ES2928096T3 - Un proceso para la concentración de un polipéptido - Google Patents

Abstract

La presente invención comprende un método de concentración de una composición que comprende un polipéptido de interés y el uso de tal composición concentrada para el tratamiento de enfermedades en mamíferos, en particular mediante inyección subcutánea. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Un proceso para la concentración de un polipéptido

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a una composición que comprende por lo menos 25 mg/ml de arilsulfatasa A (ASA), en donde la cantidad de ASA presente como agregados constituye menos del 5% p/p de la cantidad total de ASA en la composición y el uso de la misma como medicamento en el tratamiento de la leucodistrofia metacromática.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Algunos polipéptidos son útiles como medicamento para la prevención y/o tratamiento de ciertas enfermedades. La capacidad de inyectar un medicamento por vía subcutánea es una ventaja ya que facilita que los pacientes se administren el medicamento a sí mismos.

Como hay restricciones fisiológicas sobre como de grande es el volumen que es posible inyectar por vía subcutánea. Por tanto, es una ventaja para los medicamentos que se van a administrar por vía subcutánea que estén disponibles en una alta concentración para garantizar que el paciente reciba una cantidad adecuada del medicamento y/o para evitar múltiples inyecciones subcutáneas.

La WO 99/37325 divulga métodos para tratar y prevenir enfermedades provocadas por la ausencia o deficiencia de la actividad de enzimas pertenecientes a la vía biosintética del hemo. La WO 03/002731 divulga un proceso para la purificación de porfobilinógeno desaminasa recombinante a escala industrial y el uso del producto purificado para la preparación de un medicamento. De manera similar, la WO 02/099092 y la WO 2005/094874 proporciona alfa-manosidasa lisosomal y el uso terapéutico de la misma. Finalmente, la WO 2005/073367 proporciona un proceso para la purificación de la arilsulfatasa A y el uso de la enzima en el tratamiento de la leucodistrofia metacromática.

La presente invención se refiere a un método para concentrar un polipéptido de interés y al uso de una composición que comprende un polipéptido de interés concentrado para la fabricación de un medicamento para su inyección subcutánea en mamíferos.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención está definida por las reivindicaciones. Cualquier materia que quede fuera del alcance de las reivindicaciones se proporciona únicamente con propósitos de información. Además, cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante terapia.

La presente invención se refiere en un aspecto a un método para concentrar una composición que comprende un polipéptido de interés que comprende:

a) Centrifugación y/o filtración de una composición que comprende un polipéptido de interés

b) Concentrar el sobrenadante o retenido, respectivamente, obtenido del paso a).

En otro aspecto, la presente invención se refiere a una composición que comprende por lo menos 25 mg/ml de ASA, en donde la cantidad de ASA presente como agregados constituye menos del 5% p/p de la cantidad total de ASA en la composición.

En otro aspecto más, la presente invención se refiere al uso de una composición que comprende 75-250 mg/ml de AAS para la fabricación de un medicamento para inyección subcutánea en un mamífero.

En otro aspecto más, la presente invención se refiere a un método para tratar la leucodistrofia metacromática de un mamífero que comprende la inyección subcutánea de una composición de 50-300 mg/ml de arilsulfatasa A.

DEFINICIONES

Para los propósitos de la presente invención, los alineamientos de secuencias y el cálculo de las puntuaciones de homología pueden realizarse usando un alineamiento completo de Smith-Waterman, útil tanto para alineamientos de proteínas como de ADN. Para los alineamientos de proteínas y ADN se usan las matrices de puntuación predeterminadas BLOSUM50 y la matriz de identidad, respectivamente. La penalización por el primer residuo en un espacio es -12 para proteínas y -16 para ADN, mientras que la penalización por residuos adicionales en un espacio es -2 para proteínas y -4 para ADN.

El alineamiento puede realizarse con el paquete FASTA versión v20u6 (W.R. Pearson y D.J. Lipman (1988), "Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85: 2444 - 2448, yW. R. Pearson (1990) "Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA", Methods in Enzymology, 183:63-98). Pueden realizarse alineamientos múltiples de secuencias de proteínas usando "ClustalW" (Thompson, J. D., Higgins, D. G. and Gibson, TJ. (1994) CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research, 22:4673-4680). El alineamiento múltiple de secuencias de ADN puede realizarse usando el alineamiento de proteínas como plantilla, reemplazando los aminoácidos con el codón correspondiente de la secuencia de ADN.

En el contexto de la presente invención, el término "E.C." (Clase de enzimas) se refiere al sistema de clasificación de enzimas reconocido internacionalmente, Recommendations of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology, Academic Press, Inc.

El término "origen" usado en el contexto de secuencias de aminoácidos, por ejemplo, proteínas o secuencias de ácidos nucleicos, debe entenderse que se refiere al organismo del que se deriva. Dicha secuencia puede ser expresada por otro organismo usando métodos de tecnología génica bien conocidos por el experto en la técnica. Esto también abarca secuencias que se han sintetizado químicamente. Además, dichas secuencias pueden comprender cambios menores como la optimización de codones, es decir, cambios en las secuencias de ácidos nucleicos que no afectan a la secuencia de aminoácidos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Polipéptido de interés

El polipéptido de interés según la invención es la arilsulfatasa

A. En la presente se divulgan otros polipéptidos de interés que pueden ser, en particular, una hormona o una variante de la hormona, una enzima, un receptor o una parte del mismo, un anticuerpo o una parte del mismo, un alérgeno o un informador. El polipéptido de interés puede ser, en particular, una enzima seleccionada de uno de los seis grupos de enzimas principales, como una oxidorreductasa (E.C. 1), una transferasa (E.C. 2), una hidrolasa (E.C. 3), una liasa (E.C. 4), una isomerasa (E.C. 5), o una ligasa (E.C. 6). En un aspecto más particular, el polipéptido de interés puede ser una aminopeptidasa, amilasa, carbohidrasa, carboxipeptidasa, catalasa, celulasa, celobiohidrolasa, quitinasa, cutinasa, ciclodextrina glicosiltransferasa, desoxirribonucleasa, endoglucanasa, esterasa, alfa-galactosidasa, beta-galactosidasa, glucoamilasa, alfa-glucosidasa, betaglucosidasa, invertasa, lacasa, lipasa, manosidasa, mutanasa, oxidasa, enzima pectinolítica, peroxidasa, fosfolipasa, fitasa, polifenoloxidasa, enzima proteolítica, ribonucleasa, transglutaminasa, xilanasa o betaxilosidasa.

El polipéptido de interés puede ser, en particular, un polipéptido útil como medicamento.

Los ejemplos de un polipéptido de interés adecuado incluyen, pero no se limitan a, uno seleccionado del grupo que consiste de una fosfobilinógeno desaminasa, una arilsulfatasa, una alfa-manosidasa y una galactocerebrosidasa.

En principio, puede tratarse un polipéptido de interés derivable de cualquier fuente de acuerdo los métodos de la presente invención.

En una realización particular, el polipéptido de interés puede ser de origen humano. Especialmente en el contexto del uso de un polipéptido de interés para la fabricación de un medicamento que se va a administrar a humanos, el polipéptido puede ser de origen humano ya que esto puede minimizar el riesgo de reacciones alérgicas no deseadas. Las variaciones naturales del polipéptido humano debidas, por ejemplo, al polimorfismo, están incluidas en el contexto de la presente invención en el término "origen humano".

El polipéptido de interés puede producirse en particular como una proteína recombinante, es decir, una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido de interés puede introducirse en una célula para la expresión del polipéptido de interés. La expresión recombinante puede ser homóloga o heteróloga, es decir, el polipéptido de interés puede expresarse en una célula en la que se expresa de forma natural (expresión homóloga) o puede expresarse en una célula en la que no se expresa de forma natural (expresión heteróloga).

El polipéptido recombinante de interés puede ser expresado por cualquier célula adecuada para la producción recombinante del polipéptido particular de interés. Los ejemplos de células adecuadas incluyen, pero no se limitan a, células procarióticas, como una célula de E.coli o una célula de Bacillus. Los ejemplos de células eucariotas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, una célula de levadura o una célula de mamífero como una de ovario de hámster chino (CHO). Alternativamente, puede ser una célula humana.

Las células huésped adecuadas para la expresión del polipéptido glicosilado se derivan de organismos multicelulares. Los ejemplos de células de invertebrados incluyen células de plantas e insectos. Sin embargo, la célula huésped también puede ser una célula de vertebrado y la propagación de células de vertebrados en cultivo (cultivo de tejidos) se ha convertido en un procedimiento rutinario.

El término "polipéptido recombinante" o "polipéptido recombinante de interés" denota en la presente un polipéptido recombinante producido.

La referencia a un polipéptido de interés particular incluye en el contexto de la presente invención también partes o análogos funcionalmente equivalentes del polipéptido de interés. Por ejemplo, si el polipéptido de interés es una enzima, una parte funcionalmente equivalente de la enzima podría ser un dominio o una subsecuencia de la enzima que incluya el sitio catalítico necesario para permitir que el dominio o la subsecuencia ejerza sustancialmente la misma actividad enzimática que la enzima de longitud completa o, alternativamente, un gen que codifica el catalizador. El término "sustancialmente la misma actividad enzimática" se refiere a una parte o análogo equivalente que tiene por lo menos el 50%, preferiblemente por lo menos el 60%, más preferiblemente por lo menos 70%, más preferiblemente por lo menos 75%, más preferiblemente por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos el 85%, más preferiblemente por lo menos el 90%, más preferiblemente por lo menos el 95% y lo más preferible por lo menos el 97%, por lo menos el 98% o por lo menos el 99% de la actividad de la enzima natural. Un ejemplo de un análogo enzimáticamente equivalente de la enzima podría ser una proteína de fusión que incluya el sitio catalítico de la enzima en una forma funcional, pero también puede ser una variante homóloga de la enzima derivada de otra especie. Además, las moléculas completamente sintéticas que imitan la actividad enzimática específica de la enzima relevante también constituirían "análogos equivalentes enzimáticos". En general, el experto en la técnica podrá idear fácilmente ensayos apropiados para la determinación de la actividad enzimática. Para PBGD, sin embargo, un ensayo adecuado se describe en la WO 03/002731, en el ejemplo 2, así como en las secciones experimentales de las presentes solicitudes. La arilsulfatasa, además de sus sustratos naturales, también es capaz de catalizar la hidrólisis del sustrato cromogénico sintético, sulfato de para-nitrocatecol (pNCS). El producto, para-nitrocatecol (pNC), absorbe luz a 515 nm. Un ensayo para la determinación de la actividad de arilsulfatasa se describe con detalle en la WO 2005/073367 y en Fluharty et al. 1978, Met. Enzymol. 50:537-47. Para LAMAN, se divulga un ensayo de actividad enzimática apropiado en la WO 02/099092.

Porfobilinógeno desaminasa

La porfobilinógeno desaminasa, (también conocida como porfobilinógeno amoniaco-liasa (polimerizante)), E.C. 4.3.1.8. (Waldenstrom 1937, J. Acta. Med. Scand. Supl. 8). La porfobilinógeno desaminasa es la tercera enzima en la vía biosintética del hemo. E.C. 4.3.1.8 se ha transferido a E.C. 2.5.1.61, por lo que la porfobilinógeno desaminasa (PBGD) ahora se coloca bajo este número E.C.

La porfobilinógeno desaminasa cataliza la reacción de 4 porfobilinógeno H2O = hidroximetilbilano 4 NH3. La PBDG es importante en relación con la porfiria aguda intermitente (AIP), que es un trastorno autosómico dominante en el hombre provocado por un defecto (reducción del 50% de la actividad) de PBDG (ver la WO01/07065 para más detalles al respecto).

La porfobilinógeno desaminasa se conoce en resumen como PBGD y, en el contexto de la presente divulgación, estos dos términos pueden usarse de manera intercambiable entre sí.

Para la expresión recombinante de PBGD, una célula huésped puede ser, en particular, una célula de levadura o una célula de E.coli.

Para un ejemplo detallado de la construcción de una célula de E.coli recombinante, se hace referencia al ejemplo 1 de la WO01/07065 y para la construcción de células NIH 3T3 y células HeLa recombinantes capaces de expresar PBGD de ratón se hace referencia al ejemplo 6 de la WO01/07065.

