KR20090018894A - 폴리펩타이드의 농축 방법 - Google Patents

폴리펩타이드의 농축 방법 Download PDF

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    • C12Y302/01046—Galactosylceramidase (3.2.1.46)
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    • C12Y301/06008—Cerebroside-sulfatase (3.1.6.8)

Abstract

본 발명의 일측면은 다음을 포함하는 목적 폴리펩타이드를 포함하는 조성물의 농축 방법에 관한 것이다:
a) 목적 폴리펩타이드를 포함하는 조성물의 원심분리 및/또는 여과 단계;
b) a) 단계에서 얻어진 상청액 또는 보전액을 각각 농축하는 단계.
본 발명의 다른 측면은 목적 폴리펩타이드를 적어도 10 ㎎/㎖ 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 목적 폴리펩타이드를 75-250 ㎎/㎖ 포함하는 조성물의 포유동물에게 피하주사하기 위한 약의 제조용 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 PBGD 500-300 ㎎/㎖의 조성물을 피하주사하는 것을 포함하는 포유동물의 급성 간헐성 포르피리아의 치료방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 아릴설파타아제 A 50-300 ㎎/㎖의 조성물의 피하주사를 포함하는 포유동물의 이염색성 백질이영양증용의 치료방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 리소조멀 알파-만노시다아제 50-300 ㎎/㎖의 조성 물의 피하주사를 포함하는 포유동물의 리소좀 저장 장애 알파-만노시도시스의 치료방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 갈락토실세레브로시다아제 50-300 ㎎/㎖의 조성물의 피하주사를 포함하는 포유동물의 크라베병의 치료방법에 관한 것이다.

Description

폴리펩타이드의 농축 방법{A PROCESS FOR CONCENTRATION OF A POLYPEPTIDE}
본 발명은 목적 폴리펩타이드의 농축 방법, 농축된 목적 폴리펩타이드를 포함하는 조성물의 피하주사용 약으로서의 용도 및 목적 폴리펩타이드를 적어도 10 ㎎/㎖ 포함하는 조성물에 관한 것이다.
몇몇의 폴리펩타이드는 특정 질병의 예방 및/또는 치료용 약으로서 유용하다. 약을 피하주사할 수 있음은 환자가 그들 자신에게 약을 투여하는 것을 쉽게 만드는 것과 같은 이점이 있다.
얼마나 큰 부피를 피하주사하는 것이 가능한지에 대하여 생리학적인 제한이 있다. 그러므로, 피하 투여되는 약의 장점은 환자들이 충분한 양의 약을 투여받는 것을 보장하고 및/또는 다수의 피하주사를 피하게 하기 위하여, 고농도의 적용이 가능하다는 것이다.
국제특허 WO 99/37325는 햄 생합성 경로(heme biosynthetic pathway)에 속하 는 효소들의 활성이 전혀 없거나 또는 결핍된 것에 의해 야기되는 질병의 치료 및 예방의 방법을 개시하고 있다. 국제특허 WO 03/002731은 상업적인 스케일에서 재조합 포르포빌리노겐 디아미나아제(porphobilinogen deaminase)의 정제 공정과 정제된 포르포빌리노겐 디아미나아제의 약 제조용 용도를 발표하고 있다. 유사하게, 국제특허 WO 02/099092 및 WO 2005/094874는 리소조멀 알파-만노시다아제(lysosomal alpha-mannosidase) 및 이것의 치료상의 용도를 제공한다. 마지막으로, 국제특허 WO2005/073367는 아릴설파타아제 A(aryl sulfatase A)의 정제 공정 및 이염색성 백질이영양증(metachromatic leukodystrophy)의 치료에서의 효소의 용도를 제공한다.
본 발명은 목적 폴리펩타이드의 농축 방법 및 농축된 목적 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 포유동물에게 피하주사하기 위한 약의 제조용 용도에 관한 것이다.
[정의]
본 발명의 목적을 위하여, 서열의 배열과 상동성은 단백질뿐만 아니라 DNA 배열에도 유용한 완전 스미스-워터만 배열(full Smith-Waterman alignment)을 이용하여 수행될 수 있다. 디폴트 점수를 계산하는 매트릭스 BLOSUM50과 동일성 매트릭스는 단백질과 DNA 배열에 각각 사용된다. 갭(gap)의 첫번째 잔기(residue)에 대한 패널티(penalty)는 단백질에 대해서는 -12이고 DNA에 대해서는 -16인 반면 갭의 추가적인 잔기에 대한 패널티는 단백질에서는 -2이고 DNA에 대해서는 -4이다.
배열은 FASTA 패키지 버전 v20u6(W. R. Pearson and D. J. Lipman(1988), “Improved Tools for Biological Sequence Analysis”, PNAS 85:2444-2448 및 W. R. Pearson(1990) “Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA”, Methods in Enzymology, 183:63-98)에 의하여 만들어질 수 있다.
단백질 서열의 다중배열은 “ClustalW”(Thompson, J. D., Higgins, D. G. and Gibson, TJ.(1994) CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research, 22:4673-4680)을 사용하여 만들어질 수 있다. DNA 서열의 다중배열은 아미노산을 DNA 서열로부터 상응하는 코돈으로 대체하는 주형(template)으로서 단백질 배열을 사용하여 수행될 수 있다.
본 발명에서, “E. C.”(Enzyme Class; 효소 분류)라는 용어는 국제적으로 인정되는 효소 분류 시스템인 Recommendations of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology, Academic Press, Inc.을 인용한다.
아미노산 서열, 예를 들어 단백질, 또는 핵산 서열의 본 발명에서 사용된 용어 “유래(origin) ”는 그것이 파생된 유기체(organism)를 인용하는 것으로 이해된다. 상기 서열은 해당 기술 분야에서 당업자에게 잘 알려진 유전자 기술 방법을 사용하여 다른 유기체에 의해 발현될 수 있다. 이는 또한 화학적으로 합성되어온 서열을 포함한다. 게다가, 상기 서열은 코돈 최적화와 같은 사소한 변화, 즉 아미노산 서열에 영향을 미치지 않는 핵산 서열에서의 변화를 포함할 수 있다.
목적 폴리펩타이드
본 발명의 폴리펩타이드는 특히 호르몬 또는 호르몬 변형체, 효소, 리셉터(receptor) 또는 이의 일부, 항체 또는 이의 일부, 알러젠(allergen) 또는 리포터(reporter)일 수 있다. 목적 폴리펩타이드는 특히 산화환원효소(oxidoreductase, E.C. 1), 전이효소(transferase, E.C. 2), 가수분해효소(hydrolase , E.C. 3), 분해효소(lyase, E.C. 4), 이성화효소(isomerase, E.C. 5), 또는 연결효소(ligase, E.C. 6)와 같은 6개의 주요 효소 군 중의 하나로부터 선택된 효소일 수 있다. 보다 상세한 측면에서, 목적 폴리펩타이드는 아미노펩티다아제(aminopeptidase), 아밀라아제(amylase), 탄수화물 분해효소(carbohydrase), 카르복시펩티다아제(carboxypeptidase), 카탈라아제(catalase), 셀룰라아제(cellulase), 셀로비오하이드로라아제(cellobiohydrolase), 키티나아제(chitinase), 큐티나아제(cutinase), 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼라아제(cyclodextrin glycosyltransferase), 디옥시리보뉴클레아제(deoxyribonuclease), 엔도글루카나아제(endoglucanase), 에스테라아제(esterase), 알파-갈락토시다아제(alpha-galactosidase), 베타-갈락토시다아제(beta-galactosidase), 글루코아밀라아제(glucoamylase), 알파-글루코시다아제(alpha-glucosidase), 베타-글루코시다아제(beta-glucosidase), 인베르타아제(invertase), 라카아제(laccase), 리파아제(lipase), 만노시다아제(mannosidase), 뮤타나아제(mutanase), 옥시다아제(oxidase), 팩틴분해효소(pectinolytic enzyme), 페록시다아제(peroxidase), 포스포리파아제(phospholipase), 피타아제(phytase), 폴리페놀록시다아제(polyphenoloxidase), 단백질분해효소(proteolytic enzyme), 리보뉴클레아제(ribonuclease), 트랜스글루타미나아제(transglutaminase), 자일라나아제(xylanase), 또는 베타-자일로시다아제(beta-xylosidase)일 수 있다.
목적 폴리펩타이다는 특히 약으로서 유용한 폴리펩타이드일 수 있다.
적당한 목적 폴리펩타이드의 예는 포르포빌리노겐 디아미나아제(phorphobilinogen deaminase), 아릴설파타아제, 알파-만노시다아제 및 갈락토세레브로시다아제(galactocerebrosidase)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
원칙적으로 어떤 근원으로부터 유래될 수 있는 목적 폴리펩타이드는 본 발명의 방법에 따라 처리될 수 있다. 특정한 구현예에서 목적 폴리펩타이드는 인간 유래의 것일 수 있다. 특히, 본 발명에서 인간에게 투여되는 약의 제조용 목적 폴리펩타이드를 사용하는 것은 원하지 않는 알레르기 반응의 위험을 최소화할 수 있기 때문에 인간 유래의 폴리펩타이드일 수 있다. 예를 들어 동질이형(polymorphism)에 기인하는 인간 폴리펩타이드의 자연적인 변화는 본 발명에서 “인간 유래” 용어에 포함된다.
목적 폴리펩타이드는 특히 재조합 단백질과 같이 생산될 수 있다. 즉, 목적 폴리펩타이드를 부호화한 뉴클레오타이드 서열은 목적 폴리펩타이드의 발현을 위한 세포에 도입될 수 있다. 재조합 발현은 상동(homologous) 또는 이종(heterologous)일 수 있다. 즉, 목적 폴리펩타이드는 자연적으로 발현된 셀에서 발현(상동 발현)되거나 또는 자연적으로 발현되지 않은 셀에 의해 발현(이종 발현)될 수 있다.
목적 폴리펩타이드의 재조합은 특정 목적 폴리펩타이드의 재조합 생산에 적당한 어떤 세포에 의해 발현될 수 있다. 적당한 세포의 예는 E.coli 세포 또는 Bacillus 세포와 같은 원핵세포를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 적당한 진핵세포의 예는 효모 세포 또는 중국 햄스터 난소 세포(chinese hamster ovary, CHO)와 같은 포유류의 세포를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 선택적으로, 인간 세포일 수 있다.
글리코실화된 폴리펩타이드의 발현을 위한 적당한 숙주세포는 다세포생물로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 그러나, 숙주세포는 척추동물 세포일 수도 있고, 배양액(조직 배양액) 내에서 척추동물 세포의 증식은 일반적인 과정이 된다.
“재조합 폴리펩타이드” 또는 “재조합 목적 폴리펩타이드” 용어는 여기서 재조합 생산된 폴리펩타이드를 나타낸다.
특정 목적 폴리펩타이드에 대한 참조예는 또한 본 발명에서 목적 폴리펩타이드와 기능적으로 동등한 부분 또는 유사체를 포함한다. 예를 들어, 만약 목적 폴리펩타이드가 효소이면, 상기 효소와 기능적으로 동등한 부분은 도메인(domain) 또는 서브시퀀스(subsequence)가 완전-길이 효소(full-length enzyme) 또는 선택적으로 촉매에 대한 유전자 부호화와 같이 실질적으로 동일한 효소 활성을 발휘할 수 있게 하는 필수적인 촉매 부위(catalytic site)를 포함하는 효소의 도메인 또는 서브시퀀스일 수 있다. “실질적으로 동일한 효소 활성” 용어는 자연 효소의 활성의 적어도 50%, 바람직하게 적어도 60%, 보다 바람직하게 적어도 70%, 보다 바람직하게 적어도 75%, 보다 바람직하게 적어도 80%, 보다 바람직하게 적어도 85%, 보다 바람직하게 적어도 90%, 보다 바람직하게 적어도 95%, 및 가장 바람직하게 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%를 갖는 동등한 부분 또는 유사체를 언급한다. 효소적으로 동등한 효소의 유사체의 예는 기능적 형태의 효소의 촉매 부위를 포함하는 융합 단백질(fusion protein)일 수 있으나, 또한 다른 종으로부터 유래된 효소의 상동 변형체일 수도 있다. 또한, 상응하는 효소의 특정 효소 활성을 흉내낸 완전 합성된 분자는 또한 “효소의 동등한 유사체”를 구성한다.
일반적으로, 당업자는 효소 활성의 결정을 위한 적당한 분석(assays)을 쉽게 고안할 수 있다. 그러나, PBGD의 경우, 적당한 분석표가 국제특허 WO 03/002731의 실시예 2 뿐만 아니라 본 명세서의 실험 부분에 기재되어 있다. 아릴설파타아제 뿐만 아니라 이의 자연의 기질은 또한 합성체(synthetic), 색원체 기질(chromogenic substrate), 파라-니트로카테콜 설페이트(Nitrocatechol sulfate , pNCS)의 가수분해를 촉진할 수 있다. 생산물, 파라-니트로카테콜(pNCS)은 515 ㎚의 빛을 흡수한다. 아릴설파타아제 활성의 결정을 위한 분석은 국제특허 WO 2005/073367와 Fluharty et al. 1978, Meth. Enzymol. 50:537-47에 상세하게 기술되어 있다. LAMAN의 경우, 적당한 효소 활성 분석은 국제특허 WO 02/099092에 개시되어 있다.
포르포빌리노겐 디아미나아제
일 구현예에서 본 발명의 목적 폴리펩타이드는 포르포빌리노겐 디아미나아제(또는 포르포빌리노겐 암모니아-리아제(중합된)로 알려진), E.C. 4.3.1.8(Waldenstr
Figure 112008076288474-PCT00001
m 1937, J. Acta. Med. Scand. Suppl.8)일 수 있다. 포르포빌리노겐 디아미나아제는 햄 생합성 경로의 세번째 효소이다. E.C. 4.3.1.8은 E.C. 2.5.1.61로 이동되었고, 그리하여 포스포빌리노겐 디아미나아제(PBGD)는 현재 이 E.C. 번호하에 놓여 있다.
포스포빌리노겐 디아미나아제는 4 포스포빌리노겐 + H2O = 히드록시메틸빌란(hydroxymethylbilane) + 4NH3의 반응을 촉진시킨다.
PBDG는 PBDG의 결함(활성의 50% 감소)에 의해 야기되는 남성의 상염색체 우성질병(autosomal dominant disorder)인 급성 간헐성 포르피리아(acute intermittent porphyria, AIP)와 관련하여 중요하다(이와 관련한 더 상세한 내용은 국제특허 WO 01/07065을 참조).
포르포빌리노겐 디아미나아제는 짧게 말하면 PBGD로 알려져 있으며 본 발명에서 이들 두 용어는 서로 호환성있게 사용될 수 있다.
PBGD의 재조합 발현을 위해서 숙주세포는 특히 효모 세포 또는 E.coli 세포일 수 있다.
재조합 E.coli 세포 구조의 상세한 예에 대한 것은 국제특허 WO 01/07065의 실시예 1에 따라 만들어지고, 생쥐 PBGD 발현이 가능한 HeLa 세포 및 NIH 3T3 세포에 대한 것은 국제특허 WO 01/07065의 실시예 6에 따라 만들어진다.
“재조합 포르포빌리노겐 디아미나아제(rPBGD)” 용어는 여기서 재조합 생산된 PBGD를 나타낸다. 다음에서, 이 효소와 재조합 인간 형태는 각각 “PBGD”와 “rhPBGD”로 불리울 것이다. 이 용어는 또한 PBGD의 효소적으로 동등한 부분 또는 유사체 내에 포함된다. 효소의 효소적으로 동등한 부분의 일례는 도메인 또는 서브시퀀스가 완전-길이 효소 또는 대안적으로 촉매에 대한 유전자 부호화와 같이 실질적으로 같은 효소 활성을 발휘할 수 있게 하는 필수적인 촉매 부위를 포함하는 효소의 도메인 또는 서브시퀀스일 수 있다. “실질적으로 같은 효소 활성” 용어는 국제특허 WO 03/002731의 실시예 2에서 기술된 rhPBGD 활성 분석에서 측정된 자연 인간 rhPBGD의 활성의 적어도 50%, 바람직하게 적어도 60%, 보다 바람직하게 적어도 70%, 보다 바람직하게 75%, 보다 바람직하게 적어도 80%, 보다 바람직하게 적어도 85%, 보다 바람직하게 적어도 90%, 보다 바람직하게 적어도 95%, 및 가장 바람직하게 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%를 갖는 동등한 부분 또는 유사체 효소를 의미한다. 효소적으로 동등한 효소의 유사체의 예는 기능적 형태의 효소의 촉매 부위를 포함하는 융합 단백질일 수 있으나, 또한 다른 종으로부터 유래된 효소의 상동 변형체일 수도 있다. 또한, 상응하는 효소의 특정 효소 활성을 흉내낸 완전 합성된 분자는 또한 “효소의 동등한 유사체”를 구성한다.
본 발명에서 사용될 수 있는 PBGD의 예는 본 명세서의 서열 1-10, 또는 Genebank no. X04217, X04808 또는 M95623에 나타낸 것들 중 어떤 것을 포함한다.
아릴설파타아제
본 발명의 다른 구현예에서 목적 폴리펩타이드는 아릴설파타아제 A일 수 있다.
아릴설파타아제 A는 세레브로시드(cerebroside) 3-설페이트(sulfate) + H2O = 세레브로시드 + 설페이트(sulphate)의 반응을 촉진시킨다.
ASA(arylsulfatase A)는 인간의 간, 태반, 및 소변을 포함하는 다양한 근원으로부터 정제되어왔다. 그것은 낮은 등전점(isoelectric point)을 갖는 산성의 당단백질이다. pH 6.5 이상에서, 효소는 약 110 kDa의 분자량을 갖는 이량체(dimer)로서 존재한다. ASA는 pH 4.5에서 팔량체(octamer)를 형성하는 pH-의존적인 중합을 겪는다. 인간의 소변에서, 효소는 63과 54 kDa의 두개의 동일하지 않은 서브유니트(subunit)로 구성되어 있다. 인간의 간, 태반, 및 섬유아 세포로부터 정제된 ASA는 또한 55와 64 kDa 사이에서 변화하는 다소 다른 크기의 두개의 서브유니트로 구성되어 있다. 다른 리소좀 효소의 경우에서와 같이, ASA는 글리코실화된 전구체로서 막-부착 리소좀(membrane-bound ribosomes)에서 합성된다. 그 다음에 소포체와 골지체를 통하여 통과하고, 여기에서 ASA의 N-링크된 다당류는 복합체 유형의 인산화 및 황산화된 다당류의 형성으로 처리된다(Waheed A et al. Biochim Biophys Acta. 1985, 847, 53-61, Braulke T et al. Biochem Biophys Res Commun. 1987, 143, 178-185). 정상의 배양된 섬유아 세포에서, 62 kDa의 전구체 폴리펩타이드가 생산되고, 이것은 산성의 용해소체전이 엔도좀(prelysosomal endosome)(Kelly BM et al. Eur J Cell Biol. 1989, 48, 71-78)에 결합하는 만노오스-6-인산염(mannose-6-phosphate) 리셉터(Braulke T et al. J Biol Chem. 1990, 265, 6650-6655)를 경유하여 이동시킨다.
아릴설파타아제 A는 특히 인간의 유래일 수 있다. 인간 ASA 신호 펩타이드의 길이(18 아미노산)는 공통배열과 신호 서열에 대한 특정 처리 부위(processing site)에 기초로 한다. 그러므로, 유래된 인간 ASA cDNA(EMBL GenBank accession numbers J04593 and X521151)로부터 신호 펩타이드의 분할은 잔기 번호 18(Ala) 후에 모든 세포에서 수행되어야만 하며, 결과적으로 인간 ASA의 성숙된 형태가 된다. 다음에서, 재조합 아릴설파타아제 A는 rASA로 줄여서 쓸 것이고, 인간 ASA의 성숙한 형태를 포함한 아릴설파타아제 A의 성숙한 형태는 “mASA”로 불리울 것이며 성숙한 재조합 인간 ASA는 “mrhASA”로 불리울 것이다.
단백질 변형은 두개의 진핵생물 설파타아제(ASA와 아릴설파타아제 B(ASB))에서와 남조류 식물 Volvox carteri(Schmidt B et al. Cell. 1995, 82, 271-278, Selmer T et al. Eur. J. Biochem. 1996, 238, 341-345)로부터 하나에 대해서 동등시되어 왔다. 이러한 변이는 알려진 설파타아제들 사이에서 보존되는 시스테인 잔기의 2-아미노-3-옥소프로피온산 잔기로의 전환을 인도한다(Schmidt B et al. Cell. 1995, 82, 271-278). 신규한 아미노산 유도체는 또한 C*-포르밀글리신(FGly)으로 인정된다. MSD 세포로부터 유래된 ASA와 ASB에서, Cys-69 잔기는 유지된다. 결과적으로, Cys-69에서 FGly-69로의 전환은 촉매적으로 활성이 있는 ASA와 ASB의 발생이 요구되며, 이러한 단백질 변형의 결핍은 MSD의 원인이다. Cys-69은 18 잔기 신호 펩타이드를 갖는 전구체 ASA로 언급된다. mASA에서 언급된 시스테인 잔기는 Cys-51이다. 그 이상의 조사는 mASA의 Cys-51 주위의 16 잔기의 선형 서열이 전환을 지시하는데 충분하며, 단백질 변형은 폴리펩타이드가 아직 그 본래의 구조로 접어지지 않았을 때 소포체로의 동시 번역의 단백질 전좌(co-translational protein translocation) 후기단계 또는 그 이후에 일어날 수 있음을 나타낸다(Dierks T et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 1997, 94, 11963-1196, Wittke, D. et al. (2004), Acta Neuropathol. (Berl.), 108, 261-271).
ASA의 다중 형태는 인간 소변, 백혈구, 혈소판, 배양된 섬유아 세포 및 간으로부터 효소 제조의 전기영동(electrophoretic)과 등전초법(isoelectric focusing)으로 증명되어왔다. 엔도글리코시다아제 H(endoglycosidase), 시알리다아제(sialidase), 및 알칼리 인산염에 의한 처리는 분자 크기와 전기영동 패턴의 복잡성을 감소시키며, 이것은 ASA의 많은 전위 이질성이 효소의 탄수화물 함량의 변동에 기인한다는 것을 제안한다.
