CN112831524A - 人工改造的重组腺病毒载体、由其包装的病毒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种人工改造的重组腺病毒载体、由其包装的病毒及其应用。本发明揭示了基于合成生物学技术构建的新型腺病毒载体。本发明的腺病毒表达载体能够高效地包装，病毒产量高，且外源基因装载量高。本发明的腺病毒载体可应用于作为各种各样的基因的表达载体，应用于疫苗研发、基因治疗等。本发明还提供了由所述腺病毒载体包装获得的病毒等。

Description

人工改造的重组腺病毒载体、由其包装的病毒及其应用

技术领域

本发明属于生物医学以及病毒学领域，更具体地，本发明涉及一种人工改造的重组腺病毒载体、由其包装的病毒及其应用。

背景技术

腺病毒载体是目前最有应用前景的病毒载体之一。腺病毒是一种无包膜、线性的双链DNA病毒，基因组大小约为36kb。自1953年首次发现腺病毒至今，已分离出57种人血清型(分为A～G 7个亚属)及多种其它种属来源的腺病毒，其中包括C亚型人腺病毒，例如AdHu1，AdHu2，AdHu5，AdHu6等。腺病毒由于转导效率高、可携带外源基因，易于扩增及纯化，被视为优良的基因运载工具，广泛应用于各种基础研究或临床应用，包括研发针对HIV、流感、埃博拉、疟疾、狂犬病、前列腺癌、黑色素瘤等疾病的疫苗，以及用于溶瘤治疗。然而，由于75-80％的个体中存在抗AdHu5的预存中和抗体，以AdHu5为载体的疫苗，其免疫效果受预存中和抗体的影响，不仅削弱其免疫效果，而且可能增强副反应。为避免这一问题，本发明人之前选择稀有血清型或其它种属来源的腺病毒作为疫苗载体，如黑猩猩型腺病毒等。黑猩猩型腺病毒只流行于非洲的黑猩猩中，人群中一般不含抗黑猩猩型腺病毒的中和抗体，故以黑猩猩型腺病毒为疫苗载体，其综合免疫效果优于AdHu5载体。

由于腺病毒基因组相对较大，一般的分子生物学方法难以完成重组腺病毒载体的构建，因此，腺病毒载体的构建依然是一个技术瓶颈。传统的腺病毒载体构建策略主要为同源重组和基因组直接克隆，这些策略费时费力，最快也需要2个多月时间。进一步改良的策略为等温组装法，虽然这种方法声称只需要1周左右，但这只是指将多个片断用等温组装法连接在一起成为一个克隆所需的时间，尚不包括获得接头部位存在互补序列的多个小片段所需的时间以及验证过程。而且，以上这些策略都必须首先获得野生型病毒，并扩增纯化病毒，获得其基因组DNA。如果只知腺病毒基因序列，则无法完成腺病毒载体的构建。

根据上述，本领域还需要进行进一步的研究探索，来获得改进的腺病毒载体以及腺病毒，增强其临床上的应用性。

在本发明人在先研究工作(未公开的专利申请CN 201910777937.2)中，基于黑猩猩型腺病毒AdC68基因组序列，删除其E1序列和E3序列，改造其E4序列；所述改造包括以人血清5型腺病毒AdHu5基因组中相应的E4序列或其片段替换AdC68基因组中E4序列或其片段。而本发明提出了进一步优化的腺病毒载体以及腺病毒。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人工改造的重组腺病毒载体、由其包装的病毒及其应用。

在本发明的第一方面，提供一种制备腺病毒表达载体的方法，包括：基于黑猩猩型腺病毒AdC68基因组序列，完全删除其E1序列，改造其E3序列和E4序列，所述改造包括(但不限于)：(1)改造其E3序列，保留其orf9、较佳地保留其orf9和orf1，部分或全部删除其它E3的orf序列(例如，删除其orf1～orf8序列或orf2～orf8序列)；和，(2)改造其E4序列，以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf6和/或orf6/7替换其E4序列中orf6和/或orf6/7；可选地，还以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf4和/或orf3替换其E4序列中orf4和/或orf3；较佳地还删除其E4序列中orf1、orf2和/或orf3。

在本发明的另一方面，提供一种重组腺病毒载体，包括以黑猩猩型腺病毒AdC68基因组为基础的序列，其中E1序列被完全删除，E3序列和E4序列被改造；所述改造包括：(1)E3序列中，其orf9被保留、较佳地其orf9和orf1被保留，其它orf序列部分或全部被删除(例如，其orf1～orf8序列被删除或orf2～orf8序列被删除)；和，(2)E4序列中，以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf6和/或orf6/7替换其E4序列中orf6和/或orf6/7；可选地，还以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf4和/或orf3替换其E4序列中orf4和/或orf3；较佳地其E4序列中orf1、orf2和/或orf3被删除。

在一个优选例中，(2)中，所述C亚型人腺病毒包括(但不限于)：人血清5型腺病毒AdHu5，AdHu1，AdHu2，AdHu6；较佳地为AdHu5。

在另一优选例中(2)中，E4序列改造包括选自：

(a)以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf6/7和orf6替换其E4序列中orf6/7和orf6；删除其E4序列中orf1、orf2和orf3(保留AdC68来源的orf4)；

(b)以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf6、orf4和orf3替换其E4序列中orf6、orf4和orf3的序列；删除其E4序列中orf1、orf2、orf6/7；

(c)以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf6/7和orf6替换其E4序列中orf6/7和orf6的序列；

(d)以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf6、orf4替换其E4序列中orf6、orf4；删除其E4序列中orf1、orf2和orf3、orf6/7。

在另一优选例中，所述改造包括选自：

(i)删除其E3序列中orf2～orf8；且以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf6/7和orf6替换其E4序列中orf6/7和orf6，删除其E4序列中orf1、orf2和orf3(保留AdC68来源的orf4)(AdC68XY9-EGFP)；

(ii)删除其E3序列中orf2～orf8；且以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf6、orf4和orf3替换其E4序列中orf6、orf4和orf3的序列；删除其E4序列中orf1、orf2、orf6/7(AdC68XY8-EGFP)；

(iii)删除其E3序列中orf2～orf8；且以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf6/7和orf6替换其E4序列中orf6/7和orf6的序列(AdC68XY7-EGFP)；

(iv)删除其E3序列中orf1～orf8；且以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf6、orf4和orf3替换其E4序列中orf6、orf4和orf3的序列；删除其E4序列中orf1、orf2、orf6/7(AdC68XY6-EGFP)；

(v)删除其E3序列中orf1～orf8；且以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf6/7和orf6替换其E4序列中orf6/7和orf6的序列(AdC68XY5-EGFP)；

(vi)删除其E3序列中orf2～orf8；且以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf6、orf4替换其E4序列中orf6、orf4；删除其E4序列中orf1、orf2和orf3、orf6/7(AdC68XY10-EGFP)。

在另一更具体的优选例中，所述删除其E1序列为删除其基因组(黑猩猩型腺病毒AdC68基因组)序列(序列位点的计算基于GenBank登录号：AC_000011，后同)中第459-3402位序列；或

(i)中，删除其E3序列中第27446-31423位；且以人血清5型腺病毒AdHu5基因组E4序列中第32914-34077位替换其E4序列中第33518-34671位，删除其E4序列中第34943-36105位(AdC68XY9-EGFP)；

(ii)删除其E3序列中第27446-31423位；且以人血清5型腺病毒AdHu5基因组E4序列中第33193-34703位替换其E4序列中第33518-36105位的序列(AdC68XY8-EGFP)；

(iii)删除其E3序列中第27446-31423位；且以人血清5型腺病毒AdHu5基因组E4序列中第32914-34077位替换其E4序列中第33518-34671位的序列(AdC68XY7-EGFP)；

(iv)删除其E3序列中第27125-31423位；且以人血清5型腺病毒AdHu5基因组E4序列中第33193-34703替换其E4序列中第33518-36105位的序列(AdC68XY6-EGFP)；

(v)删除其E3序列中第27125-31423位；且以人血清5型腺病毒AdHu5基因组E4序列中第32914-34077位替换其E4序列中第33518-34671位的序列(AdC68XY5-EGFP)；

(vi)删除其E3序列中第27446-31423位；且以人血清5型腺病毒AdHu5基因组E4序列中第33193-34342替换其E4序列中第33518-36105位(AdC68XY10-EGFP)。

在另一优选例中，所述的重组腺病毒载体中还包括选自以下操作性相连的元件或基因：外源基因表达盒；报告基因的表达盒；反向末端重复序列；和/或酶切位点，较佳地包括：I-CeuI，PI-SceI，SwaI，PacI。

在另一优选例中，所述重组腺病毒载体具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，但，其中E3序列(SEQ ID NO:1中第26593～27587位)被替换为SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；或，其中E4序列(SEQ ID NO:1中第29274～31857位)被替换为SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列；或，其中E1序列(SEQ ID NO:1中第2432～2871位)被删除。

在本发明的另一方面，提供前面任一所述的重组腺病毒载体的用途，用于制备重组腺病毒；或，用于插入外源基因、从而表达外源基因。

在本发明的另一方面，提供一种重组腺病毒，其由前面任一所述的重组腺病毒载体包装获得。

在本发明的另一方面，提供一种制备所述的重组腺病毒的方法，所述方法包括：(A)制备前面任一所述的重组腺病毒载体；(B)将(A)的重组腺病毒载体转染病毒生产细胞，从而包装获得重组腺病毒。

在本发明的另一方面，提供所述的重组腺病毒的用途，用于：表达外源基因，从而获得目的蛋白；较佳地，所述的目的蛋白包括：具有免疫原性的蛋白，具有药学活性的蛋白，具有诊断活性的蛋白，结构蛋白，酶，融合肽，报告蛋白。

在本发明的另一方面，提供一种试剂盒，包括：前面任一所述的重组腺病毒载体；所述的重组腺病毒；和/或，病毒生产细胞。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、本发明腺病毒载体中，针对E1、E3和E4序列进行改造的改造示意图(AdC68XY5～AdC68XY10)。

图2、本发明建立的腺病毒载体pAdC68XY5-EGFP～pAdC68XY10-EGFP的酶切鉴定电泳图。

具体实施方式

腺病毒的基因组比较大，以其进行载体改造较为困难，周期长。同时，以野生型腺病毒为材料，提取其基因组为模板，进行载体改造存在野生型腺病毒残留的风险。为此，本发明人经过深入的研究，揭示了基于合成生物学技术构建的新型腺病毒载体，称为AdC68XY系列载体(具体如AdC68XY5、AdC68XY6、AdC68XY7、AdC68XY8、AdC68XY9、AdC68XY10)。一方面，本发明的腺病毒表达载体能够高效地包装，病毒产量高，且获得的病毒感染能力强；另一方面，本发明的腺病毒表达载体可容纳较大的外源基因，具有很大的应用价值。

术语

如本发明所用，所述的“元件”是指一些对于蛋白的表达有用的一系列功能性的核酸序列，本发明中，所述的“元件”被系统地构建以形成一种表达构建体。所述的“元件”的序列可以是本发明中所提供的那些，也包括它们的变体，只要这些变体基本上保留了所述“元件”的功能，其通过插入或删除一些碱基(如1-50bp；较佳地1-30bp，更佳地1-20bp，更佳地1-10bp)，或进行随机或定点突变等来获得。

如本发明所用，所述的“操作性连接”或“可操作性相连”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。

如本发明所用，所述的“表达盒”是指包含有表达目的基因所需的所有必要元件的基因表达系统，通常其包括以下元件：启动子、目的基因序列，终止子；此外还可选择性包括信号肽编码序列等。这些元件是操作性相连的。

如本发明所用，所述的“构建物(或称构建体)”指一种已经通过人为干预，使其含有按照自然界中不存在的序列所组合和排列的DNA片段的单链或者双链DNA分子。所述的“构建物”包括表达载体；或者，所述的“构建物”被包含在表达载体中、作为表达载体的一部分。

如本发明所用，所述的“外源”或“异源”是指来自不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系，或来自不同来源的核酸与宿主细胞之间的关系。例如，如果核酸与宿主细胞的组合通常不是天然存在的，则核酸对于该宿主细胞来说是异源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是“外源的”。

