poroso para retener parffculas a lo largo de todo el medio, y no solo en la superficie del medio. Estos filtros se usan habitualmente cuando el fluido que se va a filtrar contiene una alta carga de parffculas puesto que, en relacion con otros tipos de filtros, pueden retener una gran masa de parffculas antes de quedar obstruidos. Un ejemplo de filtro de profundidad es el filtro de profundidad ZETA PLUS®.

Inactivacion viral

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Los metodos de purificacion descritos en el presente texto pueden incluir uno o mas pasos de inactivacion

Debe entenderse que estos metodos pretenden dar origen a una preparacion de una enzima, que esta basicamente libre de virus infecciosos y que puede denominarse 'producto libre de virus'. Ademas, se contempla el hecho de que los diversos metodos puedan usarse independientemente o de forma conjunta.

La inactivacion viral (o inactivacion vmca) puede conseguirse mediante la adicion de uno o mas 'agentes inactivadores de virus' a una solucion que contiene la enzima. Normalmente, el paso para inactivar virus se realizara antes de los pasos de purificacion cromatografica para garantizar que el agente no esta presente en el producto final en cualquier cantidad o concentracion que puedan comprometer la seguridad del producto cuando este se utilice como un producto farmaceutico o cuando el producto se utilice para la preparacion de un producto farmaceutico. El termino 'agente inactivador de virus' pretende denotar aquellos agentes o metodos que pueden utiizarse para inactivar o desactivar los virus con envoltura lipfdica, asf como los virus sin envoltura lipfdica. Debe entenderse que el termino 'agente inactivador de virus' abarca tanto una combinacion de estos agentes y/o metodos, siempre y cuando sea adecuada, como solo un tipo de estos agentes o metodos.

Habitualmente, los agentes inactivadores de virus son detergentes y/o disolventes y, mas habitualmente, mezclas de detergente-disolvente. Debe entenderse que, opcionalmente, el agente inactivador de virus es una mezcla de uno o mas detergentes con uno o mas disolventes. Para la inactivacion de virus puede usarse una gran variedad de detergentes y disolventes. El detergente puede seleccionarse de un grupo que se compone de detergentes ionicos y no ionicos y se selecciona para que sea basicamente no desnaturalizante. Normalmente, se utiliza un detergente no ionico, ya que facilita la posterior eliminacion del detergente de la preparacion de rASA en los pasos de purificacion posteriores. Algunos detergentes adecuados son descritos, por ejemplo, por Shanbrom et al. en la Patente de EE UU 4,314,997 y en la Patente de EE UU 4,315,919. Los detergentes habituales se venden con las marcas registradas Triton X-l0o y Tween 20 o Tween 80. Los disolventes preferidos para su uso como agentes inactivadores de virus son di- o tri-alquilfosfatos, tal y como lo explican, por ejemplo, Neurath y Horowitz en la Patente de EE UU 4,764,369. El tri(n-butil) fosfato (TnBp) es un disolvente habitual. Un agente inactivador de virus especialmente preferido para la practica de la presente invencion es el Tween 80, pero, de forma alternativa, pueden usarse otros agentes o combinaciones de agentes. Normalmente, el agente se anade en un volumen tal que la concentracion de Tween-80 en la solucion que contiene ASA es de entre alrededor de un 0,5 y un 4,0% en peso, preferiblemente, una concentracion de alrededor del 1% en peso. Despues, puede anadirse TnBP para obtener una concentracion final de 0,3%, que se calcula basandose en el nuevo volumen de la muestra que contiene ASA.

El paso de inactivacion de virus se desarrolla en unas condiciones que inactivan los virus envueltos, lo que da como resultado una solucion que contiene una rASA basicamente libre de virus. En general, dichas condiciones incluyen una temperatura de 4-37° C, como 19-28° C, 23-27° C y, normalmente, alrededor de 25° C, y un tiempo de incubacion que los estudios de validacion estiman efectivo. Normalmente, es suficiente un tiempo de incubacion de 1-24 horas, preferiblemente 10-18 horas, por ejemplo alrededor de 14 horas, para garantizar una inactivacion viral suficiente. Sin embargo, las condiciones adecuadas (temperatura y tiempos de incubacion) dependen del agente inactivador de virus utilizado, el pH, la concentracion de protemas y el contenido de lfpidos de la solucion.

Se contempla el hecho de que tambien se puedan utilizar otros metodos para eliminar o inactivar virus con el objetivo de producir un producto libre de virus; por ejemplo, la adicion de metileno azul y la posterior inactivacion mediante radiacion con luz ultravioleta.

Cromatografia de intercambio ionico

Los metodos de purificacion descritos en el presente texto pueden incluir uno o mas pasos de cromatografia de intercambio ionico (por ejemplo, cromatografia de intercambio anionico y/o cromatografia de intercambio cationico).

Las personas versadas en la materia sabran que los intercambiadores de iones o intercambiadores ionicos (por ejemplo, intercambiadores de aniones y/o intercambiadores de cationes) pueden estar basados en diversos materiales en relacion con la matriz y los grupos cargados unidos a ella. Por ejemplo, pueden usarse las siguientes matrices, en las que los materiales mencionados pueden estar mas o menos entrelazados o reticulados: basadas en la agarosa (como SEPHAROSE™ (Sefarosa) CL- 6B, SEPHAROSE™ Fast Flow y S SEPHAROSE™ High Performance), basadas en la celulosa (como DEAE SEPHACEL®), basadas en el dextrano (como SEPHADEX®), basadas en el sflice y basadas en los pofimeros sinteticos.

