JP2016104000A - ポリペプチドの濃縮方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】原核細胞又は脊椎動物培養細胞での組換え発現等で得られた、アリールスルファターゼA及び/又はその機能的等価部分若しくはアナログを含む組成物を遠心分離及び/又はろ過し、得られたそれぞれ上清又は残留物を濃縮し、1又は複数のクロマトグラフィー工程による精製を行う組成物の濃縮・精製方法。前記濃縮組成物を滅菌した哺乳動物の皮下注射用の異染性白質ジストロフィーの治療用の医薬の製造のための使用。
【選択図】なし
Description
皮下注射できる容量には生理的に制限がある。つまり、患者が医薬の適切な量を受容することを確実にし、及び/又は複数回の皮下注射を回避するように高濃度で利用可能な、皮下投与される医薬が有利である。
a) 興味のあるポリペプチドを含む組成物を遠心分離及び/又はろ過し、
b) 工程a)から得られたそれぞれ上清又は残留物(retentate)を濃縮する
ことを含む、興味のあるポリペプチドを含む組成物を濃縮する方法に関する。
さらに別の態様において、本発明は、75〜250 mg/mlの興味のあるポリペプチドを含む組成物の、哺乳動物に皮下注射するための医薬の製造のための使用に関する。
さらに別の態様において、本発明は、50〜300 mg/mlのアリールスルファターゼAの組成物を皮下注射することを含む、哺乳動物の異染性白質ジストロフィーを治療する方法に関する。
さらに別の態様において、本発明は、50〜300 mg/mlのリゾソーマルアルファ-マンノシダーゼの組成物を皮下注射することを含む、哺乳動物のリゾソーム貯蔵障害アルファ-マンノシドーシスを治療する方法に関する。
さらに別の態様において、本発明は、50〜300 mg/mlのガラクトシルセレブロシダーゼの組成物を皮下注射することを含む、哺乳動物のクラッベ病を治療する方法に関する。
本発明の目的のために、配列のアラインメント及び相同性スコアの計算は、タンパク質及びDNAアラインメントの両方に有用な完全Smith-Watermanアラインメントを用いて行い得る。タンパク質及びDNAのアラインメントのために、デフォルトスコア行列BLOSUM50及び単位行列をそれぞれ用いる。ギャップの最初の残基についてのペナルティは、タンパク質について-12、及びDNAについて-16であり、ギャップの追加の残基についてのペナルティは、タンパク質について-2、及びDNAについて-4である。アラインメントは、FASTAパッケージバージョンv20u6 (W. R. Pearson及びD. J. Lipman (1988), "Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85:2444〜2448,並びにW. R. Pearson (1990) "Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA", Methods in Enzymology, 183:63〜98)を用いて行い得る。
興味のあるポリペプチドは、特に、ホルモン若しくはホルモン変異型、酵素、受容体若しくはその一部分、抗体若しくはその一部分、アレルゲン又はレポーターであり得る。興味のあるポリペプチドは、特に、6つの主要な酵素群、例えばオキシドレダクターゼ(E.C. 1)、トランスフェラーゼ(E.C. 2)、ヒドロラーゼ(E.C. 3)、リアーゼ(E.C. 4)、イソメラーゼ(E.C. 5)又はリガーゼ(E.C. 6)の1つから選択される酵素であり得る。より具体的な態様において、興味のあるポリペプチドは、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エンドグルカナーゼ、エステラーゼ、アルファ-ガラクトシダーゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、アルファ-グルコシダーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、ホスホリパーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、又はベータ-キシロシダーゼであり得る。
適切な興味のあるポリペプチドの例は、限定されないが、ポルホビリノゲンデアミナーゼ、アリールスルファターゼ、アルファ-マンノシダーゼ及びガラクトセレブロシダーゼからなる群より選択される1つである。
ある具体的な実施形態において、興味のあるポリペプチドは、ヒト起源であり得る。特に、ヒトに投与されるべき医薬の製造のために興味のあるポリペプチドを用いる関係において、該ポリペプチドは、望ましくないアレルギー性反応を最小限にし得るので、ヒト起源であり得る。例えば多型によるヒトポリペプチドの天然の変異体は、本発明の関係において、「ヒト起源」の用語に含まれる。
興味のある具体的なポリペプチドに言及して、本発明の関係において、興味のあるポリペプチドの機能的等価部分又はアナログも含まれる。例えば、興味のあるポリペプチドが酵素である場合、酵素の機能的に等価な部分は、酵素のドメイン若しくは部分配列(subsequence)であって、該ドメイン又は部分配列が、全長酵素と実質的に同じ酵素活性を発揮することを可能にする必須の触媒部位を含む酵素のドメイン若しくは部分配列、又は触媒をコードする遺伝子であり得る。用語「実質的に同じ酵素活性」は、天然酵素の活性の少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%、より好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも75%、より好ましくは少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%、最も好ましくは少なくとも97%、少なくとも98%若しくは少なくとも99%を有する等価部分又はアナログのことをいう。酵素の酵素的に等価なアナログの例は、機能的な形の酵素の触媒部位を含む融合タンパク質であり得るが、これは、別の種に由来する酵素の同種変異型でもあり得る。また、適切な酵素の比酵素活性を再現する完全に合成された分子も、「酵素的に等価なアナログ」を構成する。
