TWI700101B - 凍乾之因子ｉｘ調配物 - Google Patents

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Abstract

本發明尤其提供包含因子IX(FIX)多肽之預凍乾調配物、復原調配物及凍乾物粉末組合物。本發明亦提供用於生產包含FIX多肽之凍乾物粉末的凍乾法。

Description

凍乾之因子IX調配物
本發明大體上係關於止血障礙治療劑領域。
B型血友病(亦稱為克雷司馬斯病)為世界上最常見之遺傳性出血病症之一。其導致活體內及活體外血液凝固活性降低且在受影響個體之整個生命週期中均需要廣泛醫療監護。在不存在介入之情況下，受折磨之個體將遭受關節中自發性出血，由此造成嚴重疼痛及衰弱性不活動；血流入肌肉中造成血液在彼等組織中累積；若不立即治療，則喉部及頸部自發性出血可造成窒息；且手術、輕微意外傷害或拔牙後嚴重出血亦是盛行的。
最低程度之正常活體內血液凝固需要絲胺酸蛋白酶因子II(凝血酶原)、VII、IX、X及XI(可溶性血漿蛋白)；輔因子，包括跨膜蛋白組織因子及血漿蛋白因子V及VIII；纖維蛋白原、轉麩醯胺酸酶因子XIII、磷脂(包括活化之血小板)及鈣。其他蛋白質，包括激肽釋放酶、高分子量激肽原及因子XII，為一些活體外凝結測試 需要的，且在病理狀態下可在活體內起重要作用。
在血友病中，血液凝固因缺乏某些血漿凝血因子受干擾。B型血友病係由可由因子IX蛋白合成減少或缺陷分子活性降低引起之因子IX缺乏造成。血友病之治療係藉由以高度富含因子IX之外源性因子濃縮物置換錯誤凝結因子來進行。然而，如下文所描述，由血液產生此種濃縮物充滿技術困難。
自血漿純化因子IX(血漿衍生之因子IX；pdFIX)幾乎僅產生活性因子IX。然而，此種自血漿純化因子IX非常困難，因為因子IX僅以低濃度存在於血漿中(5μg/mL；Andersson,Thrombosis Research 7：451 459(1975))。此外，自血液純化需要移除或滅活諸如HIV及HCV之傳染劑。另外，pdFIX具有短半衰期且因此需要頻繁投藥。重組因子IX(rFIX)亦可利用，但與pdFIX一樣受較短半衰期及需要頻繁投藥(例如每週2至3次用於預防)困擾。與pdFIX相比，rFIX亦具有較低增量回收率(K值)，使得有必要使用高於pdFIX劑量之rFIX劑量。
由於開發出血漿衍生之因子IX及重組因子IX，降低死亡率、預防關節損傷及改良生活品質已成為重要成就。長期防止出血將代表治療B型血友病個體之另一關鍵進步。然而，迄今為止，尚未開發出允許長期防護之產品。因此，仍需要比當前療法更具耐受性且更有效之治療由於因子IX缺乏所致之血友病之改良方法。
特定言之，仍需要具有較高藥品強度、較長 貨架壽命、較少凍乾制程時間及較短復原時間之改良之凍乾FIX調配物。
本發明係針對一種預凍乾調配物，其包含：(a)因子IX(FIX)多肽，其具有FIX凝結活性；(b)緩衝劑；(c)穩定劑；(d)增積劑；及(e)界面活性劑，其中該調配物所具有之填充體積小於約5mL、小於約4mL或小於約3mL，且其中與參考預凍乾調配物相比，(a)至(e)中每一者之每小瓶之量(mg/小瓶)足以允許(1)當凍乾時改良FIX多肽之穩定性；(2)當凍乾時減少復原時間；(3)減少潑灑至包含該調配物之封塞上；(4)減少凍乾循環時間；(5)增加由該預凍乾調配物製備之凍乾物在室溫下之貨架壽命；或(6)其任何組合，其中該參考調配物所包含之(a)至(e)之每小瓶之量與該預凍乾調配物相同，但具有至少5mL填充體積。在一特定實施例中，該調配物之填充體積為約2.65mL。
在一些實施例中，該預凍乾調配物包含至少100IU/小瓶之FIX多肽。在一些實施例中，該預凍乾調配物包含約200IU/小瓶至約10,000IU/小瓶之FIX多肽。
在一些實施例中，該FIX多肽包含野生型FIX。在一些實施例中，該FIX多肽進一步包含與野生型FIX融合之異源部分。在一個實施例中，該異源部分為延長FIX之半衰期的部分。在另一實施例中，該異源部分包 含多肽或非多肽部分。在一個實施例中，該延長FIX之半衰期之部分包含FcRn結合搭配物或Fc區。在一個實施例中，該FIX多肽與SEQ ID NO：2具有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或100%一致性。
在一些實施例中，該填充體積為約4mL、約3.5mL、約3.0mL、約2.9mL、約2.8mL、約2.7mL、約2.65mL、約2.6mL、約2.5mL、約2.4mL、約2.3mL、約2.2mL、約2.1mL或約2.0mL。
在一些實施例中，該減少之復原時間少於1.5分鐘、少於1分鐘、少於50秒、少於40秒、少於30秒、少於20秒或少於10秒。
在一些實施例中，該緩衝劑為L-組胺酸。在一個實施例中，該緩衝劑之濃度(mg/mL)介於約3mg/mL與約15mg/mL之間。在另一實施例中，該緩衝劑之濃度介於每小瓶約8mg與約39mg之間。
在一些實施例中，該穩定劑為蔗糖。在一個實施例中，該穩定劑之濃度(mg/mL)介於10mg/mL與約50mg/mL之間。在另一實施例中，該穩定劑之濃度介於每小瓶約27mg與約132mg之間。
在一些實施例中，該增積劑為甘露醇。在一個實施例中，該增積劑之濃度(mg/mL)介於20mg/mL與約100mg/mL之間。在另一實施例中，該增積劑之濃度介於每小瓶約53mg與每小瓶約265mg之間。
在一些實施例中，該界面活性劑為聚山梨醇 酯20。在一個實施例中，該界面活性劑之濃度(mg/mL)介於0.01mg/mL與約5mg/mL之間。在另一實施例中，該界面活性劑之濃度介於每小瓶約0.03mg與約13mg之間。
在一個態樣中，本發明係針對預凍乾調配物，其包含：(a)約80至約2,750IU/mL rFIXFc；(b)約7.76mg/mL L-組胺酸；(c)約47.6mg/mL甘露醇；(d)約23.8mg/mL蔗糖；及(e)約0.2mg/mL聚山梨醇酯-20。
本發明進一步針對包含FIX多肽、緩衝劑、穩定劑、增積劑、界面活性劑或其任何組合之凍乾物粉末。
在一些實施例中，該凍乾物粉末之殘餘水分含量低於1%。
在一個實施例中，該凍乾物粉末包含：(a)FIX多肽，其量介於每小瓶約2mg與每小瓶約150mg之間；(b)緩衝劑，其量介於每小瓶10mg與每小瓶約30mg之間；(c)增積劑，其量介於每小瓶70mg與每小瓶約200mg之間；(d)穩定劑，其量介於每小瓶30mg與每小瓶100mg之間；及(e)界面活性劑，其量介於每小瓶0.05mg與每小瓶約5mg之間。