아릴설파타아제 A는 특히 혈액뇌관문을 가로지를 수 있는 아릴설파타아제 A의 형태 및/또는 뇌 안의 목적 세포로의 입장을 위한 특정 표시를 갖는 rASA의 형태일 수 있다. 특히, 아릴설파타아제 A는 만노오스-6-인산염 경로를 경유하여 생체 안에서 충분히 흡수되는 rASA일 수 있다.
그러므로, ASA는 특히 혈액뇌관문에 걸쳐 및/또는 일반적으로 세포막을 가로지르는 ASA의 수송을 증가 및/또는 용이하게 할 수 있는 소위 표지, 펩타이드 또는 매개체(vehicles)이거나 매개체로서의 독소와 같은 단백질에 공유결합될 수 있다(Schwarze et al.,Trends Cell Biol. 2000; 10(7):290-295; Lindgren et al., Trends Pharmacol. Sci. 2000; 21(3):99-103). 그러한 펩타이드 서열을 함유하는 ASA 분자는 발현 기술에 의해 생산될 수 있다. 단백질 형질도입(protein transduction) 공정은 특정한 세포 형태가 아니며 형질도입 공정이 일어나는 메커니즘은 완전히 밝혀진 것은 아니나, 이것이 몇몇 종류의 막 교란(membrane perturbation)과 수용체(receptor)에 독립적인 침투 공정에 의해 일어나는 것으로 여겨지고 있다. 부분적으로 접히지 않은 상태의 분자는 공정을 용이하게 할 수 있으나 필수적인 것은 아니다.
적당한 표지의 예는 만노오스-6-인산염 표지를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
매개체로서의 펩타이드 또는 단백질의 예는 소위 단백질-형질도입 도메인을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 적당한 단백질-형질도입 도메인의 예는 참고에 의해 여기에 편입된 국제특허 WO 2005/073367에 언급된 것을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 그러므로 단백질-형질도입 도메인은 HIV TAT단백질-YGRKKRRQRRR(Schwarze et al.,Trends Cell Biol. 2000; 10(7):290-295), 서열에 대한 그 이상의 알파-헬리시티(alpha-helicity)와 양친매 성질을 주는 TAT-YARAAARQARA의 합성 버전(Ho et al., Cancer Res. 2001; 61(2):474-477), 베타-3 인테그린(integrin) 또는 Kaposi의 육종 FGF로부터 소수성 신호 서열 부분을 기초로 한 다른 아미노산 및 펩타이드와 조합된 폴리 -R 또는 기본 -R 및 -K 잔기의 혼합물로 이루어진 합성 선도자 펩타이드(Dunican et al. Biopolymers 2001; 60(1):45-60)로부터의 11 잔기 기본 펩타이드일 수 있다.
용액과 같은 적당한 독소의 예는 참조에 의해 여기에 편입된 국제특허 WO 2005/073367를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
ASA는 특히 부호화하는 다음의 핵산 서열을 포함한다:
(a) 국제특허 WO 2005/073367의 SEQ ID NO 2의 아미노산 서열;
(b) 재조합 인간 아릴설파타아제 A와 효소적으로 동등한, (a)의 서열의 일부
(c) (a) 또는 (b)의 서열 중 어느 하나와 적어도 75%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 유사체, 상기 유사체는 재조합 인간 아릴설파타아제 A와 효소적으로 동등함.
본 발명에서, 아미노산 서열 또는 아미노산 서열의 일부는 많은 양의 아릴설파타아제 A 기질 pNCS를 37℃에서 국제특허 WO 2005/073367의 실시예 1에 기술되어 있는 아릴설파타아제 A 활성을 측정하기 위한 분석에 의해 결정되는 적어도 20 U/㎎ 폴리펩타이드(바람직하게는 50 U/㎎ 폴리펩타이드)의 특정 활성에 대응하는 속도로 가수분해할 수 있는 폴리펩타이드, 및/또는 국제특허 WO 2005/073367의 실시예 2에 기술되어 있는 분석에서 25 mU/㎖의 투약 수준에서 배양에 의해 분석되었을 때 MLD 섬유아 세포에 로딩된 라벨을 붙인 아릴설파타아제 A 기질, fx. 14C 팔미토일 설파타이드(palmitoyl sulfatide)의 적어도 40%를 가수분해할 수 있는 폴리펩타이드이다.
다른 구현예에서 ASA는 특히 다음을 포함한다:
(a) 국제특허 WO 2005/073367의 SEQ ID NO 1의 핵산 서열;
(b) 재조합 인간 아릴설파타아제 A와 효소적으로 동등한, 아미노산 서열을 부호화한 (a)의 서열의 일부;
(c) (a) 또는 (b)의 서열 중 어느 하나와 적어도 75%의 서열 동일성을 갖으며 동시에 아미노산 서열을 부호화하는 핵산 서열 유사체, 상기 유사체는 재조합 인간 아릴설파타아제 A와 효소적으로 동등함.
위에서 언급된 핵산 서열과 국제특허 WO 2005/073367의 SEQ ID NO 1 간의 서열 동일성 정도는 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%인 것이 바람직하다. 위에서 언급된 핵산 서열에 의해 부호화된 아미노산 서열과 국제특허 WO 2005/073367의 SEQ ID NO 2 간의 서열 동일성 정도는 적어도 88%, 예를 들어 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%인 것이 마찬가지로 바람직하다.
본 발명의 목적을 위하여, 아릴설파타아제 A는 재조합 효소인 것이 바람직하고, 보다 바람직한 것은 재조합 인간 아릴설파타아제 A(rhASA)이다.
rhASA는 포유동물의 세포 또는 세포주에서 생산되고, 상기 포유동물의 세포 또는 세포주는 만노오스-6-인산염 경로를 경유하여 생체 안에서 충분히 세포이물흡수되는 rASA의 복합당질(glycoform)을 생산하는 것이 바람직하다. 특히, 바람직한 rASA의 복합당질은 만노오스-6-인산염 경로를 경유하여 생체 안에서 충분한 세포이물흡수를 가능하게 하는 많은 양의 노출된 만노오스-6-인산염을 포함한다.
특정 구현예에서, rASA의 생산된 복합당질의 적어도 하나는 CHO 세포에서 생산된 복합당질과 유사하다.
성숙한 인간 아릴설파타아제 A의 51 위치의 시스테인 잔기의 후번역 변형(post translational modification)은 효소의 활성과 상응한다. 따라서, 본 발명의 바람직한 구현예에서 아릴설파타아제 A 또는 그의 동등물의 생산은, 국제특허 WO 2005/073367의 SEQ ID NO 2의 Cys-69에 대응하는 아미노산이 국제특허 WO 2005/073367의 SEQ ID NO 3의 Fgly-51에 상응하는 포르밀글리신으로 전환되는 효소의 아형(isoform)을 포함하는 생산물을 생기게 하는 속도와 조건 하에서 일어난다. 국제특허 WO 2005/073367의 SEQ ID 4는 18 아미노산 신호 펩타이드의 분할 후, 그러나 C-51의 변이 이전에 성숙한 인간 아릴설파타아제 A를 나타낸다.
그러므로, 본 발명의 다른 구현예에서 ASA 또는 그의 효소적 동등물은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다:
(a) 국제특허 WO 2005/073367의 SEQ ID NO 3의 아미노산 서열;
(b) 재조합 인간 아릴설파타아제 A와 효소적으로 동등한 (a)의 서열의 일부;
(c) (a) 또는 (b)의 서열 중 어느 하나와 적어도 75%의 서열 동일성을 가지며 동시에 재조합 인간 아릴설파타아제 A와 효소적으로 동등한 아미노산 서열.
본 발명에 따라 생산된 효소와 국제특허 WO 2005/073367의 SEQ ID NO 3 또는 국제특허 WO 2005/073367의 SEQ ID NO 4 간의 서열 동일성 정도는 적어도 80%, 예를 들어 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%인 것이 바람직하다.
생물학적 활성과 생체 안에서 효소의 효과를 위하여 최적화되는 것이 요구되며, 만약 충분한 양의 효소가 위에서 기술된 바와 같이 글리코실화 패턴을 획득하고 51 위치에서 후변역으로 변이된다면 유리하다. 그러므로, 본 발명의 ASA의 적어도 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98%는 위에서 기술된 복합당질/아형일 수 있다.
본 발명의 ASA는 그것의 구조에서 보면 국제특허 WO 2005/073367의 SEQ ID NO 3에 따른 rASA와 다를 수 있다. Cys-51 주위의 아미노산 잔기의 서열은 동일하거나 또는 SEQ ID NO 3의 상응하는 서열에 대한 높은 서열 동일성을 가진다는 것은 유리하다. 그러므로, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5와 같은 20 아미노산의 선형서열 또는 아릴설파타아제 A의 Cys-51 주위의 4 아미노산 잔기는 2005/073367의 SEQ ID NO 3에 상응하는 서열과 동일하거나 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%와 같은 적어도 90% 동일한 것이 바람직하다. 리소좀 내의 rASA의 활성 형태가 팔량체인 것과 같이 본 발명의 ASA는 특히 팔량체이거나 또는 생리학적인 조건 하에서 팔량체로 회합하는 rASA일 수 있다.
rASA의 촉매 활성으로서 이해되고 있는 ASA의 효소 활성은 검출할 수 있는 기질 또는 검출할 수 있는 최종 생산물을 인도하는 기질의 rASA 매개의 가수분해에 기초한 효소 분석표에 의해 측정될 수 있다. 바람직한 측면에서, 분석은 최종 생산물, 515 ㎚의 빛을 흡수하는 파라-니트로카테콜(pNC)을 갖는 합성체, 색원체 기질, 파라-니트로카테콜 설페이트(pNCS)에 기초한 것이 바람직하다.
리소조멀 알파-만노시다아제
또 다른 구현예에서 목적 폴리펩타이드는 리소조멀 알파-만노시다아제(LAMAN)일 수 있다. 리소조멀 알파-만노시다아제는 EC 3.2.1.24에 속하며, N-링크된 당단백질의 예정된 분해(ordered degradation) 동안에 알파-D-만노사이드에서 비환원성 말단으로부터 비환원성 알파-만노시다아제 잔기를 가수분해하는 엑소글리코시다아제(exoglycosidase)이다(Aronson and Kuranda FASEB J 3:2615-2622. 1989). 본 발명에서 리소조멀 알파-만노시다아제 용어는 약어인 LAMAN과 호환성있게 사용될 수 있다.
본 발명의 LAMAN은 특히 인간의 유래일 수 있다. 인간 효소는 15, 42 및 70 kD의 세개의 주요 당펩타이드(glycopeptide)에서 처리되는 49 잔기의 추정 단일 펩타이드와 함께 1011 아미노산의 단일 폴리펩타이드로서 합성된다(Nilssen et al. Hum. Mol. Genet. 6, 717-726. 1997).
LAMAN(MANB)의 유전자 부호화는 염색체 19(19cen-q12)에 위치된다(Kaneda et al. Chromosoma 95:8-12. 1987). MANB는 길이 21.5 kb인 24 엑손(exon)으로 구성되어 있다(GenBank accession numbers U60885-U60899; Riise et al. Genomics 42:200-207. 1997). LAMAN 전사(transcript)는 3,500 뉴클레오타이드(nts) 이상이고, 1,011 아미노산을 부호화하는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 함유한다(GenBank U60266.1).
클로닝(cloning)과 LAMAN을 부호화하는 인간 cDNA의 서열분석은 세개의 논문에서 발표되었다(Nilssen et al. Hum.Mol.Genet. 6, 717-726. 1997; Liao et al. J. Biol. Chem. 271, 28348-28358. 1996; Nebes et al. Biochem.Biophys.Res.Commun. 200, 239-245. 1994). 이상하게도, 세개의 서열은 동일하지 않다. Nilssen 등의 서열(accession # U60266.1)과 비교하였을 때, 발린에서 아스파르트산 치환을 야기하는 1670과 1671 위치에서 TA에서 AT로의 변화는 Liao 등과 Nebes 등에 의해 발견되었다.
가장 바람직한 구현예에서, 리소조멀 알파 만노시다아제는 국제특허 WO 2005/094874의 SEQ ID NO 1의 아미노산 서열을 포함한다.
실용적이고 경제적인 이유에서 본 발명의 LAMAN은 제조합으로 생산되는 것이 바람직하다. 재조합 생산에 의해 큰 단편이 만노오스-6-인산염을 함유하고 있는 효소의 제조품(preparation)을 얻는 것이 가능할 수 있다. 재조합 생산은 국제특허 WO 2005/094874의 SEQ ID NO 2의 서열을 포함하는 핵산 서열을 사용한 세포의 핵내주입(transfection) 후에 달성될 수 있다.
알파-만노시다아제는 이를테면 신체의 내장 기관의 세포에서 충분한 수용체 매개 업테이크(uptake)를 보장하는 글리코실화 프로파일(profile)을 유발하는 것과 같이 포유동물의 세포 시스템에서 만들어지는 것이 바람직하다. 특히, CHO, COS 또는 BHK 세포의 효소의 생산은 만노오스-6-인산염 잔기의 추가에 의한 효소의 충분한 후번역 변형을 보장한다는 것이 발견되었다. 게다가, 올바른 시알릴화(sialylation) 프로파일이 얻어진다. 노출된 갈락토오스 잔기 때문에 올바른 시알릴화는 간에 의한 업테이크를 예방하기 위하여 중요한 것으로 알려져 있다.
보다 바람직한 구현예에서 포유동물의 세포 시스템은 그러므로 CHO, COS, 세포 또는 BHK 세포를 포함하는 군으로부터 선택된다(Stein et al. J. Biol. Chem. 1989, 264, 1252-1259). 포유동물의 세포 시스템은 인간의 섬유아세포 세포주인 것이 바람직할 수 있다.
가장 바람직한 구현예에서, 포유동물의 세포 시스템은 CHO 세포주이다.
다른 구현예에서 리소조멀 알파-만노시다아제는 제조품의 단편이 만노오스 6-인산염 군을 운반하는 하나 이상의 N-링크된 올리고당을 갖는 리소조멀 알파 만노시다아제를 구성하는 리소조멀 알파-만노시다아제의 제조품일 수 있다.
상기 리소조멀 알파-만노시다아제 제조품의 단편이 만노오스 6-인산염 리셉터에 결합할 수 있는 것이 보다 바람직하다.
만노오스-6-인산염 수용체에 결합하는 효소의 능력은 국제특허 WO 2005/094874의 실시예 1에서 기술된 바와 같은 시험관 내 분석에서 결정될 수 있다. 여기서, MPR 친화력 300 매트릭스에 대한 효소의 결합은 만노오스-6-인산염 수용체에 결합능의 측정을 제공한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서 만노오스-6-인산염 수용체에 대한 효소의 결합은 시험관 내에서 일어난다.
본 발명의 보다 바람직한 구현예에서 이러한 단편은 리조소멀 알파-만노시다아제의 제조품의 활성의 1-75%, 예를 들어 2-70%, 예를 들어 5-60%, 예를 들어 10-50%, 예를 들어 15-45%, 예를 들어 20-40%, 예를 들어 30-35%와 같은 1-75%에 상응한다.
따라서, 리소조멀 알파-만노시다아제는 만노오스 6-인산염 의존의 결합이 Man-6-P-리셉터 매트릭스에 대한 효소 양의 2-100%, 5-95%, 10-90%, 20-80%, 30-70% 또는 40-60%가 되도록 하는 만노오스 6-인산염 잔기의 용량을 갖는 것이 바람직하다. 현재, 인산화반응 정도는 효소의 몇몇 배치(batch)에서 분석되었으며, 전형적으로, 30-45%의 효소는 인산화되고 친화 매트릭스를 결합한다.
상기 리소조멀 알파-만노시다아제 양의 2-100%, 5-90%, 10-80%, 20-75%, 30-70%, 35-65% 또는 40-60%를 구성하는 단편은 높은 친화력으로 Man-6-P-수용체에 결합하는 것이 보다 바람직하다. 이론적으로, 두개의 만노오스 6-인산염 군은 효소가 높은 친화력으로 Man-6-P-리셉터에 결합하도록 하기 위하여 서로 근접하게 위치되어야만 한다. 최근의 관찰은 높은 친화력 결합을 얻기 위해서는 인산화된 만노오스 잔기 간의 거리는 40 Å 이하이어야 한다는 것을 제안한다. 국제특허 WO 2005/094874의 SEQ ID NO 1에 따른 인간 리소조멀 알파-만노시다아제에서 두개의 만노오스 6-인산염 잔기는 367과 766 위치의 아스파라긴(asparagine) 잔기에 놓여질 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 약은 리소조멀 알파-만노시다아제, 만노오스 6-인산염 군을 이들 양쪽의 아스파라긴 잔기에 운반하는 단편을 포함하는 것이 바람직하다.
바람직하게, 알파-만노시다아제는 재조합 기술에 의해 만들어진다. 그 이상의 구현예에서, 알파-만노시다아제는 인간의 오리진의 것(hLAMAN)이고 보다 더 바람직하게는 성숙한 인간 알파-만노시다아제(mhLAMAN) 또는 이의 단편이다. 단편은 변형될 수 있으나, 효소의 활성 부위는 보존되어야 한다.
다른 단편들은 약 55와 70 kDa의 단백질 가수분해적으로 처리된 형태를 나타내는 반면, 본 발명에 따른 알파-만노시다아제의 제조에서 효소의 하나의 단편은 그것의 전구체 형태에 의해 나타내어지는 것으로 기대된다.
갈락토세레브로시다아제
다른 구현예에서 목적 폴리펩타이드는 GALC로 단축될 수 있는 갈락토세레브로시다아제일 수 있다. 갈락토세레브로시다아제는 E.C. 3.1.6.46에 속하고 D-갈락토실-N-아실스핀고신(D-galactosyl-N-acylsphingosine) + H2O = D-갈락토오스 + N-아실스핀고신의 반응을 촉진할 수 있는 효소이며, 그로므로 GALC는 예를 들어 미엘린(myelin)에서 갈락토리피트(galactolipid)의 분해를 촉진시킨다.
인간으로부터 유래된 GALC 효소는 643 아미노산을 포함하고 분자량이 72.8 kDa인 글리코실화된 리소조멀 효소이다. 본 발명의 GALC는 특히 인간 유래의 것일 수 있다. 그 이상의 구현예에서 GALC는 이전에 언급된 숙주 세포들 중 하나에서 발현된 재조합체일 수 있다. GALC의 재조합 발현을 위한 숙주 세포는 특히 CHO 세포일 수 있다.
명세서 및 청구항에서 참조예는 다음의 아미노산 및 핵산 서열로 만들어진다.
서열 기술 서열 식별자
PBGD 부호화 서열 1 SEQ ID NO.: 1
PBGD 부호화 서열 2 SEQ ID NO.: 2
PBGD 부호화 서열 3 SEQ ID NO.: 3
PBGD 부호화 서열 4 SEQ ID NO.: 4
PBGD 부호화 서열 5 SEQ ID NO.: 5
PBGD 부호화 서열 6 SEQ ID NO.: 6
PBGD 부호화 서열 7 SEQ ID NO.: 7
PBGD 부호화 서열 8 SEQ ID NO.: 8
PBGD 부호화 서열 9 SEQ ID NO.: 9
PBGD 부호화 서열 10 SEQ ID NO.: 10
PBGD 부호화 서열, GenBank Acc. No. X04217 SEQ ID NO.: 11
PBGD 부호화 서열, GenBank Acc. No. X04808 SEQ ID NO.: 12
PBGD 부호화 서열, GenBank Acc. No. M95623 SEQ ID NO.: 13
부호화 서열로부터 PBGD aa 서열, GenBank Acc. No. M95623, 구조적 형태 SEQ ID NO.: 14
부호화 서열로부터 PBGD aa 서열, GenBank Acc. No. M95623, 적혈구조혈성(erythropoietic) 형태 SEQ ID NO.: 15
ASA 부호화 서열 Genbank Acc. No. J04593 SEQ ID NO.: 16
ASA 부호화 서열 국제특허 WO 2005/073367의 SEQ ID NO. 1 SEQ ID NO.: 17
ASA aa 서열 국제특허 WO 2005/073367의 SEQ ID NO. 2 SEQ ID NO.: 18
ASA aa 서열 국제특허 WO 2005/073367의 SEQ ID NO. 3 SEQ ID NO.: 19
ASA aa 서열 국제특허 WO 2005/073367의 SEQ ID NO. 4 SEQ ID NO.: 20
LAMAN aa 서열 국제특허 WO 2005/094874의 SEQ ID NO. 1 SEQ ID NO.: 21
LAMAN 부호화 서열 국제특허 WO 2005/094874의 SEQ ID NO. 1 SEQ ID NO.: 22
갈락토세레브로시다아제 부호화 서열 SEQ ID NO.: 23
갈락토세레브로시다아제 aa 서열 SEQ ID NO.: 24
이러한 서열에 대한 참조예와 함께, 본 발명의 바람직한 구현예에 따른 목적 폴리펩타이드는 다음으로 이루어지는 군으로부터 선택된 아미노산을 포함한다:
ⅰ) SEQ ID NOs 14, 15, 18, 19, 20, 21 및 24 중 어느 하나에 의해 정의된 아미노산 서열;
ⅱ) ⅰ)에서 정의된 아미노산 서열과 기능적으로 동등한 부분; 및
ⅲ) ⅰ) 또는 ⅱ)에서 정의된 아미노산 서열과 기능적으로 동등한 유사체이며, 상기 유사체의 아미노산 서열은 ⅰ) 또는 ⅱ)에서 정의된 아미노산 서열과 적어도 75% 동일함.
특정 구현예에서, ⅲ)의 유사체는 ⅰ) 또는 ⅱ)에서 정의된 서열과 적어도 80% 동일한, 예를 들어 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 예를 들어 ⅰ) 또는 ⅱ)에서 정의된 서열과 적어도 99.5% 동일하다.
나아가, 목적 폴리펩타이드는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 핵산 서열을 사용한 재조합 발현에 의해 얻어질 수 있다:
ⅰ) SEQ ID NOs 1-13, 16, 17, 22 및 23 중 어느 하나에 의하여 정의된 핵산 서열;
ⅱ) ⅰ)에서 정의된 핵산 서열과 적어도 75% 동일한 핵산 서열.
폴리펩타이드의 재조합 생산을 위하여, ⅱ)의 산 서열은 ⅰ)에서 정의된 서열과 적어도 80% 동일한, 예를 들어 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 예를 들어 ⅰ)에서 정의된 서열과 적어도 99.5% 동일한 것이 보다 바람직하다.