ある実施形態において、本発明の興味のあるポリペプチドは、ポルホビリノゲンデアミナーゼ(ポルホビリノゲンアンモニア-リアーゼ(重合(polymerizing))としても知られる)、E.C. 4.3.1.8.であり得る(Waldenstrom 1937, J. Acta.Med. Scand. Suppl.8)。ポルホビリノゲンデアミナーゼは、ヘム生合成経路の3番目の酵素である。E.C. 4.3.1.8は、E.C. 2.5.1.61に移動されたので、ポルホビリノゲンデアミナーゼ(PBGD)は、現在、このE.C.番号のもとにある。
ポルホビリノゲンデアミナーゼは、4ポルホビリノゲン + H2O = ヒドロキシメチルビラン + 4 NH3の反応を触媒する。
ポルホビリノゲンデアミナーゼは、短縮してPBGDとしても知られ、本発明の関係において、これらの2つの用語は、互いに交換可能に用いられ得る。
組換えE.coli細胞の構築の詳細な例について、WO01/07065の実施例1が挙げられ、そしてマウスPBGDを発現可能な組換えHeLa細胞及びNIH 3T3細胞の構築のために、WO01/07065の実施例6が挙げられる。
本発明の別の実施形態において、興味のあるポリペプチドは、アリールスルファターゼAであり得る。
アリールスルファターゼAは、セレブロシド3-サルフェート + H2O = セレブロシド + サルフェートの反応を触媒する。
アリールスルファターゼAは、特に、血液脳関門を横切ることができるアリールスルファターゼAの形、及び/又は脳内の標的細胞への侵入のための特異的タグを有するrASAの形であり得る。特に、これは、インビボにおいて、マンノース-6-ホスフェート経路を介して効率的にエンドサイトーシスされるrASAであり得る。
ビヒクルとしてのペプチド又はタンパク質の例は、限定されないが、いわゆるタンパク質導入ドメインを含む。適切なタンパク質導入ドメインの例は、限定されないが、本明細書に参照により組み込まれるWO 2005/073367に記載されるものを含む。よって、タンパク質導入ドメインは、HIV TATタンパク質からの11残基の塩基性ペプチドYGRKKRRQRRR (Schwarzeら,Trends Cell Biol. 2000; 10(7): 290〜295)、より大きいアルファらせん性及び両親媒性の性質を配列に付与するTATの合成バージョンYARAAARQARA (Hoら, Cancer Res. 2001; 61(2):474〜477)、ポリR又は塩基性のR及びK残基の混合が他のアミノ酸と組み合わさって構成される合成リーダーペプチド、及びベータ-3インテグリン又はカポジ肉腫FGFのいずれかからの疎水性シグナル配列部分に基づくペプチド (Dunicanら Biopolymers 2001; 60(1): 45〜60)であり得る。
ビヒクルとしての適切な毒素の例は、限定されないが、本明細書に参照により組み込まれるWO 2005/073367に記載されるものを含む。
(a) WO 2005/073367の配列番号2のアミノ酸配列;
(b) 組換えヒトアリールスルファターゼAに酵素的に等価な(a)の配列の一部分;
(c) (a)又は(b)の配列のいずれか1つと少なくとも75%の配列同一性を有し、かつ組換えヒトアリールスルファターゼAに酵素的に等価なアミノ酸配列を同時に含むアミノ酸配列アナログをコードする核酸配列を含み得る。
(a) WO 2005/073367の配列番号1の核酸配列
(b) 組換えヒトアリールスルファターゼAに酵素的に等価なアミノ酸配列をコードする(a)の配列の一部分
(c) (a)又は(b)の配列のいずれか1つと少なくとも75%の配列同一性を有し、かつ組換えヒトアリールスルファターゼAに酵素的に等価なアミノ酸配列を同時にコードする核酸配列アナログを含み得る。
上記の核酸配列とWO 2005/073367の配列番号1との間の配列同一性の程度は、少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%であることが好ましい。上記の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列と、WO 2005/073367の配列番号2との間の配列同一性の程度が、少なくとも80%、例えば少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、少なくとも98%、又は少なくとも99%であることも同様に好ましい。
ある具体的な実施形態において、rASAの産生されたグリコフォームの少なくとも1つは、CHO細胞で産生されたグリコフォームと同様である。
(a) WO 2005/073367の配列番号3のアミノ酸配列;
(b) 組換えヒトアリールスルファターゼAに酵素的に等価な(a)の配列の一部分
(c) (a)又は(b)の配列のいずれか1つと少なくとも75%の配列同一性を有し、かつ同時に組換えヒトアリールスルファターゼAに酵素的に等価であるアミノ酸配列アナログ