在另一實施例中，該凍乾物粉末包含：(a)凍乾之FIX多肽，其量介於每小瓶約2.2mg與每小瓶約125mg之間；(b)緩衝劑，其量介於每小瓶約12.5mg與每小瓶25mg之間；(c)穩定劑，其量介於每小瓶約32.5mg與 每小瓶80mg之間；(d)增積劑，其量介於每小瓶約75mg與每小瓶150mg之間；及(e)界面活性劑，其量介於約0.1mg/mL與約2mg/mL之間。
在另一實施例中，該凍乾物粉末包含：(a)約2.2至約125mg/小瓶之該FIX多肽；(b)約20.6mg/小瓶之L-組胺酸；(c)約126.1mg/小瓶之甘露醇；(d)約63.1mg/小瓶之蔗糖；及(e)約0.53mg/小瓶之聚山梨醇酯-20。
本發明亦針對一種復原調配物，其包含藉由復原緩衝液復原之本文中所描述之凍乾物粉末。
在一個實施例中，該復原調配物包含：(a)FIX多肽，其濃度介於約0.9mg/mL與約50mg/mL之間；(b)緩衝劑，其濃度介於1.5mg/mL與約7.5mg/mL之間；(c)增積劑，其濃度介於10mg/mL與約50mg/mL之間；(d)穩定劑，其濃度介於每小瓶5mg/mL與25mg/mL之間；及(e)界面活性劑，其濃度介於0.005mg/mL與約2.5mg/mL之間。
在另一實施例中，該復原調配物包含：(a)FIX多肽，其濃度介於約0.9mg/mL與約50mg/mL之間；(b)緩衝劑，其濃度為約3.88mg/mL；(c)增積劑，其濃度為約23.8mg/mL；(d)穩定劑，其濃度為約11.9mg/mL；(e)界面活性劑，其濃度為約0.1mg/mL；及(f)復原緩衝液。
在另一實施例中，該復原調配物包含：(a)FIX多肽，其濃度介於約80IU/mL與約2,750IU/mL之 間；(b)緩衝劑，其濃度為約25mM；(c)增積劑，其濃度為約131mM；(d)穩定劑，其濃度為約35mM；(e)界面活性劑，其濃度為0.01%(w/v)；及(f)復原緩衝液。
本發明進一步係關於一種向有需要之B型血友病患者投與FIX多肽之方法，或一種預防、治療、改善或控制有需要之患者之B型血友病的方法，該方法包括向該患者投與本文中所描述之復原調配物。
本發明亦係針對一種生產包含FIX多肽之凍乾物粉末之方法，該方法包括將本文中所描述之預凍乾調配物凍乾。
在一個態樣中，本發明係針對一種凍乾FIX多肽之方法，該方法包括：(a)「冷凍步驟」，其包括將包含該FIX多肽及水性溶劑之預凍乾調配物冷凍；(b)「真空步驟」，其包括使經冷凍之預凍乾調配物之壓力降低可有效地自該經冷凍之預凍乾調配物中移除該水性溶劑之量；及(c)單一「乾燥步驟」，其包括使該經冷凍之預凍乾調配物之溫度增加至高於塌陷溫度，從而產生凍乾物粉末。在一些實施例中，在步驟(a)之前将該預凍乾調配物無菌過濾且無菌填充至小瓶中。
在另一態樣中，本發明係針對生產包含FIX多肽之凍乾物粉末之方法，該方法包括：(a)「冷凍步驟」，其包括藉由使溫度歷經約2小時緩慢降至約-55℃之冷凍溫度且將該冷凍溫度保持約2小時來冷凍包含FIX多肽之預凍乾調配物；(a')「退火步驟」，其包括使步驟 (a)之經冷凍之預凍乾調配物之溫度經約1.5小時緩慢升至約-6℃之退火溫度，將該退火溫度保持約3小時且使該溫度經約1.5小時緩慢降至約-55℃；(b)「真空步驟」，其包括將步驟(a')之經冷凍之預凍乾調配物在約-55℃下在大氣壓下保持2小時且使該壓力經約2小時緩慢降至約0.33毫巴；及(c)單一「乾燥步驟」，其包括在將壓力保持在約0.33毫巴的同時使步驟(b)之經冷凍之預凍乾調配物之溫度經3小時緩慢升至約40℃，及在將壓力保持在約0.33毫巴的同時使該經冷凍之預凍乾調配物之溫度保持在約40℃約25小時，從而產生凍乾物粉末。
在另一態樣中，該凍乾物粉末具有選自由以下組成之群的一或多種特徵：(1)當凍乾時改良FIX多肽之穩定性；(2)當凍乾時減少復原時間；(3)減少潑灑至包含該調配物之封塞上；(4)減少凍乾循環時間；(5)增加由該預凍乾調配物製備之凍乾物在室溫下之貨架壽命；或(6)其任何組合，在一個態樣中，本揭示案提供一種使包含FIX多肽之凍乾物粉末穩定之方法，該方法包括根據本文中所描述之方法將預凍乾調配物凍乾，其中就藉由使用包括多於一個乾燥步驟之凍乾法製備之凍乾物粉末而言，該凍乾物粉末經穩定，如藉由尺寸排除層析法(SEC)所量測。
在另一態樣中，本揭示案提供一種增加包含FIX多肽之凍乾物粉末之貨架壽命之方法，該方法包括根據本文中所描述之方法將預凍乾調配物凍乾，其中就藉由 使用包括多於一個乾燥步驟之凍乾法製備之凍乾物粉末之貨架壽命而言，該凍乾物粉末之貨架壽命有所增加，如藉由SEC及/或FIX凝結活性分析法所量測。
本揭示案亦提供一種減少包含FIX多肽之凍乾物粉末之復原時間的方法，該方法包括根據本文中所描述之方法將預凍乾調配物凍乾，其中就藉由使用包括多於一個乾燥步驟之凍乾法製備之凍乾物粉末之復原時間而言，該凍乾物粉末之復原時間有所減少。
本揭示案進一步提供一種減少生產包含FIX多肽之凍乾物粉末之凍乾制程時間的方法，該方法包括根據本文中所描述之方法將預凍乾調配物凍乾，其中就使用包括多於一個乾燥步驟之凍乾法生產凍乾物粉末之凍乾制程時間而言，該預凍乾調配物之凍乾制程時間有所減少。
圖1顯示各凍乾循環之小瓶裝載模式。編號1、2及3指示熱電偶位置。
圖2顯示得自於對殘餘水分與凍乾參數(溫度、真空度及時間)之函數之DOE分析的預測分析器。
圖3顯示得自於對昇華期間之產物溫度與凍乾參數(溫度及真空度)之函數之DOE分析的預測分析器。
圖4顯示得自於對昇華期間之小瓶品質流與凍乾參數(溫度及真空度)之函數之DOE分析的預測分析器。
圖5顯示得自於實例2中之DOE運作8之凍乾資料，其類似於建議rFIXFc-2G凍乾循環(儲存溫度40℃，腔室真空度250毫托(0.33毫巴)及乾燥時間25小時)。
本揭示案尤其提供包含因子IX(FIX)多肽之預凍乾調配物、復原調配物及凍乾物粉末組合物。本揭示案亦提供用於生產包含FIX多肽之凍乾物粉末的凍乾法。亦提供使包含FIX多肽之凍乾物粉末穩定之方法、增加包含FIX多肽之凍乾物粉末之貨架壽命之方法、減少包含FIX多肽之凍乾物粉末之復原時間之方法及減少包含FIX多肽之預凍乾調配物之凍乾制程時間的方法。另外，本揭示案提供藉由投與包含FIX多肽之復原調配物來預防、治療、改善或控制有需要之患者之B型血友病的方法。