如本发明所用，“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。

如本发明所用，“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的如本发明所用。

如本发明所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。

腺病毒载体

腺病毒的基因组比较大，在先前的技术中，本发明人尝试了较多的改造策略，包括针对其基因组中E1和E3进行改造，删除全部或部分的基因，但是鉴于其E4区域的重要作用，现有技术中尚没有针对其E4进行系统性改造的先例。本发明人发现，可以针对E4进行全部或部分改造，以C亚型人腺病毒基因组中相应的区域进行替换、或有限地进行序列删减，可以获得复制能力、感染能力增强的病毒，甚至还可以实现外源基因插入容量的增大。在本发明人的未公开专利申请CN 201910777937.2中，基于黑猩猩型腺病毒AdC68基因组序列，部分删除其E1序列和E3序列，改造其E4序列；所述改造包括以C亚型人腺病毒基因组中相应的E4序列或其片段替换AdC68基因组中E4序列或其片段；而本发明则提出了进一步优化的腺病毒载体以及腺病毒。

为了提高安全性，用作疫苗载体的腺病毒通常为复制缺陷型，即删除了E1基因。因此，通常用整合了AdHu5 E1基因的HEK 293细胞包装和扩增非复制型腺病毒。E4 ORF6是一个多功能蛋白，参与病毒复制的多个过程，对于腺病毒的复制极为重要。ORF6可与E1B 55-kDa结合，形成ORF6-E1B复合物，该复合物在转录后阶段促进主要晚期病毒mRNA的输出，从而加强晚期病毒基因的表达，同时抑制宿主蛋白的合成。在腺病毒感染的细胞中，ORF6-E1B复合物还参与抑制E1A诱导的p53激活，从而使p53降解，抑制宿主细胞凋亡。而且，ORF6可间接提高病毒DNA合成效率。ORF3与ORF6功能相似，可部分或完全补偿彼此的缺失。尽管AdHu5E1B 55k和E4 ORF6蛋白之间的相互作用相对保守，但AdC68的E4 ORF6蛋白与AdHu5的E4ORF6蛋白同源性较低，与AdHu5 E1B 55k的结合可能不稳定或效率降低，导致非复制型黑猩猩腺病毒产量降低。为避免出现以上问题，提高重组腺病毒AdC68的产量，本发明的具体实施例中，将AdC68的E4序列全部或部分替换成AdHu5的E4序列，设计成多个分别带有不同E4序列的重组AdC68载体。AdHu5属于C型人腺病毒，与C型腺病毒家族中的其他血清型腺病毒(如AdHu1，AdHu2，AdHu6)E4 ORF6蛋白相似度极高(>98％)，可以预见，本发明中AdC68 E4的改造，除采用AdHu5基因组相对应的序列作替换，亦可采用C型人腺病毒家族中的其他血清型腺病毒基因组的对应序列进行替换。

在本发明的具体实施例中，本发明人采用合成生物学技术，全基因组合成E1、E3区部分删除，E1区带有绿色荧光标记的新型重组腺病AdC68XY1，经线性化后在HEK 293细胞中成功包装，并扩增出遗传稳定的重组腺病毒AdC68XY1。在AdC68XY1基础上，本发明人对E1、E3、E4区域的序列进行改造：将E1区域、E3区域进行进一步删除，E4区域部分替换为AdHu5来源的序列，分别得到了AdC68XY5、AdC68XY6、AdC68XY7、AdC68XY8、AdC68XY9、AdC68XY10。在以往研究的基础上，本发明的技术方案实现了进一步扩大外源基因的装载量的目标。

基于本发明人的新方案，本发明提供了一种重组腺病毒载体(质粒)，该重组腺病毒载体包括：以黑猩猩型腺病毒AdC68基因组为基础的序列，其中E1序列被删除，E3序列和E4序列被改造；所述改造包括：(1)E3序列中，其orf9被保留、较佳地其orf9和orf1被保留，其它orf序列部分或全部被删除)；和(2)E4序列中，以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf6和/或orf6/7替换其E4序列中orf6和/或orf6/7；可选地，还以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf4和/或orf3替换其E4序列中orf4和/或orf3；较佳地其E4序列中orf1、orf2和/或orf3被删除。

作为本发明的优选方式，E4序列改造包括选自：(a)以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf6/7和orf6替换其E4序列中orf6/7和orf6；删除其E4序列中orf1、orf2和orf3(保留AdC68来源的orf4)；(b)以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf6、orf4和orf3替换其E4序列中orf6、orf4和orf3的序列；删除其E4序列中orf1、orf2、orf6/7；(c)以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf6/7和orf6替换其E4序列中orf6/7和orf6的序列；(d)以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf6、orf4替换其E4序列中orf6、orf4；删除其E4序列中orf1、orf2和orf3、orf6/7。

作为本发明的优选方式，还包括选自以下操作性相连的元件或基因：外源基因表达盒；报告基因的表达盒；反向末端重复序列和/或酶切位点。应理解，报告基因、酶切位点等元件的设计有时候是为了在进行研究时提供方便观测或检测的途径，而当将本发明的重组腺病毒载体或重组腺病毒应用于临床药学领域时，其并非是必要的；或者，可以在所述报告基因的位置上以能表达具有药学活性的目的蛋白的基因替代。

所述的表达载体通常还含有复制起点和/或标记基因等。根据本发明的提示，本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子(如CMV)上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。

本发明所述的表达载体中，可以插入外源基因的表达盒，从而表达人们感兴趣的目的蛋白。本发明的腺病毒表达载体可以作为一个表达载体平台，适用于表达多种目的蛋白，所述的目的蛋白没有特别的限制。作为一些可选的实施方式，所述的目的蛋白包括(但不限于)：具有免疫原性的蛋白，具有药学活性的蛋白(如抗体)，具有诊断活性的蛋白(如抗体)，结构蛋白，酶，融合肽，报告蛋白。所述的目的蛋白可以是单条，也可以是两条或多条，只要其编码基因的长度在所述腺病毒可容纳的包装容量内。

本发明所述的表达载体中，外源基因表达盒插入位置不唯一，较佳地包括(但不限于)：E1区域，E3区域，E4区域蛋白。

本发明的表达载体中的各元件是可操作性连接的，从而有利于病毒的包装或目的蛋白的有效表达。

作为本发明的优选方式，采用基于合成生物学的技术构建本发明的新型腺病毒载体。与传统生物学的研究方向相反，合成生物学是从最基本的要素开始一步步建立零部件，在此过程中设计、修改遗传物质，最终获得理想的新生物体。但是，应理解，除了合成生物学的技术，在获得了本发明的技术方案后，其它构建本发明的腺病毒载体的方法也应被包含在本发明中。

本发明不仅获得了一系列基于黑猩猩型腺病毒的新型载体AdC68XY，改造后的载体较传统的AdC68载体更适宜在病毒包装细胞中生长、繁殖，产量高，从而可降低产品的生产成本。而且，本发明改造后的载体外源基因装载量也大大提高了，进一步增加了腺病毒载体的适用性。

本发明为新型腺病毒载体的构建提供了一种快速有效的方法，有利于拓展腺病毒载体的应用，该腺病毒载体可容纳的外源基因的长度更为灵活，为应用腺病毒载体来表达更多种类的蛋白提供了基础。

本发明的载体可应用于各种基础研究和临床应用，譬如作为各种各样的基因的表达载体，也可应用于疫苗研发、基因治疗等。

本发明建立了以合成生物学制备重组腺病毒载体的新策略，这种策略无需获得野生型腺病毒，避免复杂的克隆过程，直接合成重组腺病毒的分子克隆，省时省力。这一策略解决了构建重组腺病毒载体的技术瓶颈，为重组腺病毒载体的发展和推广应用提供了坚实的理论和技术支撑。

腺病毒

获得所述腺病毒表达载体后，将之转染病毒生产细胞，进行病毒的繁殖。转染后的一段时间后，可以收获病毒。所述的病毒生产细胞可以是本领域公知的各种能够繁殖腺病毒的细胞，例如HEK293细胞等。

作为本发明的优选方式，收获的病毒可反复感染病毒生产细胞，持续传代。病毒滴度(TCID₅₀)的测定可以根据本领域常规方法进行。所获得的重组腺病毒也包含在本发明中。

本发明的腺病毒载体表达获得的腺病毒，在较短的病毒拯救时间内就可产生高滴度的病毒。根据实施例的结果，在病毒拯救5天后即可得到重组腺病毒，扩增感染至30盘150dish HEK293细胞可达到10¹²～10¹³vp/ml量级的病毒滴度，10¹³vp量级的病毒产量，显著优于改造前的腺病毒载体。

本发明的重组腺病毒载体生成的重组腺病毒能高效转染哺乳动物细胞、易于扩增及纯化、毒性低，其表达效率高且长久。本发明的腺病毒载体表达重组工艺简单、价格低廉、疗效持久。

本发明的腺病毒载体表达获得的腺病毒，外源基因装载量高。根据实施例的结果，外源基因装载量可在8.0～9.5kb。

组合物、试剂盒或药盒

本发明还提供了一种组合物，它含有有效量的所述的腺病毒，以及药学上可接受的载体。较佳地，所述的腺病毒表达有意义的目的蛋白。例如，所述的目的蛋白包括但不限于：具有免疫原性的蛋白，具有药学活性的蛋白(如抗体，具有杀伤肿瘤细胞活性的蛋白)，具有诊断活性的蛋白(如抗体)，结构蛋白，酶，融合肽。

通常，可将所述腺病毒配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。

本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。活性成分(腺病毒)的给药量是治疗有效量，例如每天约0.1微克/千克体重-约10毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

基于本发明的新发现，还提供了一种试剂盒/药盒，其中包括所述的腺病毒表达载体或所述的腺病毒。所述的试剂盒/药盒还可包括病毒生产细胞(如293细胞)，培养基等。

此外，所述的试剂盒/药盒中还可包括说明表达方法后腺病毒使用方法的使用说明书。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

材料和方法

细胞

HEK 293细胞株购自中国科学院上海细胞库，培养液为含有10％胎牛血清的DMEM。

限制性内切酶、感受态细胞、基因组序列

所有限制性内切酶购自New England Biolabs；Stbl2菌种购自上海唯地生物技术有限公司。

腺病毒AdC68序列参照GenBank公布序列，即GenBank登录号：AC_000011。

腺病毒人血清型5型(AdHu5)的E4序列参照GenBank登录号：AC_000008.1。

实施例1、AdC68XY系列腺病毒载体分子克隆的设计

首先，本发明人将AdC68基因组序列中的部分E1和E3的部分序列删除。E1删除大小为2552bp(删除区域为(459bp-3010bp)，从而可获得复制缺陷型腺病毒载体。E3删除大小为3721bp(删除区域为27615bp-31335bp)。E1/E3删除可使外源基因插入的容量达7.5kb左右。

本发明人在E1删除区域加入酶切位点I-CeuI/PI-SceI(便于在此区域插入外源基因)，E3删除区域加入酶切位点SwaI(以便在此区域也可插入外源基因)，在AdC68基因组的ITR两侧分别加上PacI酶切位点(便于将重组腺病毒质粒用PacI线性化)。

为了便于观察该新型重组腺病毒的包装，本发明人在E1删除区的I-CeuI和PI-SceI酶切位点之间插入CMV-EGFP序列，获得pAdC68XY1-EGFP(SEQ ID NO:1)使获得的重组腺病毒(AdC68XY1-EGFP)带有绿色荧光标记。

在AdC68XY1基础上，本发明人对其进行改造，将E1区域、E3区域进行进一步删除，E4区部分替换为AdHu5来源，得到系列重组腺病毒载体AdC68XY5-10。各载体具体改造方案见表1(表中AdC68序列位点的计算基于GenBank登录号：AC_000011的序列；AdHu5序列位点的计算基于GenBank登录号：AC_000008.1的序列)。

表1

本发明腺病毒载体中，针对E1、E3和E4序列进行改造的改造示意图(AdC68XY5～AdC68XY10)见图1。

根据表1，AdC68XY5、AdC68XY6的E3序列如SEQ ID NO:2；AdC68XY7、AdC68XY8、AdC68XY9、AdC68XY10的E3序列如SEQ ID NO:3。

根据表1，AdC68XY5、AdC68XY7的E4序列如SEQ ID NO:4；AdC68XY6、AdC68XY8的E4序列如SEQ ID NO:5；AdC68XY9的E4序列如SEQ ID NO:6；AdC68XY10的E4序列如SEQ ID NO:7。

实施例2、pAdC68XY系列腺病毒载体的分子克隆及鉴定

基于以上设计的重组腺病毒pAdC68XY1-EGFP分子克隆序列，人工合成该分子克隆。

在获得的腺病毒载体pAdC68XY1-EGFP基础上，本发明人用按实施例1表1所描述以及图1所示的设计方案，利用等温重组分子克隆方法，对AdC68的E1、E3和E4序列进行改造，分别获得pAdC68XY5-EGFP、pAdC68XY6-EGFP、pAdC68XY7-EGFP、pAdC68XY8-EGFP、pAdC68XY9-EGFP、pAdC68XY10-EGFP腺病毒病毒载体。