목적 폴리펩타이드를 포함하는 조성물
목적 폴리펩타이드를 포함하는 조성물의 다음의 기술은 본 발명의 방법에 따라 농축된 폴리펩타이드를 포함하는 조성물에 관한 것이며, 또한 목적 폴리펩타이드를 적어도 10 ㎎/㎖ 포함하는 본 발명의 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 목적 폴리펩타이드가 특히 rhPBGD, 아릴 설파타아제, 알파-만노시다아제 또는 갈락토세레브로시다아제와 같은 본 발명에 따른 폴리펩타이드 중 어느 하나인 목적 폴리펩타이드를 적어도 10 ㎎/㎖ 포함하는 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 특히 목적 폴리펩타이드를 적어도 25 ㎎/㎖, 예를 들어 목적 폴리펩타이드를 50 ㎎/㎖ 또는 적어도 75 ㎎/㎖ 또는 적어도 100 ㎎/㎖를 포함할 수 있다. 그러므로, 상기 조성물은 특히 목적 폴리펩타이드를 10-1000 ㎎/㎖ 사이, 예를 들어 목적 폴리펩타이드 10-500 ㎎/㎖ 사이 또는 10-300 ㎎/㎖ 사이 또는 10-200 ㎎/㎖ 사이 또는 25-500 ㎎/㎖ 사이 또는 25-400 ㎎/㎖ 사이 또는 40-400 ㎎/㎖ 사이 또는 40-300 ㎎/㎖ 사이 또는 50-400 ㎎/㎖ 사이 또는 50-300 ㎎/㎖ 사이 또는 75-400 ㎎/㎖ 사이 또는 75-300 ㎎/㎖ 사이 또는 100-200 ㎎/㎖ 사이 또는 100-150 ㎎/㎖ 사이를 포함할 수 있다.
목적 폴리펩타이드를 포함하는 조성물은 특히 수용액일 수 있다.
게다가 높은 농도의 목적 폴리펩타이드를 포함하는 상기 조성물은 특히 목적 폴리펩타이드의 집합체를 더 포함하지 않거나 적어도 단지 매우 적은 집합체를 더 포함할 수 있다. 그러므로, 집합체로서 존재하는 목적 폴리펩타이드의 양은 특히 조성물의 목적 폴리펩타이드의 총 양의 5 w/w% 이하를 구성할 수 있다. 특히, 상기 집합체는 목적 폴리펩타이드 총 양의 4 w/w% 이하, 예를 들어 3 w/w% 이하, 또는 2 w/w% 이하, 또는 1 w/w% 이하, 또는 0.5 w/w% 이하, 또는 0.1 w/w% 이하를 구성할 수 있다. 본 문맥에서 “집합체” 용어는 단량체가 아닌 목적 폴리펩타이드의 어떠한 형태를 의미한다. 그러므로, 용어는 목적 폴리펩타이드의 어떠한 이량체 또는 다량체를 포함한다.
게다가, 만약 상기 조성물이 목적 폴리펩타이드만으로 또는 다른 단백질, 즉 목적 폴리펩타이드와 다른 단백질의 소량만을 포함한다면 유리하다. 그러므로, 특정한 구현예에서 상기 조성물은 목적 폴리펩타이드와 다른 단백질을 1 w/w% 이하, 예를 들어 0.5 w/w% 이하, 또는 0.1 w/w% 이하, 또는 0.05 w/w% 이하, 또는 0.01 w/w% 이하로 포함한다.
요인(factor)의 범위는 폴리펩타이드의 안정성과 활성에 영향을 미치며, 목적 폴리펩타이드를 포함하는 조성물은 그러므로 특히 목적 폴리펩타이드를 가능한한 안정하게 유지하도록 최적화될 수 있다.
pH는 일반적으로 목적 폴리펩타이드의 안정성에 영향을 미치므로, 목적 폴리펩타이드를 포함하는 조성물의 pH는 특히 7.5-8.5 범위, 예를 들어 특히 pH 7.7-8.2 사이, 보다 바람직하게 pH 7.8-8.0 사이 또는 pH 7.85-7.95, 예를 들어 pH 7.8 또는 pH 7.9일 수 있다. 이는 만약 목적 폴리펩타이드가 PBGD이면 특히 그렇다.
그러므로, 목적 폴리펩타이드를 포함하는 조성물은 특히 조성물을 기술된 pH 범위 내로 유지할 수 있는 버퍼를 포함할 수 있다. 그러한 버퍼의 예는 TRIS-HCL, 구연산 나트륨 및 Na2HPO4를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 그러한 버퍼의 농도는 특별한 버퍼의 선택과 조성물 내의 다른 성분의 존재에 의존할 수 있다. 만약 버퍼가 Na2HPO4이면, Na2HPO4의 농도는 0.5-15 mM 범위, 예를 들어 1-10 mM 범위, 또는 1.5-7.5 mM 범위, 예를 들어 1.83-7.4 mM 범위, 또는 1.5-3 mM 범위, 예를 들어 1.83-3.7 mM 범위, 또는 1.83-2.45 mM 범위, 또는 3.5-7.5 mM 범위, 예를 들어 3.6-7.4 mM 범위, 또는 5.4-7.4 mM 범위, 예를 들어 1.84 mM, 또는 2.45 mM, 또는 3.67 mM 또는 5.51 mM 또는 7.34 mM일 수 있다.
만약 버퍼가 TRIS-HCL이면, TRIS-HCL의 농도는 특히 2.50 mM 범위, 예를 들어 2-40 mM, 또는 2-30 mM, 또는 2-20 mM, 또는 2-10 mM, 또는 5-25 mM, 또는 5-20 mM, 또는 8-12 mM, 또는 9-11 mM, 예를 들어 10 mM일 수 있다.
목적 폴리펩타이드를 포함하는 조성물이 포함할 수 있는 다른 화합물의 예는 아미노산, 당류, 알콜류 및 세정제(detergent)를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 그러한 적당한 화합물의 예는 글라이신, 만니톨, 슈크로오즈, L-세린, 트윈 80 또는 상기 화합물들 중 하나 이상의 조합물을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 화합물의 농도는 특정한 화합물에 의존하나, 글라이신의 경우 농도는 특히 1-200 mM 범위, 예를 들어 5-190 mM 범위, 또는 10-180 mM 범위, 또는 10-170 mM 범위, 또는 20-160 mM 범위, 또는 20-150 mM 범위, 또는 25-125 mM 범위, 또는 5-100 mM 범위, 또는 5-90 mM 범위, 또는 5-80 mM 범위, 또는 5-70 mM 범위, 또는 5-60 mM 범위, 또는 10-100 mM 범위, 또는 10-90 mM 범위, 또는 10-80 mM 범위, 또는 10-70 mM 범위, 또는 10-60 mM 범위, 또는 12-60 mM 범위, 또는 12-55 mM 범위, 또는 13.5-54 mM 범위, 또는 10-30 mM 범위, 예를 들어 13.5-27 mM 범위, 또는 13.5-18 mM 범위, 또는 25-55 mM 범위, 예를 들어 27-54 mM 범위, 또는 40-55 범위, 예를 들어 40.5-54 mM 범위, 예를 들어 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 39.5, 40, 40.5, 41, 41.5, 또는 53, 53.5, 53, 54.5 또는 55 mM일 수 있다.
만니톨의 농도는 특히 50-1000 mM 범위, 예를 들어 50-900 mM 범위, 또는 50-800 mM 범위, 또는 50-700 mM 범위, 또는 50-600 mM 범위, 또는 100-900 mM 범위, 또는 100-800 mM 범위, 또는 100-700 mM 범위, 또는 100-600 mM 범위, 또는 100-500 mM 범위, 또는 120-525 mM 범위, 또는 125-500 mM 범위, 또는 100-300 mM 범위, 예를 들어 120-275 mM 범위, 또는 120-170 mM 범위, 또는 200-600 mM 범위, 예를 들어 225-550 mM 범위, 또는 240-510 mM 범위, 또는 370-525 mM 범위, 예를 들어 120, 125, 130, 160, 165, 166.7, 170, 175, 200, 221, 225, 250, 275, 300, 365, 370, 375, 380, 385, 490, 495, 500, 505 또는 510 mM일 수 있다.
슈크로오즈의 농도는 특히 1-200 mM 범위, 예를 들어 5-190 mM 범위, 또는 10-180 mM 범위, 또는 10-170 mM 범위, 또는 20-160 mM 범위, 또는 20-150 mM 범위, 25-125 mM 범위, 또는 5-100 mM 범위, 또는 5-90 mM 범위, 또는 5-80 mM 범위, 또는 5-70 mM 범위, 또는 5-60 mM 범위, 또는 10-100 mM 범위, 또는 10-90 mM 범위, 또는 10-80 mM 범위, 또는 10-70 mM 범위, 또는 10-60 mM 범위, 또는 12-60 mM 범위, 또는 12-55 mM 범위, 또는 13.5-54 mM 범위, 또는 10-30 mM 범위, 예를 들어 13.5-27 mM 범위, 또는 13.5-18 mM 범위, 또는 25-55 mM 범위, 예를 들어 27-54 mM 범위, 또는 40-55 범위, 예를 들어 40.5-54 mM 범위, 예를 들어 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 17, 17.5, 18, 18.5, 19, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 39.5, 40, 40.5, 41, 41.5, 또는 53, 53.5, 53, 54.5 또는 55 mM일 수 있다. 만약 슈크로오즈가 또한 만니톨을 포함하는 조성물에 포함된다면, 만니톨의 농도는 특히 슈크로오즈의 농도에 상응하여 낮아질 수 있는데, 즉 만니톨과 슈크로오즈 함께의 농도는 특히 만약 만니톨이 단독으로 사용되어진다면 만니톨의 농도에서와 같을 수 있다.
트윈 80의 농도는 특히 0.001-1 w/v% 범위, 예를 들어 0.005-1 w/v% 범위, 또는 0.01-1 w/v% 범위, 또는 0.001-0.5 w/v% 범위, 또는 0.005-0.5 w/v% 범위, 또는 0.01-0.5 w/v% 범위, 또는 0.05-0.4 w/v% 범위, 또는 0.05-0.3 w/v% 범위, 또는 0.05-0.2 w/v% 범위, 또는 0.075-0.4 w/v% 범위, 또는 0.075-0.3 w/v% 범위, 또는 0.075-0.2 w/v% 범위, 또는 0.09-0.2 w/v% 범위, 예를 들어 0.075, 0.08, 0.09, 0.1, 0.125, 0.15, 0.175 또는 0.2 w/v%일 수 있다.
폴리펩타이드가 특히 PBGD, 아릴 설파타아제, 리소조멀 알파-만노시다아제 또는 갈락토세레브로시다아제일 수 있는 목적 폴리펩타이드를 포함하는 조성물은 특히 상기 언급된 화합물의 하나 이상의 조합물을 포함할 수 있다. 그러한 조성물의 적당한 예는 목적 폴리펩타이드 이외에도 Na2HPO4, 글라이신 및 만니톨을 포함하는 것일 수 있다. 조성물의 pH와 다른 화합물의 농도는 위에서 기술된 바와 같을수 있다. 그러므로, 상기 조성물은 일 구현예에서 0.5-15 mM의 Na2HPO4, 1-200 mM의 글라이신, 50-1000 mM의 만니톨과 pH 7.5-8.5 범위를 포함할 수 있다. 위에서 언급된 화합물의 농도와 pH의 어떠한 조합은 본 발명에 의해 포함된다. 목적 폴리펩타이드를 포함하는 조성물에서 다른 화합물의 적당한 조합과 pH의 특정한 예는 3.67 mM의 Na2HPO4, 27 mM의 글라이신, 250 mM의 만니톨을 포함하고 pH 7.7-7.9 범위를 갖는 것이다.
적당한 조성물의 다른 예는 다음 중 어떤 것을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
ㆍ 1.84 mM의 Na2HPO4, 13.5 mM의 글라이신, 125 mM의 만니톨과 pH 7.7-7.9 범위
ㆍ 2.45 mM의 Na2HPO4, 18 mM의 글라이신, 167 mM의 만니톨과 pH 7.7-7.9 범위
ㆍ 5.51 mM의 Na2HPO4, 40.5 mM의 글라이신, 375 mM의 만니톨과 pH 7.7-7.9 범위
ㆍ 7.34 mM의 Na2HPO4, 54 mM의 글라이신, 500 mM의 만니톨과 pH 7.7-7.9 범위
ㆍ 3.67 mM의 Na2HPO4, 27 mM의 글라이신, 220 mM의 만니톨, 30 mM의 슈크로오즈와 pH 7.7-7.9 범위
ㆍ 3.67 mM의 Na2HPO4, 245 mM의 만니톨, 32 mM의 슈크로오즈와 pH 7.7-7.9 범위
ㆍ 3.67 mM의 Na2HPO4, 27 mM의 L-세린, 250 mM의 만니톨과 pH 7.7-7.9 범위
ㆍ 10 mM의 TRIS-HCL, 27 mM의 글라이신, 250 mM의 만니톨과 pH 7.7-7.9 범위
ㆍ 3.67 mM의 구연산 나트륨, 27 mM의 글라이신, 250 mM의 만니톨과 pH 7.7-7.9 범위
ㆍ 3.67 mM의 Na2HPO4, 27 mM의 글라이신, 220 mM의 만니톨, 29 mM의 슈크로오즈, 0.1 %(w/v)의 트윈 80과 pH 7.7-7.9 범위
ㆍ 3.67 mM의 Na2HPO4, 27 mM의 글라이신, 220 mM의 만니톨, 29 mM의 슈크로오즈, 0.1 %(w/v)의 트윈 80과 pH 7.7-7.9 범위
목적 폴리펩타이드를 포함하는 조성물은 특히 포유동물의 치료상의 응용에 사용될 수 있다. 그러므로, 목적 폴리펩타이드를 포함하는 조성물은 특히 포유동물의 조직에 관해서는 등장(isotonic)일 수 있는데, 예를 들면 조직은 특히 200-400 mOsm/㎏ 범위, 예를 들어 250-350 mOsm/㎏ 범위 또는 275-325 mOsm/㎏ 범위 또는 295-305 mOsm/㎏ 범위, 예를 들어 295 mOsm/㎏ 또는 300 mOsm/㎏ 또는 305 mOsm/㎏의 삼투질 농도(osmolality)를 갖는 것일 수 있다.
목적 폴리펩타이드의 농축 방법
본 발명의 방법은 a) 목적 폴리펩타이드를 포함하는 조성물의 원심분리 및/또는 여과 단계 및 b) a) 단계에서 얻어진 조성물을 농축하는 단계를 포함한다. 본 발명의 발명자들은 목적 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 농축하기 이전에 원심분리 및/또는 여과함에 의해서 목적 폴리펩타이드의 어떠한 집합체도 없거나 또는 적어도 단지 매우 적은 목적 폴리펩타이드 집합체를 갖는 고농도로 농축된 목적 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 얻는 것이 가능하다는 것을 발견하였다. 게다가, 폴리펩타이드 집합체의 양이 감소한다는 것은 예를 들면 폴리펩타이드에 대한 면역 응답을 유도하는 위험을 증가시킬 수 있는 것과 같은 치료상의 응용에 일반적으로 유리하다.
폴리펩타이드의 피하적인 투여를 위하여, 폴리펩타이드 조성물은 단지 적은 부피가 피하적으로 주사될 수 있는 것과 같이 적은 부피에서 높은 활성을 갖는 것이 유리하다.
단백질 또는 폴리펩타이드는 일반적으로 농축될 때 집합체를 형상할 수 있다. 그러므로, 본 발명의 방법은 목적 폴리펩타이드의 농축에 사용될 때 폴리펩타이드 집합체 형성을 높은 속도로 야기하지 않는 이점이 있다. 예에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 농축 방법에 의해 얻어진 조성물 내의 PBGD 집합체의 양은 농축되지 않은 PBGD 조성물에서의 양과 유사하다.
특정한 구현예에서 방법의 a) 단계는 b) 단계 이전에 수행된다.
a) 원심분리 및/또는 여과 단계
본 발명의 발명자들은 전처리에 의해서 많은 또는 대부분의 폴리펩타이드 집합체가 제거되기 때문에 목적 폴리펩타이드를 포함하는 조성물의 농축 이전에 조성물의 원심분리 및/또는 여과에 의해 조성물을 전처리하는 것이 유리하다는 것을 발견하였다.
b) 단계의 조성물의 농축이 한외여과법(ultrafiltration)과 같은 필터 또는 막의 사용에 의지하는 방법에 의해 수행될 때, 집합체의 존재는 필터 또는 막을 막아서 작은 분자와 액체가 필터 또는 막을 통과할 수 없게 한다. 이는 조성물이 농축되는 속도를 감소킬 수 있으며 및/또는 그 이상의 어떤 농축을 완전히 막을 수 있다.
그러므로, 이러한 유형의 농축에서 a) 단계에 따른 전처리는 집합체의 제거가 상기 조성물이 전처리되지 않았을 때보다 더 농축된 목적 폴리펩타이드 조성물을 얻을 수 있게 하기 때문에 유리하다.
b) 단계에서 조성물의 농축이 동결건조 또는 증발과 같이 물의 제거에 기초한 방법에 의해 수행될 때, a) 단계의 전처리는 농축된 조성물에 존재하는 집합체의 양을 줄이는 데 유리하다.
a) 단계는 다음의 세개의 대안 중 하나에 의해 수행될 수 있다.
ㆍ 원심분리
ㆍ 여과, 또는
ㆍ 원심분리와 여과
만약 a) 단계가 원심분리와 여과 모두를 포함한다면, 본 발명의 발명자들이 원심분리가 대부분의 큰 집합체들을 제거하며 여과는 그 다음에 남은 더 작은 집합체들을 제거한다는 것을 발견하였기 때문에 여과 이전에 원심분리를 수행하는 것이 유리하다.
원심분리
집합체들을 제거할 수 있기 위하여, 목적 폴리펩타이드를 포함하는 조성물은 1500-3000 g 범위, 예를 들어 1800-2500 g 범위, 또는 2000-2300 g 범위의 힘으로 원심분리될 수 있다.
적형적으로 조성물은 10-60분 동안, 예를 들어 15-50분 동안 또는 20-40분 동안 원심분리될 수 있다.
온도는 목적 폴리펩타이드의 안정성에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 원심분리는 2-20 ℃ 범위, 예를 들어 3-15 ℃ 또는 3-10 ℃ 범위, 또는 3-8 ℃범위, 예를 들어 4 ℃ 또는 5 ℃ 또는 6 ℃에서 수행될 수 있다.
원심분리는 개개의 목적 폴리펩타이드 분자가 용액 내에 머무르는 동안에 목적 폴리펩타이드가 침전물을 결집시키는, 즉 펠렛을 형성하는 것을 초래한다. 그래서, 본 발명의 방법에서 결과적으로 사용된 것은 원심분리된 조성물의 상청액이다.
여과
목적 폴리펩타이드를 포함하는 조성물은 0.20-5 ㎛ 범위, 예를 들어 0.2-2.5 ㎛ 범위의 기공 크기를 갖는 필터를 통하여 여과될 수 있다.
필터의 기공 크기 이외에도 또한 필터가 만들어진 물질은 목적 폴리펩타이드의 여과에 영향을 미칠 수 있다. 적당한 막 필터의 예는 폴리에테르술폰(polyethersulfone , PES), 셀룰로오스 아세테이트(cellulose acetate), 재생된 셀룰로오스 및 폴리비닐리덴 플루오라이드(polyvinylidene flouride, PVDF)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
단백질과 같은 분자가 여과될 때 제거되는 것은 대개 작은 분자이므로, 여과 후에 목적 폴리펩타이드는 일반적으로 보전액에 존재할 수 있다. 그러므로, 본 발명의 다음의 단계들에서 사용되는 것은 일반적으로 여과로부터의 보전액이다.
b) 농축 단계
원칙적으로 목적 폴리펩타이드 조성물의 어떤 농축방법은 본 발명의 b) 단계에서 사용될 수 있다.
그러한 적당한 방법의 예는 한외여과법과 물의 제거에 의한 농축을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
한외여과법
한외여과법은 수압이 분자와 용매가 입자 크기, 또한 값의 차단 크기(cut-off size)로 알려진 기공으로 이루어진 막을 가로지르게 하는데 사용되는 분리방법이다. 더 큰 분자량을 가진 분자들은 막을 통과하지 않기 때문에 막의 차단 값보다 더 작은 분자량을 갖는 분자만이 막을 통과할 수 있으며 이른바 보전액을 형성할 수 있다. 그것에 의해 보전액에 존재하는 분자는 용매가 막을 가로질러 흐르는 것과 같이 농축된다.
특정한 구현예에서 목적 폴리펩타이드를 포함하는 용액 또는 조성물의 농축은 접선 유동 여과(tangential flow filtration, TFF)에 의해 수행될 수 있다. 이 방법은 특히 큰 스케일의 농축, 즉 1 리터로부터 수백 리터에 이르는 부피의 용액의 농축에 유용하다. 그러므로, 이 방법은 특히 산업적 스케일에서 목적 폴리펩타이드의 농축된 용액의 생산에 유용하다.
TFF 기술은 여과된 용액이 단지 막의 기공보다 더 작은 분자만이 막을 통하여 통과할 수 있는 반투과막을 가로질러 흐르도록 하고, 여과액을 형성하고, 더 큰 물질이 모이도록(보유액) 남겨두는 특정한 장치의 사용에 기초한다. TFF 방법과 함께 두개의 다른 압력이 적용되는데; 하나는 용액을 시스템으로 공급하고 용액을 시스템 안에서 순환하도록 하는 것이고(입구 압력), 다른 압력은 작은 분자와 용매가 막을 가로지르게 하는 막에 걸쳐서 적용된다(막 압력). 입구 압력은 전형적으로 1-3 bar 범위, 예를 들어 1.5-2 bar 사이일 수 있다. 막 압력은 전형적으로 1 bar보다 클 수 있다.
TFF가 조성물의 농축에 사용될 때 목적 폴리펩타이드의 농축된 조성물은 보전액으로서 모여질 수 있다.
TFF용으로 유용한 막은 전형적으로 재생된 셀룰로오스 또는 폴리에테르술폰(PES)으로 만들어질 수 있다.
막의 기공 크기는 전형적으로 10,000 Mw 보다 작은, 예를 들어 10-10,000 Mw 범위의 분자량 차단을 가질 수 있다.