定義
貫穿本揭示案，術語「一個」或「一種」實體係指一或多個(種)該實體；舉例而言，「一個聚核苷酸」應理解為表示一或多個聚核苷酸。因而，術語「一個」(或「一種」)、「一或多個(種)」及「至少一個(種)」在本文中可互換使用。
此外，「及/或」在用於本文中之情況下應被視作特定揭示兩個所說明之特徵或組分中之每一者而存在 或不存在另一者。因而，如諸如「A及/或B」之片語中所使用之術語「及/或」在本文中意欲包括「A及B」、「A或B」、「A」(單獨)及「B」(單獨)。同樣，如諸如「A、B及/或C」之片語中所使用之術語「及/或」意欲涵蓋以下態樣中之每一者：A、B及C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A及C；A及B；B及C；A(單獨)；B(單獨)；及C(單獨)。
應理解，在本文中以措辭「包含」描述態樣之情況下，亦提供以「由......組成」及/或「基本上由......組成」描述之其他類似態樣。
除非另外定義，否則本文中所使用之所有技術及科學術語之含義皆與熟習本揭示案所屬領域之技術人員通常所理解之含義相同。舉例而言，生物醫學與分子生物學簡明辭典(the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology),Juo,Pei-Show，第2版，2002,CRC Press；細胞與分子生物學辭典(The Dictionary of Cell and Molecular Biology)，第3版，1999,Academic Press；及牛津生物化學與分子生物學辭典(the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology)，修訂版，2000,Oxford University Press，為熟習此項技術者提供具有本揭示案中所使用之許多術語的通用詞典。
單位、字首及符號係以其國際單位制(SI)接受之形式表示。數值範圍指示限定該範圍之數字。除非另外指出，否則胺基酸序列按胺基至羧基方向自左向右書寫。 本文中所提供之標題並非對本揭示案之各種態樣之限制，其可藉由整體參考本說明書加以理解。因此，藉由參考本說明書全文，可更全面地定義下文所定義之術語。
術語「約」在本文中用於意謂大致、大約、左右或大略，且值將視量測系統之限制而定。當術語「約」與數值範圍聯合使用時，其藉由擴大所述數值之上下界限來改變該範圍。一般而言，術語「約」可將所述值之上下數值改變例如上下(高或低)10%或20%之變化。除非另外陳述，否則應假定“約”之含義在調配物或組合物之特定值的可接受誤差範圍內。
術語「多肽」、「肽」及「蛋白質」可互換使用且係指由共價連接之胺基酸殘基構成之聚合化合物。
術語「聚核苷酸」及「核酸」可互換使用，且係指由共價連接之核苷酸殘基構成之聚合化合物。聚核苷酸可為單股或雙股DNA、cDNA、RNA、載體、質體、噬菌體或病毒。
如本文中所使用之術語「投與」意謂例如開處方或將包含FIX多肽之醫藥組合物給輿個體。投與途徑之實例包括但不限於靜脈內，例如靜脈內注射及靜脈內輸注，例如經由中心靜脈通路。其他投與途徑包括皮下、肌肉內、經口、經鼻及經肺投與。包含FIX多肽之醫藥組合物可包含一或多種如本文中所描述之賦形劑。本文中所提供之方法、組合物及醫藥套組之優勢包括：改良療法順應性；減少突破性出血；增加對關節出血之保護；防止關節 損傷；降低發病率；降低死亡率；延長出血保護；減少血栓形成事件；及改良生活品質。投藥包括非經腸投藥。在一些實施例中，非經腸投藥為靜脈內或皮下投藥。
如本文中所使用之術語「治療」意謂改善或減少出血疾病或病症(包括但不限於B型血友病)之一或多種症狀。在一個實施例中，「治療」出血疾病或病症包括預防出血疾病或病症之一或多種症狀。在由FIX缺乏(例如低基線FIX活性)引起之出血疾病或病症中，術語「治療」可意謂FIX替代療法。藉由向個體投與FIXFc多肽，該個體可達成及/或維持FIX活性之血漿谷含量於約1IU/dl或高於1IU/dl。在其他實施例中，「治療」意謂降低出血疾病或病症(例如自發性或不可控制之出血發作)之一或多種症狀之頻率。然而，「治療」不必為治癒。
如本文中所使用之「患者」包括已知發作至少一次不受控制之出血發作、已經診斷有與不受控制之出血發作相關之疾病或病症(例如出血疾病或病症，例如B型血友病)、對不受控制之出血發作(例如血友病)敏感或其任何組合之個體。患者亦可包括在某些活動(例如手術、運動活動或任何重體力活動)之前處於一或多種不可控制之出血發作之危險下的個體。該患者可具有小於1%、小於0.5%、小於2%、小於2.5%、小於3%或小於4%之基線FIX活性。患者亦包括兒科人類。兒科患者已出生20年，優選地出生18年、出生16年、出生15年、出生12年、出生11年、出生6年、出生5年、出生2年及2至 11年。
如本文中所使用之「基線」為投與劑量之前個體中之最低量測血漿因子IX含量。投藥前可在兩個時間點量測因子IX血漿含量：篩選訪問時及緊鄰投藥之前。或者，(a)治療前FIX活性<1%、無可偵測之FIX抗原且具有無意義基因型之個體中之基線可定義為0%；(b)治療前FIX活性<1%且具有可偵測之FIX抗原之個體之基線可設定在0.5%；(c)治療前FIX活性介於1%與2%之間的個體的基線為Cmin(整個PK研究中之最低活性)；且(d)治療前FIX活性
Figure 104109389-A0202-12-0014-48
2%之個體之基線可設定在2%。投藥前活性高於基線可被視為來自先前治療之殘留藥物，且可能衰減至基線並且自rFIXFBP投藥後之PK資料中減去。
如本文中所使用之「穀」為在投與一個劑量之本發明嵌合多肽或另一因子IX分子之後且在投與下一劑量(若存在)之前所達到的最低血漿因子IX活性水準。谷在本文中可與「臨限值」互換使用。將基線因子IX含量自所量測之因子IX含量中減去以計算穀含量。
如本文中所使用，術語「半衰期」係指特定多肽在活體內之生物半衰期。半衰期可由投與個體之量之一半自動物之循環及/或其他組織中清除所需之時間表示。
術語「長效」及「耐久」在本文中可互換使用。在一個實施例中，術語「長效」或「耐久」指示由於投與rFIXFBP多肽所產生之FIX活性比野生型FIX(例如 BENEFIX®或血漿衍生之FIX(「pdFIX」))之FIX活性更長久。「更長久」之FIX活性可藉由此項技術中之任何已知方法加以量測，例如aPTT分析法、顯色分析法、ROTEM、TGA等。在一個實施例中，「更長久」之FIX活性可藉由T1/2β(活性)來顯示。在另一實施例中，「更長久」之FIX活性可由血漿中所存在之FIX抗原之含量，例如由T1/2β(抗原)來推斷。