将获得的系列腺病毒质粒pAdC68XY-EGFP用多种酶(MfeI、ApaI、XhoI)酶切后，经1％琼脂糖凝胶电泳，通过DNA条带证明系列腺病毒质粒pAdC68XY-EGFP分子克隆是完整、正确的。酶切鉴定电泳图见图2。

实施例3、AdC68XY系列腺病毒包装和扩增

将以上获得的重组腺病毒质粒pAdC68XY1-EGFP、pAdC68XY5-EGFP、pAdC68XY6-EGFP、pAdC68XY7-EGFP、pAdC68XY8-EGFP、pAdC68XY9-EGFP、pAdC68XY10-EGFP各取2ug，用PacI酶切线性化。

根据Lipofectamine 2000转染试剂盒的使用说明，将酶切后的腺病毒质粒DNA转染密度约70％的HEK 293细胞(6孔板)。转染前，换成无血清培养基，加入DNA/脂质体复合物，转染5小时后，换含10％FBS、1％双抗的DMEM培养基。在荧光显微镜下隔日观察EGFP荧光强度及细胞病变，直至HEK 293细胞出现大量噬斑时收集细胞，在室温与-80℃超低温冰箱之间反复冻融3次，3500rpm/min离心10min，收集上清置于-80℃超低温冰箱保种。

转染后，随着时间的推移，绿色荧光表达发生变化：荧光逐渐富集并形成簇状，最终形成噬斑，说明在HEK 293细胞中黑猩猩来源的复制缺陷型腺病毒AdC68XY1-EGFP、AdC68XY5-EGFP、AdC68XY6-EGFP、AdC68XY7-EGFP、pAdC68XY8-EGFP、AdC68XY9-EGFP、AdC68XY10-EGFP都成功包装并复制出具有感染性的病毒颗粒。

但是，不同改造的腺病毒拯救所需时间(由重组腺病毒质粒转染到细胞中，得到重组腺病毒的时间)，外源基因装载量和病毒产量存在明显差异，具体情况见表2。

表2

腺病毒	拯救时间	病毒滴度	病毒产量	装载量
					AdC68XY1-EGFP	10天	6.0×10<sup>12</sup>vp/ml	1.44×10<sup>13</sup>vp	7.5kb
AdC68XY5-EGFP	8天	5.3×10<sup>12</sup>vp/ml	1.96×10<sup>13</sup>vp	8.0kb
					AdC68XY6-EGFP	8天	4.6×10<sup>12</sup>vp/ml	1.43×10<sup>13</sup>vp	9.0kb
AdC68XY7-EGFP	5天	2.1×10<sup>13</sup>vp/ml	6.72×10<sup>13</sup>vp	8.0kb
					AdC68XY8-EGFP	5天	1.4×10<sup>13</sup>vp/ml	3.36×10<sup>13</sup>vp	9.0kb
AdC68XY9-EGFP	5天	1.6×10<sup>13</sup>vp/ml	4.80×10<sup>13</sup>vp	9.5kb
					AdC68XY10-EGFP	14天	4.2×10<sup>12</sup>vp/ml	1.01×10<sup>13</sup>vp	9.5kb

结果显示，E4区域替换为AdHu5来源的序列后，可极为显著地提高腺病毒产量。E3区域orf1、orf9的保留，有助于提高腺病毒产量。

并且，本发明人意外地发现，E4区域部分删除(orf1-2或orf1-3)仍可拯救出腺病毒，并可进一步提高外源基因的装载量，但orf6或orf6/7必须保留；其中，orf6/7或orf6的存在有利于获得相对更高的病毒产量。

除了表达“EGFR”作为外源基因，本发明人也进行了多种多样的其它类型的基因的表达，一些代表性的外源基因及其表达情况如表3。

表3

“+++”，表达量很高；“++”，表达量高；“+”，表达量中等。

结论

根据上述实施例，本发明人通过对腺病毒AdC68基因组序列进行分析、设计，并利用生物合成技术，整体合成重组腺病毒载体AdC68XY1，由于在设计时已经加上绿色荧光蛋白，经转染、病毒包装、扩增、纯化，本发明人直接获得重组腺病毒AdC68XY1-EGFP。经酶切鉴定分析，本发明人获得了正确的重组腺病毒载体AdC68XY。在此基础上，本发明人通过常规的分子克隆，对AdC68XY1做E1、E3区进一步删除，E4作进一步替换和删除，获得重组腺病毒AdC68XY5-EGFP、AdC68XY6-EGFP、AdC68XY7-EGFP、pAdC68XY8-EGFP、AdC68XY9-EGFP、AdC68XY10-EGFP，并获得相应的重组腺病毒。

本发明人不仅获得了一系列基于黑猩猩型腺病毒的新型载体AdC68XY，改造后的载体较传统的AdC68载体更适宜在包装细胞HEK293中生长、繁殖，产量高，从而可降低产品的生产成本；而且，改造后的载体外源基因装载量也大大提高了，进一步增加了腺病毒载体的适用性。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 苏州相奕生物技术有限公司

<120> 人工改造的重组腺病毒载体、由其包装的病毒及其应用

<130> 204575

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 35038

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(35038)

<223> pAdC68XY1-EGFP

<400> 1

gtcgagggat gagcgaccgt taggggcggg gcgagtgacg ttttgatgac gtggttgcga 60

ggaggagcca gtttgcaagt tctcgtggga aaagtgacgt caaacgaggt gtggtttgaa 120

cacggaaata ctcaattttc ccgcgctctc tgacaggaaa tgaggtgttt ctgggcggat 180

gcaagtgaaa acgggccatt ttcgcgcgaa aactgaatga ggaagtgaaa atctgagtaa 240

tttcgcgttt atggcaggga ggagtatttg ccgagggccg agtagacttt gaccgattac 300

gtgggggttt cgattaccgt gtttttcacc taaatttccg cgtacggtgt caaagtccgg 360

tgtttttacg tacgatatca tttccccgaa agtgccacct gaccgtaact ataacggtcc 420

taaggtagcg aaagctcaga tctcccgatc ccctatggtg cactctcagt acaatctgct 480

ctgatgccgc atagttaagc cagtatctgc tccctgcttg tgtgttggag gtcgctgagt 540

agtgcgcgag caaaatttaa gctacaacaa ggcaaggctt gaccgacaat tgcatgaaga 600

atctgcttag ggttaggcgt tttgcgctgc ttcgcgatgt acgggccaga tatacgcgtt 660

gacattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc 720

catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 780

acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 840

ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 900

aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 960

ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 1020

tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc 1080

ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt 1140

ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa 1200

tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctctctgg ctaactagag 1260

aacccactgc ttactggctt atcgaaatta atacgactca ctatagggag acccaagctg 1320

gctagcgttt aaacgggccc gcccgggctt ataagccacc atggtgagca agggcgagga 1380

gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac ggcgacgtaa acggccacaa 1440

gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac ggcaagctga ccctgaagtt 1500

catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc ctcgtgacca ccctgaccta 1560

cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag cagcacgact tcttcaagtc 1620

cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc ttcaaggacg acggcaacta 1680

caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg gtgaaccgca tcgagctgaa 1740

gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac aagctggagt acaactacaa 1800

cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac ggcatcaagg tgaacttcaa 1860

gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc gaccactacc agcagaacac 1920

ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac tacctgagca cccagtccgc 1980

cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc ctgctggagt tcgtgaccgc 2040

cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa ttataagccc gggcaagctt 2100

aagtttaaac cgctgatcag cctcgactgt gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg 2160

cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata 2220

aaatgaggaa attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt 2280

ggggcaggac agcaaggggg aggattggga agacaatagc aggcatgctg gggatgcggt 2340

gggctctatg gcttctgagg cggaaagaac cagcagatct gcagatctga attcatctat 2400

gtcgggtgcg gagaaagagg taatgaaatg gtattatggg tattatgggt ctgcattaat 2460

gaatcggtca gatatcgaca tatgctggcc accgtacatg tggcttccca tgctcgcaag 2520

ccctggcccg agttcgagca caatgtcatg accaggtgca atatgcatct ggggtcccgc 2580

cgaggcatgt tcatgcccta ccagtgcaac ctgaattatg tgaaggtgct gctggagccc 2640

gatgccatgt ccagagtgag cctgacgggg gtgtttgaca tgaatgtgga ggtgtggaag 2700

attctgagat atgatgaatc caagaccagg tgccgagcct gcgagtgcgg agggaagcat 2760

gccaggttcc agcccgtgtg tgtggatgtg acggaggacc tgcgacccga tcatttggtg 2820

ttgccctgca ccgggacgga gttcggttcc agcggggaag aatctgacta gagtgagtag 2880

tgttctgggg cgggggagga cctgcatgag ggccagaata actgaaatct gtgcttttct 2940

gtgtgttgca gcagcatgag cggaagcggc tcctttgagg gaggggtatt cagcccttat 3000

ctgacggggc gtctcccctc ctgggcggga gtgcgtcaga atgtgatggg atccacggtg 3060

gacggccggc ccgtgcagcc cgcgaactct tcaaccctga cctatgcaac cctgagctct 3120

tcgtcgttgg acgcagctgc cgccgcagct gctgcatctg ccgccagcgc cgtgcgcgga 3180

atggccatgg gcgccggcta ctacggcact ctggtggcca actcgagttc caccaataat 3240

cccgccagcc tgaacgagga gaagctgttg ctgctgatgg cccagctcga ggccttgacc 3300

cagcgcctgg gcgagctgac ccagcaggtg gctcagctgc aggagcagac gcgggccgcg 3360

gttgccacgg tgaaatccaa ataaaaaatg aatcaataaa taaacggaga cggttgttga 3420

ttttaacaca gagtctgaat ctttatttga tttttcgcgc gcggtaggcc ctggaccacc 3480

ggtctcgatc attgagcacc cggtggatct tttccaggac ccggtagagg tgggcttgga 3540

tgttgaggta catgggcatg agcccgtccc gggggtggag gtagctccat tgcagggcct 3600

cgtgctcggg ggtggtgttg taaatcaccc agtcatagca ggggcgcagg gcatggtgtt 3660

gcacaatatc tttgaggagg agactgatgg ccacgggcag ccctttggtg taggtgttta 3720

caaatctgtt gagctgggag ggatgcatgc ggggggagat gaggtgcatc ttggcctgga 3780

tcttgagatt ggcgatgtta ccgcccagat cccgcctggg gttcatgttg tgcaggacca 3840

ccagcacggt gtatccggtg cacttgggga atttatcatg caacttggaa gggaaggcgt 3900

gaaagaattt ggcgacgcct ttgtgcccgc ccaggttttc catgcactca tccatgatga 3960

tggcgatggg cccgtgggcg gcggcctggg caaagacgtt tcgggggtcg gacacatcat 4020

agttgtggtc ctgggtgagg tcatcatagg ccattttaat gaatttgggg cggagggtgc 4080

cggactgggg gacaaaggta ccctcgatcc cgggggcgta gttcccctca cagatctgca 4140

tctcccaggc tttgagctcg gaggggggga tcatgtccac ctgcggggcg ataaagaaca 4200

cggtttccgg ggcgggggag atgagctggg ccgaaagcaa gttccggagc agctgggact 4260

tgccgcagcc ggtggggccg tagatgaccc cgatgaccgg ctgcaggtgg tagttgaggg 4320

agagacagct gccgtcctcc cggaggaggg gggccacctc gttcatcatc tcgcgcacgt 4380

gcatgttctc gcgcaccagt tccgccagga ggcgctctcc ccccagggat aggagctcct 4440

ggagcgaggc gaagtttttc agcggcttga gtccgtcggc catgggcatt ttggagaggg 4500

tttgttgcaa gagttccagg cggtcccaga gctcggtgat gtgctctacg gcatctcgat 4560

ccagcagacc tcctcgtttc gcgggttggg acggctgcgg gagtagggca ccagacgatg 4620

ggcgtccagc gcagccaggg tccggtcctt ccagggtcgc agcgtccgcg tcagggtggt 4680

ctccgtcacg gtgaaggggt gcgcgccggg ctgggcgctt gcgagggtgc gcttcaggct 4740

catccggctg gtcgaaaacc gctcccgatc ggcgccctgc gcgtcggcca ggtagcaatt 4800

gaccatgagt tcgtagttga gcgcctcggc cgcgtggcct ttggcgcgga gcttaccttt 4860

ggaagtctgc ccgcaggcgg gacagaggag ggacttgagg gcgtagagct tgggggcgag 4920

gaagacggac tcgggggcgt aggcgtccgc gccgcagtgg gcgcagacgg tctcgcactc 4980

cacgagccag gtgaggtcgg gctggtcggg gtcaaaaacc agtttcccgc cgttcttttt 5040

gatgcgtttc ttacctttgg tctccatgag ctcgtgtccc cgctgggtga caaagaggct 5100

gtccgtgtcc ccgtagaccg actttatggg ccggtcctcg agcggtgtgc cgcggtcctc 5160

ctcgtagagg aaccccgccc actccgagac gaaagcccgg gtccaggcca gcacgaagga 5220

ggccacgtgg gacgggtagc ggtcgttgtc caccagcggg tccacctttt ccagggtatg 5280

caaacacatg tccccctcgt ccacatccag gaaggtgatt ggcttgtaag tgtaggccac 5340

gtgaccgggg gtcccggccg ggggggtata aaagggtgcg ggtccctgct cgtcctcact 5400

gtcttccgga tcgctgtcca ggagcgccag ctgttggggt aggtattccc tctcgaaggc 5460

gggcatgacc tcggcactca ggttgtcagt ttctagaaac gaggaggatt tgatattgac 5520

ggtgccggcg gagatgcctt tcaagagccc ctcgtccatc tggtcagaaa agacgatctt 5580

tttgttgtcg agcttggtgg cgaaggagcc gtagagggcg ttggagagga gcttggcgat 5640

ggagcgcatg gtctggtttt tttccttgtc ggcgcgctcc ttggcggcga tgttgagctg 5700

cacgtactcg cgcgccacgc acttccattc ggggaagacg gtggtcagct cgtcgggcac 5760

gattctgacc tgccagcccc gattatgcag ggtgatgagg tccacactgg tggccacctc 5820

gccgcgcagg ggctcattag tccagcagag gcgtccgccc ttgcgcgagc agaagggggg 5880

cagggggtcc agcatgacct cgtcgggggg gtcggcatcg atggtgaaga tgccgggcag 5940

gaggtcgggg tcaaagtagc tgatggaagt ggccagatcg tccagggcag cttgccattc 6000

gcgcacggcc agcgcgcgct cgtagggact gaggggcgtg ccccagggca tgggatgggt 6060

aagcgcggag gcgtacatgc cgcagatgtc gtagacgtag aggggctcct cgaggatgcc 6120

gatgtaggtg gggtagcagc gccccccgcg gatgctggcg cgcacgtagt catacagctc 6180

gtgcgagggg gcgaggagcc ccgggcccag gttggtgcga ctgggctttt cggcgcggta 6240

gacgatctgg cggaaaatgg catgcgagtt ggaggagatg gtgggccttt ggaagatgtt 6300

gaagtgggcg tggggcagtc cgaccgagtc gcggatgaag tgggcgtagg agtcttgcag 6360

cttggcgacg agctcggcgg tgactaggac gtccagagcg cagtagtcga gggtctcctg 6420

gatgatgtca tacttgagct gtcccttttg tttccacagc tcgcggttga gaaggaactc 6480

ttcgcggtcc ttccagtact cttcgagggg gaacccgtcc tgatctgcac ggtaagagcc 6540

tagcatgtag aactggttga cggccttgta ggcgcagcag cccttctcca cggggagggc 6600

gtaggcctgg gcggccttgc gcagggaggt gtgcgtgagg gcgaaagtgt ccctgaccat 6660

gaccttgagg aactggtgct tgaagtcgat atcgtcgcag cccccctgct cccagagctg 6720

gaagtccgtg cgcttcttgt aggcggggtt gggcaaagcg aaagtaacat cgttgaagag 6780

gatcttgccc gcgcggggca taaagttgcg agtgatgcgg aaaggttggg gcacctcggc 6840

ccggttgttg atgacctggg cggcgagcac gatctcgtcg aagccgttga tgttgtggcc 6900

cacgatgtag agttccacga atcgcggacg gcccttgacg tggggcagtt tcttgagctc 6960

ctcgtaggtg agctcgtcgg ggtcgctgag cccgtgctgc tcgagcgccc agtcggcgag 7020

atgggggttg gcgcggagga aggaagtcca gagatccacg gccagggcgg tttgcagacg 7080

gtcccggtac tgacggaact gctgcccgac ggccattttt tcgggggtga cgcagtagaa 7140

ggtgcggggg tccccgtgcc agcgatccca tttgagctgg agggcgagat cgagggcgag 7200

ctcgacgagc cggtcgtccc cggagagttt catgaccagc atgaagggga cgagctgctt 7260

gccgaaggac cccatccagg tgtaggtttc cacatcgtag gtgaggaaga gcctttcggt 7320

gcgaggatgc gagccgatgg ggaagaactg gatctcctgc caccaattgg aggaatggct 7380

gttgatgtga tggaagtaga aatgccgacg gcgcgccgaa cactcgtgct tgtgtttata 7440

caagcggcca cagtgctcgc aacgctgcac gggatgcacg tgctgcacga gctgtacctg 7500

agttcctttg acgaggaatt tcagtgggaa gtggagtcgt ggcgcctgca tctcgtgctg 7560

tactacgtcg tggtggtcgg cctggccctc ttctgcctcg atggtggtca tgctgacgag 7620

cccgcgcggg aggcaggtcc agacctcggc gcgagcgggt cggagagcga ggacgagggc 7680

gcgcaggccg gagctgtcca gggtcctgag acgctgcgga gtcaggtcag tgggcagcgg 7740

cggcgcgcgg ttgacttgca ggagtttttc cagggcgcgc gggaggtcca gatggtactt 7800

gatctccacc gcgccattgg tggcgacgtc gatggcttgc agggtcccgt gcccctgggg 7860

tgtgaccacc gtcccccgtt tcttcttggg cggctggggc gacgggggcg gtgcctcttc 7920

catggttaga agcggcggcg aggacgcgcg ccgggcggca ggggcggctc ggggcccgga 7980

ggcaggggcg gcaggggcac gtcggcgccg cgcgcgggta ggttctggta ctgcgcccgg 8040

agaagactgg cgtgagcgac gacgcgacgg ttgacgtcct ggatctgacg cctctgggtg 8100

aaggccacgg gacccgtgag tttgaacctg aaagagagtt cgacagaatc aatctcggta 8160

tcgttgacgg cggcctgccg caggatctct tgcacgtcgc ccgagttgtc ctggtaggcg 8220

atctcggtca tgaactgctc gatctcctcc tcttgaaggt ctccgcggcc ggcgcgctcc 8280

acggtggccg cgaggtcgtt ggagatgcgg cccatgagct gcgagaaggc gttcatgccc 8340

gcctcgttcc agacgcggct gtagaccacg acgccctcgg gatcgcgggc gcgcatgacc 8400

acctgggcga ggttgagctc cacgtggcgc gtgaagaccg cgtagttgca gaggcgctgg 8460

tagaggtagt tgagcgtggt ggcgatgtgc tcggtgacga agaaatacat gatccagcgg 8520

cggagcggca tctcgctgac gtcgcccagc gcctccaaac gttccatggc ctcgtaaaag 8580

tccacggcga agttgaaaaa ctgggagttg cgcgccgaga cggtcaactc ctcctccaga 8640

agacggatga gctcggcgat ggtggcgcgc acctcgcgct cgaaggcccc cgggagttcc 8700

tccacttcct cttcttcctc ctccactaac atctcttcta cttcctcctc aggcggcagt 8760

ggtggcgggg gagggggcct gcgtcgccgg cggcgcacgg gcagacggtc gatgaagcgc 8820

tcgatggtct cgccgcgccg gcgtcgcatg gtctcggtga cggcgcgccc gtcctcgcgg 8880

ggccgcagcg tgaagacgcc gccgcgcatc tccaggtggc cgggggggtc cccgttgggc 8940

agggagaggg cgctgacgat gcatcttatc aattgccccg tagggactcc gcgcaaggac 9000

ctgagcgtct cgagatccac gggatctgaa aaccgctgaa cgaaggcttc gagccagtcg 9060

cagtcgcaag gtaggctgag cacggtttct tctggcgggt catgttggtt gggagcgggg 9120

cgggcgatgc tgctggtgat gaagttgaaa taggcggttc tgagacggcg gatggtggcg 9180

aggagcacca ggtctttggg cccggcttgc tggatgcgca gacggtcggc catgccccag 9240

gcgtggtcct gacacctggc caggtccttg tagtagtcct gcatgagccg ctccacgggc 9300

acctcctcct cgcccgcgcg gccgtgcatg cgcgtgagcc cgaagccgcg ctggggctgg 9360

acgagcgcca ggtcggcgac gacgcgctcg gcgaggatgg cttgctggat ctgggtgagg 9420

gtggtctgga agtcatcaaa gtcgacgaag cggtggtagg ctccggtgtt gatggtgtag 9480

gagcagttgg ccatgacgga ccagttgacg gtctggtggc ccggacgcac gagctcgtgg 9540

tacttgaggc gcgagtaggc gcgcgtgtcg aagatgtagt cgttgcaggt gcgcaccagg 9600

tactggtagc cgatgaggaa gtgcggcggc ggctggcggt agagcggcca tcgctcggtg 9660

gcgggggcgc cgggcgcgag gtcctcgagc atggtgcggt ggtagccgta gatgtacctg 9720

gacatccagg tgatgccggc ggcggtggtg gaggcgcgcg ggaactcgcg gacgcggttc 9780

cagatgttgc gcagcggcag gaagtagttc atggtgggca cggtctggcc cgtgaggcgc 9840

gcgcagtcgt ggatgctcta tacgggcaaa aacgaaagcg gtcagcggct cgactccgtg 9900

gcctggaggc taagcgaacg ggttgggctg cgcgtgtacc ccggttcgaa tctcgaatca 9960

ggctggagcc gcagctaacg tggtattggc actcccgtct cgacccaagc ctgcaccaac 10020

cctccaggat acggaggcgg gtcgttttgc aacttttttt tggaggccgg atgagactag 10080

taagcgcgga aagcggccga ccgcgatggc tcgctgccgt agtctggaga agaatcgcca 10140

gggttgcgtt gcggtgtgcc ccggttcgag gccggccgga ttccgcggct aacgagggcg 10200

tggctgcccc gtcgtttcca agaccccata gccagccgac ttctccagtt acggagcgag 10260

cccctctttt gttttgtttg tttttgccag atgcatcccg tactgcggca gatgcgcccc 10320

caccaccctc caccgcaaca acagccccct ccacagccgg cgcttctgcc cccgccccag 10380

cagcaacttc cagccacgac cgccgcggcc gccgtgagcg gggctggaca gagttatgat 10440

caccagctgg ccttggaaga gggcgagggg ctggcgcgcc tgggggcgtc gtcgccggag 10500

cggcacccgc gcgtgcagat gaaaagggac gctcgcgagg cctacgtgcc caagcagaac 10560

ctgttcagag acaggagcgg cgaggagccc gaggagatgc gcgcggcccg gttccacgcg 10620

gggcgggagc tgcggcgcgg cctggaccga aagagggtgc tgagggacga ggatttcgag 10680

gcggacgagc tgacggggat cagccccgcg cgcgcgcacg tggccgcggc caacctggtc 10740

acggcgtacg agcagaccgt gaaggaggag agcaacttcc aaaaatcctt caacaaccac 10800

gtgcgcaccc tgatcgcgcg cgaggaggtg accctgggcc tgatgcacct gtgggacctg 10860

ctggaggcca tcgtgcagaa ccccaccagc aagccgctga cggcgcagct gttcctggtg 10920

gtgcagcata gtcgggacaa cgaagcgttc agggaggcgc tgctgaatat caccgagccc 10980

gagggccgct ggctcctgga cctggtgaac attctgcaga gcatcgtggt gcaggagcgc 11040

gggctgccgc tgtccgagaa gctggcggcc atcaacttct cggtgctgag tttgggcaag 11100

tactacgcta ggaagatcta caagaccccg tacgtgccca tagacaagga ggtgaagatc 11160

gacgggtttt acatgcgcat gaccctgaaa gtgctgaccc tgagcgacga tctgggggtg 11220

taccgcaacg acaggatgca ccgtgcggtg agcgccagca ggcggcgcga gctgagcgac 11280

caggagctga tgcatagtct gcagcgggcc ctgaccgggg ccgggaccga gggggagagc 11340

tactttgaca tgggcgcgga cctgcactgg cagcccagcc gccgggcctt ggaggcggcg 11400

gcaggaccct acgtagaaga ggtggacgat gaggtggacg aggagggcga gtacctggaa 11460

gactgatggc gcgaccgtat ttttgctaga tgcaacaaca acagccacct cctgatcccg 11520

cgatgcgggc ggcgctgcag agccagccgt ccggcattaa ctcctcggac gattggaccc 11580

aggccatgca acgcatcatg gcgctgacga cccgcaaccc cgaagccttt agacagcagc 11640

cccaggccaa ccggctctcg gccatcctgg aggccgtggt gccctcgcgc tccaacccca 11700

cgcacgagaa ggtcctggcc atcgtgaacg cgctggtgga gaacaaggcc atccgcggcg 11760

acgaggccgg cctggtgtac aacgcgctgc tggagcgcgt ggcccgctac aacagcacca 11820

acgtgcagac caacctggac cgcatggtga ccgacgtgcg cgaggccgtg gcccagcgcg 11880

agcggttcca ccgcgagtcc aacctgggat ccatggtggc gctgaacgcc ttcctcagca 11940

cccagcccgc caacgtgccc cggggccagg aggactacac caacttcatc agcgccctgc 12000

gcctgatggt gaccgaggtg ccccagagcg aggtgtacca gtccgggccg gactacttct 12060

tccagaccag tcgccagggc ttgcagaccg tgaacctgag ccaggctttc aagaacttgc 12120

agggcctgtg gggcgtgcag gccccggtcg gggaccgcgc gacggtgtcg agcctgctga 12180

cgccgaactc gcgcctgctg ctgctgctgg tggccccctt cacggacagc ggcagcatca 12240

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acgtggacga gcagacctac caggagatca cccacgtgag ccgcgccctg ggccaggacg 12360