からなる群より選択され得る。
さらに別の実施形態において、興味のあるポリペプチドは、リゾソーマルアルファ-マンノシダーゼ(LAMAN)であり得る。リゾソーマルアルファ-マンノシダーゼは、EC 3.2.1.24に属し、アルファ-D-マンノシドの末端の非還元アルファ-D-マンノース残基を、非還元末端から、N-結合糖タンパク質の規則正しい分解の間に加水分解するエキソグリコシダーゼである(Aronson及びKuranda FASEB J 3:2615〜2622. 1989)。本発明の関係において、用語リゾソーマルアルファ-マンノシダーゼは、短縮された用語LAMANと交換可能に用いられ得る。
LAMANをコードする遺伝子(MANB)は、第19染色体に位置する(19cen-q12) (Kanedaら Chromosoma 95:8〜12. 1987)。MANBは、21.5 kbにわたる24エキソンからなる(GenBankアクセッション番号U60885〜U60899; Riiseら Genomics 42:200〜207 . 1997)。LAMAN転写産物は、3,500ヌクレオチド(nts)を超え、1,011アミノ酸配列をコードするオープンリーディングフレームを含む(GenBank U60266.1)。
最も好ましい実施形態において、哺乳動物細胞系は、CHO細胞系である。
上記のリゾソーマルアルファ-マンノシダーゼの調製物のフラクションは、マンノース6-ホスフェート受容体に結合可能であることがさらに好ましい。
本発明のより好ましい実施形態において、このフラクションは、リゾソーマルアルファ-マンノシダーゼの調製物の活性の1〜75%、例えば2〜70%、例えば5〜60%、例えば10〜50%、例えば15〜45%、例えば20〜40%、例えば30〜35%に相当する。
別の実施形態において、興味のあるポリペプチドは、ガラクトセレブロシダーゼであり得、これはGALCと短縮できる。ガラクトセレブロシダーゼは、E.C. 3.1.6.46に属し、D-ガラクトシル-N-アシルスフィンゴシン + H2O = D-ガラクトース + N-アシルスフィンゴシンの反応を触媒できる酵素であり、つまりGALCは、例えばミエリンのガラクト脂質の分解を触媒する。
i) 配列番号14、15、18、19、20、21及び24のいずれにより規定されるアミノ酸配列;
ii) i)で規定されるアミノ酸配列の機能的に等価な部分;及び
iii) i)又はii)で規定されるアミノ酸配列の機能的に等価なアナログであって、該アナログのアミノ酸配列が、i)又はii)で規定されるアミノ酸配列と少なくとも75%同一であるアナログ
からなる群より選択されるアミノ酸を含む。
i) 配列番号1〜13、16、17、22及び23のいずれにより規定される核酸配列;
ii) i)で規定される核酸配列と少なくとも75%同一である核酸配列
からなる群より選択される配列を含む核酸配列を用いる組換え発現により得ることができる。
興味のあるポリペプチドを含む組成物についての以下の記載は、本発明の方法に従って濃縮されたポリペプチドを含む組成物と、興味のあるポリペプチドを少なくとも10 mg/ml含む本発明の組成物とに関する。
・ 1.84 mM Na2HPO4、13.5 mMグリシン、125 mMマンニトール、及び7.7〜7.9の範囲のpH。
・ 2.45 mM Na2HPO4、18 mMグリシン、167 mMマンニトール、及び7.7〜7.9の範囲のpH。
・ 5.51 mM Na2HPO4、40.5 mMグリシン、375 mMマンニトール、及び7.7〜7.9の範囲のpH。
・ 7.34 mM Na2HPO4、54 mMグリシン、500 mMマンニトール、及び7.7〜7.9の範囲のpH。
・ 3.67 mM Na2HPO4、27 mMグリシン、220 mMマンニトール、30 mMスクロース、及び7.7〜7.9の範囲のpH。
・ 3.67 mM Na2HPO4、245 mMマンニトール、32 mMスクロース、及び7.7〜7.9の範囲のpH。
・ 10 mM TRIS-HCl、27 mMグリシン、250 mMマンニトール、及び7.7〜7.9の範囲のpH。
・ 3.67 mMクエン酸Na、27 mMグリシン、250 mMマンニトール、及び7.7〜7.9の範囲のpH。
・ 3.67 mM Na2HPO4、27 mMグリシン、220 mMマンニトール、29 mMスクロース、0.1%(w/v) Tween 80、及び7.7〜7.9の範囲のpH。
・ 3.67 mM Na2HPO4、27 mMグリシン、220 mMマンニトール、29 mMスクロース、0.1%(w/v) Tween 80、及び7.7〜7.9の範囲のpH。
本発明の方法は、a) 興味のあるポリペプチドを含む組成物の遠心分離及び/又はろ過、並びにb) 工程a)からの組成物の濃縮の工程を含む。本発明の発明者らは、興味のあるポリペプチドを含む組成物を濃縮する前に該組成物を遠心分離及び/又はろ過することにより、興味のあるポリペプチドが全く又はほとんど凝集せずに、高度に濃縮された興味のあるポリペプチドを含む組成物を得ることが可能であることを見出した。さらに、例えば、ポリペプチド凝集物はポリペプチドに対する免疫応答を惹起する危険性を増加させ得るので、ポリペプチド凝集物の量が低減すれば、ポリペプチドの治療用途に一般に有利である。
ある具体的な実施形態において、本方法の工程a)は、工程b)の前に行われる。
本発明の発明者らは、興味のあるポリペプチドを含む組成物を濃縮する前に、組成物の遠心分離及び/又はろ過により該組成物を前処理することが有利であり、これは、この前処理により多くの又はほとんどのポリペプチド凝集物が除去されるからであることを見出した。