如本文中所使用之術語「凍乾物」、「凍乾物粉末」、「凍乾物製品」或「製品餅」表示藉由冷凍乾燥法製造之調配物。在真空下昇華且在高溫下解吸殘餘水之後藉由冷凍來移除溶劑(例如水)。在醫藥領域中，凍乾物係以粉末或物理穩定餅之形式存在。凍乾物之特徵在於在添加復原介質之後快速溶解。
如本文中所使用之術語「預凍乾調配物」或「凍乾進料」表示藉由冷凍乾燥法移除溶劑(例如水)之前的液體調配物。預凍乾調配物之「填充體積」為液體調配物在凍乾之前的總體積。
如本文中所使用之「T1/2β」或「βHL」為與消除相相關之半衰期，t1/2β=(ln2)/與末相相關之消除速率常數。T1/2β可由FIX活性或由血漿中之FIX抗原含量來量測。基於活性之T1/2β顯示為T1/2β(活性)，且基於FIX抗原含量之T1/2β可顯示為T1/2β(抗原)。T1/2β(活性)及T1/2β(抗原)兩者皆可顯示為範圍或幾何平均值。
如本文中所使用之術語「復原調配物」或 「復原後組合物」表示經凍乾且藉由添加稀釋劑而再溶解之調配物。稀釋劑可含有而不限於注射用水(WFI)、抑菌性注射用水(BWFI)、氯化鈉溶液(例如0.9%(w/v)NaCl)、葡萄糖溶液(例如5%葡萄糖)、含界面活性劑之溶液(例如0.01%聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80)、pH值緩衝溶液(例如磷酸鹽緩衝溶液)及其組合。
一般凍乾制程
凍乾或冷凍乾燥為廣泛用於醫藥工業中用於保存生物學及醫藥材料之制程。凍乾制程亦稱為凍乾循環，其按慣例分為三個不同階段：冷凍、初次乾燥及二次乾燥。如本文中所使用之「凍乾」係指整個凍乾制程，包括冷凍步驟及乾燥步驟兩者。
在凍乾中，在冷凍步驟期間將材料中所存在之水轉化成冰且隨後藉由在初次乾燥步驟期間藉由在低壓條件下直接昇華而自材料中移除。然而，在冷凍期間，並非所有水皆轉化成冰。水之某一部分被俘獲在含有例如調配物組分及/或活性成分之固體基質中。基質內之過量結合水可在二次乾燥步驟期間減至所要殘餘水分含量。所有凍乾步驟，即冷凍、初次乾燥及二次乾燥，決定最終製品性質。初次乾燥典型地為凍乾制程中之最長步驟，因此，對此制程部分之優化具有顯著經濟作用。
在本發明之某些態樣中，該凍乾制程僅包括初次乾燥步驟。
在本發明之某些態樣中，凍乾制程亦包括介於該冷凍步驟與該初次乾燥步驟之間的單獨「真空步驟」。
在本發明之其他態樣中，凍乾制程進一步包括介於該冷凍步驟與該初次乾燥步驟之間的「退火步驟」。
如本文中所使用之術語「退火步驟」係指進行凍乾之多肽製備之凍乾制程中在該製備之乾燥步驟之前的步驟，其中該製備之溫度自較低溫度上升至較高溫度且隨後在一段時間之後再冷卻。
按慣例進行循環及配方優化以確保初次乾燥期間之製品溫度決不超過塌陷溫度。如本文中所使用之術語「塌陷溫度」係指冷凍乾燥期間之製品溫度，高於該溫度時製品餅則開始喪失其原始結構。高於該塌陷溫度時，製品可能經歷緩慢零星鼓泡、膨脹、起泡、空穴化、穿孔、嚴重塌陷、回縮及成珠，從而可能影響製品之外觀。因此，塌陷可能導致不良製品穩定性、長乾燥時間、不均勻乾燥及損失紋理。參見例如US 2010/0041870。
可基於製品品質分析、復原時間、復原品質、高分子量、水分、玻璃轉化溫度(Tg)及生物學或生物化學活性來評估根據本發明之凍乾製品。典型地，製品品質分析包括製品降解速率分析，其係使用包括但不限於以下各項之方法進行：尺寸排除層析法(SEC)、陽離子交換-HPLC(CEX-HPLC)、X射線繞射(XRD)、調制差示掃描量 熱法(mDSC)、逆相HPLC(RP-HPLC)、多角度光散射偵測器(MALS)、螢光、紫外線吸收、濁度測定法、毛細管電泳(CE)、SDS-PAGE及其組合。在一些實施例中，對根據本發明之凍乾製品之評估包括評估餅外觀之步驟。另外，可基於製品典型地在復原之後的生物學或生物化學活性來評估凍乾製品。
凍乾之因子IX調配物
本揭示案提供包含FIX多肽之預凍乾、凍乾及凍乾後調配物或醫藥組合物。
在本發明之某些態樣中，本文中所揭示案之調配物包含FIX多肽、緩衝劑、穩定劑、增積劑及界面活性劑或其任何組合。調配物亦可含有適用於醫藥調配物之任何其他藥劑。
因子IX(FIX)多肽
除非另有規定，否則適用於調配物之FIX多肽或FIX蛋白為正常在凝結方面起作用之功能因子FIX蛋白。因而，FIX多肽包括功能性變異多肽及編碼此種功能性變異多肽之聚核苷酸。在一個實施例中，FIX多肽為人類、牛、豬、犬、貓及鼠類FIX多肽。FIX之全長多肽及聚核苷酸序列為已知的，同樣已知許多功能變異體，例如片段、突變體及經修飾型式。FIX多肽包括全長FIX、全長FIX減N末端上之Met、全長FIX減信號序列、成熟 FIX(減信號序列及前肽)及N末端上具有額外Met之成熟FIX。FIX可藉由重組手段製造(「重組因子IX」或「rFIX」)，亦即，其並非天然存在或來源於血漿。
已知許多功能性FIX變異體。以全文引用之方式併入本文中的國際公開案第WO 02/040544 A3號在第4頁第9至30列及第15頁第6至31列揭示對由肝素所致之抑制展現增加之抗性的突變體。以全文引用之方式併入本文中的國際公開案第WO 03/020764 A2號在表2及表3中(第14至24頁)及第12頁第1至27列揭示具有降低之T細胞免疫原性的FIX突變體。以全文引用之方式併入本文中的國際公開案第WO 2007/149406 A2號在第4頁第1列至第19頁第11列揭示展現增加之蛋白質穩定性、增加之活體內及活體外半衰期及增加之蛋白酶抗性的功能性突變FIX分子。WO 2007/149406 A2在第19頁第12列至第20頁第9列亦揭示嵌合及其他變異FIX分子。以全文引用之方式併入本文中的國際公開案第WO 08/118507 A2號在第5頁第14列至第6頁第5列揭示展現增加之凝結活性的FIX突變體。以全文引用之方式併入本文中的國際公開案第WO 09/051717 A2號在第9頁第11列至第20頁第2列揭示具有增加之N連接及/或O連接糖基化位點數從而增加半衰期及/或回收率之FIX突變體。以全文引用之方式併入本文中的國際公開案第WO 09/137254 A2號在第2頁第[006]段至第5頁第[011]段及第16頁第[044]段至第24頁第[057]段亦揭示具有增加之糖基化位點數的因 子IX突變體。以全文引用之方式併入本文中的國際公開案第WO 09/130198 A2號在第4頁第26列至第12頁第6列揭示具有增加之糖基化位點數從而產生增加之半衰期的功能性突變FIX分子。以全文引用之方式併入本文中的國際公開案第WO 09/140015 A2號在第11頁第[0043]段至第13頁第[0053]段揭示可用於聚合物(例如PEG)接合之Cys殘基數有所增加之功能性FIX突變體。2011年7月11日申請且於2012年1月12日公開為WO 2012/006624之國際申請案第PCT/US2011/043569號中描述FIX多肽且亦以全文引用之方式併入本文中。