다른 구현예에서, 목적 폴리펩타이드를 포함하는 조성물의 농축은 원심분리 장치의 사용에 의해 수행될 수 있다. 이 발명의 원칙은 용액은 막에 대한 원심력의 적용에 의해서 막에 의하여 여과된다는 것이다. 그러한 막은 종종 분자량(Mw) 차단, 즉 막을 통과할 수 있는 화합물의 최대 분자 크기에 의해 특징화되며, 이보다 분자 크기가 더 큰 화합물은 막을 통과할 수 없다. 본 발명에서 사용된 막의 Mw 차단은 특히 30,000 Mw, 예를 들어 10-30,000 Mw 보다 작을 수 있다.
막은 특히 폴리에테르술폰(PES) 또는 재생된 셀룰로오스로 만들어질 수 있다.
그러한 적당한 상업적인 필터 장치의 예는 Centricon Plus-80 또는 Centricon Plus-15일 수 있다.
농축은 전형반적으로 2000-4500 g, 예를 들어 2500-4000 g 사이, 또는 2750-3500 g 사이, 또는 3000-3500 g 사이, 예를 들어 3000 g 또는 3100 g 또는 3200 g 또는 3300 g 또는 3400 g 또는 3500 g에서 수행될 수 있다.
전형적으로 농축은 몇몇 시간 동안, 예를 들면 1시간 이상 동안, 예를 들어 1-10시간 동안 계속될 수 있다.
목적 폴리펩타이드의 안정성에 미치는 어떤 악영향을 최소화하기 위하여, 농축은 특히 2-20 ℃ 범위, 예를 들어 3-15 ℃ 또는 3-10 ℃ 범위 또는 3-6 ℃ 범위에서 수행될 수 있다.
물의 제거에 의한 농축
물의 제거에 의한 농축의 원칙은 전부 또는 대부분의 물이 고체를 얻기 위하여 제거되고, 그리고 나서 그 다음에 먼저 희석 또는 용해되었던 것 보다 적은 물의 부피 내에 이 고체를 희석 또는 용해하는 것이다. 그러나, 원칙적으로 다음에 화합물을 재희석 또는 재용해하는 것 없이 원하는 농도를 얻기 위해서는 단지 필요한 물의 양을 제거하는 것에 의해 수행될 수 있다.
물의 제거에 의한 적당한 농축 방법의 예는 동결건조 또는 증발을 포함한다.
동결건조와 증발 모두에서, 세개의 가장 상응하는 파라미터는 온도, 압력 및 시간이다.
동결건조 방법은 다음의 세개 또는 네개의 단계를 포함할 수 있다; 동결 상태, 첫번째 건조 상태 및 두번째 건조 상태 및 동결 상태 후에 가열냉각(annealing)하는 선택적인 단계. 동결건조는 특히 본 발명의 방법의 추가 단계에서와 같이 포함된 동결건조에 관하여 기술된 것과 같이 수행될 수 있다.
추가 단계
목적 폴리펩타이드는 자연의 근원, 즉 목적 폴리펩타이드를 자연적으로 발현하는 세포로부터 유래할 수 있으며, 또는 특히 발현된 재조합체일 수 있다.
목적 폴리펩타이드가 유래된 곳에 독립적으로, 본 발명의 방법에 실시되기 전에 정제되었을 수 있다.
그러한 “정제”는 특히 세포 파편의 제거, 목적 폴리펩타이드 이외의 다른 단백질의 제거 및 목적 폴리펩타이드가 유래되는 근원에 존재할 수 있는 다른 성분들의 제거를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 그러므로, 본 발명의 특정한 구현예에서 목적 폴리펩타이드를 포함하는 조성물은 목적 폴리펩타이드 이외의 다른 단백질을 5 w/w% 이하, 또는 1 w/w% 이하 또는 0.5 w/w% 이하 또는 0.1 w/w% 이하 또는 0.05 w/w% 이하 또는 0.01 w/w% 이하로 포함한다.
그러므로, 예를 들어 숙주 세포에 의해 발현되는 다른 단백질은 본 발명의 방법에서 사용되기 전에 목적 폴리펩타이드를 포함하는 조성물로부터 제거될 수 있다.
그러므로, 특정한 구현예에서 본 발명의 방법은 a) 단계 이전에 다음 단계들 중 하나 이상을 포함할 수 있다:
ⅰ) 목적 폴리펩타이드의 재조합 발현 단계
ⅱ) 하나 이상의 크로마토그래피 단계에 의한 목적 폴리펩타이드 조성물의 정제 단계
ⅲ) 포뮬레이션 버퍼의 교환 단계.
목적 폴리펩타이드의 재조합 발현은 특히 목적 폴리펩타이드와 관련하여 앞에서 기술된 바와 같이 수행될 수 있다.
만약 목적 폴리펩타이드가 PBGD이면 적당한 유형의 크로마토그래피의 예는 친화 크로마토그래피(affinity chromatography), 이온교환 크로마토그래피(Ion Exchange Chromatography, IEC) 및 하이드록시아파타이트 컬럼(hydroxyapatite column) 위의 크로마토그래피를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 원칙적으로 이들 크로마토그래피 방법의 어떤 조합도 사용될 수 있다. 본 발명의 발명자들은 이전에 PBGD에 대하여서는 적어도 친화 크로마토그래피 단계를 수행하는 것이 유리하며, 만약 이것이 크로마토크래피의 다른 방법 중 어떤 것과 조합된다면 다른 크로마토크래피 단계 이전에 친화 크로마토그래피 단계를 수행하는 것이 유리하다는 것을 발견하였다(국제특허 WO 03/002731 참조).
목적 폴리펩타이드가 PBGD인 구현예에서 상업적으로 이용할 수 있는 친화 크로마토크래피 컬럼은 친화 결합(affinity coupling), 군 특정 친화(group specific affinity), 및 금속 킬레이트 친화(metal chelate affinity) 컬럼을 포함한다.
Amersham Pharmacia Biotech사의 제품 카달로그 2001은 -NH2를 함유하는 고정 리간드(immobilising ligands)를 포함하는 컬럼과 첫번째 아미노산 군을 함유하는 리간드를 포함하는 컬럼과 같은 친화 결합 컬럼의 예를 보여준다.
금속 킬레이트 친화 컬럼은 노출된 히스티딘 군을 가지고 금속 이온 컴플렉스 형성을 경유하여 단백질을 정제하는데 특히 바람직하다. 국제특허 WO 01/07065의 실시예 3은 “His-Tag”을 가진 재조합 인간 포르포빌리노겐 디아미나아제(rhPBGD-His)의 구조를 기술한다. rhPBGD-His를 정제하기 위하여, 코발트 금속 친화 수지를 가진 컬럼과 같은 금속 킬레이트 친화 컬럼을 사용하는 것이 바람직하다.
친화 크로마토그래피의 다른 적당한 방법의 예는 리간드로서 돼지의 헤파린(porcine heparin)을 가진 컬럼 또는 리간드로서 Cibracon Blue 3G으로도 알려진 1-아미노-4-[[4-[[4-클로로-6-[[3 (또는 4)-술포페닐]아미노]-1,3,5-트리아진-2-일]아미노]-3-술포페닐]아미노]-9,10-디하이드로-9,10-디옥소-2-안트라센술폰산을 가진 컬럼 및 리간드 결합 방법으로서 트리아진 결합을 사용하는 방법이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상업적으로 이용할 수 있는 후자의 예는 Amersham Pharmacia Biotech의 Blue Sepharose 6 Fast Flow(FF)이다. 따라서, 본 발명의 바람직한 구현예는 여기에서 기술된, (ⅰ) 단계의 친화 크로마토그래피 컬럼이 리간드 결합 방법으로서 트리아진 결합을 사용하는 컬럼인 공정이고, 보다 바람직하게는 리간드가 Cibacron Blue 3G인 공정이다.
“이온 교환 크로마토그래피(IEC)” 용어는 여기서 당업계에 따라, 정전기에 의하여 특정 pH에서 단백질의 총 전위에 기초하여 컬럼의 전위된 군에 결합하는 단백질과 같은 분자를 분리하는 컬럼으로 이해되어진다. 이온 교환은 용액에서 분실된 다른 이온과의 교환으로 컬럼 위에 하나의 유형의 이온의 흡착을 나타낸다.
적당한 IEC 컬럼의 예는 Q Sepharose 컬럼, Q SP Sepharose 컬럼, 또는 CM Sepharose 컬럼과 같은 컬럼이고, 특히 DEAE Sepharose 컬럼일 수 있다.
적당한 하이드록시아파타이트 컬럼의 예는 세라믹 하이드록시아파타이트 컬럼이다. 하이드록시아파타이트(Ca5(PO4)3OH)2는 단백질, 효소, 핵산, 바이러스, 및 다른 거대 분자의 분리 및 정제에 사용될 수 있는 칼슘 인산염의 형태이다. 세라믹 하이드록시아파타이트는 하이드록시아파타이트의 구형의, 다공성 형태이다. CHT Type Ⅰ(Bio-Rad)는 상업적으로 이용할 수 있는 세라막 하이드록시아파타이트 크로마토그래피 컬럼의 적당한 예이다.
일 구현예에서 본 발명의 방법은 a) 단계 이전에 다음의 단계들을 포함할 수 있다:
ⅰ) PBGD의 재조합 발현 단계
ⅱ) ⅰ) 단계로부터 얻어진 PBGD 조성물을 친화 크로마토그래피시키는 단계
ⅲ) ⅱ) 단계의 PBGD 조성물을 이온교환 크로마토그래피시키는 단계.
다른 구현예에서 본 발명의 방법은 a) 단계 이전에 다음 단계들을 포함할 수 있다:
ⅰ) PBGD의 재조합 발현 단계
ⅱ) ⅰ) 단계로부터 얻어진 PBGD 조성물을 친화 크로마토그래피시키는 단계
ⅲ) ⅱ) 단계로부터 얻어진 PBGD 조성물을 이온교환 크로마토그래피시키는 단계
ⅳ) ⅲ) 단계로부터 얻어진 PBGD 조성물을 하이드록시아파타이트 컬럼시키는 단계.
이러한 방법 모두는 ⅱ) 단계로부터 얻어진 PBGD 조성물의 희석 또는 정용여과 단계를 더 포함할 수 있다. 그러므로 상기 단계는 ⅱ) 단계 후 및 ⅲ) 단계 전, 즉 ⅱa) 단계여야 한다. ⅱa) 단계는 적당한 전도도, 예를 들어 10 mS/㎝ 미만에 대한 염의 농도를 줄이는 목적을 갖는다. 만약 DEAE Sepharose가 이온교환 크로마토그래피 단계, 즉 ⅲ) 단계에서 수지로서 사용된다면, 포획된 PBGD의 DEAE Sepharose 수지로의 결합을 용이하게 할 수 있기 때문에 특히 상응할 수 있다. 희석은 정제된 물을 직접 첨가하거나 또는 정제된 물에 반대하여 한외여과법에 의해 얻어질 수도 있다.
PBGD의 재조합 발현, ⅰ) 단계는 위에서 기술된 방법 중 어떤 것에 의해 수행될 수 있다.
ⅱ) 단계에서 적당한 친화 크로마토그래피 컬럼의 예는 위에서 언급된 것 중 어떤것일 수 있다.
ⅲ) 단계에서 이온교환 크로마토그래피를 수행하는 적당한 방법의 예는 위에서 언급된 것들 중 어떤 것일 수 있다.
ⅳ) 단계에서 적당한 하이드록시아파타이트 크로마토그래피 컬럼의 예는 위에서 언급된 것들 중에서 어떤 것일 수 있다.
특정한 구현예에서 친화 크로마토그래피 컬럼은 리간드 결합 방법과 특히 리간드가 Cibracon Blue 3G인 그러한 방법으로서 트리아진 결합을 사용한 컬럼일 수 있다. 이는 특히 Blue Sepharose 6 Fast Flow 컬럼일 수 있고, 이온 교환 크로마토그래피 컬럼은 DEAE Sepharose 컬럼일 수 있으며, 또한 방법이 ⅳ) 단계를 포함하는 구현예에서 이 컬럼은 특히 세라믹 하이드록시아파타이트 컬럼일 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 방법의 b) 단계 이후에 추가의 단계들을 포함할 수 있다. 그러한 단계는 다음의 하나 이상을 포함하나, 이에 제한되지 않는다:
ㆍ 농축된 목적 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 동결건조
ㆍ 농축된 목적 폴리펩타이드를 포함하는 조성물의 버퍼를 변경
ㆍ 농축된 목적 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 멸균여과
ㆍ 증발
다른 동결건조기, 동결건조되는 용액의 부피 및 다른 파라미터는 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 적당한 동결건조기의 예는, 농축된 목적 폴리펩타이드, 즉 이 경우에는 PBGD를 포함하는 용액이 2 및 6 ㎖ 주입 유리병(Type 1)에 채워지고 고무 마개(클로로부틸)로 마개를 하게 되는, 본 발명의 예에서 사용된 Lyostar(FTM-systems) 동결건조기를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 동결건조는 다음의 세 단계에 의해 수행될 수 있다;
ⅰ) 동결,
ⅱ) 첫번째 건조, 및
ⅲ) 두번째 건조.
ⅰ) 단계 동결은 특히 분당 1 ℃에 의해 온도를 -40 ℃까지 낮추고 -40 ℃에서 30분 동안 유지하기 전에 주변 온도에서 시료를 첫번째 로딩하고 그것을 0 ℃까지 냉각하고 0 ℃에서 30분 동안 유지함에 의해 수행될 수 있다.
ⅱ) 단계 첫번째 건조는 특히 진공 압력 126 mTorr을 끌어당기고, 온도를 분당 1 ℃에 의해 0 ℃ 까지 올리고 시료를 0 ℃에서 360분 동안 유지함에 의해 수행될 수 있다.
ⅲ) 단계 두번째 건조는 특히 완전 진공(full vacuum)으로 만듦과 동시에 온도를 분당 0.5 ℃에 의해 +30 ℃까지 올리고 시료를 +30 ℃에서 360분 동안 유지함에 의해 수행될 수 있다.
두번째 건조 후에 시료는 추가로 진공 하에서 완료되거나 또는 질소로 채운 후에 완료될 수 있다.
적당한 동결건조 방법의 예는 본 발명의 실시예에서 기술된 방법을 포함한다.
또 다른 구현예에서 동결건조는 첫번째 건조 상태 이전에 가열냉각 단계를 포함할 수 있다. 본 발명의 발명자들은 동결건조 방법에서 가열냉각 단계의 포함은 크랙(crack)이 줄어듦으로써 시각적인 외관을 개선하고, 및/또는 가열냉각 단계 없이 동일한 동결건조 방법을 사용하였을 때와 비교하여 동결건조된 생산물의 재구성 시간이 짧아지게 된다는 것을 발견하였다. 동결건조된 생산물의 재구성을 위한 시간이 줄어드는 것은, 특히 용액으로서 투여되는 제약으로서 사용된다면 유리하다. 개선된 시각적인 외관은 또한 대개 대부분의 생산물에 대하여 유리한 것으로 간주된다.
그러므로, 동결건조는 다음 단계들을 포함할 수 있다:
ⅰ) 동결
ⅱ) 가열냉각
ⅲ) 첫번째 건조
ⅳ) 두번째 건조.
동결, 첫번째 건조 및 두번째 건조 단계는 특히 위에서 기술된 바와 같이 수행될 수 있다. 가열냉각 단계, 즉 ⅱ) 단계는 특히 동결의 30분 후에, 온도를 예를 들어 분당 2 ℃의 속도로 -10 또는 -20 ℃까지 올리고 이 온도를 120 또는 420분 동안 유지하고, 그 다음에 온도를 예를 들어 첫번째 건조 단계를 시작하기 전에 시료가 60-90분 동안 유지될 수 있는 온도인 -40 ℃까지 분당 2 ℃의 속도로 낮춰줌으로써 수행될 수 있다.
농축된 목적 폴리펩타이드를 포함하는 조성물의 버퍼의 변경은 특히 a) 버퍼 또는 포뮬레이션에서 농축된 목적 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 예를 들어 5-15회 희석, b) 희석된 조성물을 다시 농축, 및 상기 단계가 수행된 후에 이들 단계 전에 조성물에 존재하는 버퍼 또는 포뮬레이션의 첨가제의 양이 상기 조성물에 존재하는 버퍼 또는 포뮬레이션의 첨가제의 예를 들어 5 v/v% 이하 또는 1 v/v% 이하를 구성하도록 하기 위하여 a) 및 b) 단계를 충분한 횟수 만큼 수행하는 것에 의해 수행될 수 있다.
특히 본 발명의 b) 단계로부터 얻어진 목적 폴리펩타이드를 포함하는 조성물은 특히 상기 조성물의 멸균여과 단계 및/또는 조성물의 동결견조 단계를 더 포함할 수 있다.
멸균여과는 일반적으로 0.22 ㎛ 또는 0.20 ㎛의 기공 크기를 갖는 필터를 통하여 조성물을 여과함에 의해 수행된다. 동결건조는 특히 위에서 기술된 바와 같이 수행될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 얻어진 동결건조된 조성물에 관한 것이다.
피하주사(Subcutaneous injection)
본 발명은 또한 50-300 ㎎/㎖ 범위의 목적 폴리펩타이드를 포함하는 조성물의 포유동물에게 피하주사하기 위한 약의 제조용 용도에 관한 것이다.
목적 폴리펩타이드는 PBGD, 아릴설파타아제 A, 리소조멀 알파-만노시다아제 및 갈락토세르브로시다아제를 포함하나, 이에 제한되지 않는 본 발명에 따른 목적 폴리펩타이드 중 어떤 것일 수 있다.
용어 피하는 주로 s.c.로 단축되고 두 용어는 본 발명의 문맥에서 호환성있게 사용될 수 있다.
주사가 피하적으로 수행될 때, 생리학적인 제약 때문에 1.5 ㎖ 이상 주사하는 것은 대개 불가능하였다.
환자는 대개 특정한 양의 특정 목적 폴리펩타이드를 필요로 하는 것과 같이 환자에게 투여되는데 필요한 목적 폴리펩타이드를 포함하는 조성물의 부피와 상기 조성물에서 목적 폴리펩타이드의 농도 간에는 상호관련이 있다.
그러므로 목적 폴리펩타이드를 포함하는 조성물은 높은 농도의 목적 폴리펩타이드를 포함한다는 것과 목적 폴리펩타이드의 이러한 높은 농도는 다량의 폴리펩타이드 집합체의 형성이 없이도 얻어질 수 있다는 것은 본 발명의 이점이다. 그러한 농축된 목적 폴리펩타이드 조성물의 사용은 더 적은 부피의 상기 조성물을 주사할 수 있게 만들고, 동시에 환자가 충분한 양의 목적 폴리펩타이드를 받는 것을 보증하므로; 목적 폴리펩타이드를 피하적으로 투여하는 것을 쉽게 만든다.
목적 폴리펩타이드를 포함하는 위에서 언급된 조성물은 특히 목적 폴리펩타이드를 75-250 ㎖/㎎ 사이, 예를 들어 75-200 ㎖/㎎ 사이 또는 75-150 ㎖/㎎ 사이 또는 100-150 ㎖/㎎ 사이 또는 100-125 ㎖/㎎ 사이 또는 125-150 ㎖/㎎ 사이로 포함한다.
위에서 기술된 바와 같이, 환자가 충분한 양의 목적 폴리펩타이드를 받는다는 것을 보증하기 위하여 환자에게 주사하는데 필요한 목적 폴리펩타이드를 포함하는 조성물의 부피는 상기된 조성물의 목적 폴리펩타이드의 농도와 상호관련있다.
그러므로 그러한 조성물의 부피는 일반적으로 조성물의 목적 폴리펩타이드의 농도에 따라 조절될 것이다. 그러나, 부피는 일반적으로 0.1-1.5 ㎖ 범위, 예를 들어 0.1-1.5 ㎖ 범위 또는 0.5-1.5 ㎖ 범위 또는 0.5-1.5 ㎖ 범위 또는 0.75-1.5 ㎖ 범위 또는 0.75-1.5 ㎖ 범위 또는 1-1.5 ㎖ 범위 또는 1-1.5 ㎖ 범위일 수 있다.
환자에게 투여하는데 상응하는 목적 폴리펩타이드의 양은 일반적으로 개인의 무게와 특정 목적 폴리펩타이드에 의존한다.
일 구현예에서 본 발명은 PBGD 50-300 ㎎/㎖의 조성물의 피하주사를 포함하는 포유동물의 급성 간헐성 포르피리아(Acute Intermittent Porphyria)의 치료방법에 관한 것이다.
PBGD의 투여는 특히 급성 간헐성 포르피리아의 치료에 유용할 수 있다. 그러나, PBGD의 투여는 또한 유전성 코프로포르피리아(hereditary coproporphyria) 또는 반문상 포르피리아(variegata porphyria)와 같은 다른 포르피리아의 치료에 유용하다는 것이 예상된다. 포리피리아는 햄 생합성 경로에서 다른 결핍에 의해 야기되는 많은 질병을 집합적으로 기술하는데 사용되는 용어이다. 그러므로, 예를 들어 다른 치료학과의 조합에서, 어떤 유형의 포르피리아로 괴로워하는 환자에게의 PBGD의 투여는 경로 내에서 다른 중간체들의 전반적인 변경을 증가시키도록 도울 수 있다. 예를 들어, Meissner PN et al., 1986, European Journal of Clinical Investigation, vol. 16, 257-261; Hift RJ et al., 1997, S. Afr. Med. J., vol. 87, 718-27과 Meissner P et al., 1993, J. Clin. Invest., vol. 91, 1436-44는 유전성 코프로포르피리아와 반문상 포르피리아에서 ALA와 PBG의 축적을 기술하고 있다. 이러한 질병에서 ALA와 PBG의 축적은, 각각 ALA에서 PBG의 변환을 형성하는 네번째 및 다선번째 아랫단계에 위치한 효소 결함으로부터 유래하고, 두 개의 가장 최근의 논문에서 반문상 포르피리아를 가진 환자에게 축적되는 포르피리노겐이 PBG-디아미나아제를 억제할 수 있는 방법이 기술되어 있다.
다른 구현예에서 본 발명은 50-300 ㎎/㎖의 아릴설파타아제 A의 조성물의 피하주사를 포함하는 포유동물의 이염색성 백질이영양증(metachromatic leukodystrophy)의 치료방법에 관한 것이다.