・ 遠心分離、
・ ろ過、又は
・ 遠心分離とろ過。
凝集物を除去し得るように、興味のあるポリペプチドを含む組成物は、1500〜3000 gの範囲、例えば1800〜2500 gの範囲、又は2000〜2300 gの範囲の力で遠心分離され得る。
温度は興味のあるポリペプチドの安定性に影響し得るので、遠心分離は、2〜20℃の範囲、例えば3〜15℃、又は3〜10℃の範囲、又は3〜8℃の範囲、例えば4℃又は5℃又は6℃の温度で行い得る。
興味のあるポリペプチドを含む組成物は、0.20〜5μmの範囲、例えば0.2〜2.5μmの範囲の孔径を有するフィルタを通してろ過し得る。
フィルタの孔径に加えて、フィルタを形成する材料も、興味のあるポリペプチドのろ過に影響し得る。適切なメンブレンフィルタの例は、限定されないが、ポリエーテルスルホン(PES)、セルロースアセテート、再生セルロース及びポリビニリデンフルオリド(PVDF)を含む。
原則として、興味のあるポリペプチドの組成物を濃縮する任意の方法を、本発明の工程b)において用い得る。
このような適切な方法の例は、限定されないが、限外ろ過、及び水分の除去による濃縮を含む。
限外ろ過は、水圧を用いて、値のカットオフサイズとしても知られる特定の径の孔を有するメンブレンに分子及び溶媒を通過させる分離法である。メンブレンのカットオフ値よりも小さい分子量を有する分子のみが、メンブレンを通過できるが、より大きい分子量のものはメンブレンを通過せず、いわゆる残留物を形成する。残留物中に存在する分子は、よって、溶媒がメンブレンを通過して流れるにつれて、濃縮される。
メンブレンの孔径は、典型的には、10000 Mw未満、例えば10〜10000 Mwの範囲の分子量カットオフを有し得る。
このような適切な市販のフィルタデバイスの例は、Centricon Plus-80又はCentricon Plus-15であり得る。
典型的には、遠心分離は、数時間、例えば1時間より長く、例えば1〜10時間行い得る。
水分の除去による濃縮の原理は、通常、全て又はほとんどの水分を除去して固体を得て、次いで、以前に希釈又は溶解していたよりも少ない容量の水にこの固体を希釈又は溶解することである。しかし、原則として、これは、水分の必要な量を単に除去して、その後の化合物の再希釈又は再溶解を行わずに所望の濃度を得ることにより行い得る。
凍結乾燥及び蒸発の両方について、3つの最も関連するパラメータは、温度、圧力及び時間である。
興味のあるポリペプチドは、天然の供給源、すなわち興味のあるポリペプチドを天然に発現する細胞に由来し得るか、又はこれは特に組換え発現され得る。
興味のあるポリペプチドの由来が何であるかに関わらず、これは、本発明の方法に供する前に精製され得る。
i) 興味のあるポリペプチドの組換え発現
ii) 1又は複数のクロマトグラフィー工程による興味のあるポリペプチド組成物の精製
iii) 配合緩衝剤の交換。
i) PBGDの組換え発現
ii) 工程i)からのPBGD組成物をアフィニティクロマトグラフィーに供する
iii) 工程ii)のPBGD組成物をイオン交換クロマトグラフィーに供する。
i) PBGDの組換え発現
ii) 工程i)からのPBGD組成物をアフィニティクロマトグラフィーに供する
iii) 工程ii)からのPBGD組成物をイオン交換クロマトグラフィーに供する
iv) 工程iii)からのPBGD組成物をヒドロキシアパタイトカラムに供する。
・ 濃縮された興味のあるポリペプチドを含む組成物の凍結乾燥、
・ 濃縮された興味のあるポリペプチドを含む組成物の緩衝剤の交換、
・ 濃縮された興味のあるポリペプチドを含む組成物の滅菌ろ過、
・ 蒸発。
i) 凍結、
ii) 一次乾燥、及び
iii) 二次乾燥。
二次乾燥の後に、サンプルは、真空で密閉されるか、又は窒素を充填した後に密閉され得る。
さらなる実施形態において、凍結乾燥は、一次乾燥段階の前にアニーリング工程を含み得る。本発明の発明者らは、凍結乾燥法にアニーリング工程を含めることにより、アニーリング工程を含まない同じ凍結乾燥法を用いたときに比較して、目視によりひび割れがより少ないことによる視覚的な見た目が改善され、及び/又は凍結乾燥物の再構成時間がより短くなることを見出している。凍結乾燥物の再構築のための時間が低減されることは、溶液として投与される医薬として用いられる場合に特に有利である。視覚的な見た目の改善も、通常、ほとんどの製品について有利であるとみなされる。
i) 凍結
ii) アニーリング
iii) 一次乾燥
iv) 二次乾燥。
滅菌ろ過は、通常、0.22μm又は0.20μmの孔径のフィルタを通して組成物をろ過することにより行われる。凍結乾燥は、特に、上記のようにして行い得る。
本発明は、50〜300 mg/mlの範囲の興味のあるポリペプチドを含む組成物の、哺乳動物への皮下注射用の医薬品を製造するための使用にも関する。
興味のあるポリペプチドは、限定されないが、PBGD、アリールスルファターゼA、リゾソーマルアルファ-マンノシダーゼ及びガラクトセレブロシダーゼを含む本発明による興味のあるポリペプチドのいずれであり得る。