La resina de intercambio ionico puede prepararse siguiendo metodos conocidos. Normalmente, puede pasarse un tampon o 'buffer' de equilibrio -que permite que la resina se una a sus contra-iones- a traves de la resina de intercambio ionico antes de cargar en la resina la muestra o composicion que contiene el polipeptido y uno o mas contaminantes. Convenientemente, el tampon de equilibrio puede ser el mismo que el tampon de carga, pero esto no es necesario.

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En una realizacion opcional de la invencion, la resina de intercambio ionico puede regenerarse con un tampon de regeneracion despues de la elucion del polipeptido y, de este modo, la columna puede reutilizarse. Normalmente, el nivel de la concentracion de sales y/o del pH del tampon de regeneracion puede ser tal que basicamente todos los contaminantes y el polipeptido de interes se eluyan de la resina de intercambio ionico. Normalmente, el tampon de regeneracion tiene una concentracion de sal muy elevada para eluir los contaminantes y polipeptidos de la resina de intercambio ionico.

Cromatografia de intercambio anionico

En el caso de la resina de intercambio anionico, los grupos cargados que estan unidos covalentemente a la matriz pueden ser, por ejemplo, dietilaminoetilo (DEAE), aminoetilo cuaternario (QAE) y/o amonio cuaternario (Q). En algunas realizaciones, la resina de intercambio anionico empleada es una columna de Q Sefarosa y, mas habitualmente, puede ser Q SEPHAROSE™ Fast Flow, Q SEPHAROSE™ High Performance o una columna de Q SEPHAROSE™ XL, pero tambien pueden usarse otros intercambiadores de aniones.

La solucion acuosa que contiene la ASA y el (los) contaminante(s) puede cargarse en la resina anionica usando un tampon de carga que tiene una concentracion de sal y/o un pH tales que el polipeptido y el contaminante se unen a la resina de intercambio anionico. Posteriormente, la resina puede lavarse con uno o mas volumenes de columna de un tampon de carga, seguidos de uno o mas volumenes de columna de un tampon de lavado, aumentando asf la concentracion de sales. Finalmente, la ASA puede eluirse aumentando aun mas la concentracion de sales. De manera opcional, la elucion de la enzima tambien puede regularse disminuyendo el pH de manera gradual o escalonada. Las partes o fracciones que contienen actividad de ASA pueden recogerse y combinarse para obtener una mayor purificacion.

Para una persona con conocimientos y habilidades ordinarios en este campo, resultara evidente que pueden utilizarse numerosos y diversos tampones en los pasos de carga, lavado y elucion. Sin embargo, normalmente la columna puede equilibrarse con 1-10 lavados de la misma usando un tampon que tiene 0,05 M de MES-Tris y un pH de 7.0. Segun convenga, la muestra puede cargarse en el tampon del paso previo del proceso de purificacion, o bien la muestra puede cargarse usando un tampon de carga. La columna puede lavarse con 1-10 volumenes de columna del tampon utilizado para equilibrar, seguidos de un tampon de lavado que contiene 0,02 M de MES-Tris, 0,12 M de NaCl y un pH de 7.0. De forma alternativa, la columna puede equilibrarse, cargarse y lavarse con cualesquiera otros tampones de equilibrio, carga y lavado descritos en el presente texto y utilizados en cromatograffas de intercambio anionico. La muestra puede eluirse en un tampon que contiene 0,02 de MES-Tris, 0,26 M de NaCl y un pH de 7.0. Alternativamente, la muestra puede eluirse en cualquier otro tampon de elucion descrito en el presente texto y utilizado en cromatograffas de intercambio anionico.

Cromatografia de intercambio cationico

En una realizacion habitual, la cromatograffa de intercambio cationico comprende una cromatograffa de intercambio cationico con sulfopropilo (SP), pero pueden usarse otras membranas o resinas de cromatograffa cationica, por ejemplo, una membrana de MUSTANG™ S, una resina de S- SEPHAROSE™ o una resina de SEPHAROSE™ azul.

En algunas realizaciones, la cromatograffa de intercambio cationico se usa como paso o metodo de pulido.

La solucion acuosa que contiene la arilsulfatasa A y el (los) contaminante(s) puede cargarse en la resina cationica usando un tampon de carga que tiene una concentracion de sal y/o un pH tales que el polipeptido y el contaminante se unen a la resina de intercambio cationico. Posteriormente, la resina puede lavarse con uno o mas volumenes de columna de un tampon de carga o un tampon de equilibrio, seguidos -opcionalmente- de uno o mas volumenes de columna de un tampon de lavado, aumentando asf la concentracion de sales. Finalmente, la arilsulfatasa A puede eluirse en un tampon de elucion. Las partes o fracciones que contienen actividad de arilsulfatasa A pueden recogerse y combinarse para obtener una mayor purificacion.

En una realizacion habitual, la concentracion de NaCl y/o el pH del tampon de carga, el tampon de lavado y/o el tampon de elucion pueden optimizarse, por ejemplo, tal y como se describe en el presente texto, para aumentar o mejorar la union con el (los) objetivo(s) y/o disminuir la union con las impurezas. En algunas realizaciones, la concentracion de NaCl en el tampon de carga es de alrededor de 20 mM, 15 mM, 10 mM o menos. En algunas realizaciones, el tampon de carga tiene un pH de alrededor de 4,5, 4,3, 4,0 o menos. En algunas realizaciones, la concentracion de NaCl en el tampon de lavado es de alrededor de 20 mM, 15 mM, 10 mM o menos. En algunas realizaciones, la concentracion de NaCl en el tampon de elucion es de alrededor de 55 mM, 50 mM, 45 mM, 40 mM o menos.