이염색성 백질이영양증(MLD)은 리소조멀 효소 아릴설파타아제 A(ASA)의 상염색체 열성의 유전적 결함(autosomal recessive genetic defect)에 의해 야기되며, 미엘린초(myelin sheath) 막의 점진적인 파손(탈미엘린화(demyelination))과 중추신경계(CNS)와 말초신경계 모두의 백질에서 갈록토실 설파타이드(세레브로사이드 설페이트)의 축적을 유발한다. 조직 제조에서, 갈락토실 설파타이드는 이염색성 백질적으로 훼손된 구형의 과립의 큰 덩어리를 형성한다. 갈락토실 설파타이드는 또한 신장, 쓸개, 및 특정한 다른 내장기관 내에서 축적되고 소변에서 과량으로 방출된다.
갈락토실 설파타이드는 리소조멀 효소 아릴설파타아제 A(EC 3.1.6.8)(Austin et al. Biochem J. 1964, 93, 15C-17C)와 사포신 B(saposin B)로 불리는 스핀고리피드 활성인자(sphingolipid activator) 단백질의 조합된 작용을 통하여 갈락토세레브로사이드를 형성하는 3-O-설페이트 결합의 가수분해에 의해 정상적으로 물질대사된다. 아릴설파타아제 A의 심한 결핍은 MLD 상태의 유아기 후기, 소년기 및 성인 환자로부터의 모든 조직에서 나타난다(아래 참조). 다음에서, 아릴설파타아제 A 단백질은 “ASA”로 불리울 것이다. ASA의 심한 결핍은 MLD를 가진 환자로부터의 모든 조직에서 일어난다.
또 다른 구현예에서 본 발명은 50-300 ㎎/㎖의 리소조멀 알파-만노시다아제의 조성물의 피하주사를 포함하는 포유동물의 리소좀 저장 장애 알파-만노시도시스(lysosomal storage disorder alpha-mannosidos)의 치료방법에 관한 것이다.
알파-만노시도시스는 1/1,000,000 및 1/500/000 사이의 빈도로 세계적으로 일어나는 열성의, 상염색체성 질병이다. 만노시도시스는 유럽, 미국, 아프리카 및 또한 아시아의 모든 인종 군에서 발견된다. 리소조 저장 장애에 대한 좋은 진단 서비스를 가진 모든 나라에서 유사한 빈도로 검출된다. 그들은 외관상으로는 건강하게 태어나나 질병의 징후는 점진적이다. 알파-만노시도시스는 매우 심각한 것으로부터 매우 순한 형태에 이르는 임상의 이질성을 나타낸다. 전형적인 임상의 징후는 정신지체, 골격의 변화, 재발하는 감염을 유발하는 손상된 면역체계, 청각장애이고, 종종 질병은 조악한 얼굴, 두드러진 이마, 납작한 콧등, 작은 코, 및 넓은 입과 같은 전형적인 얼굴의 특성과 관련된다. 대부분의 심각한 경우(만노시도시스 type Ⅰ)에 어린이는 간비종대(hepatosplenomegaly)로 괴로워하고, 그들은 생애의 첫해동안 죽는다. 아마도 이러한 이른 죽음은 질병에 의해 야기되는 면역결여(immunodeficiency)에 의한 심각한 감염에 의해 야기된다. 더 순한 경우(만노시도시스 type Ⅱ)에 환자들은 대개 성인 나이에 도달한다. 환자의 골격의 약함은 20-40세에 휠체어의 필요를 유발한다. 질병은 종종 단순한 읽고 쓰기의 가장 기본적인 기술을 제외한 어떤 것도 배제하는 약한 정신의 행동을 가져오는 두뇌의 확산 기능장애(diffuse dysfunction)를 유발한다. 청각 무력함과 다른 임상의 표시들과 연관된 이러한 문제들은 독립적인 생애로부터 환자들을 방해하고, 그 결과 생애의 오랜 관리가 필요하게 된다.
또 다른 구현예에서 본 발명은 50-300 ㎎/㎖의 갈락토실세레브로시다아제의 조성물의 피하주사를 포함하는 포유동물의 크라베병(Krabbe disease)의 치료방법에 관한 것이다.
인간에게 GALC 효소의 결핍은 크라베병 또는 구형체 세포 백질이영양증(globoid cell leukodystrophy)으로 알려진 상염색체의 유전된 유전자의 리소조멀 저장 질병을 유발한다. 효소는 일반적으로 인류의 고환, 신장, 태반, 간 및 뇌에서 발현되고, GALC 효소의 결핍은 일반적으로 미엘린 물질대사와 중추 및 말초신경계(각각 CNS 및 PNS)의 장애를 유발한다.
크라베병은 나이, 국적 및 성별에 관계 없이 인간에게 관찰되어왔다.
본 발명의 일 측면에서 기술된 구현예 및 특징은 또한 발명의 다른 측면에 적용한다는 것을 나타내었다. 특히, 예를 들어 추가의 화합물의 존재, 버퍼 및 pH와 같이, 목적 폴리펩타이드를 포함하는 조성물에 대하여 기술된 모든 구현예들은 또한 본 응용에 사용된 목적 폴리펩타이드를 포함하는 조성물에 적용한다.
본 발명에 따른 대상 또는 이것의 형태 중 하나 또는 특성이 남다른 것으로 나타났을 때, 이는 또한 복수의 대상 또는 그것의 형태 또는 특성을 나타낸다. 예로서, “폴리펩타이드”로 나타낼 때, 그것은 하나 이상의 폴리펩타이드를 나타내는 것으로 이해된다.
본 명세서 전반에 걸쳐 “포함한다” 단어, 또는 “포함한다” 또는 “포함하는”과 같은 어미변화는 어떤 다른 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소들의 군, 정수 또는 단계들을 제외하고는 진술된 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소들의 군, 정수들 또는 단계들의 포함을 암시하는 것으로 이해될 것이다.
본 명세서에서 인용된 모든 특허와 특허가 아닌 참고문헌은 이로써 그들의 전체에서 참고문헌에 의해 통합된다.
다음의 제한되지 않는 실시예에 따라 발명은 더 상세하게 기술될 것이다.
물질
rhPBGD
다음의 실험예에서 사용된 rhPBGD는 Ⅳ 단계, 즉 세라믹 하이드록시아파타이트 크로마토그래피 단계를 포함하는 공정인, 국제특허 WO 03/002731의 실시예 1의 공정 2에 따라서 얻어졌다.
포뮬레이션 버퍼
재조합 및 정제된 rhPBGD는 다음의 수용성의 포뮬레이션 버퍼에 존재하였다:
3.67 mM Na2HPO4
27 mM 글라이신
250 mM 만니톨
및 pH 7.9
포뮬레이션 버퍼는 그 다음에 0.22 ㎛ 필터를 통하여 멸균여과되었다.
방법
동결건조
정제된 rhPBGD 용액의 동결건조는 다음의 스케쥴에 따라 Lyostar(FTM-systems) 동결건조기에서 수행되었다.
동결 상태 0 ℃ 30분 760 Torr
0 ℃ - -40 ℃ 1℃/분 760 Torr
-40 ℃ 30분 760 Torr
첫번째 건조 -40 ℃- 0 ℃ 1℃/분 169 mTorr
0 ℃ 240분 169 mTorr
두번째 건조 0 ℃ - 30 ℃ 10℃/60분, 180분 20 mTorr
30 ℃ 720분 20 mTorr
시각적 관찰(투명도와 색상)
액체는 아래의 계획에 따라 색상, 투명도 및 침전에 관하여 시각적으로 관찰되었다.
색상: 1: 색 없음; 2: 약간 노란색; 3: 노란색
투명도: 1: 투명; 2: 약간 흐림; 3: 흐림
다른 주의: 관찰자로부터의 다른 관찰은 여기에 포함된 몇몇의 사례(예를 들어, 침전, 불용성 물질 등)에 있었다.
pH-측정
pH-미터(Metrohm 691 pH Meter)와 전극(조합된 LL pH 전극)은 3 표준의 참조 용액(Merck)을 가지고 4.00-9.00 범위로 조정되었다. 액체는 최종적으로 분석되었다.
단백질 농도
추출물, 제조 공정의 시료, 대량의 약 물질 및 최종 생산물에서의 단백질 농도는 알칼리 매질에서 단백질에 의한 Cu2+의 Cu+로의 환원 원칙을 이용하는 방법(Biuret 반응)에 의해 결정되었다. 그 다음에 Cu+ 이온은 고도로 민감하고 선택적인 색도 검출을 초래하는 비신코닌산(bicinchoninic acid)을 함유하는 시약과 반응되었다.
순도
재조합 인간 포르포빌리노겐 디아미나아제(rhPBGD)와 rhPBGD 변이체는 유동상태에서 유기 변이자(아세토니트릴)의 백분율에 의존하는 실리카 주원료의 고정 담체에 흡착능 및 제거능에 따라 분리되었다.
rhPBGD 활성
포르포빌리노겐 디아미나아제(PBGD)는 효소로부터 방출되고 생채 내에서 우로포르피리노겐 Ⅲ 신타아제(uroporphyrinogen III synthase)의 작용에 의해 우로포르피리노겐 Ⅲ을 원형으로 만드는, 선형 사량체, 프레우로포르피리노겐(preuroporphyrinogen)을 형성하기 위하여 4개의 포르포빌리노겐(PBG) 분자의 첨가를 촉진시킨다. 프레우로포르피리노겐은 405 ㎚에서 빛을 흡수하는 우로포르피린을 형성하기 위하여 벤조퀴논과 화학적으로 산화될 수 있다. 분석은 각각의 시험 경우에 하나의 단일 바이알에서 수행되었다. rhPBGD 활성과 단백질 농도의 결정을 위하여 시험은 각각의 바이알에 대하여 각각 이중 및 삼중으로 수행되었다.
삼투성(osmolality)
동결건조된 rhPBGD의 한 바이알은 1.00 ㎖의 밀리Q-수(MilliQ-water)에 다시 부유되었다. 냉동한 rhPBGD 수용액 바이알은 해동되었다. 삼투압계(Vapro osmometer)는 3 표준 수용액으로 100-1000 mOsm/㎏(100, 290, 1000 mOsm/㎏) 범위로 조정되었다. 그 다음에 액체는 분석되었다.
실시예 1
원심분리 여과 장치를 사용한 농축
냉동된 PBGD 대량 용액(7 ㎎/㎖ rhPBGD, 3.67 mM Na2HPO4, 27 mM 글라이신, 250 mM 만니톨, pH 7.9)은 20 ℃의 항온 수조(water-bath)에서 해동되었고, 3200 g에서 10분 동안 원심분리 되었고, 그 후에 0.2 ㎛의 PES 필터(Nalgene Polyethersulfone filters)에 의해 멸균여과되었다. PBGD 대량 용액은 원심분리 여과 장치 Centricon Plus-80(Mw cut-off 30000)과 Centricon Plus-15 (Mw cut-off 30000)를 3200 g에서 몇 시간 동안 운행함에 의해 100 ㎎/㎖로 농축되었다. 농축된 용액, 즉 보전액은 0.22 ㎛ 필터(Millex GV)에 의해 멸균여과되었으며, 최종적으로 이 용액의 일부는 멸균 포뮬레이션 버퍼로 50 ㎎/㎖가 되도록 희석되었다. 5 ㎎/㎖의 용액은 재조합체와 정제된 rhPBGD를 멸균 포뮬레이션 버퍼와 직접 희석함으로써 제조되었다.
그 다음에 상기에서 기술된 바와 같이 5 ㎎/㎖, 50 ㎎/㎖ 및 100 ㎎/㎖ rhPBGD는 동결건조되었다. 상기에서 기술된 동결건조된 5, 50 및 100 ㎎/㎖ rhPBGD를 용액과 수용성의 5 ㎎/㎖ rhPBGD 용액의 몇몇의 바이알(vial)은 40℃±2℃, 75%±5%의 상대습도(RH)에서 저장되었다. 바이알들은 잘 밀폐된 두번째 포장(종이 박스)에서 빛으로부터 보호되어 저장되었다.
표시된 시점(즉, 저장시간)에 각각의 동결건조된 시료의 바이알은 1.00 ㎖의 밀리포아수(Millipore water)에 재현탁되었다.
재현탁된 각각의 바이알과 rhPBGD의 방수 바이알은 그 다음에 색상, 투명도 및 침전과 관련하여 시각적으로 관찰되었고, pH, 단백질 농도, 순도 및 rhPBGD 활성은 위에서 기술된 바와 같이 측정되었다.
결과는 다음의 표 1-4에 나타내었다:
동결건조된 생산물, 5 ㎎/㎖
시점(개월) 활성(U/㎖) 농도(㎎/㎖) 특정 활성(U/㎎) 순도(%) 시각적 관찰
0 93.2 4.3 21.5 99.6 색상: 1, 투명도: 1
0.5 81.0 5.2 15.6 ND 색상: 1, 투명도: 1
1 76.6 5.9 13.1 99.9 색상: 1, 투명도: 1
1.5 87.0 5.5 15.9 99.7 색상: 1, 투명도: 1
2 53.3 4.7 11.4 99.6 색상: 1, 투명도: 1
3 50.8 4.8 10.7 99.6 색상: 1, 투명도: 1
6 34.3 5.3 6.5 99.6 색상: 1, 투명도: 1
동결건조된 생산물; 50 ㎎/㎖
시점(개월) 활성(U/㎖) 농도(㎎/㎖) 특정 활성(U/㎎) 순도(%) 시각적 관찰
0 888 41.4 21.5 99.1 색상: 2, 투명도: 1
0.5 842 50.6 16.6 ND 색상: 2, 투명도: 1
1 746 50.6 14.8 100 색상: 2, 투명도: 1
2 640 52.9 12.1 100 색상: 2, 투명도: 1
3 634 49.0 12.9 100 색상: 2, 투명도: 1
6 422 43.0 9.8 100 색상: 2, 투명도: 1
동결건조된 생산물; 100 ㎎/㎖
시점(개월) 활성(U/㎖) 농도(㎎/㎖) 특정 활성(U/㎎) 순도(%) 시각적 관찰
0 1944 83.7 23.2 99.1 색상: 3, 투명도: 1
1 1470 98.7 14.9 100 색상: 3, 투명도: 1
2 1282 94.8 13.5 100 색상: 3, 투명도: 1
3 1253 82.6 15.2 100 색상: 3, 투명도: 1
6 739 75.5 9.8 100 색상: 3, 투명도: 1
수용성 생산물; 5 ㎎/㎖
시점(개월) 활성(U/㎖) 농도(㎎/㎖) 특정 활성(U/㎎) 순도(%) 시각적 관찰
0 95.6 4.0 23.7 99.1 색상: 1, 투명도: 1
0.5 48.1 5.4 8.9 ND 색상: 1, 투명도: 1
1 28.6 5.9 4.8 96.1 색상: 1, 투명도: 1
1.5 12.3 5.6 2.2 91.4 색상: 1, 투명도: 1
2 4.5 4.4 1.0 90.7 색상: 1, 투명도: 1
3 7.1 3.1 2.3 87.3 색상: 2, 투명도: 2
6 4.4 2.1 2.1 58.1 색상: 2, 투명도: 2
실시예 2
원심분리 여과 장치에 의한 rhPBGD 조성물의 농축
냉동된 PBGD 대량 용액(7 ㎎/㎖ rhPBGD, 3.67 mM Na2HPO4, 27 mM 글라이신, 250 mM 만니톨, pH 7.9)은 20 ℃의 항온 수조(water-bath)에서 해동되었고, 3200 g에서 10분 동안 원심분리 되었고, 그 후에 0.2 ㎛의 PES 필터(Nalgene Polyethersulfone filters)에 의해 멸균여과되었다. PBGD 대량 용액은 원심분리 여과 장치 Centricon Plus-80(Mw cut-off 30000)과 Centricon Plus-15 (Mw cut-off 30000)를 3200 g에서 몇 시간 동안 운행함에 의해 100 ㎎/㎖로 농축되었다. 농축된 용액, 즉 보전액은 0.22 ㎛ 필터(Millex GV)에 의해 멸균여과되었으며 더 낮은 농도의 용액을 얻기 위하여 멸균여과된 포뮬레이션 버퍼(위 참조)로 희석되었다. 각 농도의 부피에서 단편은 위에서 기술된 바와 같이 동결건조 되었다.
동결건조된 rhPBGD와 rhPBGD 수용액의 다른 농도는 5℃±3℃ 또는 -20℃±5℃(주변의 상대습도(RH))에서 저장되었다. 모든 바이알들은 잘 밀폐된 두번째 포장(종이 박스)에서 빛으로부터 보호되어 저장되었다.
표시된 시점(즉, 저장시간)에서 각각의 동결건조된 시료의 바이알은 1.00 ㎖의 밀리포아수에 다시 부유되었고, 그 후에 rhPBGD 수용액과 함께 색상, 투명도 및 침전을 시각적으로 관찰하고 pH, 단백질 농도, 순도, 삼투성 및 rhPBGD 활성을 측정함에 의해 시험되었다.