PBGDの投与は、急性間欠性ポルフィリン症の治療について特に有用である。しかし、PBGDの投与が、別のポリフィリン症、例えば遺伝性コプロポルフィリン症又は異型ポリフィリン症の治療に有用であり得ることも考えられる。ポリフィリン症は、ヘム生合成経路における種々の欠失により引き起こされるいくつかの疾患を集合的に表すのに用いられる用語である。よって、任意の型のポリフィリン症に罹患した患者に対する例えば他の治療剤との組み合わせでのPBGDの投与は、該経路の中の種々の中間体の全体的な代謝回転を増加させる助けになり得る。例えば、Meissner PNら, 1986, European Journal of Clinical Investigation, vol. 16, 257〜261; Hift RJら, 1997, S. Afr. Med. J., vol. 87, 718〜27及びMeissner Pら, 1993, J. Clin. Invest., vol. 91, 1436〜44は、遺伝性コプロポルフィリン症及び異型ポリフィリン症におけるALA及びPBGの蓄積について記載している。これらの疾患において、ALA及びPBGの蓄積は、ALAのPBGへの変換のそれぞれ4及び5工程下流に位置する酵素の欠損に起因する。最近の2つの文献において、異型ポルフィリン症の患者に蓄積するポルフィリノゲンがPBG-デアミナーゼをどのように阻害し得るかが記載されている。
異染性白質ジストロフィー(MLD)は、リゾソーム酵素であるアリールスルファターゼ A (ASA)における常染色体上の劣性遺伝子欠損により引き起こされ、ミエリン鞘の膜の進行性破壊(脱髄)、及びガラクトシルスルファチド(硫酸セレブロシド)の中枢神経系(CNS)及び末梢神経系の両方の白質での蓄積をもたらす。組織学的調製物において、ガラクトシルスルファチドは、異染性に染色される球形の顆粒状の塊を形成する。ガラクトシルスルファチドは、また、腎臓、胆嚢及びいくつかのその他の内臓に蓄積され、尿中に過剰量で排泄される。
アルファ-マンノシドーシスは、全世界で1/1000000〜1/500000の間の頻度で発生する劣性の常染色体疾患である。マンノシドーシスは、欧州、アメリカ、アフリカ及びアジアの全ての人種集団において見出される。これは、良好な診断サービスがある全ての国において、類似の頻度でリゾソーム貯蔵障害について検出される。彼らは、見かけ上は健康に生まれる。しかし、疾患の症状は進行性である。アルファ-マンノシドーシスは、非常に重篤な形から非常に穏やかな形までにわたる臨床上の不均質性を示す。典型的な臨床症状は、精神薄弱、骨格変化、再発性感染をもたらす免疫系障害、聴覚障害であり、該疾患は、しばしば、きめの粗い顔、顕著な額、平坦な鼻橋(nasal bridge)、小さい鼻、及び広い口のような典型的な顔の特徴と関連する。最も深刻な場合(I型マンノシドーシス)において、子供は、肝脾腫大に罹患し、生命の早期の間に死亡する。おそらく、この早期の死亡は、疾患により引き起こされる免疫不全による重篤な感染により引き起こされる。より穏やかな場合(2型マンノシドーシス)には、患者は、通常、成人の年齢に到達する。患者の骨格の衰弱により、20〜40歳で車椅子が必要となる。該疾患は、単純な読み書きの最も基本的な技術だけでなく全てを排除する弱い精神機能をしばしばもたらす脳の広汎性機能不全の原因である。これらの問題は、聴覚障害及び独立した生活を患者から排除する他の臨床症状に関連し、結果として、生涯にわたる介護が必要である。
ヒトにおいて、GALC酵素の欠損は、クラッベ病又はクラッベ型白質ジストロフィーとして知られる常染色体の遺伝性で遺伝子性のリゾソーム貯蔵疾患をもたらす。酵素は、ヒトの精巣、腎臓、胎盤、肝臓及び脳で発現され、GALC酵素の欠損は、通常、ミエリン代謝、並びに中枢及び末梢神経系(それぞれCNS及びPNS)に障害をもたらす。
クラッベ病は、いずれの年齢、国籍及び性別のヒトで観察されている。
本願で引用される特許及び非特許文献の全ては、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
実験
材料
rhPBGD
以下の実験において用いたrhPBGDは、WO 03/002731の実施例1の方法2に従って得られ、ここで、方法2は、工程IV、すなわち、セラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー工程を含む方法である。
組換え精製rhPBGDは、以下の水性配合緩衝剤中に存在した:
3.67 mM Na2HPO4
27 mM グリシン
250 mM マンニトール
及びpH 7.9。
配合緩衝剤は、次いで、0.22μmのフィルタを通して滅菌ろ過した。
凍結乾燥
精製rhPBGD溶液の凍結乾燥を、以下のスケジュールに従ってLyostar (FTM-systems)凍結乾燥機で行った。
液体を、色、澄明性及び沈殿について、以下のスキームに従って目視で調べた。
色: 1: 無色; 2: わずかに黄色; 3: 黄色
澄明性: 1: 澄明; 2: わずかに濁っている; 3: 濁っている
その他の所見: オペレータによるその他の観察は、ここに含めた場合もある(例えば沈殿物、不溶物質など)。
pH計(Metrohm 691 pH Meter)及び電極(組み合わせたLL pH電極)を、4.00〜9.00の範囲の3種類の標準参照溶液(Merck)で校正した。液体を、最後に分析した。
抽出物、処理中のサンプル、バルク薬剤及び最終生成物中のタンパク質の濃度は、アルカリ性の媒体中のタンパク質によるCu2+のCu+への還元の原理を用いる方法(ビウレット反応)により決定した。Cu+イオンを、次いで、高い感度及び選択性の比色検出をもたらすビシンコニン酸を含有する試薬と反応させた。
組換えヒトポルホビリノゲンデアミナーゼ(rhPBGD)及びrhPBGD変異型を、移動相中の有機変性剤(アセトニトリル)のパーセンテージに依存するシリカベースの固定媒体へのそれらの吸着及び脱着能力に従って分離した。