El término "porfobilinógeno desaminasa recombinante (rPBGD)" indica en la presente una PBGD producida recombinante. En lo sucesivo, esta enzima y la forma humana recombinante se denominarán "PBGD" y "rhPBGD", respectivamente. Dentro de este término también se incluye una parte o análogo enzimáticamente equivalente de PBGD. Un ejemplo de una parte enzimáticamente equivalente de la enzima podría ser un dominio o una subsecuencia de la enzima que incluye el sitio catalítico necesario para permitir que el dominio o la subsecuencia ejerza sustancialmente la misma actividad enzimática que la enzima de longitud completa o, alternativamente, un gen que codifica para el catalizador. El término "sustancialmente la misma actividad enzimática" se refiere a una parte o análogos equivalentes de enzima que tienen por lo menos un 50%, preferiblemente por lo menos un 60%, más preferiblemente por lo menos un 70%, más preferiblemente por lo menos un 75%, más preferiblemente por lo menos un 80%, más preferiblemente por lo menos un 85%, más preferiblemente por lo menos un 90%, más preferiblemente por lo menos un 95%, y lo más preferible por lo menos un 97%, por lo menos un 98%, o por lo menos un 99% de la actividad de rhPBGD humana natural medida en el ensayo de actividad de rhPBGD descrito en el ejemplo 2 de la WO 03/002731. Un ejemplo de un análogo enzimáticamente equivalente de la enzima podría ser una proteína de fusión que incluya el sitio catalítico de la enzima en una forma funcional, pero también puede ser una variante homóloga de la enzima derivada de otra especie. Además, las moléculas completamente sintéticas que imitan la actividad enzimática específica de la enzima relevante también constituirían "análogos equivalentes enzimáticos".

Un ejemplo de PBGD que puede usarse incluye cualquiera de los que se muestran en la Secuencia 1-10 de la presente solicitud, o en el Genebank N° X04217, X04808 o M95623.

Arilsulfatasa

En la presente invención el polipéptido de interés es la arilsulfatasa A.

La arilsulfatasa A cataliza la reacción de un cerebrósido 3-sulfato H2O = un cerebrósido sulfato.

La ASA se ha purificado a partir de una variedad de fuentes, incluyendo el hígado humano, la placenta y la orina. Es una glucoproteína ácida con un punto isoeléctrico bajo. Por encima de pH 6,5, la enzima existe como un dímero con un peso molecular de aproximadamente 110 kDa. La ASA experimenta una polimerización dependiente del pH formando un octámero a pH 4,5. En la orina humana, la enzima consiste de dos subunidades no idénticas de 63 y 54 kDa. La ASA purificada de hígado, placenta y fibroblastos humanos también consiste de dos subunidades de tamaños ligeramente diferentes que varían entre 55 y 64 kDa. Como en el caso de otras enzimas lisosomales, la ASA se sintetiza en los ribosomas unidos a la membrana como un precursor glicosilado. Luego pasa a través del retículo endoplásmico y Golgi, donde sus oligosacáridos N-enlazados se procesan con la formación de oligosacárido fosforilado y sulfatado del tipo complejo (Waheed A et al. Biochim Biophys Acta. 1985, 847, 53-61, Braulke T et al. Biochem Biophys Res Commun. 1987, 143, 178-185). En fibroblastos cultivados normales, se produce un polipéptido precursor de 62 kDa, que se transloca a través de la unión al receptor de manosa-6-fosfato (Braulke T et al. J Biol Chem. 1990, 265, 6650-6655) a una endosoma prelisosomal ácido (Kelly BM et al., Eur J Cell Biol. 1989, 48, 71-78).

La arilsulfatasa A puede ser en particular de origen humano. La longitud (18 aminoácidos) del péptido señal de ASA humana se basa en la secuencia consenso y en un sitio de procesamiento específico para una secuencia señal. Por lo tanto, a partir del ADNc de la ASA humana deducido (números de registro de EMBL GenBank J04593 y X521151), la escisión del péptido señal debe realizarse en todas las células después del residuo número 18 (Ala), lo que da como resultado la forma madura de ASA humana. En lo ssucesivo, la arilsulfatasa A recombinante se abreviará rASA, la forma madura de arilsulfatasa A que incluye la forma madura de ASA humana se denominará "mASA" y la ASA humana recombinante madura se denominará "mrhASA".

Se ha identificado una modificación proteica en dos sulfatasas eucariotas (ASA y arilsulfatasa B (ASB)) y en una del alga verde Volvox carteri (Schmidt B et al. Cell. 1995, 82, 271-278, Selmer T et al. Eur. J Biochem. 1996, 238, 341-345). Esta modificación lleva a la conversión de un residuo de cisteína, que se conserva entre las sulfatasas conocidas, en un residuo de ácido 2-amino-3-oxopropiónico (Schmidt B et al. Cell. 1995, 82, 271-278). El nuevo derivado de aminoácido también se reconoce como C*-formilglicina (FGly). En ASA y ASB derivadas de células MSD, se retiene el residuo Cys-69. En consecuencia, se propone que se requiere la conversión de Cys-69 a FGly-69 para generar ASA y ASB catalíticamente activas, y que la deficiencia de esta modificación proteica es la causa de MSD. Cys-69 se refiere a la ASA precursora que tiene un péptido señal de 18 residuos. En la mASA, el residuo de cisteína mencionado es Cys-51. Investigaciones adicionales han demostrado que una secuencia lineal de 16 residuos que rodean el Cys-51 en la mASA es suficiente para dirigir la conversión y que la modificación proteica se produce después o en una etapa tardía de la translocación de proteína cotraduccional en el retículo endoplásmico cuando el polipéptido todavía no se ha plegado a su estructura nativa (Dierks T et al. Proc Natl Acad Sci. 1997, 94, 11963-1196, Wittke, D. et al. (2004), Acta Neuropathol. (Berl.), 108, 261 -271).

Se han demostrado múltiples formas de AAS en electroforesis y enfoque isoeléctrico de preparaciones enzimáticas de orina humana, leucocitos, plaquetas, fibroblastos cultivados e hígado. El tratamiento con endoglicosidasa H, sialidasa y fosfatasa alcalina reduce el tamaño molecular y la complejidad del patrón electroforético, lo que sugiere que gran parte de la heterogeneidad de carga de ASA se debe a variaciones en el contenido de carbohidratos de la enzima.

La arilsulfatasa A puede ser, en particular, una forma de arilsulfatasa A, que es capaz de atravesar la barrera hematoencefálica y/o una forma de rASA, que posee marcadores específicos para entrar en células objetivo dentro del cerebro. En particular, puede ser una rASA, que experimenta eficientemente endocitosis in vivo a través de la vía de manosa-6-fosfato.

Por tanto, la ASA puede, en particular, unirse covalentemente a una llamada etiqueta, péptidos o proteínas como vehículos o toxinas como vehículos que son capaces de aumentar y/o facilitar el transporte de la ASA sobre la barrera hematoencefálica y/o a través de las membranas celulares en general (Schwarze et al., Trends Cell Biol.

2000; 10(7): 290-295; Lindgren et al., Trends Pharmacol. Sci. 2000; 21(3): 99-103). Una molécula de ASA que contiene tales secuencias peptídicas puede producirse mediante técnicas de expresión. El proceso de transducción de proteínas no es específico del tipo de célula y el mecanismo mediante el que se produce no está completamente dilucidado, sin embargo, se cree que tiene lugar por algún tipo de perturbación de la membrana y proceso de penetración que es independiente del receptor. Un estado parcialmente desplegado de la molécula puede facilitar el proceso, pero no es esencial.

Un ejemplo de una etiqueta adecuada incluye, pero no se limita a, la etiqueta manosa-6-fosfato.

Los ejemplos de péptidos o proteínas como vehículo incluyen, pero no se limitan a, los denominados dominios de transducción de proteínas. Los ejemplos de dominios de transducción de proteínas adecuados incluyen, pero no se limitan a, los mencionados en la WO 2005/073367.

Por lo tanto, el dominio de transducción de proteínas puede ser el péptido básico de 11 residuos de la proteína TAT del VIH -YGRKKRRQRRR (Schwarze et al., Trends Cell Biol. 2000; 10(7): 290-295), una versión sintética de TAT - YARAAARQARA que confiere más alfa-helicidad y naturaleza anfipática a la secuencia (Ho et al., Cancer Res. 2001; 61 (2):474-477), un péptido líder sintético compuesto por poli -R o una mezcla de residuos -R y -K básicos en combinación con otros aminoácidos y péptidos basados en fracciones de secuencia de señal hidrófobas de integrina beta-3 o FGF de sarcoma de Kaposi (Dunican et al. Biopolymers 2001; 60(1): 45-60).

Los ejemplos de toxinas adecuadas como vehículos incluyen, pero no se limitan a, las descritas en la WO 2005/073367.

La ASA puede, en particular, comprender una secuencia de ácidos nucleicos, que codifica:

(a) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2 en la WO 2005/073367;

(b) una porción de la secuencia en (a), que es enzimáticamente equivalente a la arilsulfatasa A humana recombinante

(c) un análogo de secuencia de aminoácidos que tenga por lo menos un 75% de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias en (a) o (b) y que al mismo tiempo comprenda una secuencia de aminoácidos que sea enzimáticamente equivalente a la arilsulfatasa A humana recombinante.

En el presente contexto, una secuencia de aminoácidos o una porción de una secuencia de aminoácidos que es un polipéptido capaz de hidrolizar una cantidad de pNCS del sustrato de arilsulfatasa A a 37° C a una tasa correspondiente a una actividad específica de por lo menos 20 U/mg de polipéptido (preferiblemente 50 U/mg de polipéptido) cuando se determina en un ensayo para medir la actividad de arilsulfatasa A como se describe en el ejemplo 1 de la WO 2005/073367, y/o un polipéptido, que es capaz de hidrolizar por lo menos el 40% del sustrato de arilsulfatasa A marcado, fx. 14C palmitoil sulfatida, cargada en fibroblastos MLD, cuando se analiza mediante incubación a un nivel de dosis de 25 mU/ml en un ensayo como se describe en el ejemplo 2 de la WO 2005/073367.

En otra realización en particular la ASA puede comprender:

(a) la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID NO: 1 en la WO 2005/073367

(b) una porción de la secuencia en (a), que codifica una secuencia de aminoácidos, que es enzimáticamente equivalente a la arilsulfatasa A humana recombinante

(c) un análogo de secuencia de ácidos nucleicos que tenga por lo menos un 75% de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias en (a) o (b) y que al mismo tiempo codifique una secuencia de aminoácidos, que sea enzimáticamente equivalente a la arilsulfatasa A humana recombinante

Puede preferirse que el grado de identidad de secuencias entre la secuencia de ácidos nucleicos mencionada anteriormente y la SEQ ID NO: 1 de la WO 2005/073367 sea por lo menos del 80%, como por lo menos el 85%, por lo menos el 90%, por lo menos el 95%, por lo menos el 97%, por lo menos el 98% o por lo menos el 99%. Puede preferirse igualmente que el grado de identidad de secuencias entre la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de ácidos nucleicos mencionada anteriormente y la SEQ ID NO: 2 WO 2005/073367 sea de por lo menos el 80%, como por lo menos el 85%, por lo menos el 90%, por lo menos el 95%, por lo menos el 97%, por lo menos el 98% o por lo menos el 99%.

Para los propósitos de la presente invención, se prefiere que la arilsulfatasa A sea una enzima recombinante, prefiriéndose particularmente la arilsulfatasa A humana recombinante (rhASA).

Se prefiere que la rASA se produzca en una célula o línea celular de mamífero y que dicha célula o línea celular de mamífero produzca una glicoforma de rASA, que se somete eficazmente a endocitosis in vivo a través de la vía del receptor de manosa-6-fosfato. Específicamente, la glicoforma preferida de rASA comprende una cantidad de manosa-6-fosfato expuesta, que permite una endocitosis eficaz de rASA in vivo a través de la vía de manosa-6-fosfato.

En una realización particular, por lo menos una de las glicoformas producidas de rASA es similar a una glicoforma producida en células CHO.

La modificación postraduccional del residuo de cisteína en la posición 51 en la arilsulfatasa A humana madura es relevante para la actividad de la enzima. Por consiguiente, en una realización preferida de la presente invención, la producción de arilsulfatasa A o su equivalente se produce a una tasa y en condiciones que dan como resultado un producto que comprende una isoforma de la enzima en la que el aminoácido correspondiente a Cys-69 en la SEQ ID NO: 2 de la WO 2005/073367 se convierte en Formilglicina, correspondiente a Fgly-51 en la SEQ ID NO: 3 de la WO 2005/073367. La SEQ ID NO: 4 de la WO 2005/073367 representa arilsulfatasa A humana madura después de la escisión del péptido señal de 18 aminoácidos pero antes de la modificación de C-51.

Por tanto, en otra realización de la presente invención, la ASA o su equivalente enzimático puede seleccionarse del grupo que consiste de

(a) la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3 de la WO 2005/073367;

(b) una porción de la secuencia en (a), que es enzimáticamente equivalente a la arilsulfatasa A humana recombinante

(c) un análogo de secuencia de aminoácidos que tenga por lo menos un 75% de identidad de secuencia con cualquiera de las secuencias en (a) o (b) y que al mismo tiempo sea enzimáticamente equivalente a la arilsulfatasa A humana recombinante.

Puede preferirse que el grado de identidad de secuencia entre la enzima producida de acuerdo con la invención y la ^s E^q ID NO: 3 de la WO 2005/073367 o la SEQ ID NO: 4 de la WO 2005/073367 sea de por lo menos el 80%, como por lo menos el 85%, por lo menos el 90%, por lo menos el 95%, por lo menos el 97%, por lo menos el 98% o por lo menos el 99%.