在某些實施例中，該FIX多肽包含野生型FIX。在一些實施例中，該FIX多肽進一步包含與野生型FIX融合之異源部分。在某些實施例中，該異源部分為延長FIX之半衰期的部分。在某些實施例中，該異源部分包含多肽或非多肽部分。
在其他實施例中，該FIX多肽為長效FIX多肽。長效FIX多肽可包含FIX部分及非FIX部分，例如能夠延長該FIX多肽之活體內或活體外半衰期的異源部分。例示性非FIX部分包括例如Fc、白蛋白、PAS序列、轉鐵蛋白、CTP(人絨毛膜促性腺激素(hCG)之28胺基酸C末端肽(CTP)與其4個O-聚糖)、聚乙二醇(PEG)、羥乙基澱粉(HES)、白蛋白結合多肽、白蛋白結合小分子或其任何組合。本發明之例示性長效FIX多肽包括例如因子IX-Fc多肽、因子IX-白蛋白多肽、因子IX-PAS多 肽、因子IX-轉鐵蛋白多肽、因子IX-CTP多肽、因子IX-PEG多肽、因子IX-HES多肽、因子IX-白蛋白結合多肽多肽或因子IX-白蛋白結合小分子多肽。
在一個實施例中，該FIX多肽為rFIXFc，即由人類凝血因子IX(FIX)及人類抗體(IgG1同型)之Fc域構成之重組融合蛋白質。參見例如2011年7月11日申請且公開為WO 2012/006624之國際申請案第PCT/US2011/043569號，該案係以全文引用之方式併入本文中。rFIXFc多肽為具有FIXFc單鏈(FIXFc-sc)及Fc單鏈(Fc-sc)(兩者由Fc之鉸鏈區中之兩個二硫鍵結合在一起)之異源二聚蛋白。rFIXFc需要兩個蛋白質亞單位，即FIXFc-sc(642個胺基酸，SEQ ID NO：2)及Fc-sc(227個胺基酸，SEQ ID NO：4)，以便組裝在經轉染之細胞系內以形成最終蛋白質產物rFIXFc。編碼FIXFc-sc及Fc-sc之聚核苷酸序列分別呈現為SEQ ID NO：1及SEQ ID NO：3。
在某些實施例中，rFIXFc之因子IX部分具有與血漿衍生因子IX之Thr148等位基因形式一致且具有類似於內源因子IX之結構及功能特徵的一級胺基酸序列。rFIXFc之Fc域含有IgG1之鉸鏈區、CH2區及CH3區。所組裝之rFIXFc之異源二聚體成熟形式含有869個分子量大致為98千道爾頓之胺基酸。在一些實施例中，該rFIXFc多肽包含與SEQ ID NO：2之胺基酸1至642具有至少90%、95%或100%一致性的胺基酸序列。
在一個實施例中，與FIX融合之第二部分為 FcRn結合搭配物。在另一實施例中，與FIX融合之FcRn結合搭配物為Fc片段。FcRn結合搭配物為可由FcRn受體特異性結合隨後由FcRn結合搭配物之FcRn受體活性轉運的任何分子。因而，術語Fc包括功能性IgG Fc之任何變異體。已基於X射線晶體學描述IgG之Fc部分中結合FcRn受體之區域(Burmeister等人，Nature 372：379(1994)，以全文引用之方式併入本文中)。Fc與FcRn之主要接觸區域在CH2域與CH3域接合處附近。Fc-FcRn觸點均在單一Ig重鏈內。FcRn結合搭配物包括例如整個IgG、IgG之Fc片段及IgG中包括FcRn之完整結合區的其他片段。主要接觸位點包括CH2域之胺基酸殘基248、250-257、272、285、288、290-291、308-311及314以及CH3域之胺基酸殘基385-387、428及433-436。對免疫球蛋白或免疫球蛋白片段或區域之胺基酸編號之參考均基於Kabat等人，1991,Sequences of Proteins of Immunological Interest,U.S.Department of Public Health,Bethesda；MD，該文獻係以全文引用之方式併入本文中。已自若干哺乳動物物種(包括人類)分離FcRu受體。人類FcRn、大鼠FcRn及小鼠FcRn之序列為已知的(Story等人，J.Exp.Med.180：2377(1994)，該文獻係以全文引用之方式併入本文中。)Fc可包含免疫球蛋白之CH2域及CH3域而存在或不存在免疫球蛋白之鉸鏈區。WO 2004/101740及WO 2006/074199中提供例示性Fc變異體，該兩文獻以全文引用之方式併入本文中。
Fc(或嵌合多肽之Fc部分)可含有一或多個突變及突變之組合。
Fc(或嵌合多肽之Fc部分)可含有能賦予增加之半衰期的突變，諸如M252Y、S254T、T256E及其組合，如Oganesyan等人，Mol.Immunol.46：1750(2009)中所揭示，該文獻係以全文引用之方式併入本文中；H433K、N434F及其組合，如Vaccaro等人，Nat.Biotechnol.23：1283(2005)中所揭示，該文獻係以全文引用之方式併入本文中；US 2009/0264627 A1之第1至2頁第[0012]段以及實例9及實例10中所揭示之突變體，該文獻係以全文引用之方式併入本文中；及US 20090163699 A1之第2頁第[0014]至[0021]段中所揭示之突變體，該文獻係以全文引用之方式併入本文中。