ポルホビリノゲンデアミナーゼ(PBGD)は、4分子のポルホビリノゲン(PBG)の付加を触媒して、直線状テトラマーであるプレウロポルフィリノゲンを形成し、これは、酵素から放出されて、ウロポルフィリノゲンIIIシンターゼの作用によりインビボでウロポルフィリノゲンIIIに環化される。プレウロポルフィリノゲンは、ベンゾキノンと化学的に酸化されてウロポルフィリンを形成でき、これは405 nmの光を吸収する。
分析は、各回の試験において1つの単一バイアルに対して行った。rhPBGD活性及びタンパク質濃度の決定のために、試験を、各バイアルについて、2重及び3重にそれぞれ行った。
凍結乾燥したrhPBGDの1つのバイアルを、1.00 mlのMilliQ水に再懸濁した。rhPBGDの凍結水溶液のバイアルを融解した。浸透圧計(Vapro浸透圧計)を、100〜1000 mOsm/kgの範囲の3つの標準溶液(100、290、1000 mOsm/kg)を用いて校正した。次いで、液体を分析した。
遠心フィルタデバイスを用いる濃縮
凍結したPBGD-バルク溶液(7 mg/mL rhPBGD, 3.67 mM Na2HPO4, 27 mM グリシン, 250 mM マンニトール, pH 7.9)を、20℃の水浴中で融解し、3200gにて10分間遠心分離し、その後に、0.20μm-PESフィルタ(Nalgeneポリエーテルスルホンフィルタ)により滅菌ろ過した。PBGDバルク溶液を、Centrifugal Filter Devices Centricon Plus-80 (Mwカットオフ30000)及びCentricon Plus-15 (Mwカットオフ30000)を3200 gにて数時間運転することにより、100 mg/mlまで濃縮した。濃縮された溶液、すなわち残留物を、0.22μmフィルタ(Millex GV)により滅菌ろ過し、最後に、この溶液の一部分を、滅菌配合緩衝剤で希釈して50 mg/mlを得た。5 mg/mlの溶液を、組換え精製hPBGDを滅菌配合緩衝剤で直接希釈することにより調製した。
最懸濁したバイアル及びrhPBGdの水溶液のバイアルのそれぞれを、次いで、色、澄明性及び沈殿物について目視観察し、pH、タンパク質濃度、純度及びrhPBGD活性を、上記のようにして測定した。
結果を、以下の表1〜4に示す。
遠心フィルタデバイスによるrhPBGD組成物の濃縮
凍結したPBGD-バルク溶液(7 mg/mL rhPBGD, 3.67 mM Na2HPO4, 27 mM グリシン, 250 mM マンニトール, pH 7.9)を、20℃の水浴中で融解し、3200gで10分間遠心分離した後に、0.20μm-PESフィルタ(Nalgeneポリエーテルスルホンフィルタ)により滅菌ろ過した。PBGD-バルク溶液を、Centrifugal Filter Devices Centricon Plus-80 (Mwカットオフ30000)及びCentricon Plus-15 (Mwカットオフ30000)を3200 gで数時間運転することにより100 mg/mlまで濃縮した。濃縮した溶液、すなわち残留物を、0.22μmフィルタ(Millex GV)により滅菌ろ過し、滅菌ろ過した配合緩衝剤(上記を参照)で希釈して、より低濃度の溶液を得た。各濃度の容量のフラクションを、上記のようにして凍結乾燥した。
タンジェンシャルフローろ過(TFF)によるrhPBGD組成物の濃縮
rhPBGDのバルク溶液を、次いで、最短で3日間、5℃にて暗所で融解した。
融解した溶液を、次いで、2200gにて約10分間、200 mLのコニカル遠心チューブを用いて遠心分離した。
溶液を、次いで、以下の孔径:5.0μm; 0.65μm; 0.45μm及び0.20μmの一連のフィルタによりろ過した後に、タンジェンシャルフローろ過(TFF)により濃縮した。
滅菌濃縮rhPBGD溶液を、次いで、バイアルに入れた後に、これを方法の部分に記載したようにして凍結乾燥した。
再構成時間に対する凍結乾燥の異なる形態及び/又は賦形剤の量の影響
PBGDを、実施例3に記載したようにして濃縮し、緩衝剤の交換の後に、PBGDの濃度を決定した。
濃縮PBGD溶液を、次いで、Lyostar (FTM-systems)凍結乾燥機中で凍結乾燥した。溶液を、2及び6 mlの注入ガラスバイアル(1型)に充填し、ゴムの栓(クロロブチル)で栓をした。
サンプルを周囲温度にて装填し、棚を30分間で0℃まで冷却した。温度を、-40℃まで(1分当たり1℃)下げ、その温度で30分間維持し、次いで、真空圧力を126 mTorrまで排出し、温度を0℃まで(1分当たり1℃)上げることにより一次乾燥を開始した。360分間の一次乾燥の後に、温度を+30℃まで(1分当たり0.5℃)上げ、同時に完全真空を排出した(二次乾燥の開始)。温度を+30℃で360分間維持し、次いでバイアルに真空下で栓をした。
-40℃にて30分後、温度を1分当たり2℃の割合で-10℃又は-20℃まで上げ、この温度でこれらを120又は420分間維持した後に、1分当たり2℃で-40℃まで温度を再び下げ、一次乾燥の開始前にサンプルを60〜90分間維持した。
1xの量の賦形剤は、PBGD溶液が、滅菌水中で調製された3.67 mM Na2HPO4 x 2H2O, 27 mMグリシン及び220 mM マンニトールを含むことを表す。
1.5x量の賦形剤は、PBGD溶液が、滅菌水中で調製された5.51 mM Na2HPO4 x 2H2O, 40.5 mMグリシン及び375 mM マンニトール、すなわち、1x緩衝剤中に存在する各成分の1.5xを含むことを表す。
2x賦形剤は、PBGD溶液が、滅菌水中で調製された7.34 mM Na2HPO4 x 2H2O, 54 mMグリシン及び500 mM マンニトール、すなわち1x緩衝剤中に存在する各成分の2xを含むことを表す。