En algunas realizaciones, las columnas pueden equilibrarse con mas de 3, por ejemplo, 5 o 10 volumenes de columna de 0,01 M de NaAc, 0,01 M de Nacl, 0,03 M de acido acetico y un pH de 4.2. En algunas realizaciones, la muestra puede cargarse en el tampon del paso previo del proceso de purificacion, o bien la muestra puede cargarse usando un tampon de carga. La columna puede lavarse con 1-10 volumenes de columna del tampon

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utilizado para equilibrar. De forma alternativa, la columna puede equilibrarse, cargarse y lavarse con cualesquiera otros tampones de equilibrio, carga y lavado descritos en el presente texto y utilizados en cromatograffas de intercambio cationico. La muestra puede eluirse en un tampon que contiene 0,02 M de NaAc, 0,05 M de NaCl y un pH de 4.5. Alternativamente, la muestra puede eluirse en cualquier otro tampon de elucion descrito en el presente texto y utilizado en cromatograffas de intercambio cationico.

En otra realizacion habitual, la cromatograffa de intercambio cationico puede realizarse con una temperatura optimizada, por ejemplo, tal y como se describe en el presente texto, para aumentar o mejorar la union con los objetivos y/o disminuir la union con las impurezas. Por ejemplo, la cromatograffa de intercambio cationico puede realizarse a una temperatura de alrededor de 23° C, 18° C, 16° C o menos.

Cromatograffa en modo mixto

Los metodos de purificacion descritos en el presente texto pueden incluir uno o mas pasos de cromatograffa en modo mixto.

La cromatograffa en modo mixto es un tipo de cromatograffa en el que se aplican diversos modos de separacion para resolver una mezcla de diferentes moleculas, normalmente en cromatograffa ffquida. Por ejemplo, una separacion en modo mixto puede incluir fases combinadas que muestran caractensticas de intercambios de iones y de fases inversas al mismo tiempo. Estas fases estacionarias con mas de un tipo de interaccion estan disponibles de la mano de diversos fabricantes de columnas.

En algunas realizaciones, la cromatograffa en modo mixto incluye una cromatograffa de hidroxiapatita ceramica (HA). Normalmente, la hidroxiapatita (HAP) hace referencia a la forma cristalina del fosfato de calcio. El mecanismo de la HAP comprende interacciones no espedficas entre grupos carboxilos de protemas cargados negativamente e iones de calcio en la resina cargados positivamente, y grupos amino de protemas cargados positivamente e iones de fosfato en la resina cargados negativamente. Las protemas basicas o acidas pueden adsorberse en la columna de forma selectiva ajustando el pH del tampon; la elucion se puede conseguir variando la concentracion de sal del tampon. De nuevo, resulta evidente que pueden emplearse numerosas composiciones de tampones y tambien numerosas combinaciones de tampones. Sin embargo, normalmente la columna puede equilibrarse con 1-10 lavados de la misma usando un tampon que tiene 0,001 M de NaPO4, 0,02 M de MES-Tris, 0,26 M de NaCl y un pH de 7.0. Segun convenga, la muestra puede cargarse en el tampon del paso previo del proceso de purificacion, o bien la muestra puede cargarse usando un tampon de carga. La columna puede lavarse con 1-10 volumenes de columna del tampon utilizado para equilibrar, seguidos de un tampon de lavado que contiene 0,005 M de NaPO4, 0,02 M de MES-Tris, 0,26 M de NaCl y un pH de 7.0. De forma alternativa, la columna puede equilibrarse, cargarse y lavarse con cualesquiera otros tampones de equilibrio, carga y lavado descritos en el presente texto y utilizados en cromatograffas en modo mixto. La muestra puede eluirse en un tampon que contiene 0,04 M de NaPO4 y un pH de 7.0. Opcionalmente, la columna puede decaparse mediante un lavado con 1-10 volumenes de columna de 0,4 M de NaPO4 y un pH de 12. Alternativamente, la muestra puede eluirse en cualquier otro tampon de elucion descrito en el presente texto y utilizado en cromatograffas en modo mixto.

En algunas realizaciones, la purificacion de la ASA mediante una cromatograffa en modo mixto sucede a la purificacion mediante una cromatograffa de intercambio ionico (por ejemplo, una cromatograffa de intercambio anionico). Sin embargo, tambien se contempla que estos pasos puedan realizarse en orden inverso.

Cromatograffa de interaccion hidrofobica (HIC)

Los metodos de purificacion descritos en el presente texto pueden incluir uno o mas pasos de cromatograffa de interaccion hidrofobica.

La cromatograffa de interaccion hidrofobica utiliza la atraccion de una determinada molecula hacia un entorno polar o no polar y, en referencia a las protemas, esta propension se rige por la hidrofobia o la hidrofilia de los residuos presentes en la superficie exterior expuesta de una protema. Asf, las protemas se fraccionan segun sus diversos grados de atraccion hacia una matriz hidrofoba, normalmente un soporte interior con brazos alquilos enlazadores con una cadena que tiene una longitud de 2-18 carbonos. La fase estacionaria se compone de pequenos grupos no polares (butilo, octilo o fenilo) unidos al esqueleto o estructura central de un poffmero hidrofilo (por ejemplo, SEPHArOSE™, dextrano o agarosa entrelazados). Asf, normalmente la columna de HIC es una columna de butil SEPHAROSE™ o una columna de fenil SEPHAROSE™, mas habitualmente una columna de fenil SEPHAROSE™.

El proceso de carga, lavado y elucion en una HIC siguen basicamente los mismos principios que se han descrito previamente en relacion con la cromatograffa de intercambio ionico, pero, a menudo, se aplican unas condiciones practicamente opuestas a las utilizadas en la cromatograffa de intercambio ionico. Asf, el proceso de la HIC requiere el uso de un tampon de carga con un nivel alto de sal, que desenlaza la protema para dejar expuestos los sitios hidrofobos. La protema es retenida mediante los ligandos hidrofobos de la columna, y queda expuesta a un gradiente de tampones que contienen concentraciones de sal decrecientes. A medida que la concentracion de sal

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disminuye, la protema recupera su estructura original o nativa y, finalmente, se eluye de la columna. Alternativamente, las protemas pueden eluirse con PEG.