Para que la actividad biológica y los efectos de la enzima in vivo sean óptimos, es una ventaja que una cantidad adecuada de la enzima haya adquirido un patrón de glicosilación como se ha descrito anteriormente y se haya modificado postraduccionalmente en la posición 51. Por tanto, por lo menos el 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 98% de la ASA de la presente invención puede estar en la glicoforma/isoforma descrita anteriormente.

La ASA de la presente invención puede ser diferente en cuanto a su estructura de la rASA de acuerdo con la SEQ ID NO: 3 de la 2005/073367. Puede ser una ventaja que la secuencia de residuos de aminoácidos que rodean a Cys-51 sea idéntica o tenga un alto grado de identidad de secuencia con la secuencia correspondiente en la SEQ ID NO: 3. Por tanto, puede preferirse que una secuencia lineal de 20 aminoácidos, como 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5 o 4 residuos de aminoácidos que rodean el Cys-51 en la arilsulfatasa A sea idéntica o por lo menos un 90% idéntica, como un 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica a la secuencia correspondiente en la SEQ ID NO: 3 de la 2005/073367. Como la forma activa de la rASA dentro de los lisosomas es un octámero, la ASA de la presente invención puede ser en particular una rASA que es un octámero o se ensamble en un octámero en condiciones fisiológicas.

La actividad enzimática de la ASA, que debe entenderse como la actividad catalítica de la rASA, puede medirse en un ensayo enzimático en base a la hidrólisis mediada por rASA de un sustrato detectable o un sustrato, que lleva a un producto final detectable. En un aspecto preferido, el ensayo se basa en la hidrólisis del sustrato cromogénico sintético, sulfato de para-nitrocatecol (pNCS) que tiene un producto final, para-nitrocatechol (pNC) que absorbe luz a 515 nm.

Alfa-manosidasa lisosomal

En la presente también se divulga la alfa-manosidasa lisosomal (LAMAN). La alfa-manosidasa lisomal pertenece a EC 3.2.1.24 y es una exoglucosidasa que hidroliza los residuos de alfa-D-manosa no reductores terminales en alfa-D-manósidos del extremo no reductor durante la degradación ordenada de glicoproteínas N-enlazadas (Aronson y Kuranda FASEB J 3:2615-2622, 1989). La alfa-manosidasa lisosomal puede usarse indistintamente con el término corto LAMAN.

La LAMAN puede ser en particular de origen humano. La enzima humana se sintetiza como un polipéptido individual de 1011 aminoácidos con un péptido señal putativo de 49 residuos que se procesa en tres glicopéptidos principales de 15, 42 y 70 kD (Nilssen et al. Hum.Mol.Genet. 6, 717 -726. 1997).

El gen que codifica LAMAN (MANB) se localiza en el cromosoma 19 (19cen-q12), (Kaneda et al. Chromosoma 95:8-12. 1987). El MANB consiste de 24 exones, que abarcan 21,5 kb (números de registro de GenBank U60885-U60899; Riise et al. Genomics 42:200-207. 1997). La transcripción de LAMAN tiene » 3.500 nucleótidos (nts) y contiene un marco de lectura abierto que codifica 1.011 aminoácidos (GenBank U60266.1). La clonación y secuenciación del ADNc humano que codifica LAMAN se ha publicado en tres artículos (Nilssen et al. Hum.Mol.Genet. 6, 717-726. 1997; Liao et al. J.Biol.Chem. 271, 28348-28358). 1996; Nebes et al., Biochem.Biophys.Res.Commun.200, 239-245. 1994). Curiosamente, las tres secuencias no son idénticas. Cuando se comparó con la secuencia de Nilssen et al (N° de registro U60266.1) Liao et al. y Nebes et al. descubrieron un cambio de TA a AT en las posiciones 1670 y 1671 que dio como resultado una sustitución de valina a ácido aspártico. En una realización más preferida, la alfa manosidasa lisosomal comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1 de la WO 2005/094874.

Por razones prácticas y económicas, se prefiere que LAMAN se produzca recombinantemente. Mediante producción recombinante también puede ser posible obtener una preparación de la enzima en donde una gran fracción contiene manosa-6-fosfato. La producción recombinante puede lograrse después de la transfección de una célula usando una secuencia de ácidos nucleicos que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 2 de la WO 2005/094874.

La alfa-manosidasa se prepara preferiblemente en un sistema celular de mamífero ya que esto dará como resultado un perfil de glicosilación, que asegura una captación mediada por el receptor eficiente en células de, por ejemplo, órganos viscerales del cuerpo. En particular, se ha descubierto que la producción de la enzima en células CHO, COS o BHK asegura una modificación postraduccional adecuada de la enzima mediante la adición de residuos de manosa-6-fosfato. Además se obtiene un perfil de sialilación correcto. Se sabe que la sialilación correcta es importante para evitar la absorción por el hígado, debido a los residuos de galactosa expuestos.

En realizaciones aún más preferidas, el sistema de células de mamífero se selecciona por lo tanto del grupo que comprende células CHO, COS o células BHK (Stein et al. J Biol Chem. 1989, 264, 1252-1259). Puede preferirse además que el sistema de células de mamífero sea una línea celular de fibroblastos humanos.

En una realización más preferida, el sistema de células de mamífero es una línea celular de CHO. En otra realización, la alfa-manosidasa lisosomal puede ser una preparación de alfa-manosidasa lisosomal en donde una fracción de dicha preparación consiste de alfa-manosidasa lisosomal que tiene uno o más oligosacáridos N-enlazados que llevan grupos manosa 6-fosfato.

Se prefiere además que una fracción de una preparación de dicha alfa-manosidasa lisosomal sea capaz de unirse a los receptores de manosa 6-fosfato.

La capacidad de la enzima para unirse a los receptores de manosa-6-fosfato puede determinarse en un ensayo in vitro como se describe en el ejemplo 1 de la WO 2005/094874. Aquí, la unión de la enzima a una matriz 300 de afinidad MPR proporciona una medida de su capacidad para unirse a los receptores de manosa-6-fosfato. En una realización preferida de la invención, la unión de la enzima a los receptores de manosa-6-fosfato se produce in vitro.

En realizaciones más preferidas esta fracción corresponde del 1 al 75% de la actividad de una preparación de alfa-manosidasa lisosomal, como del 2 al 70%, como del 5 al 60%, como del 10 al 50% como del 15 al 45%, como del 20 al 40%, como del 30 al 35%.

Por consiguiente, se prefiere que la alfa-manosidasa lisosomal tenga un contenido de residuos de manosa 6-fosfato que permitan la unión dependiente de manosa 6-fosfato del 2 al 100%, del 5 al 95%, del 10 al 90%, del 20 al 80%, del 30 al 70% o del 40 al 60% de la cantidad de enzima a una matriz de receptor Man-6-P. En la actualidad, se ha analizado el grado de fosforilación en varios lotes de enzima y, típicamente, se fosforila y se une a la matriz de afinidad del 30 al 45% de la enzima.

Se prefiere además que una fracción que constituya del 2 al 100%, del 5 al 90%, del 10 al 80%, del 20 al 75%, del 30 al 70%, del 35 al 65% o del 40 al 60% de la cantidad de dicha alfa lisosomal-manosidasa se una al receptor de Man-6-P con alta afinidad. Teóricamente, dos grupos manosa 6-fosfato deben colocarse uno cerca del otro para que la enzima se una a un receptor de Man-6-P con alta afinidad. Observaciones recientes sugieren que la distancia entre los residuos de manosa fosforilada debe ser de 40 Á o menos para obtener una unión de alta afinidad. En la alfa-manosidasa lisosomal humana de acuerdo con la SEQ ID NO: 1 de la WO 2005/094874 los dos residuos de manosa 6-fosfato pueden estar situados en los residuos de asparagina en las posiciones 367 y 766. Por consiguiente, se prefiere que el medicamento comprenda alfa-manosidasa lisosomal, una fracción de la cual lleva grupos manosa 6-fosfato en ambos residuos de asparagina.

Preferiblemente, la alfa-manosidasa se prepara mediante técnicas recombinantes. En una realización adicional, la alfa-manosidasa es de origen humano (hLAMAN) y se prefiere aún más una alfa-manosidasa humana madura (mhLAMAN) o un fragmento de la misma. El fragmento puede modificarse, sin embargo deben conservarse los sitios activos de la enzima.

Es de esperar que, en las preparaciones de alfa-manosidasa de acuerdo con la presente invención, una fracción de la enzima esté representada por su forma precursora, mientras que otras fracciones representan las formas procesadas proteolíticamente de aproximadamente 55 y 70 kDa.

Galactocerebrosidasa

Otro polipéptido de interés puede ser una galactocerebrosidasa, que puede acortarse a GALC. La galactocerebrosidasa pertenece a E.C. 3.1.6.46 y son enzimas capaces de catalizar la reacción de D-galactosil-N-acilesfingosina H2O = D-galactosa N-acilesfingosina, por tanto GALC cataliza la degradación de galactolípidos en, por ejemplo, mielina.

La enzima GALC derivada de humanos es una enzima lisosomal glicosilada que comprende 643 aminoácidos y tiene un peso molecular de 72,8 kDa. La GALC de la presente invención puede ser en particular de origen humano. En una realización adicional, la GALC puede expresarse recombinantemente en una de las células huésped mencionadas anteriormente. La célula huésped para la expresión recombinante de GALC puede ser, en particular, una célula CHO.

En la descripción y en las reivindicaciones se hace referencia a las siguientes secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos:

Con referencia a estas secuencias, el polipéptido de interés, de acuerdo con realizaciones preferidas de la invención, comprende un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de:

i) una secuencia de aminoácidos como se define en cualquiera de las SEQ ID NO: 18, 19, 20;

ii) una parte funcionalmente equivalente de una secuencia de aminoácidos como se define en i); y

iii) un análogo funcionalmente equivalente de una secuencia de aminoácidos como se define en i) o ii), siendo la secuencia de aminoácidos de dicho análogo idéntica por lo menos en un 75% a una secuencia de aminoácidos como se define en i) o ii).

En realizaciones particulares, el análogo en iii) es por lo menos un 80% idéntico a una secuencia como se define en i) o ii), como por lo menos un 85%, por lo menos un 90%, por lo menos un 95%, por lo menos un 98%, por lo menos un 99%, o como por lo menos un 99,5% idéntico a una secuencia como se define en i) o ii).

Además, el polipéptido de interés puede obtenerse mediante expresión recombinante usando una secuencia de ácidos nucleicos que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de:

i) una secuencia de ácidos nucleicos como se define por cualquiera de las SEQ ID NO: 1-13, 16, 17, 22 y 23; ii) una secuencia de ácidos nucleicos que es por lo menos un 75% idéntica a una secuencia de ácidos nucleicos como se define en i).

Para la producción recombinante del polipéptido puede preferirse además que la secuencia de ácido en ii) sea por lo menos un 80% idéntica a una secuencia definida en i), como por lo menos un 85%, por lo menos un 90%, por lo menos un 95%, por lo menos un 98%, por lo menos un 99%, o como por lo menos un 99,5% idéntica a una secuencia como se define en i).

Composición que comprende un polipéptido de interés.

La presente invención se refiere a una composición que comprende por lo menos 25 mg/ml de ASA, como por lo menos 50 mg/ml o por lo menos 75 mg/ml o por lo menos 100 mg/ml del polipéptido de interés. Por tanto, dicha composición puede comprender en particular entre 25-500 mg/ml o entre 25-400 mg/ml o entre 40-400 mg/ml 0 entre 40-300 mg/ml o entre 50-400 mg/ml o entre 50-400 mg/ml o entre 50-300 mg/ml o entre 75-400 mg/ml o entre 75-300 mg/ml o entre 100-200 mg/ml o entre 100-150 mg/ml polipéptido de interés.

La composición que comprende un polipéptido de interés puede ser, en particular, una solución acuosa. Además de comprender una alta concentración de polipéptido de interés, dicha composición en particular no comprende agregados del polipéptido de interés o por lo menos solo muy pocos agregados. Por tanto, la cantidad de polipéptido de interés presente como agregados constituye menos del 5% p/p de la cantidad total de polipéptido de interés en la composición. En particular, dichos agregados pueden constituir menos del 4% p/p, como menos del 3% p/p, o menos del 2% p/p, o menos del 1% p/p, o menos del 0,5% p/p, o menos del 0,1% p/p de la cantidad total de polipéptido de interés. En el presente contexto, el término "agregados" significa cualquier forma del polipéptido de interés que no sea monomérica. Por tanto, el término abarca cualquier dímero o multímero del polipéptido de interés.

Además, es una ventaja si dicha composición comprende solo el polipéptido de interés o por lo menos solo trazas menores de otras proteínas, es decir, proteínas diferentes del polipéptido de interés. Por lo tanto, en una realización particular, dicha composición comprende menos del 1% p/p, como menos del 0,5% p/p, o menos del 0,1% p/p, o menos del 0,05% p/p, o menos del 0,01% p/p de otras proteínas además del polipéptido de interés.