アニーリング凍結乾燥サイクルは、上記のとおりであり、ここで、アニーリング工程は、温度を-10℃まで上げ、サンプルをこの温度で120分間維持した後に-40℃まで再び下げることを含む。
延長アニーリング凍結乾燥サイクルは、上記のとおりであり、ここで、アニーリング工程は、温度を-20℃まで上げ、サンプルをこの温度で420分間維持した後に-40℃まで再び下げることを含む。
凍結乾燥生成物の見かけに対する凍結乾燥の異なる形態及び/又は賦形剤の量の影響
PBGDの濃縮された凍結乾燥溶液を、実施例4に記載されるようにして調製し、賦形剤の量及び凍結乾燥サイクルの種類に対する言及は、実施例4と同じ意味を有する。
凍結乾燥生成物の目視観察により、以下の結果が得られた。
A: それぞれ4.6 mg/ml、66.6 mg/ml及び109.4 mg/mlのrhPBGDを含む溶液から調製した3つの生成物の比較は、凍結乾燥生成物のひび割れの数が、rhPBGDの濃度が増加するにつれて増加することを示した。
B: 150 mg/mlのrhPBGDを含み、1x及び1.5xの量の賦形剤を含む溶液から調製した2つの生成物の比較は、凍結乾燥生成物のひび割れの数が、1.5xの量の賦形剤を含む生成物について、1xの量の賦形剤を含む生成物よりも少ないことを示した。
D: 原型、アニーリング及び延長アニーリング凍結乾燥サイクルを用いて150 mg/mlのrhPBGD溶液から調製した3つの凍結乾燥生成物の比較は、凍結乾燥生成物におけるひび割れの数が、アニーリング凍結乾燥サイクルにより調製された生成物において、原型の凍結乾燥サイクルにより調製された生成物よりも低いことを示した。さらに、延長アニーリング凍結乾燥サイクルにより調製された生成物中のひび割れの数は、アニーリング凍結乾燥サイクルにより調製された生成物よりも低かった。
凍結乾燥rhPBGDの安定性に対する、回復容量、賦形剤の量及び凍結乾燥の形態の影響
濃縮rhPBGD溶液の凍結乾燥サンプルを、実施例4に記載されるようにして調製した。
「バルク溶液」は、凍結乾燥前のPBGDの濃縮溶液である。
表21は、回復容量(Rec. vol:凍結乾燥生成物を再懸濁する容量である)に対するrhPBGDの濃度、賦形剤の量(実施例4と同じ定義を用いる)、凍結乾燥の形態(実施例4と同じ定義を用いる)、及び充填容量の比(fill. Vol:これは、凍結乾燥される前の組成物の容量である)に関して以下の特徴を有するrhPBGD溶液の結果を示す。
・ 約5 mg/ml rhPBGD
・ 1xの量の賦形剤
・ 原型凍結乾燥サイクル
・ Fill.vol = Rec. vol
溶液2:
・ 約70 mg/ml rhPBGD
・ 1xの量の賦形剤
・ 原型凍結乾燥サイクル
・ Fill.vol = 2x Rec. vol
・ 約110 mg/ml rhPBGD
・ 1xの量の賦形剤
・ 原型凍結乾燥サイクル
・ Fill.vol = Rec. vol
溶液4:
・ 約70 mg/ml rhPBGD
・ 1xの量の賦形剤
・ 原型凍結乾燥サイクル
・ Fill.vol = 1.5x Rec. vol
・ 約90 mg/ml rhPBGD
・ 2/3xの量の賦形剤
・ 原型凍結乾燥サイクル
・ Fill.vol = 1.5x Rec. vol
溶液6:
・ 約60 mg/ml rhPBGD
・ 1/2xの量の賦形剤
・ 原型凍結乾燥サイクル
・ Fill.vol = 2x Rec. vol
・ 約110 mg/ml rhPBGD
・ 1xの量の賦形剤
・ アニーリング凍結乾燥サイクル
・ Fill.vol = Rec. vol
溶液8:
・ 約60 mg/ml rhPBGD
・ 1xの量の賦形剤
・ アニーリング凍結乾燥サイクル
・ Fill.vol = 2x Rec. vol
・ 約150 mg/ml rhPBGD
・ 1xの量の賦形剤
・ アニーリング凍結乾燥サイクル
・ Fill.vol = Rec. vol
溶液10:
・ 約150 mg/ml rhPBGD
・ 1xの量の賦形剤
・ 原型凍結乾燥サイクル
・ Fill.vol = Rec. vol
溶液2について第4及び9週の時点で、並びに溶液4について第9週の時点で、間違った回復容量を用いた。
rhPBGDの安定性に対する異なる賦形剤の影響
rhPBGDを実施例4に記載されるようにして濃縮し、次いで、緩衝剤を、以下に記載される4つの緩衝剤の1つに交換した。生成物を、次いで、原型のアニーリング工程を含んで実施例4に記載されるようにして凍結乾燥し、サンプルの安定性を、実施例6に記載されるようにして試験した。
配合A (実施例6の溶液9に相当): 250 mM マンニトール, 27 mM グリシン及び3.67 mM Na2HPO4。
配合B: 250 mM マンニトール, 27 mM グリシン及び10 mM TRIS-HCL。
配合C: 250 mM マンニトール, 27 mM グリシン, 3.67 mM Na2HPO4及び0.1% Tween 80。
配合D: 221 mM マンニトール, 29 mM スクロース, 27 mM グリシン, 3.67 mM Na2HPO4及び0.1% Tween 80。
Claims (22)
- a) アリールスルファターゼA及び/又はその機能的等価部分若しくはアナログを含む組成物を遠心分離及び/又はろ過し、
b) 工程a)から得られたそれぞれ上清又は残留物を濃縮する
ことを含む、アリールスルファターゼA、その機能的等価部分及びアナログを含む組成物を濃縮する方法。 - アリールスルファターゼAが、
i) 配列番号18、19及び20のいずれかにより定義されるアミノ酸配列;