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cgccccagta cgcgctcagc accgaggagg agcgcatcct gcgttacgtg cagcagagcg 12480

tgggcctgtt cctgatgcag gagggggcca cccccagcgc cgcgctcgac atgaccgcgc 12540

gcaacatgga gcccagcatg tacgccagca accgcccgtt catcaataaa ctgatggact 12600

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gccccttgtg gaagaaggaa ggcagcgacc gacgcccgtc ctcggcgctg tccggccgcg 12840

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tgaacagtat ccgcagcagc gagctgggca ggatcacgcg cccgcgcttg ctgggcgaag 12960

aggagtactt gaatgactcg ctgttgagac ccgagcggga gaagaacttc cccaataacg 13020

ggatagaaag cctggtggac aagatgagcc gctggaagac gtatgcgcag gagcacaggg 13080

acgatccccg ggcgtcgcag ggggccacga gccggggcag cgccgcccgt aaacgccggt 13140

ggcacgacag gcagcgggga cagatgtggg acgatgagga ctccgccgac gacagcagcg 13200

tgttggactt gggtgggagt ggtaacccgt tcgctcacct gcgcccccgt atcgggcgca 13260

tgatgtaaga gaaaccgaaa ataaatgata ctcaccaagg ccatggcgac cagcgtgcgt 13320

tcgtttcttc tctgttgttg ttgtatctag tatgatgagg cgtgcgtacc cggagggtcc 13380

tcctccctcg tacgagagcg tgatgcagca ggcgatggcg gcggcggcga tgcagccccc 13440

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tcgttactcg gagctggcac ccttgtacga taccacccgg ttgtacctgg tggacaacaa 13560

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tggggtgaca gtgacagagg attatgatgg tagtcaggat gagctgaagt atgaatgggt 13860

ggaatttgag ctgcccgaag gcaacttctc ggtgaccatg accatcgacc tgatgaacaa 13920

cgccatcatc gacaattact tggcggtggg gcggcagaac ggggtgctgg agagcgacat 13980

cggcgtgaag ttcgacacta ggaacttcag gctgggctgg gaccccgtga ccgagctggt 14040

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cttccaggaa ggcttccaga tcatgtacga ggatctggag gggggcaaca tccccgcgct 14220

cctggatgtc gacgcctatg agaaaagcaa ggaggatgca gcagctgaag caactgcagc 14280

cgtagctacc gcctctaccg aggtcagggg cgataatttt gcaagcgccg cagcagtggc 14340

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caagaacagg agctacaacg tactaccgga caagataaac accgcctacc gcagctggta 14460

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ctcggacgtc acctgcggcg tggagcaagt ctactggtcg ctgcccgaca tgatgcaaga 14580

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gaccctgccg ctgcgcagca gtatccgggg agtccagcgc gtgaccgtta ctgacgccag 14880

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cgtgcgcggg cacttccgcg ctccctgggg cgccctcaag ggccgcgtgc ggtcgcgcac 15120

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ggcggccaga cgcgcggctt caggcgccag cgccggcagg acccggagac gcgcggccac 15420

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aaggaagaga tgctccaggt catcgcgcct gagatctacg gccctgcggt ggtgaaggag 15660

gaaagaaagc cccgcaaaat caagcgggtc aaaaaggaca aaaaggaaga agaaagtgat 15720

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gggcggaagg tgcaaccggt gctgagaccc ggcaccaccg tggtcttcac gcccggcgag 15840

cgctccggca ccgcttccaa gcgctcctac gacgaggtgt acggggatga tgatattctg 15900

gagcaggcgg ccgagcgcct gggcgagttt gcttacggca agcgcagccg ttccgcaccg 15960

aaggaagagg cggtgtccat cccgctggac cacggcaacc ccacgccgag cctcaagccc 16020

gtgaccttgc agcaggtgct gccgaccgcg gcgccgcgcc gggggttcaa gcgcgagggc 16080

gaggatctgt accccaccat gcagctgatg gtgcccaagc gccagaagct ggaagacgtg 16140

ctggagacca tgaaggtgga cccggacgtg cagcccgagg tcaaggtgcg gcccatcaag 16200

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gaaacgcaga ccgagcccat gatcaagccc agcaccagca ccatggaggt gcagacggat 16320

ccctggatgc catcggctcc tagtcgaaga ccccggcgca agtacggcgc ggccagcctg 16380

ctgatgccca actacgcgct gcatccttcc atcatcccca cgccgggcta ccgcggcacg 16440

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cgcgcacctc tgaccctgcc gcgcgcgcgc taccacccga gcatcgccat ttaaactttc 16620

gcctgctttg cagatcaatg gccctcacat gccgccttcg cgttcccatt acgggctacc 16680

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agcgccactg agacacactt ggaaacatct tgtaataaac caatggactc tgacgctcct 16920

ggtcctgtga tgtgttttcg tagacagatg gaagacatca atttttcgtc cctggctccg 16980

cgacacggca cgcggccgtt catgggcacc tggagcgaca tcggcaccag ccaactgaac 17040

gggggcgcct tcaattggag cagtctctgg agcgggctta agaatttcgg gtccacgctt 17100

aaaacctatg gcagcaaggc gtggaacagc accacagggc aggcgctgag ggataagctg 17160

aaagagcaga acttccagca gaaggtggtc gatgggctcg cctcgggcat caacggggtg 17220

gtggacctgg ccaaccaggc cgtgcagcgg cagatcaaca gccgcctgga cccggtgccg 17280

cccgccggct ccgtggagat gccgcaggtg gaggaggagc tgcctcccct ggacaagcgg 17340

ggcgagaagc gaccccgccc cgatgcggag gagacgctgc tgacgcacac ggacgagccg 17400

cccccgtacg aggaggcggt gaaactgggt ctgcccacca cgcggcccat cgcgcccctg 17460

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tcccgcccct ctacagtggc taagcccctg ccgccggtgg ccgtggcccg cgcgcgaccc 17580

gggggcaccg cccgccctca tgcgaactgg cagagcactc tgaacagcat cgtgggtctg 17640

ggagtgcaga gtgtgaagcg ccgccgctgc tattaaacct accgtagcgc ttaacttgct 17700

tgtctgtgtg tgtatgtatt atgtcgccgc cgccgctgtc caccagaagg aggagtgaag 17760

aggcgcgtcg ccgagttgca agatggccac cccatcgatg ctgccccagt gggcgtacat 17820

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cgccacagac acctacttca gtctggggaa caagtttagg aaccccacgg tggcgcccac 17940

gcacgatgtg accaccgacc gcagccagcg gctgacgctg cgcttcgtgc ccgtggaccg 18000

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tgatcagcca atctacgcag ataaaaccta tcagcctgaa cctcaagtgg gtgatgctga 18360

atggcatgac atcactggta ctgatgaaaa gtatggaggc agagctctta agcctgatac 18420

caaaatgaag ccttgttatg gttcttttgc caagcctact aataaagaag gaggtcaggc 18480

aaatgtgaaa acaggaacag gcactactaa agaatatgac atagacatgg ctttctttga 18540

caacagaagt gcggctgctg ctggcctagc tccagaaatt gttttgtata ctgaaaatgt 18600

ggatttggaa actccagata cccatattgt atacaaagca ggcacagatg acagcagctc 18660

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caactttatc gggctcatgt actacaacag cactggcaat atgggggtgc tggccggtca 18780

ggcttctcag ctgaatgctg tggttgactt gcaagacaga aacaccgagc tgtcctacca 18840

gctcttgctt gactctctgg gtgacagaac ccggtatttc agtatgtgga atcaggcggt 18900

ggacagctat gatcctgatg tgcgcattat tgaaaatcat ggtgtggagg atgaacttcc 18960

caactattgt ttccctctgg atgctgttgg cagaacagat acttatcagg gaattaaggc 19020

taatggaact gatcaaacca catggaccaa agatgacagt gtcaatgatg ctaatgagat 19080

aggcaagggt aatccattcg ccatggaaat caacatccaa gccaacctgt ggaggaactt 19140

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gaaccccttc aaccaccacc gcaatgcggg gctgcgctac cgctccatgc tcctgggcaa 19380

cgggcgctac gtgcccttcc acatccaggt gccccagaaa tttttcgcca tcaagagcct 19440

cctgctcctg cccgggtcct acacctacga gtggaacttc cgcaaggacg tcaacatgat 19500

cctgcagagc tccctcggca acgacctgcg cacggacggg gcctccatct ccttcaccag 19560

catcaacctc tacgccacct tcttccccat ggcgcacaac acggcctcca cgctcgaggc 19620

catgctgcgc aacgacacca acgaccagtc cttcaacgac tacctctcgg cggccaacat 19680

gctctacccc atcccggcca acgccaccaa cgtgcccatc tccatcccct cgcgcaactg 19740

ggccgccttc cgcggctggt ccttcacgcg tctcaagacc aaggagacgc cctcgctggg 19800

ctccgggttc gacccctact tcgtctactc gggctccatc ccctacctcg acggcacctt 19860

ctacctcaac cacaccttca agaaggtctc catcaccttc gactcctccg tcagctggcc 19920

cggcaacgac cggctcctga cgcccaacga gttcgaaatc aagcgcaccg tcgacggcga 19980

gggctacaac gtggcccagt gcaacatgac caaggactgg ttcctggtcc agatgctggc 20040

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gccttcgtgc actggcccga ccgccccatg gacaagaacc ccaccatgaa cttgctgacg 21060

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aaatcgaaag ggttctgccg ggtctcggca tggcccgcgg gcagggacac gttgcggaac 21360

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aaggagtcgg tccacagctt ccgcgtcagt tgcagggcgc ccagcaggtc gggcgcggag 21480

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cagcactgga acaccatcag ggccgggtgc ttcacgctcg ccagcaccgt cgcgtcggtg 21600

atgctctcca cgtcgaggtc ctcggcgttg gccatcccga agggggtcat cttgcaggtc 21660

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agcatcatct gggcctggtc ggcgttcatc cccgggtaca tggccttcat gaaagcctcc 21780