결과는 다음의 표 5-19에 나타내었다:
수용성 생산물; 11 ㎎/㎖; 저장 온도: +5℃
시점 (개월) 단백질 농도 (㎎/㎖) 활성 (U/㎖) 특정 활성 (U/㎎) 순도(%) pH 삼투성 (mOsm/㎏) 시각적 관찰 색상 1-3 투명도 1-3 용액 집합체
0 10.9 255.0 23.4 100.0 7.80 290 색상: 2
투명도: 1
투명
없음/거의 없음
1 9.5 216.8 22.8 100.0 7.81 305 색상: 2
투명도: 1
투명
없음/거의 없음
2 10.9 230.2 21.1 98.0 7.80 300 색상: 2
투명도: 1
투명
없음/거의 없음
3 11.2 226.6 20.2 100.0 7.76 290 색상: 2
투명도: 1
투명
거의 없음
6 14.7 271.1 18.4 100.0 7.77 300 색상: 2
투명도: 1
투명
몇개 있음
수용성 생산물: 11 ㎎/㎖; 저장 온도: -20℃
시점 (개월) 단백질 농도 (㎎/㎖) 활성 (U/㎖) 특정 활성 (U/㎎) 순도(%) pH 삼투성 (mOsm/㎏) 시각적 관찰 색상 1-3 투명도 1-3 용액 집합체
0 10.4 236.1 22.6 100 7.80 290 색상: 2
투명도: 1
투명
없음
1 11.7 270.3 23.1 100 7.81 302 색상: 2
투명도: 1
투명
없음
2 ND ND ND ND ND ND ND
3 12.4 247.7 20.0 100 7.77 288 색상: 2
투명도: 1
투명
없음
6 13.4 291.5 21.8 100 7.77 301 색상: 2
투명도: 1
투명
없음
동결건조된 생산물, 11 ㎎/㎖; 저장 온도: +5℃
시점 (개월) 단백질 농도 (㎎/㎖) 활성 (U/㎖) 특정 활성 (U/㎎) 순도(%) pH 삼투성 (mOsm/㎏) 시각적 관찰 색상 1-3; 투명도 1-3; 용액; 집합체
0 10.9 230.0 21.2 100.0 7.80 290 색상: 2
투명도: 1
투명
없음
1 ND ND ND ND ND ND ND
2 ND ND ND ND ND ND ND
3 13.3 269.3 20.2 100.0 7.74 282 색상: 2
투명도: 1
투명
없음
6 14.7 237.9 16.2 100.0 7.76 290 색상: 2
투명도: 1
투명
없음
수용성 생산물, 17 ㎎/㎖; 저장 온도: +5℃
시점 (개월) 단백질 농도 (㎎/㎖) 활성 (U/㎖) 특정 활성 (U/㎎) 순도(%) pH 삼투성 (mOsm/㎏) 시각적 관찰 색상 1-3 투명도 1-3 용액 집합체
0 18.0 471.0 26.1 100.0 7.80 298 색상: 2
투명도: 1
투명
없음/거의 없음
1 17.5 360.4 20.6 100.0 7.81 311 색상: 2
투명도: 1
투명
없음/거의 없음
2 18.3 397.0 21.7 100.0 7.83 302 색상: 2
투명도: 1
투명
없음/거의 없음
3 16.6 376.5 22.7 100.0 7.77 294 색상: 2
투명도: 1
투명
거의 없음
6 16.0 257.3 16.1 100.0 7.76 305 색상: 2
투명도: 1
투명
몇개 있음
수용성 생산물, 17 ㎎/㎖; 저장 온도: -20℃
시점 (개월) 단백질 농도 (㎎/㎖) 활성 (U/㎖) 특정 활성 (U/㎎) 순도(%) pH 삼투성 (mOsm/㎏) 시각적 관찰 색상 1-3 투명도 1-3 용액 집합체
0 17.9 411.6 23.0 100.0 7.80 298 색상: 2
투명도: 1
투명
없음
1 17.4 439.5 25.3 100.0 7.80 310 색상: 2
투명도: 1
투명
없음
2 ND ND ND ND ND ND ND
3 16.4 389.4 23.7 100.0 7.77 292 색상: 2
투명도: 1
투명
없음
6 18.0 373.8 20.8 100.0 7.76 305 색상: 2
투명도: 1
투명
없음
동결건조된 생산물, 17 ㎎/㎖; 저장 온도: 5℃
시점 (개월) 단백질 농도 (㎎/㎖) 활성 (U/㎖) 특정 활성 (U/㎎) 순도(%) pH 삼투성 (mOsm/㎏) 시각적 관찰 색상 1-3 투명도 1-3 용액 집합체
0 16.9 380.1 22.5 100.0 7.80 298 색상: 2
투명도: 1
투명
없음
1 ND ND ND ND ND ND ND
2 ND ND ND ND ND ND ND
3 15.6 391.9 25.1 100.0 7.76 285 색상: 2
투명도: 1
투명
없음
6 16.6 341.3 20.6 100.0 7.75 297 색상: 2
투명도: 1
투명
없음
수용성 생산물; 36 ㎎/㎖; 저장 온도: +5℃
시점 (개월) 단백질 농도 (㎎/㎖) 활성 (U/㎖) 특정 활성 (U/㎎) 순도(%) pH 삼투성 (mOsm/㎏) 시각적 관찰 색상 1-3 투명도 1-3 용액 집합체
0 36.0 844.4 23.4 100.0 7.81 305 색상: 2
투명도: 1
투명
없음/거의 없음
1 35.5 778.1 21.9 100.0 7.82 314 색상: 2
투명도: 1
투명
없음/거의 없음
2 35.4 798.5 22.6 100.0 7.81 310 색상: 2
투명도: 1
투명
없음/거의 없음
3 28.9 687.9 23.8 100.0 7.77 303 색상: 2
투명도: 1
투명
거의 없음
6 37.2 537.3 14.4 100.0 7.77 312 색상: 2
투명도: 1
투명
몇개 있음
수용성 생산물; 36 ㎎/㎖; 저장 온도: -20℃
시점 (개월) 단백질 농도 (㎎/㎖) 활성 (U/㎖) 특정 활성 (U/㎎) 순도(%) pH 삼투성 (mOsm/㎏) 시각적 관찰 색상 1-3 투명도 1-3 용액 집합체
0 34.0 853.4 25.1 100.0 7.81 305 색상: 2
투명도: 1
투명
없음
1 38.0 853.6 22.5 100.0 7.83 321 색상: 2
투명도: 1
투명
없음
2 ND ND ND ND ND ND ND
3 31.6 776.3 24.6 100.0 7.76 299 색상: 2
투명도: 1
투명
없음
6 30.6 543.8 17.8 100.0 7.75 311 색상: 2
투명도: 1
투명
없음
동결건조된 생산물, 36 ㎎/㎖; 저장 온도: 5℃
시점 (개월) 단백질 농도 (㎎/㎖) 활성 (U/㎖) 특정 활성 (U/㎎) 순도(%) pH 삼투성 (mOsm/㎏) 시각적 관찰 색상 1-3 투명도 1-3 용액 집합체
0 29.5 657.0 22.3 100.0 7.81 305 색상: 2
투명도: 1
투명
없음
1 ND ND ND ND ND ND ND
2 ND ND ND ND ND ND ND
3 28.7 747.6 26.0 100.0 7.75 290 색상: 2
투명도: 1
투명
없음
6 29.8 579.3 19.4 100.0 7.76 300 색상: 2
투명도: 1
투명
없음
수용성 생산물, 50 ㎎/㎖; 저장 온도: 5℃
시점 (개월) 단백질 농도 (㎎/㎖) 활성 (U/㎖) 특정 활성 (U/㎎) 순도(%) pH 삼투성 (mOsm/㎏) 시각적 관찰 색상 1-3 투명도 1-3 용액 집합체
0 46.2 780.9 16.9 96.3 7.59 317 색상: 3
투명도: 1
약간 유백색
없음
1 47.9 915 19.1 90 7.58 305 색상: 3
투명도: 1
약간 유백색
없음
2 47.2 898.3 19.0 100 7.60 318 색상: 3
투명도: 1
약간 유백색
없음
3 60.8 1102.6 18.1 100 7.72 314 색상: 3
투명도: 1
투명
없음
6 62.5 902.8 14.4 100 7.60 331 색상: 3
투명도: 2
투명
없음
9 41.7 618.5 14.8 100 7.60 336 색상: 3
투명도: 2
투명
없음
12 50.2 540.8 10.8 97.5 7.60 329 색상: 3
투명도: 2
투명
없음
수용성 생산물, 50 ㎎/㎖; 저장 온도: -20℃
시점 (개월) 단백질 농도 (㎎/㎖) 활성 (U/㎖) 특정 활성 (U/㎎) 순도(%) pH 삼투성 (mOsm/㎏) 시각적 관찰 색상 1-3 투명도 1-3 용액 집합체
0 46.2 780.9 16.9 96.3 7.59 317 색상: 3
투명도: 1
약간 유백색
없음
1 47.2 899.1 19.0 93.7 7.58 313 색상: 3
투명도: 1
약간 유백색
없음
2 53 1222.7 23.1 100.0 7.60 315 색상: 3
투명도: 1
약간 유백색
없음
3 61.2 1336.2 21.8 100.0 7.75 320 색상: 3
투명도: 1
약간 유백색
없음
6 52.2 1001.3 19.2 100.0 7.60 321 색상: 3
투명도: 1
약간 유백색
없음
12 50.4 887.9 17.6 100.0 7.60 320 색상: 3
투명도: 1
약간 유백색
없음
동결건조된 생산물, 50 ㎎/㎖; 저장 온도: 5℃
시점 (개월) 단백질 농도 (㎎/㎖) 활성 (U/㎖) 특정 활성 (U/㎎) 순도(%) pH 삼투성 (mOsm/㎏) 시각적 관찰 색상 1-3 투명도 1-3 케이크/용액 집합체
0 42.7 759.4 17.8 100.0 7.58 292 색상: 3
투명도: 1
케이크: 노란색, 몇개의 크랙 용액: 투명
없음
1 42.6 840.4 19.7 63.1 7.58 293 색상: 3
투명도: 1
케이크: 노란색, 몇개의 크랙 용액: 투명
없음
2 42.1 937.0 22.3 100.0 7.60 292 색상: 3
투명도: 1
케이크: 노란색, 몇개의 크랙 용액: 투명
없음
3 47.4 1014.7 21.4 100.0 7.75 291 색상: 3
투명도: 1
케이크: 노란색, 몇개의 크랙 용액: 투명
없음
6 49.0 876.5 17.9 100.0 7.60 304 색상: 3
투명도: 1
케이크: 노란색, 몇개의 크랙 용액: 투명
없음
12 51.3 945.0 18.4 100.0 7.60 308 색상: 3
투명도: 1
케이크: 노란색, 몇개의 크랙 용액: 투명
없음
수용성 생산물, 100 ㎎/㎖; 저장 온도: 5℃
시점 (개월) 단백질 농도 (㎎/㎖) 활성 (U/㎖) 특정 활성 (U/㎎) 순도(%) pH 삼투성 (mOsm/㎏) 시각적 관찰 색상 1-3 투명도 1-3 용액 집합체
0 81.8 1705.7 20.9 99.9 7.60 350 색상: 3
투명도: 1
약간 유백색
없음
1 85.9 1942.4 22.6 96.9 7.55 352 색상: 3
투명도: 1
약간 유백색
없음
2 95.7 1690.8 17.7 96.9 7.65 357 색상: 3
투명도: 1
약간 유백색
없음
3 104.3 1671.2 16.0 100.0 7.65 350 색상: 3
투명도: 1
약간 유백색
없음
6 96.0 1642.6 17.1 100.0 7.62 360 색상: 3
투명도: 1
약간 유백색
없음
9 102.8 1270.8 12.4 100.0 7.63 352 색상: 3
투명도: 2
약간 유백색
없음
11 86.2 1140.2 13.2 100.0 7.60 353 색상: 3
투명도: 2
약간 유백색
없음
12 113.9 1550.6 13.6 100.0 7.58 350 색상: 3
투명도: 2
약간 유백색
없음
15 114.7 1160.6 10.1 98.3 7.61 350 색상: 3
투명도: 2
약간 유백색
없음
18 86.2 907.4 10.5 100.0 7.67 340 색상: 3
투명도: 2
약간 유백색
없음
수용성 생산물, 100 ㎎/㎖; 저장 온도: -20℃
시점 (개월) 단백질 농도 (㎎/㎖) 활성 (U/㎖) 특정 활성 (U/㎎) 순도(%) pH 삼투성 (mOsm/㎏) 시각적 관찰 색상 1-3 투명도 1-3 용액 집합체
0 81.8 1705.7 20.9 99.9 7.60 316 색상: 3
투명도: 1
약간 유백색
없음
1 89.3 2108.8 23.6 100.0 7.56 350 색상: 3
투명도: 1
약간 유백색
없음
2 112.0 2066.5 18.5 100.0 7.65 353 색상: 3
투명도: 1
약간 유백색
없음
3 100.2 2172.4 21.7 96.7 7.65 352 색상: 3
투명도: 1
투명
없음
6 87.5 2672.3 30.6 100.0 7.62 352 색상: 3
투명도: 1
투명
없음
9 97.1 2040.3 21.0 100.0 7.62 353 색상: 3
투명도: 1
투명
없음
11 104.6 2234.0 21.4 100.0 7.60 353 색상: 3
투명도: 1
투명
없음
12 94.5 1608.8 17.0 100.0 7.57 350 색상: 3
투명도: 1
약간 유백색
없음
15 118.0 2015.9 17.1 100.0 7.62 351 색상: 3
투명도: 1
약간 유백색
없음
18 90.6 1736.4 19.2 100.0 7.69 338 색상: 3
투명도: 1
약간 유백색
없음
동결건조된 생산물, 100 ㎎/㎖; 저장 온도: 5℃
시점 (개월) 단백질 농도 (㎎/㎖) 활성 (U/㎖) 특정 활성 (U/㎎) 순도(%) pH 삼투성 (mOsm/㎏) 시각적 관찰 색상 1-3 투명도 1-3 케이크/용액 집합체
0 76.0 1638.3 21.5 100.0 7.60 316 색상: 3
투명도: 1
케이크: 노란색, 몇개의 크랙 용액: 투명
없음
1 71.6 1747.6 24.4 100.0 7.55 318 색상: 3
투명도: 1
케이크: 노란색, 몇개의 크랙 용액: 투명
없음
2 81.6 1769.9 21.7 100.0 7.63 313 색상: 3
투명도: 1
케이크: 노란색, 몇개의 크랙 용액: 투명
없음
3 84.1 1616.6 19.2 98.2 7.65 320 색상: 3
투명도: 1
케이크: 노란색, 몇개의 크랙 용액: 투명
없음
6 96.7 2197.6 22.7 100.0 7.60 324 색상: 3
투명도: 1
케이크: 노란색, 몇개의 크랙 용액: 투명
없음
9 ND ND ND ND ND ND ND
12 96.0 1978.4 20.6 100.0 7.57 322 색상: 3
투명도: 1
케이크: 노란색, 몇개의 크랙 용액: 투명
없음
15 ND ND ND ND ND ND ND
18 80.6 1602.6 19.9 100.0 7.75 310 색상: 3
투명도: 1
케이크: 노란색, 몇개의 크랙 용액: 투명
없음
실시예 3
접선 유동 여과(TFF)에 의한 rhPBGD 조성물의 농축
PBGD 대량 용액은 그 다음에 5 ℃, 암실에서 최소 3일 동안 해동되었다.
해동된 용액은 그 다음에 200 ㎖ 원뿔의 원심분리 튜브를 이용하여 2200 g에서 대략 10분 동안 원심분리되었다.
용액은 그 다음에 접선 유동 여과(TFF)에 의해 농축되기 전에 다음의 기공 크기: 5.0 ㎛; 0.65 ㎛; 0.45 ㎛; 및 0.20 ㎛를 갖는 일련의 필터를 통하여 여과되었다.
TFF에 의한 농축은 대략 20-25 psi의 펌프 입구 압력과 대략 4-6 psi의 Pellicon® XL Filter에 걸친 압력을 가진 Millipore Labscale TFF 시스템과 Millipore Pellicon® XL Filter를 이용하여 수행되었다. rhPBGD는 알루미늄 호일 시트에 의해 TFF 시스템의 시료 용기를 덮음으로써 절차 동안에 빛으로부터 보호되었다.
TFF 절차로부터 얻어진 농축된 rhPBGD 용액은 그 다음에 멸균수에서 제조된 3.67 mM Na2HPO4 × 2H2O, 27 mM 글라이신 및 220 mM 만니톨을 함유하는 포뮬레이션 버퍼에 대하여 버퍼-변경되었다. 이는 상기 버퍼를 TFF-시스템에 연속적으로 첨가하고 상기 버퍼가 이전의 버퍼를 대체할 때까지 막을 통과하도록 가압함에 의해 수행되었다.
농축된 및 버퍼-변경된 rhPBGD 용액은 그 다음에 0.22 ㎛의 기공 크기를 갖는 필터를 통과함에 의해 멸균여과되었다. 이러한 멸균여과는 각각의 시간에 새로운 필터로 두번 수행되었다.
멸균 농축된 rhPBGD 용액은 그 다음에 방법 부분에서 기술된 바와 같이 동결건조되기 전에 바이알에 놓여졌다.
실시예 4
다른 방식의 동결건조 및/또는 첨가제의 양이 재구성 시간에 미치는 영향
PBGD는 실시예 3에서 기술된 바와 같이 농축되었고 버퍼의 교환 후에 PGBD의 농도는 결정되었다.
농축된 PBGD 용액은 그 다음에 Lyostar (FTM-systems) 동결건조기에서 동결건조되었다. 용액은 2 및 6 ㎖ 주사 유리 바이알(type Ⅰ)들에 채워졌고 고무 마개(클로로부틸)로 마개를 하게 되었다.
원래의 동결건조 사이클:
시료는 주변 온도에 로드되었고 선반들은 0 ℃에서 30분 동안 냉각되었다. 온도는 -40 ℃(분당 1 ℃씩)까지 낮춰졌으며 거기에서 30분 동안 유지되었고, 그 다음에 진공 압력은 230 mTorr까지 끌어당겨졌으며 첫번째 건조는 온도를 0 ℃(분당 1 ℃씩)까지 올림에 의해 시작되었다. 첫번째 건조의 360분 후에 온도는 +30 ℃(분당 0.5 ℃씩)까지 올려졌고 동시에 완전 진공이 만들어졌다(두번째 건조의 시작). 온도는 +30 ℃에서 360분 동안 유지되었으며 바이알은 그 다음에 진공 하에 마개를 하게 되었다.
가열냉각 단계를 포함하는 동결건조:
-40 ℃에서 30분 후, 분당 2 ℃의 속도로 온도가 다시 분당 2 ℃씩 -40 ℃까지 다시 낮춰지기 전에 온도는 120 또는 420분 동안 유지되는 온도인 -10 ℃ 또는 -20 ℃까지 올려졌으며, 시료는 첫번째 건조의 시작 전에 60-90분 동안 유지되었다.
결과는 첨가제를 고려하여 짧은 기간이 사용된 표 20에 나타냈으며, 동결건조 사이클은 다음을 의미한다:
1× 첨가제 양은 PBGD 용액이 멸균수에서 제조된 3.67 mM Na2HPO4 × 2H2O, 27 mM 글라이신 및 220 mM 만니톨을 포함하는 것을 나타낸다.
1.5× 첨가제 양은 PBGD 용액이 멸균수에서 제조된 5.51 mM Na2HPO4 × 2H2O, 40.5 mM 글라이신 및 375 mM 만니톨, 즉 1× 버퍼에 존재하는 각 성분의 1.5×을 포함하는 것을 나타낸다.
2× 첨가제 양은 PBGD 용액이 멸균수에서 제조된 7.34 mM Na2HPO4 × 2H2O, 54 mM 글라이신 및 500 mM 만니톨, 즉 1× 버퍼에 존재하는 각 성분의 2×을 포함하는 것을 나타낸다.
원래의 동결건조 사이클은 위에서 기술된 바와 같다.
가열냉각 동결건조 사이클은 다시 -40 ℃까지 낮추기 전에 가열냉각 단계가 온도를 -10 ℃까지 올리고, 이 온도에서 시료를 120분 동안 유지하는 것을 포함하는, 위에서 기술된 바와 같다.
확장된 가열냉각 동결 건조 사이클은 다시 -40 ℃까지 낮추기 전에 가열냉각 단계가 온도를 -20 ℃까지 올리고, 이 온도에서 시료를 420분 동안 유지하는 것을 포함하는, 위에서 기술된 바와 같다.
첨가제 양 단백질 농도 (㎎/㎖) 다른 동결건조 사이클을 위한 재구성 시간
원래 가열냉각 확장된 가열냉각
1× 198 600 550 480
1× 175 540 500 450
1× 150 450 480 180
1× 125 330 100 10
1× 100 40 10 10
1× 80 25 10 10
1.5× 200 480 40 60
1.5× 175 220 10 10
1.5× 150 60 10 10
1.5× 125 15 10 10
1.5× 100 10 10 10
2× 200 120 20
2× 175 40 20
2× 150 20 10
2× 100 10 10
실시예 5
동결건조의 다른 방식 및/또는 첨가제의 양이 동결건조된 생산물의 외관에 미치는 영향
농축 및 동결건조된 PBGD 용액은 실시예 4에서 기술된 바와 같이 제조되었고, 첨가제의 양에 대한 참고예 및 동결건조 사이클의 유형은 실시예 4에서와 같은 의미를 갖는다.
다음 결과는 동결건조된 생산물의 시각적인 검사에 의해 얻어졌다:
A: 각각 4.6 ㎎/㎖, 66.6 ㎎/㎖ 및 109.4 ㎎/㎖ rhPBGD를 포함하는 용액으로부터 제조된 세개의 생산물의 비교는 동결건조된 생산물에서의 크랙의 수가 rhPBGD의 농도가 증감에 따라 증가한다는 것을 나타내었다.
B: 150 ㎎/㎖ rhPGBD을 포함하는 용액, 및 첨가제의 1× 및 1.5× 양을 포함하는 용액으로부터 제조된, 두개의 생산물의 비교는 동결건조된 생산물에서의 크랙의 수가 1× 첨가제 양을 포함하는 생산물보다 1.5× 첨가제 양을 포함하는 생산물에서 더 낮은 것을 나타내었다.
C: 1× 및 2× 첨가제 양을 포함하는, 150 ㎎/㎖ rhPGBD 용액으로부터 제조된 두개의 동결건조된 생산물의 비교는 2× 첨가제 양을 가진 동결건조된 생산물에서의 크랙의 수가 1× 첨가제 양을 포함하는 생산물보다 더 낮은 것을 나타내었다.
D: 원래의, 가열냉각 및 확장된 가열냉각 동결건조 사이클의 사용에 의해 150 ㎎/㎖ rhPGBD로부터 제조된 세개의 동결건조된 생산물의 비교는, 동결건조된 생산물에서의 크랙의 수가 원래의 동결건조 사이클에 따라 제조된 생산물에서보다 가열냉각 동결건조 사이클에 따라 제조된 생산물에서 더 낮은 것을 나타내었다. 게다가, 확장된 가열냉각 동결건조 사이클에 따라 제조된 생산물에서의 크랙의 수는 가열냉각 동결건조 사이클에 따라 제조된 생산물에서보다 더 낮았다.
E: 세개의 동결건조된 생산물은 각각 150, 175 및 200 ㎎/㎖의 rhPBGD 용액으로부터 제조되었다. 동결건조된 생산물은 각각 첨가제 1.5× 양을 포함하였고 그들은 가열냉각 사이클에 의해 동결건조되었다. 동결건조된 생산물의 중 아무것도 어떤 크랙도 포함하지 않았다.
F: 두개의 동결건조된 rhPBGD 생산물은 150 ㎎/㎖ rhPBGD 용액으로부터 제조되었다. 이것들 중 하나는 첨가제 1× 양을 포함하였고 원래의 동결건조 사이클에 따라서 제조된 반면, 다른 하나는 첨가제 1.5× 양을 포함하였고 확장된 동결건조 사이클에 따라 제조되었다. 첨가제 1.5× 양을 포함하고 확장된 동결건조 사이클에 따라 제조된 생산물은 첨가제 1× 양을 포함하고 원래의 동결건조 사이클에 따라 제조된 생산물보다 크랙이 더 적었다.
G: 두개의 동결건조된 rhPBGD 생산물은 150 ㎎/㎖ rhPBGD 용액으로부터 제조되었다. 그들 중 하나는 첨가제 1× 양을 포함하였고 원래의 동결건조 사이클에 따라서 제조된 반면, 다른 하나는 첨가제 1× 양과 조합하여 0.1%의 트윈 80을 포함하였고 확장된 동결건조 사이클에 따라 제조되었다. 첨가제 1× 양과 조합하여 0.1%의 트윈 80을 포함하는 생산물은 첨가제 1× 양을 포함하고 원래의 동결건조 사이클에 따라 제조된 생산물보다 크랙이 더 적었다.
실시예 6
회수 부피, 첨가제 양 및 동결건조 방식이 동결건조된 rhPBGD의 안정성에 미치는 영향
농축된 rhPBGD 용액 동결건조된 시료는 실시예 4에서 기술된 바와 같이 제조되었다.
“대량 용액”은 동결건조 전에 PBGD의 농축된 용액이다.
표 21은 rhPBGD의 농도, 첨가제 양(실시예 4에서 사용된 것과 같은 같은 정의이다), 동결건조 방식(실시예 4에서 사용된 것과 같은 같은 정의이다) 및 회복 부피(Rec. vol 동결건조된 생산물이 재현탁되는 부피이다)에 대한 채우는 부피(fill. Vol 동결건조 되기 전에 조성물의 부피이다)의 비율과 관련된 다음의 특성들을 갖는 rhPBGD 용액의 결과를 나타낸다.
용액 1:
ㆍ 약 5 ㎎/㎖ rhPBGD
ㆍ 첨가제 1× 양
ㆍ 원래의 동결건조 사이클
ㆍ Fill. vol = Rec. vol
용액 2:
ㆍ 약 70 ㎎/㎖ rhPBGD
ㆍ 첨가제 1× 양
ㆍ 원래의 동결건조 사이클
ㆍ Fill. vol = 2× Rec. vol
용액 3:
ㆍ 약 110 ㎎/㎖ rhPBGD
ㆍ 첨가제 1× 양
ㆍ 원래의 동결건조 사이클
ㆍ Fill. vol = Rec. vol
용액 4:
ㆍ 약 70 ㎎/㎖ rhPBGD
ㆍ 첨가제 1× 양
ㆍ 원래의 동결건조 사이클
ㆍ Fill. vol = 1.5× Rec. vol
용액 5:
ㆍ 액 90 ㎎/㎖ rhPBGD
ㆍ 첨가제 2/3× 양
ㆍ 원래의 동결건조 사이클
ㆍ Fill. vol = 1.5× Rec. vol
용액 6:
ㆍ 약 60 ㎎/㎖ rhPBGD
ㆍ 첨가제 1/2× 양
ㆍ 원래의 동결건조 사이클
ㆍ Fill. vol = 2× Rec. vol
용액 7:
ㆍ 약 110 ㎎/㎖ rhPBGD
ㆍ 첨가제 1× 양
ㆍ 가열냉각 동결건조 사이클
ㆍ Fill. vol = Rec. vol
용액 8:
ㆍ 약 60 ㎎/㎖ rhPBGD
ㆍ 첨가제 1× 양
ㆍ 가열냉각 동결건조 사이클
ㆍ Fill. vol = 2× Rec. vol
용액 9:
ㆍ 약 150 ㎎/㎖ rhPBGD
ㆍ 첨가제 1× 양
ㆍ 가열냉각 동결건조 사이클
ㆍ Fill. vol = Rec. vol
용액 10:
ㆍ 약 150 ㎎/㎖ rhPBGD
ㆍ 첨가제 1× 양
ㆍ 원래의 동결건조 사이클
ㆍ Fill. vol = Rec. vol
표 21에 나타내지는 않았다 하더라도 순도는 또한 각 시점에서 시험되었고 모든 경우에 100%로 발견되었다.