Una variedad de factores afectan a la estabilidad y a la actividad de los polipéptidos y, por lo tanto, la composición que comprende un polipéptido de interés puede optimizarse en particular para mantener el polipéptido de interés lo más estable posible.

El pH afecta generalmente a la estabilidad de un polipéptido de interés, por lo que el pH de una composición que comprende un polipéptido de interés puede estar en particular en el intervalo de 7,5-8,5, como en particular entre pH 7,7-8,2, más particularmente entre pH 7,8-8,0 o entre pH 7,85-7,95, como pH 7,8 o pH 7,9. Este puede ser el caso en particular si el polipéptido de interés es PBGD.

Por tanto, la composición que comprende un polipéptido de interés puede comprender, en particular, un tampón capaz de mantener la composición dentro del intervalo de pH descrito. Los ejemplos de tales tampones incluyen, pero no están limitados a, TRIS-HCL, Na-Citrato y Na2HPO4. La concentración de dicho tampón puede depender de la elección del tampón particular y de la presencia de otros componentes en la composición. Si el tampón es Na2HPO4 la concentración de Na2HPO4 puede estar en el intervalo de 0,5-15 mM, como en el intervalo de 1 -10 mM, o en el intervalo de 1,5-7,5 mM, como en el intervalo de 1,83-7,4 mM, o en el intervalo de 1,5- 3 mM, como en el intervalo de 1,83-3,7 mM, o en el intervalo de 1,83-2,45 mM, o en el intervalo de 3,5-7,5 mM, como en el intervalo de 3,6-7,4 mM, o en el intervalo de 5,4-7,4 mM, como 1,84 mM o 2,45 mM o 3,67 mM o 5,51 mM o 7,34 mM.

Si el tampón es TRIS-HCL, la concentración de TRIS-HCL puede estar en particular en el intervalo de 2-50 mM, como 2-40 mM, o 2-30 mM, o 2-20 mM, o 2-10 mM., o 5-25 mM, o 5-20 mM, o 8-12 mM, o 9-11 mM, por ejemplo, 10 mM.

Los ejemplos de otros compuestos que puede comprender la composición que comprende un polipéptido de interés incluyen, pero no se limitan a, aminoácidos, azúcares, alcoholes y detergentes. Los ejemplos de dichos compuestos adecuados incluyen, pero no se limitan a, glicina, manitol, sacarosa, L-serina, Tween 80 o una combinación de uno o más de dichos compuestos. La concentración de estos compuestos depende del compuesto particular, pero para la glicina la concentración puede estar en particular en el intervalo de 1-200 mM, como en el intervalo de 5-190 mM, o en el intervalo de 10-180 mM. o en el intervalo de 10-170 mM, o en el intervalo de 20-160 mM, o en el intervalo de 20-150 mM, o en el intervalo de 25-125 mM, o en el intervalo de 5-100 mM, o en el intervalo de 5-90 mM, o en el intervalo de 5-80 mM, o en el intervalo de 5-70 mM, o en el intervalo de 5-60 mM, o en el intervalo de 10-100 mM, o en el intervalo de 10-90 mM, o en el intervalo de 10-80 mM, o en el intervalo de 10-70 mM, o en el intervalo de 10-60 mM, o en el intervalo de 12-60 mM, o en el intervalo de 12-55 mM, o en el intervalo de 13,5-54 mM, o en el intervalo de 10-30 mM, como en el intervalo de 13,5-27 mM, o en el intervalo de 13,5-18 mM, o en el intervalo de 25-55 mM, como en el intervalo de 27-54 mM, o en el intervalo de 40-55, como en el intervalo de 40.5- 54 mM, como 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 39,5, 40, 40,5, 41, 41,5 o 53, 53,5, 53, 54,5 o 55 mM.

La concentración de manitol puede estar en particular en el intervalo de 50-1000 mM, como en el intervalo de 50-900 mM, o en el intervalo de 50-800 mM, o en el intervalo de 50-700 mM, o en el intervalo de 50-600 mM, o en el intervalo de 100-900 mM, o en el intervalo de 100-800 mM, o en el intervalo de 100-700 mM, o en el intervalo de 100-600 mM, o en el intervalo de 100-500 mM, o en el intervalo de 120-525 mM, o en el intervalo de 125-500 mM, o en el intervalo de 100-300 mM, como en el intervalo de 120-275 mM, o en el intervalo de 120-170 mM, o en el intervalo de 200-600 mM, como en el intervalo de 225-550 mM, o en el intervalo de 240-510 mM, o en el intervalo de 370-525 mM, como 120, 125, 130, 160, 165, 166,7, 170, 175, 200, 221, 225, 250, 275, 300, 365, 370, 375, 380, 385, 490, 495, 500, 505 o 510 mM.

La concentración de sacarosa puede estar en particular en el intervalo de 1-200 mM, como en el intervalo de 5-190 mM, o en el intervalo de 10-180 mM, o en el intervalo de 10-170 mM, o en el intervalo de 20-160 mM, o en el intervalo de 20-150 mM, o en el intervalo de 25-125 mM, o en el intervalo de 5-100 mM, o en el intervalo de 5-90 mM, o en el intervalo de 5-80 mM, o en el intervalo de 5-70 mM, o en el intervalo de 5-60 mM, o en el intervalo de 10-100 mM, o en el intervalo de 10-90 mM, o en el intervalo de 10-80 mM, o en el intervalo de 10-70 mM, o en el intervalo de 10-60 mM, o en el intervalo de 12-60 mM, o en el intervalo de 12-55 mM, o en el intervalo de 13,5-54 mM, o en el intervalo de 10-30 mM, como en el intervalo de 13,5-27 mM, o en el intervalo de 13,5-18 mM, o en el intervalo de 25-55 mM, como como en el intervalo de 27-54 mM, o en el intervalo de 40-55, como en el intervalo de 40.5- 54 mM, como 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 39,5, 40, 40,5, 41, 41,5 o 53, 53,5, 53, 54,5 o 55 mM. Si la sacarosa está incluida en una composición que también comprende manitol, la concentración de manitol puede reducirse en particular en correspondencia con la concentración de sacarosa; es decir, la concentración de manitol y sacarosa juntos puede ser, en particular, la misma que la concentración de manitol si éste se usara solo.

La concentración de Tween 80 puede estar en particular en el intervalo de 0,001-1% p/v, como en el intervalo de 0,005-1% p/v, o en el intervalo de 0,01-1% p/v, o en el intervalo de 0,001-0,5% p/v, o en el intervalo de 0,005-0,5% p/v, o en el intervalo de 0,01-0,5% p/v, o en el intervalo de 0,05-0,4% p/v, o en el intervalo de 0,05-0,3% p/v, o en el intervalo de 0,05-0,2% p/v, o en el intervalo de 0,075-0,4% p/v, o en el intervalo de 0,075-0,3% p/v, o en el intervalo de 0,075-0,2% p/v, o en el intervalo de 0,09-0,2% p/v, como 0,075, 0,08, 0,09, 0,1, 0,125, 0,15, 0,175 o 0,2% p/v

La composición que comprende un polipéptido de interés, en donde el polipéptido en particular puede ser una PBGD, una arilsulfatasa, una alfa-manosidasa lisosomal o una galactocerebrosidasa, puede comprender en particular una combinación de uno o más de los compuestos mencionados anteriormente. Un ejemplo adecuado de dicha composición puede ser uno que además del polipéptido de interés comprenda Na2HPÜ4, glicina y manitol. El pH de la composición y la concentración de los diferentes compuestos pueden ser como se ha descrito anteriormente. Por lo tanto, dicha composición puede comprender en una realización Na2HPÜ40,5-15 mM, glicina 1­ 200 mM, manitol 50-1000 mM y un pH en el intervalo de 7,5-8,5. La presente invención abarca cualquier combinación de las concentraciones mencionadas anteriormente de compuestos y pH. Un ejemplo específico de una combinación adecuada de otros compuestos y pH en la composición que comprende un polipéptido de interés es uno que comprende Na2HPÜ43,67 mM, glicina 27 mM, manitol 250 mM y tiene un pH en el intervalo de 7,7 a 7,9.

Otros ejemplos de composiciones adecuadas incluyen, pero no se limitan a, cualquiera de los siguientes:

• Na2HPO41,84 mM, glicina 13,5 mM, manitol 125 mM y pH en el intervalo de 7,7 a 7,9.

• Na2HPO42,45 mM, glicina 18 mM, manitol 167 mM y pH en el intervalo de 7,7 a 7,9.

• Na2HPO45,51 mM, glicina 40,5 mM, manitol 375 mM y pH en el intervalo de 7,7 a 7,9.

• Na2HPO47,34 mM, glicina 54 mM, manitol 500 mM y pH en el intervalo de 7,7 a 7,9.

• Na2HPO43,67 mM, glicina 27 mM, manitol 220 mM, sacarosa 30 mM y pH en el intervalo de 7,7 a 7,9.

• Na2HPO43,67 mM, manitol 245 mM, sacarosa 32 mM y pH en el intervalo de 7,7 a 7,9.

• Na2HPO43,67 mM, L-serina 27 mM, manitol 250 mM y pH en el intervalo de 7,7 a 7,9.

• TRIS-HCl 10 mM, glicina 27 mM, manitol 250 mM y pH en el intervalo de 7,7 a 7,9.

• NaCitrat 3,67 mM, glicina 27 mM, manitol 250 mM y pH en el intervalo de 7,7 a 7,9.

• Na2HPO43,67 mM, glicina 27 mM, manitol 220 mM, sacarosa 29 mM, Tween 80 al 0,1% (p/v) y pH en el intervalo de 7,7 a 7,9.

• Na2HPÜ43,67 mM, glicina 27 mM, manitol 220 mM, sacarosa 29 mM, Tween 80 al 0,1% (p/v) y pH en el intervalo de 7,7 a 7,9.

La composición que comprende un polipéptido de interés puede usarse en particular para aplicaciones terapéuticas en mamíferos. Por tanto, la composición que comprende un polipéptido de interés puede ser, en particular, isotónica con respecto al tejido de los mamíferos, por ejemplo, puede tener en particular una osmolalidad en el intervalo de 200-400 mOsm/kg, como en el intervalo de 250-350 mOsm/kg o en el intervalo de 275-325 mOsm/kg o en el intervalo de 295-305 mOsm/kg, como 295 mOsm/kg o 300 mOsm/kg o 305 mOsm/kg.

Método de concentrar un polipéptido de interés.

El método de la presente invención comprende los pasos de a) centrifugación y/o filtración de una composición que comprende un polipéptido de interés y b) concentración de la composición del paso a). Los inventores de la presente invención han descubierto que mediante la centrifugación y/o filtración de una composición que comprende un polipéptido de interés antes de concentrar dicha composición, es posible obtener una composición que comprende un polipéptido de interés altamente concentrado sin ninguno o con por lo menos pocos agregados del polipéptido de interés. Además, generalmente es una ventaja para las aplicaciones terapéuticas de un polipéptido que se reduzca la cantidad de agregados de polipéptido, por ejemplo, ya que pueden aumentar el riesgo de provocar una respuesta inmunitaria hacia el polipéptido.

Para la administración de un polipéptido por vía subcutánea, es una ventaja que la composición de polipéptido tenga una alta actividad en un volumen pequeño, ya que solo pueden inyectarse por vía subcutánea volúmenes pequeños.

Las proteínas o los polipéptidos pueden, en general, formar agregados cuando se concentran. Por tanto, es una ventaja que cuando el método de la presente invención se usa para concentrar un polipéptido de interés, no provoque una alta tasa de formación de agregados de polipéptidos. Como se muestra en los ejemplos, la cantidad de agregados de PBGD en la composición obtenida por el método de concentración de la presente invención es similar a la de una composición de PBGD no concentrada.

En una realización particular, el paso a) del método se realiza antes del paso b).

Paso a) centrifugación y/o filtración

Los inventores de la presente invención han descubierto que antes de concentrar una composición que comprende un polipéptido de interés, es una ventaja tratar previamente la composición mediante centrifugación y/o filtración de la composición, ya que con este pretratamiento se eliminan muchos o la mayoría de los agregados del polipéptido.

Cuando la concentración de la composición en el paso b) se realiza mediante un método que se basa en el uso de un filtro o una membrana, como la ultrafiltración, la presencia de agregados puede bloquear el filtro o la membrana de tal manera que las moléculas pequeñas y el líquido no pueden cruzar el filtro o la membrana. Esto puede disminuir la velocidad a la que se concentra la composición y/o bloquear completamente cualquier concentración adicional.

Por tanto para este tipo de concentración el pretratamiento de acuerdo con el paso a) es una ventaja ya que la eliminación de los agregados permite obtener composiciones de un polipéptido de interés que están más concentradas que si dicha composición no se hubiera pretratado.