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ggggaggccc ggcgcgacta catccgcgac tgcgtctacc tctacctctg ccacacctgg 24180

cagacgggca tgggcgtgtg gcagcagtgt ctggaggagc agaacctgaa agagctctgc 24240

aagctcctgc agaagaacct caagggtctg tggaccgggt tcgacgagcg caccaccgcc 24300

tcggacctgg ccgacctcat tttccccgag cgcctcaggc tgacgctgcg caacggcctg 24360

cccgacttta tgagccaaag catgttgcaa aactttcgct ctttcatcct cgaacgctcc 24420

ggaatcctgc ccgccacctg ctccgcgctg ccctcggact tcgtgccgct gaccttccgc 24480

gagtgccccc cgccgctgtg gagccactgc tacctgctgc gcctggccaa ctacctggcc 24540

taccactcgg acgtgatcga ggacgtcagc ggcgagggcc tgctcgagtg ccactgccgc 24600

tgcaacctct gcacgccgca ccgctccctg gcctgcaacc cccagctgct gagcgagacc 24660

cagatcatcg gcaccttcga gttgcaaggg cccagcgaag gcgagggttc agccgccaag 24720

gggggtctga aactcacccc ggggctgtgg acctcggcct acttgcgcaa gttcgtgccc 24780

gaggactacc atcccttcga gatcaggttc tacgaggacc aatcccatcc gcccaaggcc 24840

gagctgtcgg cctgcgtcat cacccagggg gcgatcctgg cccaattgca agccatccag 24900

aaatcccgcc aagaattctt gctgaaaaag ggccgcgggg tctacctcga cccccagacc 24960

ggtgaggagc tcaaccccgg cttcccccag gatgccccga ggaaacaaga agctgaaagt 25020

ggagctgccg cccgtggagg atttggagga agactgggag aacagcagtc aggcagagga 25080

ggaggagatg gaggaagact gggacagcac tcaggcagag gaggacagcc tgcaagacag 25140

tctggaggaa gacgaggagg aggcagagga ggaggtggaa gaagcagccg ccgccagacc 25200

gtcgtcctcg gcgggggaga aagcaagcag cacggatacc atctccgctc cgggtcgggg 25260

tcccgctcga ccacacagta gatgggacga gaccggacga ttcccgaacc ccaccaccca 25320

gaccggtaag aaggagcggc agggatacaa gtcctggcgg gggcacaaaa acgccatcgt 25380

ctcctgcttg caggcctgcg ggggcaacat ctccttcacc cggcgctacc tgctcttcca 25440

ccgcggggtg aactttcccc gcaacatctt gcattactac cgtcacctcc acagccccta 25500

ctacttccaa gaagaggcag cagcagcaga aaaagaccag cagaaaacca gcagctagaa 25560

aatccacagc ggcggcagca ggtggactga ggatcgcggc gaacgagccg gcgcaaaccc 25620

gggagctgag gaaccggatc tttcccaccc tctatgccat cttccagcag agtcgggggc 25680

aggagcagga actgaaagtc aagaaccgtt ctctgcgctc gctcacccgc agttgtctgt 25740

atcacaagag cgaagaccaa cttcagcgca ctctcgagga cgccgaggct ctcttcaaca 25800

agtactgcgc gctcactctt aaagagtagc ccgcgcccgc ccagtcgcag aaaaaggcgg 25860

gaattacgtc acctgtgccc ttcgccctag ccgcctccac ccatcatcat gagcaaagag 25920

attcccacgc cttacatgtg gagctaccag ccccagatgg gcctggccgc cggtgccgcc 25980

caggactact ccacccgcat gaattggctc agcgccgggc ccgcgatgat ctcacgggtg 26040

aatgacatcc gcgcccaccg aaaccagata ctcctagaac agtcagcgct caccgccacg 26100

ccccgcaatc acctcaatcc gcgtaattgg cccgccgccc tggtgtacca ggaaattccc 26160

cagcccacga ccgtactact tccgcgagac gcccaggccg aagtccagct gactaactca 26220

ggtgtccagc tggcgggcgg cgccaccctg tgtcgtcacc gccccgctca gggtataaag 26280

cggctggtga tccggggcag aggcacacag ctcaacgacg aggtggtgag ctcttcgctg 26340

ggtctgcgac ctgacggagt cttccaactc gccggatcgg ggagatcttc cttcacgcct 26400

cgtcaggccg tcctgacttt ggagagttcg tcctcgcagc cccgctcggg tggcatcggc 26460

actctccagt tcgtggagga gttcactccc tcggtctact tcaacccctt ctccggctcc 26520

cccggccact acccggacga gttcatcccg aacttcgacg ccatcagcga gtcggtggac 26580

ggctacgatt gaatgtccca tggtggcgca gctgacctag ctcggcttcg acacctggac 26640

cactgccgcc gcttccgctg cttcgctcgg gatctcgccg agtttgccta ctttgagctg 26700

cccgaggagc accctcaggg cccggcccac ggagtgcgga tcgtcgtcga agggggcctc 26760

gactcccacc tgcttcggat cttcagccag cgtccgatcc tggtcgagcg cgagcaagga 26820

cagacccttc tgactctgta ctgcatctgc aaccaccccg gcctgcatga aagtctttgt 26880

tgtctgctgt gtactgagta taataaaagc tgagatcagc gactactccg gacttccgtg 26940

tgttcctgaa tccatcaacc agtctttgtt cttcaccggg aacgagaccg agctccagct 27000

ccagtgtaag ccccacaaga agtacctcac ctggctgttc cagggctccc cgatcgccgt 27060

tgtcaaccac tgcgacaacg actatttaaa tccacaatac atgcccatat tagactatga 27120

ggccgagcca cagcgaccca tgctccccgc tattagttac ttcaatctaa ccggcggaga 27180

tgactgaccc actggccaac aacaacgtca acgaccttct cctggacatg gacggccgcg 27240

cctcggagca gcgactcgcc caacttcgca ttcgccagca gcaggagaga gccgtcaagg 27300

agctgcagga tgcggtggcc atccaccagt gcaagagagg catcttctgc ctggtgaaac 27360

aggccaagat ctcctacgag gtcactccaa acgaccatcg cctctcctac gagctcctgc 27420

agcagcgcca gaagttcacc tgcctggtcg gagtcaaccc catcgtcatc acccagcagt 27480

ctggcgatac caaggggtgc atccactgct cctgcgactc ccccgactgc gtccacactc 27540

tgatcaagac cctctgcggc ctccgcgacc tcctccccat gaactaatca cccccttatc 27600

cagtgaaata aagatcatat tgatgatgat tttacagaaa taaaaaataa tcatttgatt 27660

tgaaataaag atacaatcat attgatgatt tgagtttaac aaaaaaataa agaatcactt 27720

acttgaaatc tgataccagg tctctgtcca tgttttctgc caacaccact tcactcccct 27780

cttcccagct ctggtactgc aggccccggc gggctgcaaa cttcctccac acgctgaagg 27840

ggatgtcaaa ttcctcctgt ccctcaatct tcattttatc ttctatcaga tgtccaaaaa 27900

gcgcgtccgg gtggatgatg acttcgaccc cgtctacccc tacgatgcag acaacgcacc 27960

gaccgtgccc ttcatcaacc cccccttcgt ctcttcagat ggattccaag agaagcccct 28020

gggggtgttg tccctgcgac tggccgaccc cgtcaccacc aagaacgggg aaatcaccct 28080

caagctggga gagggggtgg acctcgattc ctcgggaaaa ctcatctcca acacggccac 28140

caaggccgcc gcccctctca gtttttccaa caacaccatt tcccttaaca tggatcaccc 28200

cttttacact aaagatggaa aattatcctt acaagtttct ccaccattaa atatactgag 28260

aacaagcatt ctaaacacac tagctttagg ttttggatca ggtttaggac tccgtggctc 28320

tgccttggca gtacagttag tctctccact tacatttgat actgatggaa acataaagct 28380

taccttagac agaggtttgc atgttacaac aggagatgca attgaaagca acataagctg 28440

ggctaaaggt ttaaaatttg aagatggagc catagcaacc aacattggaa atgggttaga 28500

gtttggaagc agtagtacag aaacaggtgt tgatgatgct tacccaatcc aagttaaact 28560

tggatctggc cttagctttg acagtacagg agccataatg gctggtaaca aagaagacga 28620

taaactcact ttgtggacaa cacctgatcc atcaccaaac tgtcaaatac tcgcagaaaa 28680

tgatgcaaaa ctaacacttt gcttgactaa atgtggtagt caaatactgg ccactgtgtc 28740

agtcttagtt gtaggaagtg gaaacctaaa ccccattact ggcaccgtaa gcagtgctca 28800

ggtgtttcta cgttttgatg caaacggtgt tcttttaaca gaacattcta cactaaaaaa 28860

atactggggg tataggcagg gagatagcat agatggcact ccatatacca atgctgtagg 28920

attcatgccc aatttaaaag cttatccaaa gtcacaaagt tctactacta aaaataatat 28980

agtagggcaa gtatacatga atggagatgt ttcaaaacct atgcttctca ctataaccct 29040

caatggtact gatgacagca acagtacata ttcaatgtca ttttcataca cctggactaa 29100

tggaagctat gttggagcaa catttggggc taactcttat accttctcat acatcgccca 29160

agaatgaaca ctgtatccca ccctgcatgc caacccttcc caccccactc tgtggaacaa 29220

actctgaaac acaaaataaa ataaagttca agtgttttat tgattcaaca gttttacagg 29280

attcgagcag ttatttttcc tccaccctcc caggacatgg aatacaccac cctctccccc 29340

cgcacagcct tgaacatctg aatgccattg gtgatggaca tgcttttggt ctccacgttc 29400

cacacagttt cagagcgagc cagtctcggg tcggtcaggg agatgaaacc ctccgggcac 29460

tcccgcatct gcacctcaca gctcaacagc tgaggattgt cctcggtggt cgggatcacg 29520

gttatctgga agaagcagaa gagcggcggt gggaatcata gtccgcgaac gggatcggcc 29580

ggtggtgtcg catcaggccc cgcagcagtc gctgccgccg ccgctccgtc aagctgctgc 29640

tcagggggtc cgggtccagg gactccctca gcatgatgcc cacggccctc agcatcagtc 29700

gtctggtgcg gcgggcgcag cagcgcatgc ggatctcgct caggtcgctg cagtacgtgc 29760

aacacagaac caccaggttg ttcaacagtc catagttcaa cacgctccag ccgaaactca 29820

tcgcgggaag gatgctaccc acgtggccgt cgtaccagat cctcaggtaa atcaagtggt 29880

gccccctcca gaacacgctg cccacgtaca tgatctcctt gggcatgtgg cggttcacca 29940

cctcccggta ccacatcacc ctctggttga acatgcagcc ccggatgatc ctgcggaacc 30000

acagggccag caccgccccg cccgccatgc agcgaagaga ccccgggtcc cggcaatggc 30060

aatggaggac ccaccgctcg tacccgtgga tcatctggga gctgaacaag tctatgttgg 30120

cacagcacag gcatatgctc atgcatctct tcagcactct caactcctcg ggggtcaaaa 30180

ccatatccca gggcacgggg aactcttgca ggacagcgaa ccccgcagaa cagggcaatc 30240

ctcgcacaga acttacattg tgcatggaca gggtatcgca atcaggcagc accgggtgat 30300

cctccaccag agaagcgcgg gtctcggtct cctcacagcg tggtaagggg gccggccgat 30360

acgggtgatg gcgggacgcg gctgatcgtg ttcgcgaccg tgtcatgatg cagttgcttt 30420

cggacatttt cgtacttgct gtagcagaac ctggtccggg cgctgcacac cgatcgccgg 30480

cggcggtctc ggcgcttgga acgctcggtg ttgaaattgt aaaacagcca ctctctcaga 30540

ccgtgcagca gatctagggc ctcaggagtg atgaagatcc catcatgcct gatggctctg 30600

atcacatcga ccaccgtgga atgggccaga cccagccaga tgatgcaatt ttgttgggtt 30660

tcggtgacgg cgggggaggg aagaacagga agaaccatga ttaactttta atccaaacgg 30720

tctcggagta cttcaaaatg aagatcgcgg agatggcacc tctcgccccc gctgtgttgg 30780

tggaaaataa cagccaggtc aaaggtgata cggttctcga gatgttccac ggtggcttcc 30840

agcaaagcct ccacgcgcac atccagaaac aagacaatag cgaaagcggg agggttctct 30900

aattcctcaa tcatcatgtt acactcctgc accatcccca gataattttc atttttccag 30960

ccttgaatga ttcgaactag ttcctgaggt aaatccaagc cagccatgat aaagagctcg 31020

cgcagagcgc cctccaccgg cattcttaag cacaccctca taattccaag atattctgct 31080

cctggttcac ctgcagcaga ttgacaagcg gaatatcaaa atctctgccg cgatccctga 31140

gctcctccct cagcaataac tgtaagtact ctttcatatc ctctccgaaa tttttagcca 31200

taggaccacc aggaataaga ttagggcaag ccacagtaca gataaaccga agtcctcccc 31260

agtgagcatt gccaaatgca agactgctat aagcatgctg gctagacccg gtgatatctt 31320

ccagataact ggacagaaaa tcgcccaggc aatttttaag aaaatcaaca aaagaaaaat 31380

cctccaggtg gacgtttaga gcctcgggaa caacgatgaa gtaaatgcaa gcggtgcgtt 31440

ccagcatggt tagttagctg atctgtagaa aaaacaaaaa tgaacattaa accatgctag 31500

cctggcgaac aggtgggtaa atcgttctct ccagcaccag gcaggccacg gggtctccgg 31560