4주와 9시점에서 용액 2의 경우와 1주와 9시점에서 용액 4의 경우 틀린 회복 부피가 사용되었다.
용액 측정 점 (주) Fill. Vol (㎖) Rec. Vol (㎖) pH 삼투성 (mosmol/㎏) 단백질 농도 (㎎/㎖) 활성 (U/㎖) 특정 활성 (U/㎖)
1 대량 4.6 78 17.1
0 0.67 0.67 7.54 274 4.8 85 17.8
2 0.67 0.67 7.22 274 4.6 87 19.4
4 0.67 0.67 7.78 279 5.1 75 14.5
7 0.67 0.67 7.87 284 5.1 68 13.3
9 0.67 0.67 7.67 403 7.0 93 13.2
2 대량 66.6 1129 16.9
0 0.67 0.335 7.64 525 113 1915 16.9
2 0.67 0.335 7.63 459 93.6 1593 17.0
4 0.67 0.67 7.75 264 64.6 1104 17.1
7 0.67 0.335 7.95 451 106.4 2106 19.8
9 0.67 0.67 7.59 247 51.4 859 16.7
3 대량 109.4 1491 13.6
0 0.67 0.67 7.75 274 99.9 1598 16.0
2 0.67 0.67 7.64 269 91.4 1543 16.9
4 0.67 0.67 7.68 274 101.2 1825 18.0
7 0.67 0.67 7.71 278 103.4 2045 19.8
9 0.67 0.67 7.67 274 88.3 1656 18.8
4 대량 71.5 1244 17.4
0 0.67 0.45 7.64 448 113.8 1748 15.4
2 0.67 0.45 7.63 411 86.4 1806 20.9
4 0.67 0.45 7.77 362 109.9 1897 17.3
7 0.67 0.45 7.90 379 95.2 686 (7.2)
9 0.67 0.67 7.63 273 59.7 1090 18.3
5 대량 91.0 1610 17.7
0 0.67 0.45 7.65 296 119.4 2014 16.9
2 0.67 0.45 7.61 285 112.3 2093 18.6
4 0.67 0.45 7.90 292 125.1 2409 19.3
7 0.67 0.45 7.88 297 116.4 1928 16.6
9 0.67 0.45 7.34 278 102.5 1490 14.5
6 대량 60.7 992 16.3
0 0.67 0.335 7.63 295 112.6 1753 15.6
2 0.67 0.335 7.60 288 86.9 1787 20.6
4 0.67 0.335 7.83 287 116.4 2106 18.1
7 0.67 0.335 8.20 299 109.7 695 (6.3)
9 0.67 0.335 7.44 287 95.2 1636 17.2
7 대량 116.4 1926 16.5
0 0.67 0.67 7.56 275 101.1 1750 17.3
2 0.67 0.67 7.51 276 93.4 1831 19.6
4 0.67 0.67 7.60 270 101.6 1774 17.5
7 0.67 0.67 7.53 283 102.2 1639 16.0
9 0.67 0.67 7.46 274 89.9 960 10.7
8 대량 64.5 1119 17.4
0 0.67 0.335 7.52 511 100.7 1718 17.1
2 0.67 0.335 7.51 459 99.3 1900 19.1
4 0.67 0.335 7.70 482 114.5 1913 16.7
9 0.67 0.335 7.29 425 102.3 1650 16.1
9 대량 165 3587 21.7
0 0.60 0.60 7.71 309 121.4 2819 23.2
4 0.60 0.60 7.74 - 140.3 2014 14.4
7.5 0.60 0.60 7.61 292 135.9 1640 12.1
10 대량 165 3587 21.7
0 0.60 0.60 7.86 276 142.1 2397 16.9
3 0.40 0.40 8.20 314 141.9 2381 16.8
5 0.60 0.60 7.60 302 131.8 2304 17.5
실시예 7
다른 첨가제가 rhPBGD의 안정성에 미치는 영향
rhPBGD는 실시예 4에서 기술된 바와 같이 농축되었고 그 후에 버퍼는 아래에 기술된 네개의 버퍼 중 하나로 변경되었다. 생산물은 그 후에 실시예 4에서 기술된 바와 같이 포함된 원래의 냉각단계를 이용하여 동결건조되었고 시료의 안정성은 실시예 6에서 기술된 바와 같이 시험되었다.
다음의 네개의 포뮬레이션이 rhPBGD의 안정성에 미치는 영향이 시험되었다:
포뮬레이션 A(실시예 6의 용액 9에 상응): 250 mM 만니톨, 27 mM 글라이신 및 3.67 mM Na2HPO4.
포뮬레이션 B: 250 mM 만니톨, 27 mM 글라이신 및 10 mM TRIS-HCL.
포뮬레이션 C: 250 mM 만니톨, 27 mM 글라이신, 3.67 mM Na2HPO4 및 0.1% 트윈 80.
포뮬레이션 D: 221 mM 만니톨, 29 mM 슈크로오즈, 27 mM 글라이신, 3.67 mM Na2HPO4 및 0.1% 트윈 80.
결과는 표 22에 나타내었다.
포뮬레이션 측정 점 (주) Fill. Vol (㎖) Rec. Vol (㎖) pH 삼투성 (mosmol/㎏) 단백질 농도 (㎎/㎖) 활성 (U/㎖) 특정 활성 (U/㎖)
A 대량 7.69 366 165 3587 21.7
0 0.60 0.60 7.71 309 121.4 2819 23.2
4 0.60 0.60 7.74 - 140.3 2014 14.4
7.5 0.60 0.60 7.61 292 135.9 1640 12.1
B 대량 7.54 320 173 3595 20.8
0 0.60 0.60 7.58 284 148.1 3726 25.2
3 0.60 0.60 7.57 280 165.4 2947 17.8
4 0.60 0.60 7.69 - 167.5 2367 14.1
7.5 0.60 0.60 7.60 283 150.4 2235 14.9
C 대량 7.40 338 178 3606 20.2
0 0.60 0.60 7.76 290 142.9 2662 18.6
3 0.60 0.60 7.43 285 181.7 2332 12.8
4 0.60 0.60 7.42 - 173.1 1436 8.3
6 0.60 0.60 7.55 274 156.6 1254 7.4
7.5 0.60 0.60 7.34 274 141.5 1252 8.9
D 대량 7.41 337 175 3869 22.1
0 0.60 0.60 7.80 292 127.5 2355 18.5
3 0.60 0.60 7.35 288 143.9 1988 13.8
4 0.60 0.60 7.26 - 159.3 1644 10.3
6 0.60 0.60 7.30 281 135.7 1236 9.1
7.5 0.60 0.60 7.28 282 125.7 1146 9.1
<110> Zymenex A/S Stefan Nilsson <120> A process for concentration of polypeptides <130> 08PC157 <150> DK PA 2006 00488 <151> 2006-04-04 <150> DK PA 2006 00922 <151> 2006-07-05 <160> 26 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1035 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgagagtga ttcgcgtggg tacccgcaag agccagcttg ctcgcataca gacggacagt 60 gtggtggcaa cattgaaagc ctcgtaccct ggcctgcagt ttgaaatcat tgctatgtcc 120 accacagggg acaagattct tgatactgca ctctctaaga ttggagagaa aagcctgttt 180 accaaggagc ttgaacatgc cctggagaag aatgaagtgg acctggttgt tcactccttg 240 aaggacctgc ccactgtgct tcctcctggc ttcaccatcg gagccatctg caagcgggaa 300 aaccctcatg atgctgttgt ctttcaccca aaatttgttg ggaagaccct agaaaccctg 360 ccagagaaga gtgtggtggg aaccagctcc ctgcgaagag cagcccagct gcagagaaag 420 ttcccgcatc tggagttcag gagtattcgg ggaaacctca acacccggct tcggaagctg 480 gacgagcagc aggagttcag tgccatcatc ctggcaacag ctggcctgca gcgcatgggc 540 tggcacaacc gggttgggca gatcctgcac cctgaggaat gcatgtatgc tgtgggccag 600 ggggccttgg gcgtggaagt gcgagccaag gaccaggaca tcttggatct ggtgggtgtg 660 ctgcacgatc ccgagactct gcttcgctgc atcgctgaaa gggccttcct gaggcacctg 720 gaaggaggct gcagtgtgcc agtagccgtg catacagcta tgaaggatgg gcaactgtac 780 ctgactggag gagtctggag tctagacggc tcagatagca tacaagagac catgcaggct 840 accatccatg tccctgccca gcatgaagat ggccctgagg atgacccaca gttggtaggc 900 atcactgctc gtaacattcc acgagggccc cagttggctg cccagaactt gggcatcagc 960 ctggccaact tgttgctgag caaaggagcc aaaaacatcc tggatgttgc acggcaattg 1020 aacgatgccc attaa 1035 <210> 2 <211> 1035 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 atgagagtga ttcgcgtggg tacccgcaag agccagcttg ctcgcataca gacggacagt 60 gtggtggcaa cattgaaagc ctcgtaccct ggcctgcagt ttgaaatcat tgctatgtcc 120 accacagggg acaagattct tgatactgca ctctctaaga ttggagagaa aagcctgttt 180 accaaggagc ttgaacatgc cctggagaag aatgaagtgg acctggttgt tcactccttg 240 aaggacctgc ccactgtgct tcctcctggc ttcaccatcg gagccatctg caagcgggaa 300 aaccctcatg atgctgttgt ctttcaccca aaatttgttg ggaagaccct agaaaccctg 360 ccagagaaga gtgtggtggg aaccagctcc ctgcgaagag cagcccagct gcagagaaag 420 ttcccgcatc tggagttcag gagtattcgg ggaaacctca acacccggct tcggaagctg 480 gacgagcagc aggagttcag tgccatcatc ctggcaacag ctggcctgca gcgcatgggc 540 tggcacaacc gggtggggca gatcctgcac cctgaggaat gcatgtatgc tgtgggccag 600 ggggccttgg gcgtggaagt gcgagccaag gaccaggaca tcttggatct ggtgggtgtg 660 ctgcacgatc ccgagactct gcttcgctgc atcgctgaaa gggccttcct gaggcacctg 720 gaaggaggct gcagtgtgcc agtagccgtg catacagcta tgaaggatgg gcaactgtac 780 ctgactggag gagtctggag tctagacggc tcagatagca tacaagagac catgcaggct 840 accatccatg tccctgccca gcatgaagat ggccctgagg atgacccaca gttggtaggc 900 atcactgctc gtaacattcc acgagggccc cagttggctg cccagaactt gggcatcagc 960 ctggccaact tgttgctgag caaaggagcc aaaaacatcc tggatgttgc acggcaattg 1020 aacgatgccc attaa 1035 <210> 3 <211> 1035 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 atgagagtga ttcgcgtggg tacccgcaag agccagcttg ctcgcataca gacggacagt 60 gtggtggcaa cattgaaagc ctcgtaccct ggcctgcagt ttgaaatcat tgctatgtcc 120 accacagggg acaagattct tgatactgca ctctctaaga ttggagagaa aagcctgttt 180 accaaggagc ttgaacatgc cctggagaag aatgaagtgg acctggttgt tcactccttg 240 aaggacctgc ccactgtgct tcctcctggc ttcaccatcg gagccatctg caagcgggaa 300 aaccctcatg atgctgttgt ctttcaccca aaatttgttg ggaagaccct agaaaccctg 360 ccagagaaga gtgtggtggg aaccagctcc ctgcgaagag cagcccagct gcagagaaag 420 ttcccgcatc tggagttcag gagtattcgg ggaaacctca acacccggct tcggaagctg 480 gacgagcagc aggagttcag tgccatcatc ctggcaacag ctggcctgca gcgcatgggc 540 tggcacaacc gggtggggca gatcctgcac cctgaggaat gcatgtatgc tgtgggccag 600 ggggccttgg gcgtggaagt gcgagccaag gaccaggaca tcttggatct ggtgggtgtg 660 ctgcacgatc ccgagactct gcttcgctgc atcgctgaaa gggccttcct gaggcacctg 720 gaaggaggct gcagtgtgcc agtagccgtg catacagcta tgaaggatgg gcaactgtac 780 ctgactggag gagtctggag tctagacggc tcagatagca tacaagagac catgcaggct 840 accatccatg tccctgccca gcatgaagat ggccctgagg atgacccaca gttggtaggc 900 atcactgctc gtaacattcc acgagggccc cagttggctg cccagaactt gggcatcagc 960 ctggccaact tgttgctgag caaaggagcc aaaaacatcc tggatgttgc acggcaattg 1020 aacgatgccc attaa 1035 <210> 4 <211> 1034 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 atgagagtga ttcgcgtggg tacccgcaag agccagcttg ctcgcataca gacggacagt 60 gtggtggcaa cattgaaagc ctcgtaccct ggcctgcagt ttgaaatcat tgctatgtcc 120 accacagggg acaagattct tgatactgca ctctctaaga ttggagagaa aagcctgttt 180 accaaggagc ttgaacatgc cctggagaag aatgaagtgg acctggttgt tcactccttg 240 aaggacctgc ccactgtgct tcctcctggc ttcaccatcg gagccatctg caagcgggaa 300 aaccctcatg atgctgttgt cttcacccaa aatttgttgg gaagacccta gaaaccctgc 360 cagagaagag tgtggtggga accagctccc tgcgaagagc agcccagctg cagagaaagt 420 tcccgcatct ggagttcagg agtattcggg gaaacctcaa cacccggctt cggaagctgg 480 acgagcagca ggagttcagt gccatcatcc tggcaacagc tggcctgcag cgcatgggct 540 ggcacaaccg ggtggggcag atcctgcacc ctgaggaatg catgtatgct gtgggccagg 600 gggccttggg cgtggaagtg cgagccaagg accaggacat cttggatctg gtgggtgtgc 660 tgcacgatcc cgagactctg cttcgctgca tcgctgaaag ggccttcctg aggcacctgg 720 aaggaggctg cagtgtgcca gtagccgtgc atacagctat gaaggatggg caactgtacc 780 tgactggagg agtctggagt ctagacggct cagatagcat acaagagacc atgcaggcta 840 ccatccatgt ccctgcccag catgaagatg gccctgagga tgacccacag ttggtaggca 900 tcactgctcg taacattcca cgagggcccc agttggctgc ccagaacttg ggcatcagcc 960 tggccaactt gttgctgagc aaaggagcca aaaacatcct ggatgttgca cggcaattga 1020 acgatgccca ttaa 1034 <210> 5 <211> 1035 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 atgagagtga ttcgcgtggg tacccgcaag agccagcttg ctcgcataca gacgggcagt 60 gtggtggcaa cattgaaagc ctcgtaccct ggcctgcagt ttgaaatcat tgctatgtcc 120 accacagggg acaagattct tgatactgca ctctctaaga ttggagagaa aagcctgttt 180 accaaggagc ttgaacatgc cctggagaag aatgaagtgg acctggttgt tcactccttg 240 aaggacctgc ccactgtgct tcctcctggc ttcaccatcg gagccatctg caagcgggaa 300 aaccctcatg atgctgttgt ctttcaccca aaatttgttg ggaagaccct agaaaccctg 360 ccagagaaga gtgtggtggg aaccagctcc ctgcgaagag cagcccagct gcagagaagg 420 ttcccgcatc tggagttcag gagtattcgg ggaaacctca acacccggct tcggaagctg 480 gacgagcagc aggagttcag tgtcatcatc ctggcaacag ctggcctgca gcgcatgggc 540 tggcacaacc gggttgggca gatcctgcac cctgaggaat gcatgtatgc tgtgggccag 600 ggggccttgg gcgtggaagt gcgagccaag gaccaggaca tcttggatct ggtgggtgtg 660 ctgcacgatc ccgagactct gcttcgctgc atcgctgaaa gggccttcct gaggcacctg 720 gaaggaggct gcagtgtgcc agtagccgtg catacagcta tgaaggatgg gcaactgtac 780 ctgactggag gagtctggag tctagacggc tcagatagca tacaagagac catgcaggct 840 accatccatg tccctgccca gcatgaagat ggccctgagg atgacccaca gttggtaggc 900 atcactgctc gtaacattcc acgagggccc cagttggctg cccagaactt gggcatcagc 960 ctggccaact tgttgctgag caagggagcc aaaaacatcc tggatgttgc acggcaattg 1020 aacgatgccc attaa 1035 <210> 6 <211> 1035 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 atgagagtga ttcgcgtggg tacccgcaag agccagcttg ctcgcataca gacggacagt 60 gtggtggcaa cattgaaagc ctcgtaccct ggcctgcagt ttgaaatcat tgctatgtcc 120 accacagggg acaagattct tgatactgca ctctctaaga ttggagagaa aagcctgttt 180 accaaggagc ttgaacatgc cctggagaag aatgaagtgg acctggttgt tcactccttg 240 aaggacctgc ccactgtgct tcctcctggc ttcaccatcg gagccatctg caagcgggaa 300 aaccctcatg atgctgttgt ctttcaccca aaatttgttg ggaagaccct agaaaccctg 360 ccagagaaga gtgtggtggg aaccagctcc ctgcgaagag cagcccagct gcagagaaag 420 ttcccgcatc tggagttcag gagtattcgg ggaaacctca acacccggct tcggaagctg 480 gacgagcagc aggagttcag tgccatcatc ctggcaacag ctggcctgca gcgcatgggc 540 tggcacaacc gggtggggca gatcctgcac cctgaggaat gcatgtatgc tgtgggccag 600 ggggccttgg gcgtggaagt gcgagccaag gaccaggaca tcttggatct ggtgggtgtg 660 ctgcacgatc ccgagactct gcttcgctgc atcgctgaaa gggccttcct gaggcacctg 720 gaaggaggtt gcagtgtgcc agtagccgtg catacagcta tgaaggatgg gcaactgtac 780 ctgactggag gagtctggag tctagacggc tcagatagca tacaagagac catgcaggct 840 accatccatg tccctgccca gcatgaagat ggccctgagg atgacccaca gttggtaggc 900 atcactgctc gtaacattcc acgagggccc cagttggctg cccagaactt gggcatcagc 960 ctggccaact tgttgctgag caaaggagcc aaaaacatcc tggatgttgc acggcaattg 1020 aacgatgccc attaa 1035 <210> 7 <211> 1034 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 atgagagtga ttcgcgtggg tacccgcaag agccagcttg ctcgcataca gacggacagt 60 gtggtggcaa cattgaaagc ctcgtaccct ggcctgcagt ttgaaatcat tgctatgtcc 120 accacagggg acaagattct tgatactgca ctctctaaga ttggagagaa aagcctgttt 180 accaaggagc ttgaacatgc cctggagaag aatgaagtgg acctggttgt tcactccttg 240 aaggacctgc ccactgtgct tcctcctggc ttcaccatcg gagccatctg caagcgggaa 300 aaccctcatg atgctgttgt ctttcaccca aaatttgttg ggaagaccct agaaaccctg 360 ccagagaaga gtgtggtggg aaccagctcc ctgcgaagag cagcccagct gcagagaaag 420 ttcccgcatc tggagttcag gagtattcgg ggaaacctca acacccggct tcggaagctg 480 gacgagcagc aggagttcag tgccatcatc ctggcaacag ctggcctgca gcgcatgggc 540 tggcacaacc gggtggggca gatcctgcac cctgaggaat gcatgtatgc tgtgggccag 600 ggggccttgg gcgtggaagt gcgagccaag gaccaggaca tcttggatct ggtgggtgtg 660 ctgcacgatc ccgagactct gcttcgctgc atcgctgaaa gggccttcct gaggcacctg 720 gaaggaggct gcagtgtgcc agtagccgtg catacagcta tgaaggatgg gcaactgtac 780 ctgactggag gagtctggag tctagacggc tcagatagca tacaagagac catgcaggct 840 accatccatg tccctgccca gcatgaagat ggccctgagg atgacccaca gttggtaggc 900 atcactgctc gtaacattcc acgagggccc cagttggctg cccagaactt 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720 gaaggaggct gcagtgtgcc agtagccgtg catacagcta tgaaggatgg gcaactgtac 780 ctgactggag gagtctggag tctagacggc tcagatagca tacaagagac catgcaggcc 840 accatccatg tccctaccca gcatgaagat ggccctgagg atgacccaca gttggtaggc 900 atcactgctc gtaacattcc acgagggccc cagttggctg cccagaactt gggcatcagc 960 ctggccaact tgttgctgag caaaggagcc aaaaacatcc tggatgttgc acggcaattg 1020 aacgatgccc attaa 1035 <210> 9 <211> 1260 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 cacaggaaac agctatgacc atgattacgc caagctcgaa attaaccctc actaaaggga 60 acaaaagctg gagctccacc gcggtggcgg ccgctctaga actagtggat cccccgggct 120 gcaggaattc atgagagtga ttcgcgtggg tacccgcaag agccagcttg ctcgcataca 180 gacggacagt gtggtggcaa cattgaaagc ctcgtaccct ggcctgcagt ttgaaatcat 240 tgctatgtcc accacagggg acaagattct tgatactgca ctctctaaga ttggagagaa 300 aagcctgttt accaaggagc ttgaacatgc cctggagaag aatgaagtgg acctggttgt 360 tcactccttg aaggacctgc ccactgtgct tcctcctggc ttcaccatcg gagccatctg 420 caagcgggaa aaccctcatg atgctgttgt ctttcaccca aaatttgttg ggaagaccct 480 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gattatattg gaatttggaa tgagaggtca tataatgcca 600 attatattaa gatattaaga aaaatgctga attatcaagg tctccagcga gtgaaaatca 660 tagcaagtga taatctctgg gagtccatct ctgcatccat gctccttgat gccgaactct 720 tcaaggtggt tgatgttata ggggctcatt atcctggaac ccattcagca aaagatgcaa 780 agttgactgg gaagaagctt tggtcttctg aagactttag cactttaaat agtgacatgg 840 gtgcaggctg ctggggtcgc attttaaatc agaattatat caatggctat atgacttcca 900 caatcgcatg gaatttagtg gctagttact atgaacagtt gccttatggg agatgcgggt 960 tgatgacggc ccaagagcca tggagtgggc actacgtggt agaatctcct gtctgggtat 1020 cagctcatac cactcagttt actcaacctg gctggtatta cctgaagaca gttggccatt 1080 tagagaaagg aggaagctac gtagctctga ctgatggctt agggaacctc accatcatca 1140 ttgaaaccat gagtcataaa cattctaagt gcatacggcc atttcttcct tatttcaatg 1200 tgtcacaaca atttgccacc tttgttctta agggatcttt tagtgaaata ccagagctac 1260 aggtatggta taccaaactt ggaaaaacat ccgaaagatt tctttttaag cagctggatt 1320 ctctatggct ccttgacagc gatggcagtt tcacactgag cctgcatgaa gatgagctgt 1380 tcacactcac cactctcacc actggtcgca aaggcagcta cccgcttcct ccaaaatccc 1440 agcccttccc aagtacctat aaggatgatt tcaatgttga ttacccattt tttagtgaag 1500 ctccaaactt tgctgatcaa actggtgtat ttgaatattt tacaaatatt gaagaccctg 1560 gcgagcatca cttcacgcta cgccaagttc tcaaccagag acccattacg tgggctgccg 1620 atgcatccaa cacaatcagt attataggag actacaactg gaccaatctg actataaagt 1680 gtgatgttta