El uso de fenil SEPHAROSE™ como fase solida en la HIC es habitual en la presente divulgacion. De nuevo, resulta evidente de inmediato que, cuando se trata de las condiciones exactas y de los tampones y combinaciones de tampones utilizados para los procesos de carga, lavado y elucion, existe un gran numero de posibilidades diferentes. En una realizacion habitual, la columna puede equilibrarse en un tampon que tiene 0,05 M de NaPO4, 1 M de NaCl y un pH de 5.5. Segun convenga, la muestra puede cargarse en el tampon del paso previo del proceso de purificacion, o bien la muestra puede cargarse usando un tampon de carga. El lavado puede realizarse usando 1-2 lavados de columna con un tampon de equilibrio, seguidos de 1-5 volumenes de columna de 0,02 M de MES, 0,05 M de NaPO4, 0,5 M de NaCl y un pH de 5.5. De forma alternativa, la columna puede equilibrarse, cargarse y lavarse con cualesquiera otros tampones de equilibrio, carga y lavado descritos en el presente texto y utilizados en la HIC. La arilsulfatasa A puede eluirse usando 0,02 M de MES-Tris, 0,06 M de NaCl y un pH de 7.0. Alternativamente, la muestra puede eluirse en cualquier otro tampon de elucion descrito en el presente texto en relacion con la HIC.

En algunas realizaciones, la purificacion de la arilsulfatasa a mediante una HIC sucede a la purificacion mediante una cromatograffa de intercambio ionico (por ejemplo, una cromatograffa de intercambio anionico). En metodos de la presente invencion, la purificacion de la arilsulfatasa A mediante una HIC sucede a la purificacion mediante una cromatograffa en modo mixto.

Ultrafiltracion/Diafiltracion

Los metodos de purificacion descritos en el presente texto pueden incluir uno o mas pasos de ultrafiltracion y/o diafiltracion.

El termino 'ultrafiltracion' hace referencia a un proceso de separacion de membrana, regido por un gradiente de presion, en el que la membrana fracciona los componentes de un ffquido en funcion de su tamano y estructura solvatados. La 'diafiltracion' es un tipo especializado de proceso de ultrafiltracion en el que la fraccion retenida se diluye con agua y se re-ultrafiltra para reducir la concentracion de los componentes solubles de filtrado y aumentar aun mas la concentracion de los componentes retenidos.

En algunas realizaciones, la arilsulfatasa A se purifica mediante su separacion de los contaminantes segun el tamano de estos en un entorno acido y utilizando una filtracion de flujo tangencial. La arilsulfatasa A forma un octamero con un pH bajo con un peso molecular teorico de 480 kDa y, por consiguiente, sera retenida por una membrana relativamente abierta, mientras que la mayor parte de los contaminantes pasaran esta membrana (Sommerlade et al., (1994) Biochem. J., 297; 123-130; Schmidt et al., (1995) Cell, 82, 271-278; Lukatela et al., (1998) Biochemistry, 37, 3654-3664).

En una realizacion habitual, el tampon de diafiltracion contiene 0,01 M de fosfato-citrato de sodio, 0,137 M de NaCl y un pH de 6.0.

En algunas realizaciones, como el material reactivo o material de partida para este proceso es una suspension de arilsulfatasa A tal y como se ha eluido de la columna de cromatograffa en el paso previo del proceso, el pH de esta suspension se ajusta a 4-5 mediante la adicion de 0,2-1 M de Na-acetato con un pH de 4.5. Despues, se realiza una diafiltracion a 1-10 volumenes de tampon de Na-acetato con un pH de 4.0-5.5 de un modo que resulta muy conocido para una persona versada en la materia. La filtracion puede realizarse mediante la aplicacion de diversos tipos de filtros diferentes con un peso nominal cuyos valores de corte son de entre 20 y 450 kDa; sin embargo, es habitual usar un filtro con un valor de corte de entre 100 y 300 kDa. Para un procesamiento adicional de la solucion que contiene arilsulfatasa A, el pH se ajusta hasta un valor de entre 7 y 8 mediante la adicion de una base de Tris para obtener una concentracion final de aproximadamente 20-50 mM.

Como alternativa a la filtracion de flujo tangencial acida que se ha explicado previamente, la separacion de la ASA respecto a los contaminantes puede lograrse mediante una filtracion en gel acida utilizando basicamente las mismas condiciones y composiciones de tampones. La filtracion se realiza con un pH bajo y por medio de una columna de filtracion en gel, que se ha equilibrado con una solucion con un pH bajo, por ejemplo, una solucion de Na-acetato de 0,2-0,9 M y un pH de 4-5. Opcionalmente, la solucion de arilsulfatasa A puede concentrarse mediante filtracion de flujo tangencial utilizando un filtro de 20-50 kDa antes de la filtracion en gel. El grado de concentracion puede variar considerablemente, de manera que la arilsulfatasa A puede estar concentrada desde alrededor de 0,1 mg/ml hasta alrededor de 50 mg/ml, preferiblemente alrededor de 5 mg/ml.

En algunas realizaciones, el conjunto de muestras se concentra con una pantalla Biomax A (30 kDa). La diafiltracion se realiza con 3-5 lavados de columna de 20 mM de Na-acetato, pH de 5.4-5.7.

Filtracion para eliminar virus

Los metodos de purificacion descritos en el presente texto pueden incluir uno o mas pasos de filtracion para

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eliminar virus (o filtracion para la eliminacion de virus).