cgcgaccctc gtaaaaattg tcgctatgat tgaaaaccat cacagagaga cgttcccggt 31620

ggccggcgtg aatgattcga caagatgaat acacccccgg aacattggcg tccgcgagtg 31680

aaaaaaagcg cccgaggaag caataaggca ctacaatgct cagtctcaag tccagcaaag 31740

cgatgccatg cggatgaagc acaaaattct caggtacaaa atgtaattac tcccctcctg 31800

cacaggcagc aaagcccccg atccctccag gtacacatac aaagcctcag cgtccatagc 31860

ttaccgagca gcagcacaca acaggcgcaa gagtcagaga aaggctgagc tctaacctgt 31920

ccacccgctc tctgctcaat atatagccca gatctacact gacgtaaagg ccaaagtcta 31980

aaaatacccg ccaaataatc acacacgccc agcacacgcc cagaaaccgg tgacacactc 32040

aaaaaaatac gcgcacttcc tcaaacgccc aaaactgccg tcatttccgg gttcccacgc 32100

tacgtcatca aaacacgact ttcaaattcc gtcgaccgtt aaaaacgtca cccgccccgc 32160

ccctaacggt cgcccgtctc tcagccaatc agcgccccgc atccccaaat tcaaacacct 32220

catttgcata ttaacgcgca caaaaagttt gaggtatatt attgatgatg gttaattaag 32280

ggaattcact ggccgtcgtt ttacaacgtc gtgactggga aaaccctggc gttacccaac 32340

ttaatcgcct tgcagcacat ccccctttcg ccagctggcg taatagcgaa gaggcccgca 32400

ccgatcgccc ttcccaacag ttgcgcagcc tgaatggcga atggcgcctg atgcggtatt 32460

ttctccttac gcatctgtgc ggtatttcac accgcatatg gtgcactctc agtacaatct 32520

gctctgatgc cgcatagtta agccagcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct 32580

gacgggcttg tctgctcccg gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct 32640

gcatgtgtca gaggttttca ccgtcatcac cgaaacgcgc gagacgaaag ggcctcgtga 32700

tacgcctatt tttataggtt aatgtcatga taataatggt ttcttagacg tcaggtggca 32760

cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt tttctaaata cattcaaata 32820

tgtatccgct catgagacaa taaccctgat aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga 32880

gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc 32940

ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg 33000

cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc 33060

ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat 33120

cccgtattga cgccgggcaa gagcaactcg gtcgccgcat acactattct cagaatgact 33180

tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat 33240

tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata acactgcggc caacttactt ctgacaacga 33300

tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc 33360

ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga 33420

tgcctgtagc aatggcaaca acgttgcgca aactattaac tggcgaacta cttactctag 33480

cttcccggca acaattaata gactggatgg aggcggataa agttgcagga ccacttctgc 33540

gctcggccct tccggctggc tggtttattg ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt 33600

ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct 33660

acacgacggg gagtcaggca actatggatg aacgaaatag acagatcgct gagataggtg 33720

cctcactgat taagcattgg taactgtcag accaagttta ctcatatata ctttagattg 33780

atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt gataatctca 33840

tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga 33900

tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa 33960

aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga 34020

aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt tcttctagtg tagccgtagt 34080

taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt 34140

taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat 34200

agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct 34260

tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca 34320

cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag 34380

agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc 34440

gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga 34500

aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca 34560

tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag 34620

ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg 34680

aagagcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat taatgcagct 34740

ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt aatgtgagtt 34800

agctcactca ttaggcaccc caggctttac actttatgct tccggctcgt atgttgtgtg 34860

gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagcta tgaccatgat tacgccaagc 34920

ttgcatgcct gcaggtttaa acccttaatt aaccatcttc aataatatac ctcaaacttt 34980

ttgtgcgcgt taatatgcaa atgaggcgtt tgaatttggg gaggaagggc ggtgattg 35038

<210> 2

<211> 408

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(408)

<223> AdC68XY5、AdC68XY6的 E3序列

<400> 2

atgactgacc cactggccaa caacaacgtc aacgaccttc tcctggacat ggacggccgc 60

gcctcggagc agcgactcgc ccaacttcgc attcgccagc agcaggagag agccgtcaag 120

gagctgcagg atgcggtggc catccaccag tgcaagagag gcatcttctg cctggtgaaa 180

caggccaaga tctcctacga ggtcactcca aacgaccatc gcctctccta cgagctcctg 240

cagcagcgcc agaagttcac ctgcctggtc ggagtcaacc ccatcgtcat cacccagcag 300

tctggcgata ccaaggggtg catccactgc tcctgcgact cccccgactg cgtccacact 360

ctgatcaaga ccctctgcgg cctccgcgac ctcctcccca tgaactaa 408

<210> 3

<211> 737

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(737)

<223> AdC68XY7\ AdC68XY8\ AdC68XY9\ AdC68XY10 的E3序列

<400> 3

atgtcccatg gtggcgcagc tgacctagct cggcttcgac acctggacca ctgccgccgc 60

ttccgctgct tcgctcggga tctcgccgag tttgcctact ttgagctgcc cgaggagcac 120

cctcagggcc cggcccacgg agtgcggatc gtcgtcgaag ggggcctcga ctcccacctg 180

cttcggatct tcagccagcg tccgatcctg gtcgagcgcg agcaaggaca gacccttctg 240

actctgtact gcatctgcaa ccaccccggc ctgcatgaaa gtctttgttg tctgctgtgt 300

actgagtata ataaaagctg aatttaaata tgactgaccc actggccaac aacaacgtca 360

acgaccttct cctggacatg gacggccgcg cctcggagca gcgactcgcc caacttcgca 420

ttcgccagca gcaggagaga gccgtcaagg agctgcagga tgcggtggcc atccaccagt 480

gcaagagagg catcttctgc ctggtgaaac aggccaagat ctcctacgag gtcactccaa 540

acgaccatcg cctctcctac gagctcctgc agcagcgcca gaagttcacc tgcctggtcg 600

gagtcaaccc catcgtcatc acccagcagt ctggcgatac caaggggtgc atccactgct 660

cctgcgactc ccccgactgc gtccacactc tgatcaagac cctctgcggc ctccgcgacc 720

tcctccccat gaactaa 737

<210> 4

<211> 2594

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(2594)

<223> AdC68XY5 \AdC68XY7的E4序列

<400> 4

tcacagaacc ctagtattca acctgccacc tccctcccaa cacacagagt acacagtcct 60

ttctccccgg ctggccttaa aaagcatcat atcatgggta acagacatat tcttaggtgt 120

tatattccac acggtttcct gtcgagccaa acgctcatca gtgatattaa taaactcccc 180

gggcagctca cttaagttca tgtcgctgtc cagctgctga gccacaggct gctgtccaac 240

ttgcggttgc ttaacgggcg gcgaaggaga agtccacgcc tacatggggg tagagtcata 300

atcgtgcatc aggatagggc ggtggtgctg cagcagcgcg cgaataaact gctgccgccg 360

ccgctccgtc ctgcaggaat acaacatggc agtggtctcc tcagcgatga ttcgcaccgc 420

ccgcagcata aggcgccttg tcctccgggc acagcagcgc accctgatct cacttaaatc 480

agcacagtaa ctgcagcaca gcaccacaat attgttcaaa atcccacagt gcaaggcgct 540

gtatccaaag ctcatggcgg ggaccacaga acccacgtgg ccatcatacc acaagcgcag 600

gtagattaag tggcgacccc tcataaacac gctggacata aacattacct cttttggcat 660

gttgtaattc accacctccc ggtaccatat aaacctctga ttaaacatgg cgccatccac 720

caccatccta aaccagctgg ccaaaacctg cccgccggct atacactgca gggaaccggg 780

actggaacaa tgacagtgga gagcccagga ctcgtaacca tggatcatca tgctcgtcat 840

gatatcaatg ttggcacaac acaggcacac gtgcatacac ttcctcagga ttacaagctc 900

ctcccgcgtt agaaccatat cccagggaac aacccattcc tgaatcagcg taaatcccac 960

actgcaggga agacctcgca cgtaactcac gttgtgcatt gtcaaagtgt tacattcggg 1020

cagcagcgga tgatcctcca gtatggtagc gcgggtttct gtctcaaaag gaggtagacg 1080

atccctactg tacggagtgc gccgagacaa ccgagatcgt gttggtcgta gtgtcatgcc 1140

aaatggaacg ccggacgtag tcattttcgt acttgctgta gcagaacctg gtccgggcgc 1200

tgcacaccga tcgccggcgg cggtctcggc gcttggaacg ctcggtgttg aaattgtaaa 1260

acagccactc tctcagaccg tgcagcagat ctagggcctc aggagtgatg aagatcccat 1320

catgcctgat ggctctgatc acatcgacca ccgtggaatg ggccagaccc agccagatga 1380

tgcaattttg ttgggtttcg gtgacggcgg gggagggaag aacaggaaga accatgatta 1440

acttttaatc caaacggtct cggagtactt caaaatgaag atcgcggaga tggcacctct 1500

cgcccccgct gtgttggtgg aaaataacag ccaggtcaaa ggtgatacgg ttctcgagat 1560

gttccacggt ggcttccagc aaagcctcca cgcgcacatc cagaaacaag acaatagcga 1620

aagcgggagg gttctctaat tcctcaatca tcatgttaca ctcctgcacc atccccagat 1680

aattttcatt tttccagcct tgaatgattc gaactagttc ctgaggtaaa tccaagccag 1740

ccatgataaa gagctcgcgc agagcgccct ccaccggcat tcttaagcac accctcataa 1800

ttccaagata ttctgctcct ggttcacctg cagcagattg acaagcggaa tatcaaaatc 1860

tctgccgcga tccctgagct cctccctcag caataactgt aagtactctt tcatatcctc 1920

tccgaaattt ttagccatag gaccaccagg aataagatta gggcaagcca cagtacagat 1980

aaaccgaagt cctccccagt gagcattgcc aaatgcaaga ctgctataag catgctggct 2040

agacccggtg atatcttcca gataactgga cagaaaatcg cccaggcaat ttttaagaaa 2100

atcaacaaaa gaaaaatcct ccaggtggac gtttagagcc tcgggaacaa cgatgaagta 2160

aatgcaagcg gtgcgttcca gcatggttag ttagctgatc tgtagaaaaa acaaaaatga 2220

acattaaacc atgctagcct ggcgaacagg tgggtaaatc gttctctcca gcaccaggca 2280

ggccacgggg tctccggcgc gaccctcgta aaaattgtcg ctatgattga aaaccatcac 2340

agagagacgt tcccggtggc cggcgtgaat gattcgacaa gatgaataca cccccggaac 2400

attggcgtcc gcgagtgaaa aaaagcgccc gaggaagcaa taaggcacta caatgctcag 2460

tctcaagtcc agcaaagcga tgccatgcgg atgaagcaca aaattctcag gtacaaaatg 2520

taattactcc cctcctgcac aggcagcaaa gcccccgatc cctccaggta cacatacaaa 2580

gcctcagcgt ccat 2594

<210> 5

<211> 1511

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1511)