Fc(或嵌合多肽之Fc部分)亦可包括例如以下突變：IgG之Fc區可根據諸如定點突變誘發等公認程式加以修飾，以產生經修飾之IgG或Fc片段或其中將由FcRn結合之部分。此種修飾包括例如遠離FcRn接觸位點之修飾以及處於接觸位點內保留或甚至增強與FcRn結合之修飾。舉例而言，人類IgG1 Fc(Fcγ1)中之以下單一胺基酸殘基可經取代而不顯著損失對FcRn之Fc結合親和力：P238A、S239A、K246A、K248A、D249A、M252A、T256A、E258A、T260A、D265A、S267A、H268A、E269A、D270A、E272A、L274A、N276A、Y278A、D280A、V282A、E283A、H285A、N286A、T289A、 K290A、R292A、E293A、E294A、Q295A、Y296F、N297A、S298A、Y300F、R301A、V303A、V305A、T307A、L309A、Q311A、D312A、N315A、K317A、E318A、K320A、K322A、S324A、K326A、A327Q、P329A、A330Q、A330S、P331A、P331S、E333A、K334A、T335A、S337A、K338A、K340A、Q342A、R344A、E345A、Q347A、R355A、E356A、M358A、T359A、K360A、N361A、Q362A、Y373A、S375A、D376A、A378Q、E380A、E382A、S383A、N384A、Q386A、E388A、N389A、N390A、Y391F、K392A、L398A、S400A、D401A、D413A、K414A、R416A、Q418A、Q419A、N421A、V422A、S424A、E430A、N434A、T437A、Q438A、K439A、S440A、S444A及K447A，其中舉例而言，P238A表示在位置編號238上以丙胺酸取代野生型脯胺酸。除丙胺酸以外，其他胺基酸可取代以上所說明之位置上的野生型胺基酸。可以單一地向Fc中引入突變，從而產生多於一百個不同於天然Fc之FcRn結合搭配物。另外，此等個別突變中之兩者、三者或更多者之組合可一起引入，從而產生數以百計之FcRn結合搭配物。此等突變中某些可賦予FcRn結合搭配物新功能。舉例而言，一個實施例併入N297A，從而移除高度保守之N糖基化位點。此突變之作用在於降低免疫原性，從而增加FcRn結合搭配物之循環半衰期；及致使FcRn結合搭配物不能夠結合FcyRI、FcyRIIA、FcyRIIB及 FcyRIIIA，而不損害對FcRn之親和力(Routledge等人，1995,Transplantation 60：847，其係以全文引用之方式併入本文中；Friend等人，1999,Transplantation 68：1632，其係以全文引用之方式併入本文中；Shields等人，1995,J.Biol.Chem.276：6591，其係以全文引用之方式併入本文中；)。另外，至少三種人類Fcγ受體看似可識別下鉸鏈區內之IgG上之結合位點(一般為胺基酸234-237)。因此，新功能及可能之降低之免疫原性之另一實例可歸因於此區域之突變，舉例而言，如藉由人類IgG1之胺基酸233-236「ELLG」置換為來自於IgG2之相應序列「PVA」(具有一個胺基酸缺失)。已顯示，當已引入此種突變時，介導各種效應功能之FcγRI、FcγRII及FcγRIII將不結合IgG1(Ward及Ghetie,Therapeutic Immunology 2：77(1995)，其係以全文引用之方式併入本文中；及Armour等人，Eur.J.Immunol.29：2613(1999)，其係以全文引用之方式併入本文中)。作為由上述突變產生之新功能之另一實例，在一些情況下，FcRn親和力可有所增加，超過野生型。此增加之親和力可體現增加之「締合」速率、降低之「解離」速率或增加之「締合」速率與降低之「解離」速率兩者。據信可賦予增加之FcRn親和力的突變包括例如T256A、T307A、E380A及N434A(Shields等人，J.Biol.Chem.276：6591(2001)，該文獻係以全文引用之方式併入本文中)。
Fc(或嵌合多肽之Fc部分)可與表14中所示之 Fc胺基酸序列(例如SEQ ID NO：4之胺基酸21至247)具有至少約60%、約70%、約80%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或約100%一致性。Fc(或嵌合多肽之Fc部分)可與表14中所示之Fc胺基酸序列(例如SEQ ID NO：4之胺基酸21至247)一致。
如上文所論述，例示性長效多肽亦包括與一或多個白蛋白多肽、白蛋白結合多肽或白蛋白結合小分子融合之FIX。在一個實施例中，該白蛋白為人類白蛋白。白蛋白或白蛋白結合蛋白可融合於FIX之N末端或FIX之C末端或插入FIX中之兩個胺基酸之間。可用於本發明之白蛋白(例如其片段)之實例為已知的，例如美國專利第7,592,010號；美國專利第6,686,179號；及Schulte,Thrombosis Res.124增刊2：S6-S8(2009)，該等文獻各自係以全文引用之方式併入本文中。
白蛋白結合多肽可包括而不限於可結合白蛋白之細菌白蛋白結合域、白蛋白結合肽或白蛋白結合抗體片段。由Kraulis等人，FEBS Lett.378：190-194(1996)及Linhult等人，Protein Sci.11：206-213(2002)所揭示之來自鏈球菌蛋白G之結構域3為細菌白蛋白結合域之一個實例。白蛋白結合肽之實例包括具有核心序列DICLPRWGCLW(SEQ ID NO：5)之一系列肽。參見例如Dennis等人，J.Biol.Chem.2002,277：35035-35043(2002)。白蛋白結合抗體片段之實例揭示於以下文獻中：Muller及Kontermann,Curr.Opin.Mol.Ther.9：319-326 (2007)；Rooverset等人，Cancer Immunol.Immunother.56：303-317(2007)；及Holt等人，Prot.Eng.Design Sci.,21：283-288(2008)，該等文獻係以全文引用之方式併入本文中。
在某些態樣中，本發明之重組FIX多肽包含至少一個針對可結合白蛋白之非多肽小分子、其變異體或衍生物的連接位點。此種白蛋白結合部分之一個實例為如Trusselet等人，Bioconjugate Chem.20：2286-2292(2009)所揭示之2-(3-順丁烯二醯亞胺基丙醯胺基)-6-(4-(4-碘苯基)丁醯胺基)己酸酯(「Albu」標籤)。
如上文所論述，例示性長效多肽亦包括與人絨毛膜促性腺激素之β亞單位之至少一個C末端肽(CTP)或其片段、變異體或衍生物融合之FIX。CTP可融合於FIX，於FIX之N末端或於FIX之C末端。已知融合或插入重組蛋白質之一或多種CTP肽可增加該蛋白質之活體內半衰期。參見例如美國專利第5,712,122號，該專利係以全文引用之方式併入。例示性CTP肽包括DPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPIL(SEQ ID NO：6)或SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(SEQ ID NO：7)。參見例如美國專利申請公開案第US 2009/0087411 A1號，該案係以引用之方式併入。