Normalmente, la filtracion de virus se realiza tras la purificacion de la enzima mediante uno o mas pasos de cromatograffa. En algunas realizaciones, el paso o proceso de filtracion de virus se realiza mediante el pasaje de la solucion que contiene la ASA, que es el resultado de un paso de purificacion a traves de un filtro esterilizado y el posterior pasaje de la solucion filtrada esterilizada a traves de un nanofiltro. Con el termino 'filtro esterilizado' se hace referencia a un filtro que elimina basicamente todos los microorganismos capaces de propagar y/o causar infecciones. Mientras que el filtro habitual tiene un tamano de poros de alrededor de 0,1 micras, el tamano de los poros puede variar entre alrededor de 0,05 y 0,3 micras. Puede ser factible reemplazar o combinar la filtracion de virus de la muestra, tal y como se ha realizado en el proceso de purificacion, con el procedimiento de poner en contacto la muestra con un detergente.

Formulacion

Los metodos descritos en el presente texto pueden dar como resultado un producto o formulacion (tambien llamada 'preparacion') que contiene una cantidad relativa de arilsulfatasa A bioactiva, en particular, arilsulfatasa A, que supone al menos un 90%, por ejemplo, al menos un 95%, al menos un 97%, al menos un 98%, al menos un 99%, al menos un 99,5%, al menos un 99,6%, al menos un 99,7%, al menos un 99,8% o al menos un 99,9% de la cantidad total de protemas presentes en el producto o formulacion, tal y como se determina mediante HPLC de fase inversa o HPLC de exclusion de tamano.

Puede prepararse una formulacion (o preparacion) terapeutica que comprenda el polipeptido, conjugado opcionalmente con una molecula heterologa, mezclando el polipeptido que tenga el grado de pureza deseado con un portador, excipiente o estabilizador opcional farmaceuticamente aceptable ('Remington's Pharmaceutical Sciences', 16a edicion, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores, excipientes y estabilizadores 'farmaceuticamente aceptables' no son toxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen tampones como fosfato, citrato y otros acidos organicos; antioxidantes que incluyen acido ascorbico y metionina; conservantes (como cloruro amonico de octadeciidimetilbencilo; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio: alcohol fenol, butil o bencilo; parabenos alquilos como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipeptidos de bajo peso molecular (menos de alrededor de 10 residuos); protemas como albumina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polfmeros hidrofilos como polivinilpirrolidona; aminoacidos como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacaridos, disacaridos y otros carbohidratos, incluyendo glucosa, manosa o dextrinas; agentes quelantes como EDTA; azucares como sucrosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contra-iones que forman sales como sodio; complejos metalicos (por ejemplo, complejos de Zn-protemas); y/o surfactantes no ionicos como polisorbato, poloxameros o polietilenglicol (PEG).

Los ingredientes activos tambien pueden encontrarse dentro de microcapsulas preparadas, por ejemplo, mediante tecnicas de coacervacion o polimerizacion interfacial, por ejemplo, microcapsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcapsulas de poli-(metilmetacilato), respectivamente, en sistemas coloidales de liberacion de medicamentos (por ejemplo, liposomas, microesferas de albumina, microemulsiones, nanopartmulas y nanocapsulas) o en macroemulsiones. Estas tecnicas se desvelan en 'Remington's Pharmaceutical Siences', 16a edicion, Osol, A. Ed. (1980).

Tambien pueden preparse preparaciones de liberacion sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberacion sostenida incluyen matrices semipermeables de polfmeros solidos hidrofobos que contienen la variante del polipeptido, de manera que dichas matrices estan en forma de productos moldeados, por ejemplo, pelmulas o microcapsulas. Los ejemplos de matrices de liberacion sostenida incluyen poliesteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato) o polivinilalcohol, poliactidos (Patente de EE UU N° 3,773,919), copolfmeros de acido L-glutamico y etil-L-glutamato, acetato de etilen-vinilo no degradable, copolfmeros degradables de acido lactico-acido glicolico como LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas de copolfmero de acido lactico-acido glicolico y acetato de leuprolida) y acido poli-D-(-)3-hidroxibutmco.

El polipeptido purificado tal y como se ha desvelado en el presente texto o la composicion que contiene el polipeptido y un portador farmaceuticamente aceptable se utiliza posteriormente para diversos diagnosticos, terapias u otros usos conocidos para dichos polipeptidos y composiciones. Por ejemplo, el polipeptido puede usarse para tratar un desorden en un mamffero administrando al mairufero una cantidad terapeuticamente efectiva del polipeptido.

En algunas realizaciones, la arilsulfatasa se formula o prepara en una solucion isotonica como una de 154 mM de NaCl, o 0,9% de NaCl y 10-50 mM de fosfato de sodio con un pH de 6.5-8.0 o fosfato de sodio, glicina, manitol o las correspondientes sales de potasio. En otra realizacion, la ASA se formula en un tampon fisiologico, como, por ejemplo:

a) un tampon de formulacion I que contiene (en mM): Na2HPO4 (3,50-3,90), NaH2PO4 (0-0,5), glicina (2530), manitol (230-270) y agua para inyeccion; o

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b) un tampon de formulacion II que contiene (en mM): Tris-HCl (10), glicina (25-30), manitol (230-270) y

agua para inyeccion.

La arilsulfatasa A purificada puede prepararse para administrate directamente al sistema nervioso central (CNS), por ejemplo, por v^a intratecal o intracerebral, o para administrate por otros medios, por ejemplo, por via intravenosa (IV), o ambas, ya sea de manera simultanea, de manera secuencial o de cualquier otra forma combinada, de acuerdo con un paradigma de tratamiento determinado por un medico para cada paciente. Por ejemplo, la composicion farmaceutica descrita en el presente texto puede administrarse por una via que incluye una administracion intracerebroventricular, espinal, intratecal o intracraneal. La composicion farmaceutica descrita en el presente texto tambien puede administrarse por una via que no sea una administracion intracerebroventricular, espinal, intratecal o intracraneal, como una via seleccionada de un grupo que comprende la administracion intravenosa, intraarterial, oral, subcutanea, intraperitoneal, intramuscular, intraparenquimal, a traves de la mucosa, nasal y rectal.