Cuando la concentración de la composición en el paso b) se realiza mediante un método que se basa en la eliminación de agua, como secado por congelación o evaporación, el pretratamiento del paso a) tiene la ventaja de que reduce la cantidad de agregados presentes en la composición concentrada.

El paso a) puede realizarse mediante una de las siguientes tres alternativas:

• centrifugación,

• filtración, o

• centrifugación y filtración.

Si el paso a) comprende tanto centrifugación como filtración, es una ventaja realizar la centrifugación antes de la filtración, ya que los inventores de la presente invención han descubierto que la centrifugación elimina la mayoría de los agregados grandes y la filtración elimina posteriormente los agregados más pequeños restantes. Centrifugación

Para poder eliminar los agregados, la composición que comprende un polipéptido de interés puede centrifugarse a una fuerza en el intervalo de 1500-3000 g, como en el intervalo de 1800-2500 g, o en el intervalo de 2000-2300 g.

Típicamente, la composición puede centrifugarse durante 10-60 minutos, por ejemplo durante 15-50 minutos o durante 20-40 minutos.

Como la temperatura puede afectar a la estabilidad del polipéptido de interés, la centrifugación puede realizarse a una temperatura en el intervalo de 2 a 20° C, como de 3 a 15° C o en el intervalo de 3 a 10° C, o en el intervalo de 3-8° C, como a 4° C o 5° C o 6° C.

La centrifugación da como resultado que el polipéptido de interés se agregue al sedimento, es decir, forme un sedimento, mientras que las moléculas individuales del polipéptido de interés permanecen en la solución. Por tanto, es el sobrenadante de la composición centrifugada el que se usa posteriormente en el método de la presente invención.

Filtración

La composición que comprende un polipéptido de interés puede filtrarse a través de un filtro que tenga un tamaño de poro en el intervalo de 0,20-5 gm, como en el intervalo de 0,2-2,5 gm.

Además del tamaño de poro del filtro, el material del que está hecho el filtro también puede afectar a la filtración del polipéptido de interés. Los ejemplos de filtros de membrana adecuados incluyen, pero no se limitan a, polietersulfona (PES), acetato de celulosa, celulosa regenerada y fluoruro de polivinilideno (PVDF).

Cuando se filtran moléculas como proteínas, habitualmente son las moléculas pequeñas las que se eliminan por lo que, después de la filtración, el polipéptido de interés puede estar generalmente presente en el retenido. Por tanto, generalmente es el retenido de la filtración lo que se usa en los pasos posteriores de la presente invención.

Paso b) concentración

En principio, en el paso b) de la presente invención puede usarse cualquier método para concentrar el polipéptido de la composición de interés.

Los ejemplos de dichos métodos adecuados incluyen, pero no se limitan a, ultrafiltración y concentración por eliminación de agua.

Ultrafiltración

La ultrafiltración es un método de separación en el que se usa presión hidráulica para forzar a las moléculas y el solvente a través de una membrana que comprende poros de un tamaño particular, también conocido como tamaño de valor de corte. Solo las moléculas que tienen un peso molecular menor que el valor de corte de la membrana pueden atravesar la membrana, mientras que aquellas con un peso molecular mayor no cruzan la membrana y forman el denominado retenido. Las moléculas presentes en el retenido se concentran de este modo a medida que el solvente fluye a través de la membrana.

En una realización particular la concentración de la solución o composición que comprende un polipéptido de interés puede realizarse mediante filtración de flujo tangencial (TFF). Este método es particularmente útil para la concentración a gran escala, es decir, para la concentración de soluciones con un volumen de un litro a varios cientos de litros. Por tanto, este método es particularmente útil para la producción de soluciones concentradas de un polipéptido de interés a escala industrial.

La técnica de TFF se basa en el uso de un aparato particular que hace que la solución que se va a filtrar fluya a través de una membrana semipermeable; solo las moléculas que son más pequeñas que los poros de la membrana pasarán a través de la membrana, formando el filtrado, dejando materia más grande para ser recogida (retenido). Con el método de TFF se aplican dos presiones diferentes; una para bombear la solución hacia el sistema y hacerla circular en el sistema (presión de entrada), y otra presión se aplica sobre la membrana (presión de membrana) para forzar a las moléculas pequeñas y al solvente a través de la membrana. La presión de entrada puede estar típicamente en el intervalo de 1 a 3 bares, como entre 1,5 y 2 bares. La presión de la membrana típicamente puede ser mayor de 1 bar.

La composición concentrada de un polipéptido de interés puede recogerse como el retenido cuando se usa TFF para concentrar la composición.

Las membranas útiles para la TFF pueden estar hechas típicamente de celulosa regenerada o poliétersolufona (PES).

El tamaño de poro de la membrana puede tener típicamente un límite de peso molecular que es menor de 10.000 Mw, como en el intervalo de 10-10.000 Mw.

En otra realización, la concentración de la composición que comprende un polipéptido de interés puede realizarse mediante el uso de un dispositivo centrífugo. El principio de este método es que la solución se filtra sobre una membrana mediante la aplicación de una fuerza centrífuga sobre la membrana. Tales membranas se caracterizan a menudo por un punto de peso molecular (Mw), es decir, este es el tamaño molecular máximo de los compuestos que pueden cruzar la membrana y los compuestos con un tamaño molecular mayor que este no cruzarán la membrana. El punto de corte de Mw de las membranas usadas en la presente invención puede ser, en particular, menor de 30.000 Mw, como entre 10 y 30.000 Mw.

La membrana puede estar hecha en particular de polietersulfona (PES) o de celulosa regenerada.

Ejemplos de tales dispositivos de filtro comerciales adecuados pueden ser Centricon Plus-80 o Centricon Plus-15.

La concentración puede realizarse típicamente por centrifugación a 2000-4500g, como entre 2500-4000g, o entre 2750-3500g, o entre 3000-3500g, como a 3000g o 3100g o 3200g o 3300g o 3400g o 3500g.

Típicamente, la centrifugación puede realizarse durante varias horas, por ejemplo, durante más de una hora, por ejemplo, durante 1-10 horas.

Para minimizar cualquier efecto negativo sobre la estabilidad del polipéptido de interés, la centrifugación puede realizarse en particular a una temperatura en el intervalo de 2-20° C, como en el intervalo de 3-15° C o en el intervalo de 3-10° C o en el intervalo de 3-6° C.

Concentración por eliminación de agua.

El principio de concentración por eliminación de agua suele ser que toda, o la mayor parte del agua se elimina para obtener un sólido, y luego posteriormente diluir o disolver este sólido en un volumen de agua que es menor que en el que se diluyó o disolvió previamente. Sin embargo, en principio puede realizarse simplemente eliminando la cantidad de agua necesaria para obtener la concentración deseada sin volver a diluir o disolver posteriormente el compuesto.

Los ejemplos de métodos adecuados de concentración por eliminación de agua incluyen secado por congelación y evaporación.

Tanto para el secado por congelación como para la evaporación los tres parámetros más relevantes son la temperatura, la presión y el tiempo.

El método de secado por congelación puede comprender los siguientes tres o cuatro pasos; una fase de congelación, una fase de secado primaria y una fase de secado secundaria y opcionalmente un paso de recocido después de la fase de congelación. El secado por congelación puede realizarse en particular como se describe con respecto al secado por congelación incluido como un paso adicional del método de la presente invención.

Pasos adicionales

El polipéptido de interés puede derivarse de una fuente natural, es decir, de células que expresan de manera natural el polipéptido de interés, o en particular puede expresarse recombinantemente.

Independientemente de dónde se derive el polipéptido de interés, puede haber sido purificado antes de someterse a un método de la presente invención.

Tal "purificación" puede incluir en particular, pero no se limita a, la eliminación de desechos celulares, la eliminación de otras proteínas distintas del polipéptido de interés y la eliminación de otros componentes que pueden estar presentes en la fuente de la que se deriva el polipéptido de interés. Por tanto, en una realización particular de la presente invención, la composición que comprende un polipéptido de interés comprende menos del 5% p/p o menos del 1% p/p o menos del 0,5% p/p o menos del 0,1% p/p o menos del 0,05% p/p o menos del 0,01% p/p de otras proteínas además del polipéptido de interés.

Por tanto, otras proteínas que son expresadas, por ejemplo por una célula huésped, pueden eliminarse de la composición que comprende un polipéptido de interés antes de que se use en un método de la presente invención.

Por tanto, en una realización particular, el método de la presente invención puede comprender uno o más de los siguientes pasos antes del paso a):

i) expresión recombinante de un polipéptido de interés

ii) purificación de la composición de polipéptido de interés mediante uno o más pasos de cromatografía iii) cambio del tampón de formulación

La expresión recombinante de un polipéptido de interés puede realizarse en particular como se ha descrito anteriormente con respecto al polipéptido de interés.

Si el polipéptido de interés es PBGD, los ejemplos de tipos adecuados de cromatografía incluyen, pero no se limitan a, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico (IEC) y cromatografía en una columna de hidroxiapatita. En principio, puede usarse cualquier combinación de estos métodos de cromatografía. Los inventores de la presente invención han descubierto con anterioridad para PBGD que es una ventaja realizar por lo menos el paso de cromatografía de afinidad y si este se combina con cualquiera de los otros métodos de cromatografía es una ventaja realizar el paso de cromatografía de afinidad antes de los otros pasos de cromatografía (ver, por ejemplo, la WO 03/002731).

Para la realización en la que el polipéptido de interés es PBGD, los ejemplos de columnas de cromatografía de afinidad comercialmente disponibles incluyen columnas de acoplamiento de afinidad, afinidad específica de grupo y afinidad de quelato metálico.

El catálogo de productos 2001 de la empresa Amersham Pharmacia Biotech proporciona ejemplos de columnas de acoplamiento por afinidad como columnas que comprenden ligandos inmovilizantes que contienen -NH2 y columnas que comprenden ligandos que contienen grupos amino primarios.

Se prefieren especialmente las columnas de afinidad de quelatos metálicos para purificar proteínas a través de la formación de complejos de iones metálicos con grupos de histidina expuestos. El Ejemplo 3 de la WO01/07065 describe la construcción de una porfobilinógeno desaminasa humana recombinante con una "etiqueta His" (rhPBGD-His). Para purificar la rhPBGD-His, se prefiere usar una columna de afinidad de quelatos metálicos, como una columna que tenga una resina de afinidad de cobalto metálico.

Los ejemplos de otros métodos adecuados de cromatografía de afinidad incluyen, pero no se limitan a, columnas que tienen heparina porcina como ligando o columnas que tienen ácido 1-amino-4-[[4-[[4-cloro-6-[[3 (o 4)-sulfofenil]amino]-1,3,5-triazin-2-il]amino]-3-sulfofenil]amino]-9,10-dihidro-9,10-dioxo-2-antracenosulfónico, también conocido como Cibracon Blue 3G, como ligando y usar acoplamiento de triazina como método de acoplamiento de ligando. Un ejemplo comercialmente disponible de este último es Blue Sepharose 6 Fast Flow (FF) de Amersham Pharmacia Biotech. Por consiguiente, una realización preferida de la invención se refiere al proceso, como se describe en la presente, en donde columna de cromatografía de afinidad del paso (i) es una columna que usa un acoplamiento de triazina como método de acoplamiento de ligando, y más preferiblemente en donde el ligando es Cibacron Blue 3G.

El término "cromatografía de intercambio iónico (IEC)" debe entenderse en la presente de acuerdo con la técnica como una columna que separa moléculas como proteínas en base a su carga neta a un pH determinado mediante unión electrostática a un grupo cargado en la columna. El intercambio iónico denota la absorción de iones de un tipo en una columna a cambio de otros que se pierden en la solución.

Los ejemplos de columnas de IEC adecuadas son columnas como una columna Q Sepharose, una columna Q SP Sepharose o una columna CM Sepharose, en particular puede ser una columna DEAE Sepharose.

Un ejemplo de una columna de hidroxiapatita adecuada es una columna de hidroxiapatita cerámica. La hidroxiapatita (Ca5(PO4)3OH)2 es una forma de fosfato de calcio que puede usarse para la separación y purificación de proteínas, enzimas, ácidos nucleicos, virus y otras macromoléculas. La hidroxiapatita cerámica es una forma macroporosa esférica de hidroxiapatita. La CHT Tipo I (Bio-Rad) es un ejemplo de una columna de cromatografía de hidroxiapatita cerámica comercialmente disponible.