如上文所論述，例示性長效多肽亦包括與至少一個PAS序列或其片段、變異體或衍生物融合之FIX。PAS序列可融合於FIX之N末端或FIX之C末端。如本 文中所使用之PAS肽或PAS序列意謂主要包含丙胺酸及絲胺酸殘基或主要包含丙胺酸、絲胺酸及脯胺酸殘基之胺基酸序列，該胺基酸序列在生理條件下形成隨機螺圈構形。因此，PAS序列為包含丙胺酸、絲胺酸及脯胺酸、基本上由丙胺酸、絲胺酸及脯胺酸組成或由丙胺酸、絲胺酸及脯胺酸組成之構築塊、胺基酸聚合物或序列卡匣，其可用作嵌合蛋白質中之異源部分之一部分。當添加除丙胺酸、絲胺酸及脯胺酸以外之殘基作為PAS序列中之次要組分時，胺基酸聚合物亦可形成隨機螺圈構形。「次要組分」意謂除丙胺酸、絲胺酸及脯胺酸以外之胺基酸可添加於PAS序列中達到一定程度，例如至多約12%(亦即，PAS序列之100個胺基酸中之約12個)、至多約10%、至多約9%、至多約8%、約6%、約5%、約4%、約3%、約2%或約1%之胺基酸。不同於丙胺酸、絲胺酸及脯胺酸之胺基酸可選自由以下組成之群：Arg、Asn、Asp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Trp、Tyr及Val。在生理條件下，PAS肽形成隨機螺圈構形且從而可介導本發明之重組蛋白質之活體內及/或活體外穩定性增加，且具有促凝血活性。
PAS肽之非限制性實例包括ASPAAPAPASPAAPAPSAPA(SEQ ID NO：8)、AAPASPAPAAPSAPAPAAPS(SEQ ID NO：9)、APSSPSPSAPSSPSPASPSS(SEQ ID NO：10)、APSSPSPSAPSSPSPASPS(SEQ ID NO：11)、 SSPSAPSPSSPASPSPSSPA(SEQ ID NO：12)、AASPAAPSAPPAAASPAAPSAPPA(SEQ ID NO：13)、ASAAAPAAASAAASAPSAAA(SEQ ID NO：14)或其任何變異體、衍生物、片段或組合。PAS序列之其他實例可由例如美國專利公開案第2010/0292130 A1號、PCT申請公開案第WO 2008/155134 A1號及歐洲已頒予專利EP2173890獲知。
如上文所論述，例示性長效多肽亦包括與至少一個轉鐵蛋白肽或其片段、變異體或衍生物融合之FIX。至少一個轉鐵蛋白肽可融合於FIX之N末端或FIX之C末端或插入FIX中之兩個胺基酸之間。任何轉鐵蛋白均可融合於或插入本發明之重組FIX蛋白中。作為一個實例，野生型人類Tf(Tf)為大約75KDa(不考慮糖基化)、具有兩個主要結構域N(約330個胺基酸)及C(約340個胺基酸)之679個胺基酸蛋白質，其看似來源於基因複製。參見GenBank登錄號NM001063、XM002793、M12530、XM039845、XM 039847及S95936(www.ncbi.nlm.nih.gov)，該等登錄號均以全文引用之方式併入本文中。
轉鐵蛋白藉由轉鐵蛋白受體(TfR)介導之胞吞作用來轉運鐵。在鐵釋放至內涵體隔室中且Tf-TfR複合物再循環至細胞表面之後，Tf釋放回細胞外空間以用於下一鐵轉運循環。Tf具有超過14至17天之長半衰期(Li等人，Trends Pharmacol.Sci.23：206-209(2002))。已研究轉鐵蛋白融合蛋白之半衰期延長、癌症療法之靶向遞送、 胰島素原之經口遞送及持續活化(Brandsma等人，Biotechnol.Adv.,29：230-238(2011)；Bai等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：7292-7296(2005)；Kim等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.,334：682-692(2010)；Wang等人，J.Controlled Release 155：386-392(2011))。
如上文所論述，例示性長效多肽亦包括與至少一個聚乙二醇(PEG)部分融合之FIX。
PEG化FIX可能係指FIX與至少一個聚乙二醇(PEG)分子之間形成的結合物。PEG可以多種分子量及平均分子量範圍購自市面。PEG平均分子量範圍之典型實例包括但不限於約200、約300、約400、約600、約1000、約1300-1600、約1450、約2000、約3000、約3000-3750、約3350、約3000-7000、約3500-4500、約5000-7000、約7000-9000、約8000、約10000、約8500-11500、約16000-24000、約35000、約40000、約60000及約80000道爾頓。此等平均分子量僅作為實例提供且決非意在具有限制性。
本發明之重組長效FIX蛋白可經PEG化以包括單或多(例如2至4個)PEG部分。PEG化可藉由此項技術中已知的任何PEG化反應來進行。用於製備PEG化蛋白質產物之方法一般將包括(i)使多肽與聚乙二醇(諸如PEG之反應性酯或醛衍生物)在使得本發明之肽連接於一或多個PEG基團之條件下反應；及(ii)獲得反應產物。一般而言，反應之最佳反應條件將基於已知參數及所要結果 根據情況確定。
熟習此項技術者可利用許多PEG連接法，例如Malik F等人，Exp.Hematol.20：1028-35(1992)；Francis,Focus on Growth Factors 3(2)：4-10(1992)；歐洲專利公開案第EP0401384號、第EP0154316號及第EP0401384號；及國際專利申請公開案第WO92/16221號及第WO95/34326號。作為一個非限制性實例，FIX變異體可在FIX中之一或多個插入位點上含有半胱胺酸取代，且半胱胺酸可進一步結合於PEG聚合物。參見Mei等人，Blood 116：270-279(2010)及美國專利第7,632,921號，該等文獻係以全文引用之方式併入本文中。