La arilsulfatasa A purificada mediante un metodo descrito en el presente texto puede usarse como medicamento para reducir los niveles de esfingolfpido 3-O-sulfogalactosilceramida (galactosil sulfatido) en las celulas del sistema nervioso periferico y/o del sistema nervioso central de un sujeto que padece de y/o al que le han diagnosticado leucodistrofia metacromatica. La administracion de ASA provocara una disminucion en el deterioro de las habilidades de aprendizaje motor y/o un aumento en la velocidad de la conduccion del sistema motor nervioso y/o en la amplitud de la conduccion nerviosa.

La inyeccion intratecal (esto es, la inyeccion directa en el fluido cerebroespinal) de alfa-L-iduronidasa humana recombinante (rhIDU) puede reducir el almacenamiento de carbohidratos en el tejido cerebral en el caso de un tipo de mucopolisacaridosis canina (MPL) (Kakkis, 2003).

En algunas realizaciones, la composicion farmaceutica descrita en el presente texto se administra directamente al sistema nervioso central (CNS) de un sujeto, logrando asf una reduccion de las celulas diana del CNS del sujeto.

En algunas realizaciones, la composicion farmaceutica descrita en el presente texto se administra por via intravenosa y/o inyeccion espinal a un sujeto, logrando asf una reduccion en los niveles de galactosil sulfatido de las celulas diana del sistema nervioso periferico y en las celulas diana del sistema nervioso central del sujeto.

En algunas realizaciones, la arilsulfatasa A descrita en el presente texto se endocitosa eficazmente 'in vivo' en las celulas diana de un tejido seleccionado de un grupo que comprende el CNS (por ejemplo, oligodendroglfa), el sistema nervioso periferico (por ejemplo, celulas de Schwann), el Mgado, los rinones, el bazo y el corazon.

Tambien se contempla que la naturaleza exacta de los planes de tratamiento basados en el metodo de acuerdo con la presente invencion dependeran de factores como la edad, el sexo y el estadio de la enfermedad del sujeto que se va a tratar, y que el regimen optimo de dosis y la frecuencia de administracion pueden determinarse, de manera ventajosa, sobre una base empmca. Por ejemplo, la composicion farmaceutica puede administrarse en una o mas dosis, de manera que cada dosis contiene una cantidad de arilsulfatasa A de entre alrededor de 0,1 y alrededor de 100 mg/kg de peso corporal, por ejemplo, entre alrededor de 0,25 y alrededor de 50, entre alrededor de 1 y alrededor de 25, entre alrededor de 1 y alrededor de 10 o entre alrededor de 1 y alrededor de 5 mg/kg de peso corporal. La composicion farmaceutica tambien puede administrarse siguiendo un regimen diario, semanal, bisemanal o mensual.

Debe entenderse que el termino 'niveles efectivos o eficaces' hace referencia a los niveles de arilsulfatasa A que son efectivos o eficaces para provocar una reduccion de al menos un 10% del esfingolfpido 3-O- sulfogalactosilceramida (galactosil sulfatido) almacenado en las celulas de los organos viscerales, incluyendo los rinones, o en el CNS, tal y como se determina, por ejemplo, mediante una TLC (tambien llamada 'cromatograffa en capa fina' o 'CCF') realizada 8 dfas despues de la administracion de arilsulfatasa A por via intratecal o intravenosa, por ejemplo. Puede ser preferible que la reduccion del galactosil sulfatido sea de al menos alrededor de un 15%, al menos alrededor de un 20%, al menos alrededor de un 25%, al menos alrededor de un 30% o al menos alrededor de un 40% con respecto a los niveles presentes antes de la administracion de la enzima. Ademas, puede ser preferible que la arilsulfatasa A se administre en una cantidad de entre alrededor de 5 y 100 mg de enzima por kg de peso corporal, por ejemplo, alrededor de 10 mg/kg de peso corporal, alrededor de 20 mg/kg de peso corporal, alrededor de 30 mg/kg de peso corporal, alrededor de 50 mg/kg de peso corporal, alrededor de 60 mg/kg de peso corporal, alrededor de 70 mg/kg de peso corporal, alrededor de 80 mg/kg de peso corporal o alrededor de 90 mg/kg de peso corporal.

En algunas realizaciones, la composicion farmaceutica descrita en el presente texto incluye complementos y/o formulaciones con una capacidad reconocida para facilitar la administracion de macromoleculas a traves de la barrera hematoencefalica.

En algunas realizaciones, el uso de complementos o adjuntos, como compuestos o formulaciones con una

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capacidad reconocida para facilitar la administracion de macromoleculas al sistema nervioso central, no parece ser necesario para obtener el efecto observado en el sistema nervioso central. Por ello, en algunas realizaciones, el medicamento no comprende ninguno de los siguientes componentes:

a) un vehnculo, como un peptido o polipeptido, para administrar la enzima (arilsulfatasa A) al sistema nervioso central, y

b) un componente capaz de provocar la apertura o la disrupcion de la barrera hematoencefalica, y

c) una celula intacta, incluyendo una celula transducida, como una celula autologa transducida, por ejemplo, fibroblastos o linfocitos de la sangre periferica transducidos.