catagagacc cctgacacag gaggtgtgtt cattgcagga agagtaaata 1740 aaggtggtat tttgattaga agtgccagag gaattttctt ctggattttt gcaaatggat 1800 cttacagggt tacaggtgat ttagctggat ggattatata tgctttagga cgtgttgaag 1860 ttacagcaaa aaaatggtat acactcacgt taactattaa gggtcatttc gcctctggca 1920 tgctgaatga caagtctctg tggacagaca tccctgtgaa ttttccaaag aatggctggg 1980 ctgcaattgg aactcactcc tttgaatttg cacagtttga caactttctt gtggaagcca 2040 cacgctaata cttaacaggg catcatagaa tactctggat tttcttccct tctttttggt 2100 tttggttcag agccaattct tgtttcattg gaacagtata tgaggctttt gagactaaaa 2160 ataatgaaga gtaaaagggg agagaaattt atttttaatt taccctgtgg aagattttat 2220 tagaattaat tccaagggga aaactggtga atctttaaca ttacctggtg tgttccctaa 2280 cattcaaact gtgcattggc cataccctta ggagtggttt gagtagtaca gacctcgaag 2340 ccttgctgct aacactgagg tagctctctt catcttattt gcaagcggtc ctgtagatgg 2400 cagtaacttg atcatcactg agatgtattt atgcatgctg accgtgtgtc caagtgagcc 2460 agtgtcttca tcacaagatg atgctgccat aatagaaagc tgaagaacac tagaagtagc 2520 tttttgaaaa ccacttcaac ctgttatgct ttatgctcta aaaagtattt ttttattttc 2580 ctttttaaga tgatactttt gaaatgcagg atatgatgag tgggatgatt ttaaaaacgc 2640 ctctttaata aactacctct aacactattt ctgcggtaat agatattagc agattaattg 2700 ggttatttgc attatttaat ttttttgatt ccaagttttg gtcttgtaac cactataact 2760 ctctgtgaac gtttttccag gtggctggaa gaaggaagaa aacctgatat agccaatgct 2820 gttgtagtcg tttcctcagc ctcatctcac tgtgctgtgg tctgtcctca catgtgcact 2880 ggtaacagac tcacacagct gatgaatgct tttctctcct tatgtgtgga aggaggggag 2940 cacttagaca tttgctaact cccagaattg gatcatctcc taagatgtac ttacttttta 3000 aagtccaaat atgtttatat ttaaatatac gtgagcatgt tcatcatgtt gtatgattta 3060 tactaagcat taatgtggct ctatgtagca aatcagttat tcatgtaggt aaagtaaatc 3120 tagaattatt tataagaatt actcattgaa ctaattctac tatttaggaa tttataagag 3180 tctaacatag gcttagctac agtgaagttt tgcattgctt ttgaagacaa gaaaagtgct 3240 agaataaata agattacaga gaaaattttt tgttaaaacc aagtgatttc cagctgatgt 3300 atctaatatt ttttaaaaca aacattatag aggtgtaatt tatttacaat aaaatgttcc 3360 tactttaaat atacaattca gtgagttttg ataaattgat atacccatgt aaccaacact 3420 ccagtcaagc ttcagaatat ttccatcacc ccagaaggtt ctcttgtata cctgctcagt 3480 cagttccttt cactcccaat tgttggcagc cattgatagg aattctatca ctataggtta 3540 gttttctttg ttccagaaca tcatgaaagc ggcgtcatgt actgtgtatt cttatgaatg 3600 gtttctttcc atcagcataa tgatttgaga ttggtccatg ttgtgtgatt cagtggtttg 3660 ttccttctta tttctgaaga gttttccatt gtatgaatat accacaattt gtttcctccc 3720 caccagtttc tgatactaca attaaaactg tctacattta c 3761 <210> 24 <211> 669 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Met Thr Ala Ala Ala Gly Ser Ala Gly Arg Ala Ala Val Pro Leu Leu 1 5 10 15 Leu Cys Ala Leu Leu Ala Pro Gly Gly Ala Tyr Val Leu Asp Asp Ser 20 25 30 Asp Gly Leu Gly Arg Glu Phe Asp Gly Ile Gly Ala Val Ser Gly Gly 35 40 45 Gly Ala Thr Ser Arg Leu Leu Val Asn Tyr Pro Glu Pro Tyr Arg Ser 50 55 60 Gln Ile Leu Asp Tyr Leu Phe Lys Pro Asn Phe Gly Ala Ser Leu His 65 70 75 80 Ile Leu Lys Val Glu Ile Gly Gly Asp Gly Gln Thr Thr Asp Gly Thr 85 90 95 Glu Pro Ser His Met His Tyr Ala Leu Asp Glu Asn Tyr Phe Arg Gly 100 105 110 Tyr Glu Trp Trp Leu Met Lys Glu Ala Lys Lys Arg Asn Pro Asn Ile 115 120 125 Thr Leu Ile Gly Leu Pro Trp Ser Phe Pro Gly Trp Leu Gly Lys Gly 130 135 140 Phe Asp Trp Pro Tyr Val Asn Leu Gln Leu Thr Ala Tyr Tyr Val Val 145 150 155 160 Thr Trp Ile Val Gly Ala Lys Arg Tyr His Asp Leu Asp Ile Asp Tyr 165 170 175 Ile Gly Ile Trp Asn Glu Arg Ser Tyr Asn Ala Asn Tyr Ile Lys Ile 180 185 190 Leu Arg Lys Met Leu Asn Tyr Gln Gly Leu Gln Arg Val Lys Ile Ile 195 200 205 Ala Ser Asp Asn Leu Trp Glu Ser Ile Ser Ala Ser Met Leu Leu Asp 210 215 220 Ala Glu Leu Phe Lys Val Val Asp Val Ile Gly Ala His Tyr Pro Gly 225 230 235 240 Thr His Ser Ala Lys Asp Ala Lys Leu Thr Gly Lys Lys Leu Trp Ser 245 250 255 Ser Glu Asp Phe Ser Thr Leu Asn Ser Asp Met Gly Ala Gly Cys Trp 260 265 270 Gly Arg Ile Leu Asn Gln Asn Tyr Ile Asn Gly Tyr Met Thr Ser Thr 275 280 285 Ile Ala Trp Asn Leu Val Ala Ser Tyr Tyr Glu Gln Leu Pro Tyr Gly 290 295 300 Arg Cys Gly Leu Met Thr Ala Gln Glu Pro Trp Ser Gly His Tyr Val 305 310 315 320 Val Glu Ser Pro Val Trp Val Ser Ala His Thr Thr Gln Phe Thr Gln 325 330 335 Pro Gly Trp Tyr Tyr Leu Lys Thr Val Gly His Leu Glu Lys Gly Gly 340 345 350 Ser Tyr Val Ala Leu Thr Asp Gly Leu Gly Asn Leu Thr Ile Ile Ile 355 360 365 Glu Thr Met Ser His Lys His Ser Lys Cys Ile Arg Pro Phe Leu Pro 370 375 380 Tyr Phe Asn Val Ser Gln Gln Phe Ala Thr Phe Val Leu Lys Gly Ser 385 390 395 400 Phe Ser Glu Ile Pro Glu Leu Gln Val Trp Tyr Thr Lys Leu Gly Lys 405 410 415 Thr Ser Glu Arg Phe Leu Phe Lys Gln Leu Asp Ser Leu Trp Leu Leu 420 425 430 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Thr Leu Ser Leu His Glu Asp Glu Leu Phe 435 440 445 Thr Leu Thr Thr Leu Thr Thr Gly Arg Lys Gly Ser Tyr Pro Leu Pro 450 455 460 Pro Lys Ser Gln Pro Phe Pro Ser Thr Tyr Lys Asp Asp Phe Asn Val 465 470 475 480 Asp Tyr Pro Phe Phe Ser Glu Ala Pro Asn Phe Ala Asp Gln Thr Gly 485 490 495 Val Phe Glu Tyr Phe Thr Asn Ile Glu Asp Pro Gly Glu His His Phe 500 505 510 Thr Leu Arg Gln Val Leu Asn Gln Arg Pro Ile Thr Trp Ala Ala Asp 515 520 525 Ala Ser Asn Thr Ile Ser Ile Ile Gly Asp Tyr Asn Trp Thr Asn Leu 530 535 540 Thr Ile Lys Cys Asp Val Tyr Ile Glu Thr Pro Asp Thr Gly Gly Val 545 550 555 560 Phe Ile Ala Gly Arg Val Asn Lys Gly Gly Ile Leu Ile Arg Ser Ala 565 570 575 Arg Gly Ile Phe Phe Trp Ile Phe Ala Asn Gly Ser Tyr Arg Val Thr 580 585 590 Gly Asp Leu Ala Gly Trp Ile Ile Tyr Ala Leu Gly Arg Val Glu Val 595 600 605 Thr Ala Lys Lys Trp Tyr Thr Leu Thr Leu Thr Ile Lys Gly His Phe 610 615 620 Ala Ser Gly Met Leu Asn Asp Lys Ser Leu Trp Thr Asp Ile Pro Val 625 630 635 640 Asn Phe Pro Lys Asn Gly Trp Ala Ala Ile Gly Thr His Ser Phe Glu 645 650 655 Phe Ala Gln Phe Asp Asn Phe Leu Val Glu Ala Thr Arg 660 665 <210> 25 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 11 residue basic peptide from HIV TAT protein <400> 25 Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg 1 5 10 <210> 26 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic TAT peptide <400> 26 Tyr Ala Arg Ala Ala Ala Arg Gln Ala Arg Ala 1 5 10

Claims (28)

  1. 다음을 포함하는 목적 폴리펩타이드를 포함하는 조성물의 농축 방법:
    a) 목적 폴리펩타이드를 포함하는 조성물의 원심분리 및/또는 여과 단계;
    b) a) 단계에서 얻어진 상청액 또는 보전액을 각각 농축하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 목적 폴리펩타이드는 포르포빌리노겐 디아미나아제, 아릴설파타아제 A, 알파 만노시다아제, 갈락토시세레브로시다아제, 및 이들과 기능적으로 동등한 부분 및 유사체로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 목적 폴리펩타이드는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산을 포함하는 방법:
    ⅰ) SEQ ID NOs 14, 15, 18, 19, 20, 21 및 24 중 어느 하나에 의해 정의된 아미노산 서열;
    ⅱ) ⅰ)에서 정의된 아미노산 서열과 기능적으로 동등한 부분; 및
    ⅲ) ⅰ) 또는 ⅱ)에서 정의된 아미노산 서열과 기능적으로 동등한 유사체이며, 상기 유사체의 아미노산 서열은 ⅰ) 또는 ⅱ)에서 정의된 아미노산 서열과 적어도 75% 동일한 유사체.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, b) 단계는 동결건조 또는 증발에 의하여 수행되 는 것인 방법.
  5. 상기 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, b) 단계는 한외여과법에 의하여 수행되는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, b) 단계는 접선 유동 여과에 의하여 수행되는 것인 방법.
  7. 제5항에 있어서, b) 단계는 원심분리 장치에 의하여 수행되는 것인 방법.
  8. 상기 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, 목적 폴리펩타이드를 포함하는 상기 조성물은 글라이신, L-세린, 슈크로오즈 및 만니톨로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 성분을 더 포함하는 방법.
  9. 상기 청구항들 중 어느 한 항에 있어서,목적 폴리펩타이드를 포함하는 상기 조성물은 TRIS-HCL, 구연산 나트륨 및 Na2HPO4로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 버퍼를 더 포함하는 방법.
  10. 상기 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, b) 단계로부터 얻어진 목적 폴리펩타이드를 포함하는 농축된 조성물의 멸균 단계를 더 포함하는 방법.
  11. 상기 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, b) 단계로부터 얻어진 목적 폴리펩타이드를 포함하는 농축된 조성물의 동결건조 단계를 더 포함하는 방법.
  12. 상기 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, a) 단계의 원심분리는 1800-2500 g에서 수행되는 것인 방법.
  13. 상기 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, a) 단계의 여과에서 사용되는 필터는 0.20-5.0 마이크로미터 범위의 기공 크기를 갖는 것인 방법.
  14. 상기 청구항들 중 어느 한 항에 있어서, a) 단계 이전에 다음 단계들 중 하나 이상을 더 포함하는 방법:
    ⅰ) 목적 폴리펩타이드의 재조합 발현 단계;
    ⅱ) 하나 이상의 크로마토그래피 단계에 의한 목적 폴리펩타이드의 정제 단계; 및
    ⅲ) 포뮬레이션 버퍼의 교환 단계.
  15. 제14항에 있어서, ⅱ) 단계의 크로마토그래피는 친화 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피 및 하이드록시아파타이트 크로마토그래피로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  16. 제14항에 있어서, a) 단계 이전에 다음 단계들을 포함하는 방법:
    ⅰ) 목적 폴리펩타이드의 재조합 발현 단계;
    ⅱ) ⅰ) 단계로부터의 목적 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 친화 크로마토그래피시키는 단계; 및
    ⅲ) ⅱ) 단계의 목적 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 이온교환 크로마토그래피시키는 단계.
  17. 제14항에 있어서, a) 단계 이전에 다음 단계들을 포함하는 방법:
    ⅰ) 목적 폴리펩타이드의 재조합 발현 단계;
    ⅱ) ⅰ) 단계로부터의 목적 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 친화 크로마토그래피시키는 단계;
    ⅲ) ⅱ) 단계로부터의 목적 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 이온교환 크로마토그래피시키는 단계; 및
    ⅳ) ⅲ) 단계로부터의 목적 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 하이드록시아파타이트 컬럼시키는 단계.
  18. 제14항에 있어서, 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함하는 핵산 서열을 사용한 재조합 발현 단계를 포함하는 방법:
    ⅰ) SEQ ID NOs 1-13, 16, 17, 22 및 23 중 어느 하나에 의하여 정의된 핵산 서열;
    ⅱ) ⅰ)에서 정의된 핵산 서열과 적어도 75% 동일한 핵산 서열.
  19. 제16항 또는 제17항 중 어느 한 항에 있어서, ⅱ) 단계로부터 얻어진 목적 폴리펩타이드를 포함하는 조성물을 희석 또는 정용여과하는 단계를 더 포함하는 방법.
  20. 포르포빌리노겐 디아미나아제, 아릴설파타아제 A, 리소조멀 알파-만노시다아제 및 갈락토실세레브로시다아제로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드를 적어도 10 ㎎/㎖ 포함하는 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 청구항 3에서 정의된 폴리펩타이드인 조성물.
  22. 포르포빌리노겐 디아미나아제, 아릴설파타아제 A, 리소조멀 알파-만노시다아제 및 갈락토실세레브로시다아제로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩타이드를 75-250 ㎎/㎖ 포함하는 조성물의 포유동물에게 피하주사되는 약의 제조용 용도.
  23. 제22항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 청구항 3에서 정의된 폴리펩타이드인 용도.
  24. 제22항 또는 23항에 있어서, 상기 약은 급성 간헐성 포르피리아(acute intermittent porphyria), 이염색성 백질이영양증(metachromatic leukodystrophy), 리소좀 저장 장애 알파-만노시도시스(lysosomal storage disorder alpha-mannosidosis) 또는 크라베병(Krabbe disease)의 치료용인 용도.
  25. PBGD 500-300 ㎎/㎖의 조성물을 피하주사하는 것을 포함하는 포유동물의 급성 간헐성 포르피리아의 치료방법.
  26. 아릴설파타아제 A 50-300 ㎎/㎖의 조성물의 피하주사를 포함하는 포유동물의 이염색성 백질이영양증의 치료방법.
  27. 리소조멀 알파-만노시다아제 50-300 ㎎/㎖의 조성물의 피하주사를 포함하는 포유동물의 리소좀 저장 장애 알파-만노시도시스의 치료방법.
  28. 갈락토실세레브로시다아제 50-300 ㎎/㎖의 조성물의 피하주사를 포함하는 포유동물의 크라베병의 치료방법.
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Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ576986A (en) 2004-01-30 2010-12-24 Shire Pharmaceuticals Ireland Ltd Production and purification of recombinant arylsulfatase A
CA2644642C (en) * 2006-04-04 2016-01-26 Zymenex A/S A process for concentration of a polypeptide
NZ601790A (en) * 2010-02-24 2014-03-28 Zymenex As Process for production and purification of recombinant lysosomal alpha-mannosidase
IL291556B2 (en) * 2010-06-25 2024-02-01 Shire Human Genetic Therapies Methods and compositions for administration of arylsulfatase A to the central nervous system
NZ702800A (en) 2010-06-25 2017-03-31 Shire Human Genetic Therapies Methods and compositions for cns delivery of heparan n-sulfatase
EP2588130B1 (en) 2010-06-25 2016-08-17 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Cns delivery of therapeutic agents
RU2012154576A (ru) 2010-06-25 2014-07-27 Шир Хьюман Дженетик Терапис, Инк. Способы и композиции для доставки к цнс гепаран-n-сульфатазы
US10336992B2 (en) 2011-07-08 2019-07-02 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Methods for purification of arylsulfatase A
US20140377244A1 (en) 2011-12-23 2014-12-25 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Stable formulations for cns delivery of arylsulfatase a
US20150284698A1 (en) * 2012-11-13 2015-10-08 Ace Biosciences A/S PURIFICATION OF RECOMBINANT HUMAN GALACTOCEREBROSIDE B-GALACTOSIDASE (rhGALC)
AU2013357812B2 (en) * 2012-12-11 2019-10-10 Centogene Gmbh Method for the diagnosis of metachromatic leukodystrophy
BR112015015948B1 (pt) 2013-01-09 2022-05-17 Takeda Pharmaceutical Company Limited Método de purificação da proteína arilsulfatase a (asa) recombinante
AU2014228938B2 (en) 2013-03-15 2019-05-02 Bioverativ Therapeutics Inc. Factor IX polypeptide formulations
MX2016012447A (es) 2014-03-24 2017-01-06 Biogen Ma Inc Formulaciones de factor ix liofilizadas.
US11584777B2 (en) 2017-08-31 2023-02-21 Green Cross Corporation Method for purifying a sulfatase protein
KR102290596B1 (ko) * 2020-09-10 2021-08-19 주식회사 파이안바이오테크놀로지 분리된 미토콘드리아를 포함하는 주사용 조성물 및 이의 용도

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2041280A1 (en) 1990-05-10 1991-11-11 Yosuke Sawada Arylsulfatase
NO960163D0 (no) * 1996-01-15 1996-01-15 Thomas Berg Mutasjonsdeteksjon av bovin
DK1049487T3 (da) 1998-01-27 2002-09-16 Hemebiotech As Behandling af akut intermitterende porfyri og andre porfyriske lidelser
JP4685238B2 (ja) * 1998-06-09 2011-05-18 ツエー・エス・エル・ベーリング・アクチエンゲゼルシヤフト 静脈投与用免疫グロブリン及び他の免疫グロブリン生成物の製造法
SK288128B6 (sk) * 1998-06-09 2013-10-02 Csl Behring Ag Process for purifying immunoglobulin G (IgG), liquid immunoglobulin product and use thereof for the preparation of a medicament
US6537777B1 (en) 1998-07-27 2003-03-25 Hemebiotech A/S Human porphobilinogen deaminase sequences
AUPQ026799A0 (en) * 1999-05-10 1999-06-03 Csl Limited Method of increasing protein stability by removing immunoglobulin aggregates
WO2001007065A2 (en) 1999-07-27 2001-02-01 Hemebiotech A/S PRODUCTION OF rhPBGD AND NEW THERAPEUTIC METHODS FOR TREATING PATIENTS WITH ACUTE INTERMITTENT PORPHYRIA (AIP) AND OTHER PORPHYRIC DISEASES
US6812339B1 (en) * 2000-09-08 2004-11-02 Applera Corporation Polymorphisms in known genes associated with human disease, methods of detection and uses thereof
AU2002232803A1 (en) 2000-11-15 2002-05-27 Genzyme Corporation Expression system for recombinant proteins
WO2002099092A2 (en) * 2001-06-07 2002-12-12 Hemebiotech A/S Production of recombinant human lysosomal alpha-mannosidase
WO2002098455A2 (en) * 2001-06-07 2002-12-12 Hemebiotech A/S Production of recombinant human arylsulfatase a
WO2003002731A1 (en) * 2001-06-29 2003-01-09 Hemebiotech A/S A PROCESS FOR PURIFICATION OF RECOMBINANT PORPHOBILINOGEN DEAMINASE (rhPBGD)
US7232670B2 (en) * 2001-09-28 2007-06-19 St. Jude Children's Research Hospital Targeting proteins to cells expressing mannose receptors via expression in insect cells
CA2472937C (en) 2002-01-11 2014-06-17 Biomarin Pharmaceutical, Inc. Use of p97 as an enzyme delivery system for the delivery of therapeutic lysosomal enzymes
US7118675B2 (en) * 2002-02-04 2006-10-10 Millipore Corporation Process for removing protein aggregates and virus from a protein solution
CH694697A5 (de) 2004-01-29 2005-06-15 Koelbl Engineering Und Consult Gummimehl-enthaltende Elastomerlegierungen.
NZ576986A (en) * 2004-01-30 2010-12-24 Shire Pharmaceuticals Ireland Ltd Production and purification of recombinant arylsulfatase A
DK1740204T3 (en) 2004-04-01 2018-05-22 Chiesi Farm Spa MEDICAL USE OF ALFA MANNOSIDASE
US20060051347A1 (en) * 2004-09-09 2006-03-09 Winter Charles M Process for concentration of antibodies and therapeutic products thereof
CA2644642C (en) * 2006-04-04 2016-01-26 Zymenex A/S A process for concentration of a polypeptide

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