<223> AdC68XY6\AdC68XY8 的E4序列

<400> 5

ctacatgggg gtagagtcat aatcgtgcat caggataggg cggtggtgct gcagcagcgc 60

gcgaataaac tgctgccgcc gccgctccgt cctgcaggaa tacaacatgg cagtggtctc 120

ctcagcgatg attcgcaccg cccgcagcat aaggcgcctt gtcctccggg cacagcagcg 180

caccctgatc tcacttaaat cagcacagta actgcagcac agcaccacaa tattgttcaa 240

aatcccacag tgcaaggcgc tgtatccaaa gctcatggcg gggaccacag aacccacgtg 300

gccatcatac cacaagcgca ggtagattaa gtggcgaccc ctcataaaca cgctggacat 360

aaacattacc tcttttggca tgttgtaatt caccacctcc cggtaccata taaacctctg 420

attaaacatg gcgccatcca ccaccatcct aaaccagctg gccaaaacct gcccgccggc 480

tatacactgc agggaaccgg gactggaaca atgacagtgg agagcccagg actcgtaacc 540

atggatcatc atgctcgtca tgatatcaat gttggcacaa cacaggcaca cgtgcataca 600

cttcctcagg attacaagct cctcccgcgt tagaaccata tcccagggaa caacccattc 660

ctgaatcagc gtaaatccca cactgcaggg aagacctcgc acgtaactca cgttgtgcat 720

tgtcaaagtg ttacattcgg gcagcagcgg atgatcctcc agtatggtag cgcgggtttc 780

tgtctcaaaa ggaggtagac gatccctact gtacggagtg cgccgagaca accgagatcg 840

tgttggtcgt agtgtcatgc caaatggaac gccggacgta gtcatatttc ctgaagcaaa 900

accaggtgcg ggcgtgacaa acagatctgc gtctccggtc tcgccgctta gatcgctctg 960

tgtagtagtt gtagtatatc cactctctca aagcatccag gcgccccctg gcttcgggtt 1020

ctatgtaaac tccttcatgc gccgctgccc tgataacatc caccaccgca gaataagcca 1080

cacccagcca acctacacat tcgttctgcg agtcacacac gggaggagcg ggaagagctg 1140

gaagaaccat gttttttttt ttattccaaa agattatcca aaacctcaaa atgaagatct 1200

attaagtgaa cgcgctcccc tccggtggcg tggtcaaact ctacagccaa agaacagata 1260

atggcatttg taagatgttg cacaatggct tccaaaaggc aaacggccct cacgtccaag 1320

tggacgtaaa ggctaaaccc ttcagggtga atctcctcta taaacattcc agcaccttca 1380

accatgccca aataattctc atctcgccac cttctcaata tatctctaag caaatcccga 1440

atattaagtc cggccattgt aaaaatctgc tccagagcgc cctccacctt cagcctcaag 1500

cagcgaatca t 1511

<210> 6

<211> 1435

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1435)

<223> AdC68XY9的 E4序列

<400> 6

tcacagaacc ctagtattca acctgccacc tccctcccaa cacacagagt acacagtcct 60

ttctccccgg ctggccttaa aaagcatcat atcatgggta acagacatat tcttaggtgt 120

tatattccac acggtttcct gtcgagccaa acgctcatca gtgatattaa taaactcccc 180

gggcagctca cttaagttca tgtcgctgtc cagctgctga gccacaggct gctgtccaac 240

ttgcggttgc ttaacgggcg gcgaaggaga agtccacgcc tacatggggg tagagtcata 300

atcgtgcatc aggatagggc ggtggtgctg cagcagcgcg cgaataaact gctgccgccg 360

ccgctccgtc ctgcaggaat acaacatggc agtggtctcc tcagcgatga ttcgcaccgc 420

ccgcagcata aggcgccttg tcctccgggc acagcagcgc accctgatct cacttaaatc 480

agcacagtaa ctgcagcaca gcaccacaat attgttcaaa atcccacagt gcaaggcgct 540

gtatccaaag ctcatggcgg ggaccacaga acccacgtgg ccatcatacc acaagcgcag 600

gtagattaag tggcgacccc tcataaacac gctggacata aacattacct cttttggcat 660

gttgtaattc accacctccc ggtaccatat aaacctctga ttaaacatgg cgccatccac 720

caccatccta aaccagctgg ccaaaacctg cccgccggct atacactgca gggaaccggg 780

actggaacaa tgacagtgga gagcccagga ctcgtaacca tggatcatca tgctcgtcat 840

gatatcaatg ttggcacaac acaggcacac gtgcatacac ttcctcagga ttacaagctc 900

ctcccgcgtt agaaccatat cccagggaac aacccattcc tgaatcagcg taaatcccac 960

actgcaggga agacctcgca cgtaactcac gttgtgcatt gtcaaagtgt tacattcggg 1020

cagcagcgga tgatcctcca gtatggtagc gcgggtttct gtctcaaaag gaggtagacg 1080

atccctactg tacggagtgc gccgagacaa ccgagatcgt gttggtcgta gtgtcatgcc 1140

aaatggaacg ccggacgtag tcattttcgt acttgctgta gcagaacctg gtccgggcgc 1200

tgcacaccga tcgccggcgg cggtctcggc gcttggaacg ctcggtgttg aaattgtaaa 1260

acagccactc tctcagaccg tgcagcagat ctagggcctc aggagtgatg aagatcccat 1320

catgcctgat ggctctgatc acatcgacca ccgtggaatg ggccagaccc agccagatga 1380

tgcaattttg ttgggtttcg gtgacggcgg gggagggaag aacaggaaga accat 1435

<210> 7

<211> 1150

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1150)

<223> AdC68XY10的 E4序列

<400> 7

ctacatgggg gtagagtcat aatcgtgcat caggataggg cggtggtgct gcagcagcgc 60

gcgaataaac tgctgccgcc gccgctccgt cctgcaggaa tacaacatgg cagtggtctc 120

ctcagcgatg attcgcaccg cccgcagcat aaggcgcctt gtcctccggg cacagcagcg 180

caccctgatc tcacttaaat cagcacagta actgcagcac agcaccacaa tattgttcaa 240

aatcccacag tgcaaggcgc tgtatccaaa gctcatggcg gggaccacag aacccacgtg 300

gccatcatac cacaagcgca ggtagattaa gtggcgaccc ctcataaaca cgctggacat 360

aaacattacc tcttttggca tgttgtaatt caccacctcc cggtaccata taaacctctg 420

attaaacatg gcgccatcca ccaccatcct aaaccagctg gccaaaacct gcccgccggc 480

tatacactgc agggaaccgg gactggaaca atgacagtgg agagcccagg actcgtaacc 540

atggatcatc atgctcgtca tgatatcaat gttggcacaa cacaggcaca cgtgcataca 600

cttcctcagg attacaagct cctcccgcgt tagaaccata tcccagggaa caacccattc 660

ctgaatcagc gtaaatccca cactgcaggg aagacctcgc acgtaactca cgttgtgcat 720

tgtcaaagtg ttacattcgg gcagcagcgg atgatcctcc agtatggtag cgcgggtttc 780

tgtctcaaaa ggaggtagac gatccctact gtacggagtg cgccgagaca accgagatcg 840

tgttggtcgt agtgtcatgc caaatggaac gccggacgta gtcatatttc ctgaagcaaa 900

accaggtgcg ggcgtgacaa acagatctgc gtctccggtc tcgccgctta gatcgctctg 960

tgtagtagtt gtagtatatc cactctctca aagcatccag gcgccccctg gcttcgggtt 1020

ctatgtaaac tccttcatgc gccgctgccc tgataacatc caccaccgca gaataagcca 1080

cacccagcca acctacacat tcgttctgcg agtcacacac gggaggagcg ggaagagctg 1140

gaagaaccat 1150

Claims (13)

1.一种制备腺病毒表达载体的方法，包括：基于黑猩猩型腺病毒AdC68基因组序列，完全删除其E1序列，改造其E3序列和E4序列，所述改造包括：

(1)改造其E3序列，保留其orf9、较佳地保留其orf9和orf1，部分或全部删除其它E3的orf序列；和

(2)改造其E4序列，以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf6和/或orf6/7替换其E4序列中orf6和/或orf6/7；可选地，还以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf4和/或orf3替换其E4序列中orf4和/或orf3；较佳地还删除其E4序列中orf1、orf2和/或orf3。

2.一种重组腺病毒载体，包括以黑猩猩型腺病毒AdC68基因组为基础的序列，其中E1序列被完全删除，E3序列和E4序列被改造；所述改造包括：

(1)E3序列中，其orf9被保留、较佳地其orf9和orf1被保留，其它orf序列部分或全部被删除；和

(2)E4序列中，以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf6和/或orf6/7替换其E4序列中orf6和/或orf6/7；可选地，还以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf4和/或orf3替换其E4序列中orf4和/或orf3；较佳地其E4序列中orf1、orf2和/或orf3被删除。

3.如权利要求1所述的方法或权利要求2所述的重组腺病毒载体，其特征在于，(2)中，所述C亚型人腺病毒包括(但不限于)：人血清5型腺病毒AdHu5，AdHu1，AdHu2，AdHu6；较佳地为AdHu5。

4.如权利要求1所述的方法或权利要求2所述的重组腺病毒载体，其特征在于，(2)中，E4序列改造包括选自：

(a)以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf6/7和orf6替换其E4序列中orf6/7和orf6；删除其E4序列中orf1、orf2和orf3；

(b)以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf6、orf4和orf3替换其E4序列中orf6、orf4和orf3的序列；删除其E4序列中orf1、orf2、orf6/7；

(c)以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf6/7和orf6替换其E4序列中orf6/7和orf6的序列；

(d)以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf6、orf4替换其E4序列中orf6、orf4；删除其E4序列中orf1、orf2和orf3、orf6/7。

5.如权利要求1所述的方法或权利要求2所述的重组腺病毒载体，其特征在于，所述改造包括选自：

(i)删除其E3序列中orf2～orf8；且以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf6/7和orf6替换其E4序列中orf6/7和orf6，删除其E4序列中orf1、orf2和orf3；

(ii)删除其E3序列中orf2～orf8；且以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf6、orf4和orf3替换其E4序列中orf6、orf4和orf3的序列；删除其E4序列中orf1、orf2、orf6/7；

(iii)删除其E3序列中orf2～orf8；且以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf6/7和orf6替换其E4序列中orf6/7和orf6的序列；

(iv)删除其E3序列中orf1～orf8；且以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf6、orf4和orf3替换其E4序列中orf6、orf4和orf3的序列；删除其E4序列中orf1、orf2、orf6/7；

(v)删除其E3序列中orf1～orf8；且以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf6/7和orf6替换其E4序列中orf6/7和orf6的序列；

(vi)删除其E3序列中orf2～orf8；且以C亚型人腺病毒基因组E4序列中orf6、orf4替换其E4序列中orf6、orf4；删除其E4序列中orf1、orf2和orf3、orf6/7。

6.如权利要求1、2或5所述，其特征在于，所述删除其E1序列为删除其基因组序列中第459-3402位序列；或

(i)中，删除其E3序列中第27446-31423位；且以人血清5型腺病毒AdHu5基因组E4序列中第32914-34077位替换其E4序列中第33518-34671位，删除其E4序列中第34943-36105位；

(ii)删除其E3序列中第27446-31423位；且以人血清5型腺病毒AdHu5基因组E4序列中第33193-34703位替换其E4序列中第33518-36105位的序列；

(iii)删除其E3序列中第27446-31423位；且以人血清5型腺病毒AdHu5基因组E4序列中第32914-34077位替换其E4序列中第33518-34671位的序列；

(iv)删除其E3序列中第27125-31423位；且以人血清5型腺病毒AdHu5基因组E4序列中第33193-34703替换其E4序列中第33518-36105位的序列；

(v)删除其E3序列中第27125-31423位；且以人血清5型腺病毒AdHu5基因组E4序列中第32914-34077位替换其E4序列中第33518-34671位的序列；

(vi)删除其E3序列中第27446-31423位；且以人血清5型腺病毒AdHu5基因组E4序列中第33193-34342替换其E4序列中第33518-36105位。

7.如权利要求1所述的方法或权利要求2所述的重组腺病毒载体，其特征在于，该载体中还包括选自以下操作性相连的元件或基因：

外源基因表达盒；

报告基因的表达盒；

反向末端重复序列；和/或

酶切位点；较佳地包括：I-CeuI，PI-SceI，SwaI，PacI。

8.如权利要求1所述的方法或权利要求2所述的重组腺病毒载体，其特征在于，所述重组腺病毒载体具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，但，

其中E3序列被替换为SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列；或

其中E4序列被替换为SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列；或

其中E1序列被删除。

9.权利要求2～8任一所述的重组腺病毒载体的用途，用于制备重组腺病毒；或，用于插入外源基因、从而表达外源基因。

10.一种重组腺病毒，其由权利要求2～8任一所述的重组腺病毒载体包装获得。

11.一种制备权利要求10所述的重组腺病毒的方法，其特征在于，所述方法包括：

(A)制备权利要求2～8任一所述的重组腺病毒载体；

(B)将(A)的重组腺病毒载体转染病毒生产细胞，从而包装获得重组腺病毒。

12.权利要求10所述的重组腺病毒的用途，其特征在于，用于：表达外源基因，从而获得目的蛋白；较佳地，所述的目的蛋白包括：具有免疫原性的蛋白，具有药学活性的蛋白，具有诊断活性的蛋白，结构蛋白，酶，融合肽，报告蛋白。

13.一种试剂盒，包括：

权利要求2～8任一所述的重组腺病毒载体；

权利要求10所述的重组腺病毒；和/或

病毒生产细胞。

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