En algunas realizaciones, un tratamiento suplementario con cualquiera de los agentes o componentes mencionados previamente puede resultar innecesario. Por lo tanto, en algunas realizaciones, el medicamento es para administrarselo a un sujeto que no esta recibiendo ningun tratamiento adicional para reducir los niveles de esfingolfpido 3-O-sulfogalactosilceramida, incluyendo:

a) la administracion de una formulacion que comprende un vehnculo, como un peptido, polipeptido o anticuerpo, para administrar la enzima (arilsulfatasa A) al sistema nervioso central, y

b) la administracion de un componente capaz de provocar la apertura o la disrupcion de la barrera hematoencefalica, y

c) la administracion de una celula intacta, incluyendo una celula transducida, como una celula autologa transducida, por ejemplo, fibroblastos o linfocitos de la sangre periferica transducidos.

En una realizacion adicional, la composicion farmaceutica comprende ademas una solucion hipertonica o se administra junto con una solucion hipertonica para provocar la apertura osmotica de la barrera hematoencefalica.

La actividad enzimatica, que debe entenderse como la actividad catalttica de la ASA, puede medirse con un ensayo enzimatico basado en la hidrolisis -mediada por la ASA- de un sustrato detectable o de un sustrato que produce un producto final detectable. En un aspecto, el ensayo se basa en la hidrolisis del sustrato -sintetico y cromogenico- sulfato de para-Nitrocatecol (pNCS), cuyo producto final, el para-Nitrocatecol, absorbe luz a 515 nm.

Por ejemplo, un ensayo enzimatico de arilsulfatasa A puede ser el siguiente:

Materiales: 50 mM de sulfato de p-Nitrocatecol: disolver 0,156 g de sulfato de p-Nitrocatecol (Sigma, Catalogo # N-7251) en 10 ml de H2O doblemente destilada (dd). Guardar en papel de aluminio a 4° C.

3 M de acetato de sodio, pH de 5.0: disolver 24,69 g de acetato de sodio en 100 ml de H2O dd, ajustada a un pH de 5 y guardar a temperatura ambiente.

Tampon de ensayo 4X (debena prepararse el mismo dfa de uso): mezclar 5,0 ml de 3 M de acetato de sodio, pH de 5.0, 6,0 ml de 50 mM de sulfato de p-Nitrocatecol y 4,0 ml de H2O dd.

1 M de NaOH: 4 g de NaOH + 100 ml de H2O dd; guardado a temperatura ambiente.

Procedimiento: por motivos de deteccion y analisis, los ensayos se realizaron en placas Elisa con fondo plano. Se anadieron 25 pL del tampon de ensayo 4X a 75 pL de muestra o una dilucion adecuada de esta. Las placas se incubaron durante la noche a 4° C, se detuvo el proceso con 200 pL de 1M de NaOH y se registro la absorbancia a 515 nm en un lector de placa.

Para determinar la actividad espedfica de las muestras purificadas con DEAE, los ensayos se dispusieron en tubos y se doblaron todos los volumenes. Las incubaciones se realizaron a 37° C durante periodos de entre 5 y 20 minutos usando 10-1000 ng de enzima. Las muestras se leyeron en un espectrofotometro utilizando una cubeta con un recorrido de 1 cm. La actividad espedfica se define como los moles de sulfato de p-Nitrocatecol hidrolizados por minuto por cada mg de protema a 37° C, pH de 5.0.

Calculos: una Unidad (1 U) de actividad enzimatica se define como la hidrolisis de 1 pmol de sulfatasa de p- Nitrocatecol (pNCS) por minuto a 37° C, pH de 5.0.

Se utiliza la siguiente ecuacion para calcular la actividad enzimatica en pmoles de pNCS hidrolizada / min x ml (=Unidades/ml):

_____Vtot (ml)_______________________________X AA = Unidades/ml (1)

eM/1000 x Vmuestra (ml) x Tiempo de incubacion (min)

donde:

AA = absorbancia de la muestra - absorbancia del blanco

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Vtot (ml) = volumen total de reaccion en ml (en este caso, 0,15 ml)

Vmuestra (ml) = volumen de muestra anadido, en ml (en este caso, 0,05 ml)

eM = el coeficiente de extincion molar del producto pNC, que, en este caso, es 12 400 M-1 cm-1

La ecuacion 1 puede simplificarse mas si se escribe como:

AA x (0,15 / (12 400/1000 x 0,05 x 30)) =

X pmol(es) / (minuto(s) x ml) (=Unidades/ml) (1)

Para calcular la actividad espedfica en pmoles del pNC consumido/(minuto(s) x mg) (=Unidades/mg), dividir la ecuacion 1 por la concentracion de protemas de la muestra:

Ecuacion 1 / Concentracion de protemas (mg/ml) = Y pmoles / (minuto(s) x mg) = Unidades/mg (2)

La concentracion total de protemas en las muestras en proceso y los productos finales puede determinarse mediante un ensayo disponible comercialmente que utiliza los principios de la reduccion de Cu2+ a Cu+ por medio de protemas en un medio alcalino (la reaccion de Biuret). Una persona versada en la materia conoce bien este metodo.

La concentracion de arilsulfatasa A en las muestras recogidas despues de varios pasos del proceso de purificacion puede calcularse por medio de un ensayo por inmunoabsorcion ligado a enzimas (tambien denominado 'ELISA', por sus siglas en ingles) con arilsulfatasa A. La determinacion cuantitativa de una protema mediante ELISA es una tecnica convencional bien conocida por las personas con conocimientos y habilidades ordinarios en este campo. Sin embargo, esta dentro del alcance de la presente invencion proporcionar una ELISA espedfica para la deteccion de rASA que se basa en capturar o atrapar la enzima con inmunoglobulinas policlonales espedficas y, posteriormente, detectar la enzima capturada con anticuerpos monoclonales espedficos.