ii) i)で定義されるアミノ酸配列の機能的等価部分;及び
iii) i)又はii)で定義されるアミノ酸配列の機能的等価アナログであって、そのアミノ酸配列がi)又はii)で定義されるアミノ酸配列と少なくとも75%同一であるアナログ
からなる群より選択されるアミノ酸を含む請求項1に記載の方法。 - 工程b)が、凍結乾燥又は蒸発により行われる請求項1又は2に記載の方法。
- 工程b)が、限外ろ過により行われる請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 工程b)が、タンジェンシャルフローろ過により行われる請求項4に記載の方法。
- 工程b)が、遠心デバイスを用いて行われる請求項4に記載の方法。
- アリールスルファターゼAを含む組成物が、グリシン、L-セリン、スクロース及びマンニトールからなる群より選択される1又は複数の成分をさらに含む請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- アリールスルファターゼAを含む組成物が、TRIS-HCL、クエン酸Na及びNa2HPO4からなる群より選択される1又は複数の緩衝剤をさらに含む請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
- 工程b)から得られたアリールスルファターゼAを含む濃縮された組成物を滅菌する工程をさらに含む請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 工程b)から得られたアリールスルファターゼAを含む濃縮された組成物を凍結乾燥する工程をさらに含む請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 工程a)の遠心分離が、1800〜2500 gで行われる請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 工程a)のろ過のために用いられるフィルタが、0.20〜5.0マイクロメートルの範囲の孔径を有する請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
- 工程a)の前に、以下の
i) アリールスルファターゼAの、原核細胞又は脊椎動物培養細胞での組換え発現、
ii) アリールスルファターゼAの、1又は複数のクロマトグラフィー工程による精製、
iii) 配合緩衝剤の交換
の工程の1又は複数をさらに含む請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。 - 工程ii)のクロマトグラフィーが、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及びヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーからなる群より選択される請求項13に記載の方法。
- 工程a)の前に、以下の
i) アリールスルファターゼAの組換え発現、
ii) 工程i)からのアリールスルファターゼAを含む組成物をアフィニティクロマトグラフィーに供する、及び
iii) 工程ii)のアリールスルファターゼAを含む組成物をイオン交換クロマトグラフィーに供する
工程を含む請求項13に記載の方法。 - 工程a)の前に、以下の
i) アリールスルファターゼAの組換え発現、
ii) 工程i)からのアリールスルファターゼAを含む組成物をアフィニティクロマトグラフィーに供する、
iii) 工程ii)からのアリールスルファターゼAを含む組成物をイオン交換クロマトグラフィーに供する、及び
iv) 工程iii)からのアリールスルファターゼAを含む組成物をヒドロキシアパタイトカラムに供する
工程を含む請求項13に記載の方法。 - i) 配列番号16及び17のいずれかにより定義される核酸配列;
ii) i)で定義される核酸配列と少なくとも75%同一である核酸配列
からなる群より選択される配列を含む核酸配列を用いる組換え発現を含む請求項13に記載の方法。 - 工程ii)から得られたアリールスルファターゼAを含む組成物を希釈又はダイアフィルトレーションする工程をさらに含む請求項15又は16に記載の方法。
- 少なくとも25 mg/mlのアリールスルファターゼAを含み、組成物中のアリールスルファターゼAの全量の5%未満が凝集物の形で存在する組成物。
- アリールスルファターゼAが、
i) 配列番号18、19及び20のいずれかにより定義されるアミノ酸配列;
ii) i)で定義されるアミノ酸配列の機能的等価部分;及び
iii) i)又はii)で定義されるアミノ酸配列の機能的等価アナログであって、そのアミノ酸配列がi)又はii)で定義されるアミノ酸配列と少なくとも75%同一であるアナログ
からなる群より選択されるアミノ酸を含む請求項19に記載の組成物。 - 75〜250 mg/mlのアリールスルファターゼAを含む組成物の、哺乳動物の皮下注射用の異染性白質ジストロフィーの治療用の医薬の製造のための使用。
- アリールスルファターゼAが、
i) 配列番号18、19及び20のいずれかにより定義されるアミノ酸配列;
ii) i)で定義されるアミノ酸配列の機能的等価部分;及び
iii) i)又はii)で定義されるアミノ酸配列の機能的等価アナログであって、そのアミノ酸配列がi)又はii)で定義されるアミノ酸配列と少なくとも75%同一であるアナログ
からなる群より選択されるアミノ酸を含む請求項21に記載の使用。
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