El método puede comprender los siguientes pasos antes del paso a):

i) expresión recombinante de PBGD

ii) someter la composición de PBGD del paso i) a cromatografía de afinidad

iii) someter la composición de PBGD del paso ii) a cromatografía de intercambio iónico

En una realización adicional, el método de la presente invención puede comprender los siguientes pasos antes del paso a):

i) expresión recombinante de PBGD

ii) someter la composición de PBGD del paso i) a cromatografía de afinidad

iii) someter la composición de PBGD del paso ii) a cromatografía de intercambio iónico

iv) someter la composición de PBGD del paso iii) a una columna de hidroxiapatita

Ambos métodos pueden incluir opcionalmente un paso adicional de dilución o diafiltración de la composición de PBGD obtenida del paso ii). Por tanto, dicho paso debería ser después del paso ii) y antes del iii), es decir, un paso iia). El paso iia) tiene el propósito de reducir la concentración de sales a una conductividad adecuada, por ejemplo, < 10 mS/cm. En particular, esto puede ser relevante si se usa DEAE Sepharose como resina en el paso de cromatografía de intercambio iónico, es decir, el paso iii), ya que esto puede facilitar la unión de la PBGD capturada a la resina DEAE Sepharose. La dilución puede obtenerse mediante la adición de agua purificada directamente o mediante ultrafiltración contra agua purificada.

La expresión recombinante de PBGD, paso i) puede realizarse mediante cualquiera de los métodos descritos anteriormente.

Los ejemplos de columnas de cromatografía de afinidad adecuadas en el paso ii) pueden ser cualquiera de las mencionadas anteriormente.

Los ejemplos de métodos adecuados para realizar la cromatografía de intercambio iónico en el paso iii) pueden ser cualquiera de los mencionados anteriormente.

Los ejemplos de columnas de cromatografía de hidroxiapatito adecuadas en el paso iv) pueden ser cualquiera de las mencionadas anteriormente.

En una realización particular, la columna de cromatografía de afinidad puede ser una columna que usa un acoplamiento de triazina como método de acoplamiento de ligando, y en particular un método en el que el ligando es Cibracon Blue 3G. Esta puede ser, en particular, una columna Blue Sepharose 6 Fast Flow, y la columna de cromatografía de intercambio iónico puede ser una columna DEAE Sepharose, y en la realización en la que el método también comprende un paso iv), esta columna puede ser, en particular, una columna de hidroxiapatita cerámica.

El método de la presente invención también puede comprender pasos adicionales después del paso b) del método. Tales pasos incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes:

• secado por congelación de la composición que comprende un polipéptido de interés concentrado,

• cambiar el tampón de la composición que comprende un polipéptido de interés concentrado,

• filtración estéril de la composición que comprende un polipéptido de interés concentrado,

• evaporación

En el método de la presente invención pueden usarse diferentes secadores por congelación, volumen de soluciones a secar por congelación y otros parámetros. Un ejemplo de un secador por congelación adecuado incluye, pero no se limita a, un secador por congelación Lyostar (FTM-systems) como se usa en los ejemplos de la presente invención, donde las soluciones que comprenden un polipéptido de interés concentrado, es decir, en este caso PBGD, se llenaron en viales de vidrio para inyección de 2 y 6 ml (tipo 1) y se taparon con tapones de goma (clorobutilo). El secado por congelación puede realizarse mediante los siguientes tres pasos;

i) congelación,

ii) secado primario, y

iii) secado secundario.

Paso i) la congelación puede realizarse en particular cargando primero una muestra a temperatura ambiente y enfriándola a 0° C y manteniéndola a 0° C durante 30 minutos, antes de bajar la temperatura en 1° C por minuto a -40° C y manteniéndola a -40° C durante 30 minutos.

Paso ii) el secado primario puede realizarse en particular provocando una presión de vacío de 126 mTorr, elevando la temperatura en 1° C por minuto hasta 0° C y manteniendo la muestra a 0° C durante 360 minutos.

Paso iii) el secado secundario puede realizarse en particular provocando el vacío total simultáneamente con el aumento de la temperatura en 0,5° C por minuto a 30° C y manteniendo la muestra a 30° C durante 360 minutos.

Después del secado secundario, la muestra puede cerrarse adicionalmente al vacío o cerrarse después de llenarla con nitrógeno.

Un ejemplo de un método de secado por congelación adecuado incluye el descrito en los ejemplos de la presente invención.

El secado por congelación puede comprender en una realización adicional un paso de recocido antes de la fase de secado primario. Los inventores de la presente invención han descubierto que la inclusión de un paso de recocido en el método de secado por congelación mejora la apariencia visual, como se visualiza por menos grietas, y/o da como resultado un tiempo de reconstitución más corto del producto secado por congelación en comparación con cuando se usa el mismo método de secado por congelación pero sin el paso de recocido. Es una ventaja que se reduzca el tiempo de reconstitución de un producto secado por congelación, especialmente si se va a usar como un producto farmacéutico que se administra como una solución. Generalmente también se considera una ventaja para la mayoría de los productos una apariencia visual mejorada.

Por tanto, la secado por congelación puede comprender los siguientes pasos:

i) congelación

ii) recocido

iii) secado primario

iv) secado secundario.

Los pasos de congelación, secado primario y secado secundario pueden realizarse en particular como se ha descrito anteriormente. El paso de recocido, es decir, el paso ii), puede realizarse en particular después de 30 minutos de congelación, elevando la temperatura a, por ejemplo, una tasa de 2° C por minuto a -10° C o -20° C y manteniendo esta temperatura durante 120 o 420 minutos y luego bajando la temperatura, por ejemplo, a una tasa de 2° C por minuto a -40° C, a cuya temperatura la muestra puede mantenerse a 60-90 minutos antes de comenzar el paso de secado primario.

El cambio del tampón de la composición que comprende un polipéptido de interés concentrado puede realizarse en particular a) diluyendo, por ejemplo, de 5 a 15 veces, la composición que comprende un polipéptido de interés concentrado en un tampón o formulación, b) concentrando la composición diluida de nuevo y realizando los pasos a) y b) un número de veces suficiente para que la cantidad de excipientes en el tampón o formulación presente en la composición antes de estos pasos constituya menos de, por ejemplo, el 5% v/v o menos del 1% v/v de excipientes en el tampón o formulación presente en dicha composición después de que se hayan realizado dichos pasos.

En particular, la composición que comprende un polipéptido de interés obtenido del paso b) de la presente invención puede comprender además en particular un paso de filtración estéril de dicha composición y/o un paso de secado por congelación de la composición. La filtración estéril generalmente se realiza mediante la filtración de la composición a través de un filtro con un tamaño de poro de 0,22 gm o 0,20 gm. El secado por congelación puede realizarse en particular como se ha descrito anteriormente.

La presente invención también se refiere a una composición secada por congelación obtenida mediante un método de la presente invención.

Inyección subcutánea

La presente invención también se refiere al uso de una composición que comprende en el intervalo de 50­ 300 mg/ml de polipéptido de interés para la fabricación de un medicamento para inyección subcutánea en un mamífero.

El polipéptido de interés de acuerdo con la presente invención es la arilsulfatasa A.

El término subcutáneo a menudo se abrevia a s.c. y los dos términos pueden usarse indistintamente en el contexto de la presente invención.

Cuando la inyección se realiza por vía subcutánea, habitualmente no es posible inyectar más de 1,5 ml debido a restricciones fisiológicas.

Como el paciente habitualmente necesita una cierta cantidad del polipéptido particular de interés, hay una correlación entre el volumen de la composición que comprende un polipéptido de interés que necesita administrarse al paciente y la concentración del polipéptido de interés en dicha composición.

Por lo tanto, una ventaja de la presente invención es que la composición que comprende un polipéptido de interés comprende una alta concentración del polipéptido de interés y que esta alta concentración del polipéptido de interés puede obtenerse sin la formación de grandes cantidades de agregados de polipéptido. El uso de tales composiciones de polipéptido de interés concentradas permite inyectar un volumen menor de dicha composición y al mismo tiempo asegurar que el paciente reciba una cantidad adecuada del polipéptido de interés; facilitando de este modo la administración subcutánea del polipéptido de interés.

La composición mencionada anteriormente que comprende un polipéptido de interés puede comprender en particular entre 75-250 mg/ml, como entre 75-200 mg/ml o entre 75-150 mg/ml o entre 100-150 mg/ml o entre 100­ 125 mg/ml o entre 125-150 mg/ml de polipéptido de interés.

Como se ha descrito anteriormente, el volumen de la composición que comprende un polipéptido de interés que es necesario inyectar al paciente para asegurar que el paciente recibe una cantidad adecuada del polipéptido de interés se correlaciona con la concentración del polipéptido de interés en dicha composición.

Por tanto, el volumen de tal composición generalmente se ajustará de acuerdo con la concentración del polipéptido de interés en la composición. Sin embargo, el volumen puede estar generalmente en el intervalo de 0,1­ 1,5 ml, como en el intervalo de 0,1 -1,5 ml o en el intervalo de 0,5-1,5 ml o en el intervalo de 0,5-1,5 ml o en el intervalo de 0,75 -1,5 ml o en el intervalo de 0,75-1,5 ml o en el intervalo de 1 -1,5 ml o en el intervalo de 1 -1,5 ml.

La cantidad de polipéptido de interés que es relevante administrar a un paciente depende generalmente del peso del individuo y del polipéptido de interés particular.

También se divulga en la presente una composición de 50-300 mg/ml de PBGD para su uso en un método de tratamiento de la porfiria intermitente aguda en un mamífero que comprende la inyección subcutánea de la composición de 50-300 mg/ml de PBGD.

La administración de PBGD puede ser útil en particular para el tratamiento de la

Porfiria intermitente aguda. Sin embargo, se contempla que la administración de PBGD también puede ser útil para el tratamiento de otras porfirias, como la coproporfiria hereditaria o la porfiria variegata. La porfiria es un término usado para describir colectivamente una serie de enfermedades provocadas por diferentes deficiencias en la vía biosintética del grupo hemo. Por tanto, se contempla que la administración de PBGD, por ejemplo, en combinación con otras terapias, a un paciente que padece cualquier tipo de porfiria puede ayudar a aumentar el recambio general de los diferentes productos intermedios en la vía. Por ejemplo, Meissner PN et al., 1986, European Journal of Clinical Investigation, vol. 16, 257-261; Hift RJ et al., 1997, S. Afr. Med. J., vol. 87, 718-27 y Meissner P et al., 1993, J. Clin. Invest., vol. 91, 1436-44 describen la acumulación de ALA y PBG en coproporhiria hereditaria y porfiria variegata. En estas enfermedades, la acumulación de ALA y PBG es el resultado de defectos enzimáticos que se encuentran cuatro y cinco pasos en sentido descendente de la conversión de ALA a PBG, respectivamente. En los dos artículos más recientes se describe cómo el porfirinógeno que se acumula en los pacientes con porfiria variegata es capaz de inhibir la PBG-desaminasa.

En una realización adicional, la presente invención se refiere a una composición de 50-300 mg/ml de arilsulfatasa A para su uso en un método de tratamiento de leucodistrofia metacromática en mamíferos que comprende la inyección subcutánea de la composición de 50-300 mg/ml de arilsulfatasa A.

La leucodistrofia metacromática (MLD) está provocada por un defecto genético autosómico recesivo en la enzima lisosomal arilsulfatasa A (ASA), lo que da como resultado una ruptura progresiva de las membranas de la vaina de mielina (desmielinización) y acumulación de galactosil sulfatida (sulfato de cerebrósido) en la sustancia blanca tanto del sistema nervioso central (SNC) como del sistema nervioso periférico. En las preparaciones histológicas, la galactosil sulfatida forma masas granulares esféricas que se tiñen metacromáticamente. La galactosil sulfatida también se acumula en los riñones, la vesícula biliar y otros órganos viscerales y se excreta en cantidades excesivas en la orina.

La galactosil sulfatida normalmente se metaboliza por hidrólisis del enlace 3-O-sulfato para formar galactocerebrosida a través de la acción combinada de la enzima lisosomal arilsulfatasa A (EC 3.1.6.8) (Austin et al. Biochem J. 1964, 93, 15C-17C) y una proteína activadora de esfingolípidos denominada saposina B. En todos los tejidos de pacientes con formas de MLD infantil tardía, juvenil y adulta (ver más adelante) se produce una deficiencia profunda de arilsulfatasa A. En lo sucesivo, la proteína arilsulfatasa A se denominará "ASA". Se produce una profunda deficiencia de ASA en todos los tejidos de los pacientes con MLD.

Se divulga además en la presente una composición de 50-300 mg/ml de alfa-manosidasa lisosomal para su uso en un método de tratamiento de un mamífero para el trastorno de almacenamiento lisosomal alfa-manosidosis que comprende la inyección subcutánea de la composición de 50-300 mg/ml de alfa-manosidasa lisosomal.

La alfa-manosidosis es una enfermedad autosómica recesiva que se presenta en todo el mundo con una frecuencia de entre 1/1.000.000 y 1/500.000. La manosidosis se encuentra en todos los grupos étnicos de Europa, América, África y también en Asia. Se detecta en todos los países con un buen servicio de diagnóstico de trastornos de almacenamiento lisosomal, con una frecuencia similar. Nacen aparentemente sanos; sin embargo, los síntomas de las enfermedades son progresivos. La alfa-manosidosis presenta heterogeneidad clínica, variando desde formas muy graves hasta formas muy leves. Los síntomas clínicos típicos son: retraso mental, cambios esqueléticos, sistema inmunitario deteriorado que da como resultado infecciones recurrentes, deficiencia auditiva y, a menudo, la enfermedad se asocia con características faciales típicas, como cara tosca, frente prominente, puente nasal aplanado, nariz pequeña y una boca ancha. En los casos más graves (manosidosis tipo I) los niños padecen hepatoesplenomegalia y mueren durante los primeros años de vida. Posiblemente esta muerte prematura esté provocada por infecciones graves debidas a la inmunodeficiencia provocada por la enfermedad. En los casos más leves (manosidosis tipo 2) los pacientes habituales llegan a la edad adulta. Las debilidades esqueléticas de los pacientes dan como resultado la necesidad de sillas de ruedas entre los 20 y los 40 años.