La pureza y la identidad de las diferentes preparaciones de arilsulfatasa A pueden determinarse mediante metodos que las personas con habilidades ordinarias en esta materia conocen bien, como HPLC de fase inversa, SDS-PAGE y 'Western blot' de arilsulfatasa A. Ademas, la cantidad de protemas de celulas enteras ('HCP', por sus siglas en ingles) en las preparaciones de arilsulfatasa A puede determinarse usando ELISA y tambien tecnicas de 'Western blot' que utilizan anticuerpos disponibles comercialmente. Normalmente, todos los procesos mencionados previamente se adaptan por comodidad para llevarlos a cabo en placas microtituladoras.

Una de las caractensticas del producto de arilsulfatasa A y de la formulacion que contiene arilsulfatasa A de acuerdo con la presente divulgacion es su muy bajo contenido de protemas de celulas huesped. En un producto o formulacion previstos para ser una composicion farmaceutica o un producto pensados para usarse en la preparacion de una composicion farmaceutica, el contenido de las mencionadas protemas es fundamental, puesto que se espera que tengan efectos inmunogenicos. En una realizacion habitual de la invencion, el producto o formulacion finales contienen menos de un 1,5% de protemas de celulas enteras, como menos de un 1%, por ejemplo, menos de un 0,75% o menos de un 0,5% o menos de un 0,25% de protemas de celulas enteras. Ademas, el producto o formulacion pueden contener impurezas en forma de variantes del componente principal enzimaticamente inactivas. En una realizacion habitual, el producto o formulacion de acuerdo con la presente invencion contiene al menos un 90% de ASA enzimaticamente activa, como un 92% o un 94%. En una realizacion aun mas habitual, la cantidad relativa de arilsulfatasa A enzimaticamente activa es de al menos un 95%, como un 96% o un 97% o incluso un 98% o un 99%, tal y como se determina mediante HPLC de fase inversa o HPLC de exclusion de tamano.

Una caractenstica adicional de la enzima o formulacion preparada de acuerdo con el proceso de la invencion es su elevado nivel de actividad espedfica. Por ello, es preferible que la formulacion o la composicion farmaceutica de acuerdo con la divulgacion contengan arilsulfatasa A con una actividad espedfica de al menos 10 U/mg, al menos 20 U/mg, al menos 25 U/mg, al menos 30 U/mg, al menos 40 U/mg, al menos 50 U/mg, al menos 60 U/mg, al menos 70 U/mg, al menos 75 U/mg, al menos 80 U/mg, al menos 85 U/mg, al menos 90 U/mg, al menos 100 U/mg, al menos 150 U/mg, al menos 200 U/mg, al menos 250 U/mg o al menos 300 U/mg de protema, por ejemplo, tal y como se determina mediante un metodo descrito en el presente texto. Habitualmente, la ASA tiene una actividad espedfica de entre alrededor de 50 U/mg y alrededor de 140 U/mg.

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Reivindicaciones

1. Un metodo para purificar la arilsulfatasa A (ASA) de una muestra; el metodo incluye: proporcionar una muestra de ASA,

someter la muestra a una primera cromatograffa de intercambio ionico que es una cromatograffa de intercambio anionico,

someter la muestra a una cromatograffa en modo mixto,

someter la muestra a una cromatograffa de interaccion hidrofobica, y

someter la muestra a una segunda cromatograffa de intercambio ionico,

de manera que la muestra se somete a la cromatograffa en modo mixto antes que a la cromatograffa de interaccion hidrofobica.
2. El metodo de la reivindicacion 1, en el que la ASA purificada tiene una actividad espedfica de entre alrededor de 50 U/mg y alrededor de 140 u/mg.
3. El metodo de las reivindicaciones 1 o 2, en el que la ASA purificada contiene menos de un 1,5% de protemas de celulas enteras.
4. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la muestra de protema ASA procede de un extracto celular crudo o un sobrenadante de un cultivo celular.
5. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, de manera que el metodo comprende someter la muestra de ASA a una primera cromatograffa de intercambio ionico que es una cromatograffa de intercambio anionico, someter la muestra de la primera cromatograffa de intercambio ionico a una cromatograffa en modo mixto, someter la muestra de la cromatograffa en modo mixto a una cromatograffa de interaccion hidrofobica, y someter la muestra de la cromatograffa de interaccion hidrofobica a una segunda cromatograffa de intercambio ionico, obteniendo asf una protema ASA purificada.
6. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la cromatograffa de intercambio anionico es una cromatograffa de intercambio anionico de aminas cuaternarias.
7. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la segunda cromatograffa de intercambio ionico es una cromatograffa de intercambio cationico y en el que, opcionalmente, la cromatograffa de intercambio cationico es una cromatograffa de intercambio cationico con sulfopropilo (SP).
8. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la cromatograffa en modo mixto es una cromatograffa de hidroxiapatita ceramica (HA).
9. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la cromatograffa de interaccion hidrofobica es una cromatograffa de fenilo, una cromatograffa de butilo o una cromatograffa de octilo.
10. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el metodo comprende, ademas, someter la muestra de ASA a una inactivacion viral y en el que, opcionalmente, la inactivacion viral comprende la adicion de un disolvente o un detergente.
11. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el metodo comprende, ademas, someter la muestra de ASA a una filtracion para eliminar virus y en el que, opcionalmente, la filtracion para eliminar virus incluye pasar la solucion que contiene la Asa a traves de un filtro esterilizado y, posteriormente, pasarla a traves de un nanofiltro.
12. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el metodo comprende, ademas, un paso de filtracion en profundidad.
13. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la protema ASA purificada de acuerdo con el metodo se prepara o formula en una composicion farmaceutica.
14. El metodo de la reivindicacion 13, en el que la composicion se prepara o formula para su administracion intravenosa o intratecal.
15. El metodo de la reivindicacion 13 o 14, en el que la composicion se prepara o formula pasa usarse en un metodo para tratar la leucodistrofia metacromatica (MLD) de un sujeto.