La enfermedad causa una disfunción difusa del cerebro que a menudo da como resultado rendimientos mentales débiles que excluye todo menos las habilidades más básicas de lectura y escritura simples. Estos problemas asociados con las incapacidades auditivas y otras manifestaciones clínicas impiden que el paciente tenga una vida independiente, siendo la consecuencia la necesidad de cuidados de por vida.

En otra realización más, se describe una composición de 50-300 mg/ml de galactosilcerebrosidasa para su uso en un método de tratamiento de la enfermedad de Krabbe en un mamífero que comprende la inyección subcutánea de la composición de 50-300 mg/ml de galactosilcerebrosidasa.

En los seres humanos, una deficiencia en la enzima GALC da como resultado una enfermedad de almacenamiento lisosomal genética heredada autosómica conocida como enfermedad de Krabbe o leucodistrofia de células globoides. La enzima se expresa generalmente en los testículos, los riñones, la placenta, el hígado y el cerebro de los seres humanos y una deficiencia de la enzima GALC generalmente da como resultado un trastorno en el metabolismo de la mielina y en los sistemas nerviosos central y periférico (SNC y SNP, respectivamente).

La enfermedad de Krabbe se ha observado en humanos de cualquier edad, nacionalidad y sexo. Cabe señalar que las realizaciones y características descritas en el contexto de uno de los aspectos de la presente invención también se aplican a los otros aspectos de la invención. En particular, todas las realizaciones descritas para la composición que comprende un polipéptido de interés, como la presencia de compuestos, tampones y pH adicionales, también se aplican a la composición que comprende un polipéptido de interés usado en las presentes aplicaciones.

Cuando se hace referencia en singular a un objeto de acuerdo con la presente invención o a una de sus funciones o características, también se hace referencia al objeto o a sus funciones o características en plural. Como ejemplo, cuando se hace referencia a "un polipéptido" debe entenderse que se refiere a uno o más polipéptidos.

A lo largo de la presente memoria descriptiva se entenderá que la palabra "comprender", o variaciones como "comprende" o "que comprende", implica la inclusión de un elemento, número entero o paso, o grupo de elementos, números enteros o pasos indicados, pero no la exclusión de cualquier otro elemento, número entero o paso, o grupo de elementos, números enteros o pasos.

Ahora se describirá la invención con detalles adicionales en las siguientes secciones experimentales.

EXPERIMENTAL

Materiales

rhPBGD

La rhPBGD usada en los siguientes experimentos se obtuvo de acuerdo con el proceso 2 en el ejemplo 1 de la WO 03/002731, donde el proceso 2 es el proceso que incluye el paso IV, es decir, el paso de cromatografía de hidroxiapatita cerámica.

Tampón de formulación

La rhPBGD recombinante y purificada estaba presente en el siguiente tampón de formulación acuosa: Na2HPO43,67 mM

Glicina 27 mM

Manitol 250 mM

y un pH de 7,9

Luego, el tampón de formulación se filtró en condiciones estériles a través de un filtro de 0,22 gm.

Métodos

Secado por congelación

El secado por congelación de las soluciones de rhPBGD purificadas se realizó en un secador por congelación Lyostar (FTM-systems) de acuerdo con el siguiente programa:

Observación visual (Transparencia y color)

El líquido se estudió visualmente con respecto al color, la transparencia y los precipitados de acuerdo con el siguiente esquema.

Color: 1: Sin color; 2: Ligeramente amarillo; 3: amarillo

Transparencia: 1: Transparente; 2: Ligeramente turbio; 3: Turbio

Otros comentarios: En algunos casos, se incluyeron aquí otras observaciones del operador (por ejemplo, precipitados, material no disuelto, etc.)

Medición de pH

El medidor de pH (medidor de pH Metrohm 691) y el electrodo (electrodo de pH LL combinado) se calibraron con 3 soluciones de referencia estándar (Merck) en el intervalo de 4,00 a 9,00. Finalmente se analizó el líquido.

Concentración de proteínas

La concentración de proteínas en el extracto, las muestras en proceso, la sustancia farmacéutica a granel y el producto final se determinó mediante un método que utiliza los principios de la reducción de Cu2+ a Cu+ por la proteína en un medio alcalino (reacción de Biuret). Luego, los iones de Cu+ se hicieron reaccionar con un reactivo que contenía ácido bicinconínico, lo que dio como resultado una detección colorimétrica altamente sensible y selectiva.

Pureza

La porfobilinógeno desaminasa humana recombinante (rhPBGD) y las variantes de rhPBGD se separaron de acuerdo con su capacidad para adsorberse y desorberse en medios estacionarios basados en sílice dependiendo del porcentaje de modificador orgánico (acetonitrilo) en la fase móvil.

Actividad de rhPBGD

La porfobilinógeno desaminasa (PBGD) cataliza la adición de 4 moléculas de porfobilinógeno (PBG) para formar un tetrámero lineal, preuroporfirinógeno, que se libera de la enzima y se circulariza in vivo a uroporfirinógeno III por la acción de la uroporfirinógeno III sintasa. El preuroporfirinógeno puede oxidarse químicamente con benzoquinona para formar uroporfirina, que absorbe luz a 405 nm.

Los análisis se realizaron en un único vial en cada ocasión de prueba. Para la determinación de la actividad de rhPBGD y la concentración de proteína, las pruebas se realizaron por duplicado y triplicado, respectivamente, para cada vial.

Osmolalidad

Se volvió a suspender un vial de rhPBGD secado por congelación en 1,00 ml de agua MilliQ. Se descongeló el vial de solución acuosa congelada de rhPBGD. El osmómetro (osmómetro Vapro) se calibró con 3 soluciones estándar en el intervalo de 100-1000 mOsm/kg (100, 290, 1000 mOsm/kg). Luego se analizó el líquido.

Ejemplo de Referencia 1

Concentración con dispositivos de filtro centrífugo

Se descongeló la solución a granel de PBGD congelada (7 mg/ml de rhPBGD, Na2HPO43,67 mM, glicina 27 mM, manitol 250 mM, pH 7,9) en un baño de agua a 20° C, se centrifugó a 3200 g durante 10 min y posteriormente se filtró en condiciones estériles con filtros PES de 0,20 pm (filtros de polietersulfona Nalgene). La solución a granel de PBGD se concentró a 100 mg/ml haciendo funcionar Centrifugal Filter Devices Centricon Plus-80 (punto de corte de Mw 30000) y Centricon Plus-15 (punto de corte de Mw 30000) a 3200 g durante varias horas. La solución concentrada, es decir, el retenido, se filtró en condiciones estériles mediante filtros de 0,22 pm (Millex GV) y finalmente una parte de esta solución se diluyó con tampón de formulación estéril para obtener 50 mg/ml. La solución de 5 mg/ml se preparó diluyendo directamente la hPBGD recombinante y purificada con tampón de formulación estéril.

Luego, se secaron por congelación 5 mg/ml, 50 mg/ml y 100 mg/ml de rhPBGD como se ha descrito anteriormente. Se almacenaron varios viales de cada una de las soluciones de rhPBGD secadas por congelación mencionadas anteriormente con 5, 50 y 100 mg/ml de rhPBGD y de la solución acuosa de 5 mg/ml de rhPBGD a 40° C ± 2° C, 75% ± 5% de humedad relativa (HR). Los viales se almacenaron protegidos de la luz en un envase secundario (caja de papel) bien sellado.

En los puntos temporales indicados (es decir, tiempo de almacenamiento) se volvió a suspender un vial de cada muestra secada por congelación en 1,00 ml de agua Millipore.

Luego se observaron visualmente cada uno de los viales resuspendidos y el vial acuoso de rhPBGd con respecto al color, la transparencia y los precipitados, y se midió el pH, la concentración de proteínas, la pureza y la actividad de rhPBGD como se ha descrito anteriormente.

Los resultados se dan en las siguientes tablas 1-4:

T l 1: Pr ^ r n l i n m ml

^

T l 4: Pr m ml

Ejemplo de referencia 2

Concentración de una composición de rhPBGD mediante dispositivos de filtro centrífugo

La solución a granel de PBGD congelada (7 mg/ml de rhPBGD, Na2HPO43,67 mM, glicina 27 mM, manitol 250 mM, pH 7,9) se descongeló en un baño de agua a 20° C, se centrifugó a 3200 g durante 10 min y posteriormente se filtró en condiciones estériles con filtros PES de 0,20 pm (filtros de polietersulfona Nalgene). La solución a granel de PBGD se concentró a 100 mg/ml haciendo funcionar Centrifugal Filter Devices Centricon Plus-80 (punto de corte de Mw 30000) y Centricon Plus-15 (punto de corte de Mw 30000) a 3200 g durante varias horas. La solución concentrada, es decir, el retenido, se filtró en condiciones estériles con filtros de 0,22 pm (Millex GV) y se diluyó con tampón de formulación filtrado en condiciones estériles (ver más arriba) para obtener soluciones de concentraciones más bajas. Una fracción en volumen de cada concentración se secó por congelación como se ha descrito anteriormente.

Las diferentes concentraciones de rhPBGD secada por congelación y solución acuosa de rhPBGD se almacenaron a 5° C ± 3° C o a -20° C ± 5° C (humedad relativa ambiental (HR)). Todos los viales se almacenaron protegidos de la luz en un paquete secundario bien sellado (caja de papel).

En los puntos temporales indicados (es decir, tiempo de almacenamiento), se volvió a suspender un vial de cada muestra secada por congelación en 1,00 ml de agua Millipore y luego se analizó junto con la solución acuosa de rhPBGD observando visualmente el color, la transparencia y los precipitados, y midiendo el pH, la concentración de proteínas, la pureza, la osmolalidad y la actividad de rhPBGD.

Los resultados se dan en las siguientes tablas 5-19:

Tabla 5: Producto acuoso 11 m /ml Tem eratura de almacenamiento: 5° C

Tabla 6: Producto acuoso: 11 m/ml Temeratura de almacenamiento: -20° C

^ °

T l : Pr 17 m ml Tm r r lm n mi n : °

continuación

Tabla 9: Producto acuoso 17 m/ml Temeratura de almacenamiento: -20° C

°

continuación

T l 11: Pr m ml Tm r r lm n mi n : °

T l 12: Pr m ml Tm r r lm n mi n : -2°

continuación

T l 1: Pr r n l in m ml Tm r r lm nmi n : °

°

continuación

- °

continuación

^ °

Tabla 17: Producto acuoso 100 m/ml Tem eratura de almacenamiento: 5° C

Tabla 18: Producto acuoso 100 m/ml Tem eratura de almacenamiento: -20° C

°

Ejemplo de referencia 3

Concentración de una composición de rhPBGD por filtración de flujo tangencial (TFF)

Luego la solución a granel de rhPBGD se descongeló durante un mínimo de tres días a 5° C y en la oscuridad.

Luego la solución descongelada se centrifugó con tubos de centrífuga cónicos de 200 ml durante aproximadamente 10 minutos a 2200 g.

Luego la solución se filtró a través de una serie de filtros con los siguientes tamaños de poro: 5,0 gm; 0,65 gm; 0,45 gm y 0,20 gm antes de concentrarla por filtración de flujo tangencial (TFF).

La concentración por TFF se realizó con un sistema TFF Millipore Labscale y un filtro Millipore Pellicon® XL con una presión de entrada de la bomba de aproximadamente 20-25 psi y una presión sobre el filtro Pellicon® XL de aproximadamente 4-6 psi. La rhPBGD se protegió de la luz durante el procedimiento cubriendo el recipiente de muestra del sistema TFF con láminas de papel de aluminio.

Luego, la solución de rhPBGD concentrada obtenida del procedimiento de TFF se cambió de tampón por un tampón de formulación que contenía Na2HPÜ4 x 2H2O 3,67 mM, glicina 27 mM y manitol 220 mM preparado en agua estéril. Esto se realizó añadiendo continuamente dicho tampón al sistema TFF y presionándolo a través de la membrana hasta que dicho tampón reemplazó al tampón anterior.

Luego la solución de rhPBGD concentrada y con el tampón cambiado se filtró en condiciones estériles pasándola a través de un filtro con un tamaño de poro de 0,22 gm. Esta filtración estéril se realizó dos veces con un filtro nuevo cada vez.

Luego la solución de rhPBGD concentrada en condiciones estériles se colocó en viales antes de secarla por congelación como se describe en la sección del método.

Ejemplo de referencia 4

El efecto de los diferentes modos de secado por congelación y/o la cantidad de excipientes sobre el tiempo de reconstitución

La PBGD se concentró como se describe en el ejemplo 3 y después del intercambio del tampón se determinó la concentración de PBGD.

Luego la solución concentrada de PBGD se secó por congelación en un secador por congelación Lyostar (FTM-systems). Las soluciones se envasaron en viales de vidrio para inyección de 2 y 6 ml (tipo 1) y se taparon con tapones de goma (clorobutilo).

Ciclo de secado por congelación original:

Las muestras se cargaron a temperatura ambiente y los estantes se enfriaron a 0° C durante 30 minutos. La temperatura se redujo a -40° C (1° C por minuto) y se mantuvo ahí durante 30 minutos y luego la presión de vacío se llevó a 126 mTorr y el secado primario comenzó elevando la temperatura a 0° C (1° C por minuto). minuto). Después de 360 minutos de secado primario, la temperatura se elevó a 30° C (0,5° C por minuto) y simultáneamente se aplicó vacío total (inicio del secado secundario). La temperatura se mantuvo a 30° C durante 360 minutos y luego los viales se taparon al vacío.

Secado por congelación con inclusión de un paso de recocido:

Después de 30 minutos a -40° C, la temperatura se elevó a una tasa de 2° C por minuto a -10° C o -20° C, temperatura a la que se mantuvo durante 120 o 420 minutos antes de disminuir la temperatura de nuevo con 2° C por minuto a -40° C donde las muestras se mantuvieron durante 60-90 minutos antes del inicio del secado primario.

Los resultados se muestran en la Tabla 20 donde los términos abreviados usados con respecto a los excipientes y el ciclo de secado por congelación significan lo siguiente:

1 x cantidad de excipientes se refiere a que la solución de PBGD comprende Na2HPO4 x 2H2O 3,67 mM, glicina 27 mM y manitol 220 mM preparados en agua estéril.

1,5x cantidad de excipientes se refiere a que la solución de PBGD comprende Na2HPO4 x 2H2O 5,51 mM, glicina 40,5 mM y manitol 375 mM preparados en agua estéril, es decir, 1,5x de cada uno de los componentes presentes en el tampón 1X.

2x excipientes se refiere a que la solución de PBGD comprende Na2HPÜ4 x 2H2O 7,34 mM, glicina 54 mM y manitol 500 mM preparados en agua estéril, es decir, 2x de cada uno de los componentes presentes en el tampón 1x.

El ciclo de secado por congelación original es como se ha descrito anteriormente.

El ciclo de secado por congelación y recocido es como se ha descrito anteriormente, donde el paso de recocido comprende elevar la temperatura a -10° C manteniendo la muestra a esta temperatura durante 120 minutos antes de bajarla de nuevo a -40° C.

El ciclo de secado por congelación y recocido ampliado es como se ha descrito anteriormente, donde el paso de recocido comprende elevar la temperatura a -20° C manteniendo la muestra a esta temperatura durante 420 minutos antes de bajarla de nuevo a -40° C.

Tabla 20:

Ejemplo de referencia 5

El efecto de diferentes modos de secado por congelación y/o la cantidad de excipientes sobre la apariencia del producto secado por congelación

Las soluciones concentradas y secadas por congelación de PBGD se prepararon como se describe en el ejemplo 4 y las referencias a la cantidad de excipientes y el tipo de ciclo de secado por congelación tienen el mismo significado que en el ejemplo 4.

Se obtuvieron los siguientes resultados mediante inspección visual de los productos secados por congelación:

A: La comparación de tres productos preparados a partir de soluciones que contenían respectivamente 4,6 mg/ml, 66,6 mg/ml y 109,4 mg/ml de rhPBGD mostró que el número de grietas en el producto secado por congelación aumentaba a medida que aumentaba la concentración de rhPBGD.

B: La comparación de dos productos, preparados a partir de una solución que comprende 150 mg/ml de rhPBGD y que comprende una cantidad de excipientes de 1x y 1,5x, mostró que el número de grietas en el producto secado por congelación fue menor para el producto que comprendía una cantidad de 1,5x de excipientes que el producto que comprendía una cantidad de 1x de excipientes.

C: La comparación de dos productos secados por congelación preparados a partir de una solución de rhPBGD de 150 mg/ml, que contenían cantidades de 1x y 2x de excipientes, mostró que el número de grietas en el producto secado por congelación con una cantidad de 2x de excipientes fue menor que el producto que contenía la cantidad de 1x de excipientes.

D: La comparación de tres productos secados por congelación preparados a partir de una solución de rhPBGD de 150 mg/ml usando el ciclo de secado por congelación original, recocido y recocido prolongado mostró que el número de grietas en el producto secado por congelación era menor en el producto que se preparó de acuerdo con el ciclo de secado por congelación y recocido que en el producto preparado de acuerdo con el ciclo de secado por congelación original. Además, el número de grietas en el producto preparado de acuerdo con el ciclo de secado por congelación y recocido prolongado fue menor que en el producto preparado de acuerdo con el ciclo de secado por congelación y recocido.

E: Se prepararon tres productos secados por congelación a partir de una solución de rhPBGD de 150, 175 y 200 mg/ml, respectivamente. Cada uno de los productos secados por congelación comprendía 1,5x la cantidad de excipientes y se secaron por congelación con el ciclo de recocido. Ninguno de los productos secados por congelación presentaba grietas.

F: Se prepararon dos productos de rhPBGD secados por congelación a partir de una solución de rhPBGD de 150 mg/ml. Uno de ellos comprendía una cantidad de excipientes de 1x y se preparó de acuerdo con el ciclo de secado por congelación original, mientras que el otro comprendía una cantidad de excipientes de 1,5x y se preparó de acuerdo con el ciclo de secado por congelación y recocido prolongado. El producto que comprendía 1,5x la cantidad de excipientes y se preparó de acuerdo con el ciclo de secado por congelación y recocido prolongado comprendía menos grietas que el producto que comprendía una cantidad de 1x de excipientes y se preparó de acuerdo con el ciclo de secado por congelación original.

G: Se prepararon dos productos de rhPBGD secados por congelación a partir de una solución de rhPBGD de 150 mg/ml. Uno de ellos comprendía una cantidad 1x y de excipientes se preparó de acuerdo con el ciclo de secado por congelación original, mientras que el otro contenía 0,1% de Tween 80 en combinación con una cantidad 1x de excipientes y se preparó de acuerdo con el ciclo de secado por congelación y recocido prolongado. El producto que comprendía 0,1% de Tween 80 en combinación con una cantidad 1x de excipientes y que se preparó de acuerdo con el ciclo de secado por congelación y recocido prolongado comprendía menos grietas que el producto que comprendía la cantidad de excipientes 1x y que se preparó de acuerdo con el ciclo de secado por congelación original.

Ejemplo de referencia 6

El efecto del volumen de recuperación, la cantidad de excipientes y el modo de secado por congelación sobre la estabilidad de la rhPBGD secada por congelación

Se prepararon muestras secadas por congelación de soluciones concentradas de rhPBGD como se describe en el ejemplo 4.

La "solución a granel" es una solución concentrada de PBGD antes del secado por congelación. La Tabla 21 muestra los resultados de las soluciones de rhPBGD que tienen las siguientes características con respecto a la concentración de rhPBGD, cantidad de excipientes (donde se usan las mismas definiciones que en el ejemplo 4), el modo de secado por congelación (donde se usan las mismas definiciones que en el ejemplo 4) y la proporción del volumen de llenado (Vol llen. que es el volumen de la composición antes de secarse por congelación) frente al volumen de recuperación (Vol. rec. que es el volumen en el que se vuelve a suspender el producto secado por congelación):

Solución 1:

• Aproximadamente 5 mg/ml de rhPBGD

• 1 x cantidad de excipiente

• Ciclo de secado por congelación original

• Vol. llen. = Vol. rec.

Solución 2:

• Aproximadamente 70 mg/ml de rhPBGD

• 1 x cantidad de excipiente

• Ciclo de secado por congelación original

• Vol. llen. = 2x Vol. Vol. rec.

Solución 3:

• Aproximadamente 110 mg/ml de rhPBGD

• 1 x cantidad de excipiente

• Ciclo de secado por congelación original

• Vol. llen. = Vol. rec.

Solución 4:

Aproximadamente 70 mg/ml de rhPBGD

1 x cantidad de excipiente

Ciclo de secado por congelación original

• Vol. llen. = 1.5x Vol. rec.

Solución 5:

• Aproximadamente 90 mg/ml de rhPBGD

• 2/3x cantidad de excipiente

• Ciclo de secado por congelación original

• Vol. llen. = 1.5x Vol. rec.

Solución 6:

• Aproximadamente 60 mg/ml de rhPBGD

• 1/2x cantidad de excipiente

• Ciclo de secado por congelación original

• Vol. llen. = 2x Vol. rec.

Solución 7:

• Aproximadamente 110 mg/ml de rhPBGD

• 1x cantidad de excipiente

• Ciclo de secado por congelación y recocido

• Vol. llen. = Vol. rec.

Solución 8:

• Aproximadamente 60 mg/ml de rhPBGD

• 1 x cantidad de excipiente

• Ciclo de secado por congelación y recocido

• Vol. llen. = 2x Vol. rec.

Solución 9:

• Aproximadamente 150 mg/ml de rhPBGD

• 1 x cantidad de excipiente

• Ciclo de secado por congelación y recocido

• Vol. llen. = Vol. rec.

Solución 10:

• Aproximadamente 150 mg/ml de rhPBGD

• 1 x cantidad de excipiente

• Ciclo de secado por congelación original

• Vol. llen. = Vol. rec.

Aunque no se muestra en la Tabla 21, también se probó la pureza para cada punto temporal y se descubrió que era del 100% en todos los casos.

Para la solución 2 en el punto temporal de la semana 4 y 9 y para la solución 4 en el punto temporal de la semana 9 se usó un volumen de recuperación incorrecto.

Tabla 21:

continuación

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende por lo menos 25 mg/ml de arilsulfatasa A (ASA), en donde la cantidad de arilsulfatasa A presente como agregados constituye menos del 5% p/p de la cantidad total de arilsulfatasa A en la composición.

2. La composición de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la arilsulfatasa A comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de:

i) una secuencia de aminoácidos definida por cualquiera de las SEQ ID NO: 18, 19 y 20;

ii) una parte funcionalmente equivalente de una secuencia de aminoácidos como se define en i); y

iii) un análogo funcionalmente equivalente de una secuencia de aminoácidos como se define en i) o ii), la secuencia de aminoácidos del análogo siendo por lo menos un 75% idéntica a una secuencia de aminoácidos como se define en i) o ii),

en donde la parte funcionalmente equivalente o el análogo de la misma ejerce sustancialmente la misma actividad enzimática que la enzima de longitud completa.

3. La composición de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que comprende una solución acuosa que es isotónica con respecto al tejido de un mamífero.

4. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la composición comprende menos del 1% p/p de otras proteínas además de la arilsulfatasa A, preferiblemente en donde la cantidad de arilsulfatasa A presente como agregados constituye menos del 1% p/p de la cantidad total de arilsulfatasa A en la composición.

5. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el pH de la composición es de 7,5 a 8,5.

6. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además uno o más de los tampones seleccionados del grupo que consiste de: TRIS-HCL, Na-citrato y Na2HPO4, y/o que comprende además uno o más de los componentes seleccionados del grupo formado por: glicina, L-serina, sacarosa, manitol y Tween 80.

7. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la osmolalidad de la composición es de 200 a 400 mOsm/kg.

8. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la actividad específica de la arilsulfatasa A es de por lo menos 20 U/mg, preferiblemente en donde la actividad específica de la arilsulfatasa A es de por lo menos 50 U/mg.

9. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la arilsulfatasa A es una arilsulfatasa A humana recombinante (rhASA), preferiblemente en donde la arilsulfatasa A se expresa recombinantemente en células procariotas o en células de vertebrados en cultivo.

10. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde 20 residuos de aminoácidos lineales que rodean a Cys-51 en la secuencia de arilsulfatasa A son por lo menos 90% idénticos a la secuencia correspondiente en la SEQ ID NO: 19.

11. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la arilsulfatasa A está codificada por una secuencia de ácidos nucleicos que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de:

i) una secuencia de ácidos nucleicos como se define por cualquiera de las SEQ ID NO: 16 y 17; y

ii) una secuencia de ácidos nucleicos que es por lo menos un 75% idéntica a una secuencia de ácidos nucleicos como se define en i).

12. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la composición puede obtenerse mediante un proceso que comprende los pasos de a) centrifugación y/o filtración de una composición que comprende ASA y b) concentración de la composición del paso a).

13. El uso de la composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-12 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la leucodistrofia metacromática, en donde dicho medicamento es para una aplicación terapéutica.

14. Una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-12 para su uso en el tratamiento de la leucodistrofia metacromática.