如上文所論述，例示性長效多肽亦包括與至少一個羥乙基澱粉(HES)聚合物融合之FIX。HES為天然存在之支鏈澱粉之衍生物且在體內由α-澱粉酶降解。HES展現有利生物學性質且用作血液容量置換劑並且在臨床上用於血液稀釋療法。參見例如Sommermeyer等人，Krankenhauspharmazie 8：271-278(1987)；及Weidler等人，Arzneim.-Forschung/Drug Res.41：494-498(1991)。
HES主要以分子量分佈及取代度為特徵。HES所具有之平均分子量(重量平均值)為1至300kD、2至200kD、3至100kD或4至70kD。就羥乙基而言，羥乙基澱粉可進一步展現0.1至3、0.1至2、0.1至0.9或0.1至0.8之莫耳取代度及在2至20範圍內之C2：C6取代比。平均分子量為約130kD之HES為得自Fresenius之 VOLUVEN®。VOLUVEN®為用於例如治療適應症中所使用之體積置換以便治療及預防低血容量症的人工膠體。熟習此項技術者可利用許多HES連接方法，例如與上文所述相同之PEG連接法。
因子IX凝結活性係以國際單位(IU)表示。一個IU之因子IX活性大致對應於一毫升正常人血漿中之因子IX之量。若干分析法可用於量測因子IX活性，包括一步凝結分析法(活化部分凝血酶時間；aPTT)、凝血酶世代時間(TGA)及旋轉式血栓彈性分析術(ROTEM®)。
緩衝劑
適用於本發明之緩衝劑可為用於在添加另一酸或鹼之後維持溶液之酸性(pH值)接近所選值的弱酸或鹼。合適之緩衝劑可藉由維持調配物之pH值控制而使醫藥調配物之穩定性最大化。合適之緩衝劑亦可確保生理相容性或優化溶解性。流變學性質、黏度及其他性質亦可視調配物之pH值而定。常用緩衝劑包括但不限於組胺酸、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽、乙酸鹽及磷酸鹽。在一些實施例中，緩衝劑包含L-組胺酸或L-組胺酸與L-組胺酸鹽酸鹽與等滲劑之混合物，且可能用此項技術中已知的酸或鹼進行pH值調節。在某些實施例中，該緩衝劑為L-組胺酸。在某些實施例中，該調配物之pH值係維持在約6與約8之間或約6.5與約7.5之間。
穩定劑
將穩定劑添加至醫藥製品中以便穩定該製品。此種藥劑可以許多不同的方式穩定蛋白質。常用穩定劑包括但不限於諸如甘胺酸、丙胺酸、離胺酸、精胺酸或蘇胺酸之胺基酸、諸如葡萄糖、蔗糖、海藻糖、棉籽糖或麥芽糖之糖、諸如甘油、甘露醇、山梨醇、環糊精或任何種類及分子量之聚葡萄糖或PEG之多元醇。在本發明之一個態樣中，選擇穩定劑以便使凍乾製劑中之FIX多肽之穩定性最大化。在某些實施例中，穩定劑為蔗糖。
增積劑
可將增積劑添加至藥物製品中以便增加製品之體積及品質，從而有助於對其進行精確計量及處理。常用增積劑包括但不限於乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、碳酸鈣或硬脂酸鎂。在某些實施例中，增積劑為甘露醇。
界面活性劑
界面活性劑為具有親水性基團及疏水性基團之兩性物質。界面活性劑可為陰離子、陽離子、兩性離子或非離子的。非離子界面活性劑之實例包括但不限於乙氧基化烷基、乙氧基化壬基苯酚、乙氧基化胺、聚氧化乙烯、聚氧化丙烯、諸如鯨蠟醇或油醇之脂肪醇、椰油醯胺MEA、椰油醯胺DEA、聚山梨醇酯或十二烷基二甲胺氧 化物。在某些實施例中，該界面活性劑為聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。
預凍乾調配物
在一個態樣中，本揭示案提供一種預凍乾調配物，其包含：(a)因子IX(FIX)多肽，其具有FIX凝結活性；(b)緩衝劑；(c)穩定劑；(d)增積劑；及(ee)界面活性劑，其中該調配物所具有之填充體積小於約5mL、小於約4mL或小於約3mL，且其中(a)至(e)中每一者之每小瓶之量(mg/小瓶)足以允許與參考預凍乾調配物相比，(1)當凍乾時改良該FIX多肽之穩定性；(2)當凍乾時減少復原時間；(3)減少潑灑至包含該調配物之封塞上；(4)減少凍乾循環時間；(5)增加由該預凍乾調配物製備之凍乾物在室溫下之儲存期限；或(6)其任何組合，且其中該參考調配物所包含之(a)至(e)之每小瓶之量與該預凍乾調配物相同，但具有至少5mL填充體積。在 一些實施例中，該參考調配物具有5.3mL填充體積或5mL填充體積。
在其他實施例中，該預凍乾調配物允許選自以下之至少兩種、至少三種、至少四種或至少五種性質：(1)當凍乾時改良該FIX多肽之穩定性；(2)當凍乾時減少復原時間；(3)減少潑灑至包含該調配物之封塞上；(4)減少凍乾循環時間；及n(5)增加由該預凍乾調配物製備之凍乾物在室溫下之儲存期限。在某些實施例中，該預凍乾調配物允許(1)當凍乾時改良該FIX多肽之穩定性。在某些實施例中，該預凍乾調配物允許(2)當凍乾時減少復原時間。在某些實施例中，該預凍乾調配物允許(3)減少潑灑至包含該調配物之封塞上。在某些實施例中，該預凍乾調配物允許(4)減少凍乾循環時間。在某些實施例中，該預凍乾調配物允許(5)增加由該預凍乾調配物製備之凍乾物在室溫下之儲存期限。在某些實施例中，該預凍乾調配物允許(6)本文中所描述之性質的任何組合。
在某些實施例中，該預凍乾調配物包含至少約100IU/小瓶之FIX多肽。在某些實施例中，該預凍乾調配物包含至少約200IU/小瓶至約10,000IU/小瓶之FIX多肽、約200IU/小瓶至約6,000IU/小瓶或約500IU/小瓶至約5,000IU/小瓶。在某些實施例中，該預凍乾調配物包含約220IU/小瓶、約250IU/小瓶、約300IU/小瓶、約400IU/小瓶、約500IU/小瓶、約600IU/小瓶、約700IU/小瓶、約800IU/小瓶、約900IU/小瓶、約1,000IU/ 小瓶、約1,100IU/小瓶、約1,200IU/小瓶、約1,300IU/小瓶、約1,400IU/小瓶、約1,500IU/小瓶、約2,000IU/小瓶、約2,500IU/小瓶、約3,000IU/小瓶、約4,000IU/小瓶、約5,000IU/小瓶、約5,500IU/小瓶、約6,000IU/小瓶、約6,500IU/小瓶、約7,000IU/小瓶、約7,500IU/小瓶、約8,000IU/小瓶、約8,500IU/小瓶、約9,000IU/小瓶、約9,500IU/小瓶或約10,000IU/小瓶之該FIX多肽。
在一些實施例中，藉由減少填充體積來達成該預凍幹調配物之更高濃度。在某些實施例中，該預凍乾調配物所具有之填充體積為約4.0mL、約3.5mL、約3.0mL、約2.9mL、約2.8mL、約2.7mL、約2.65mL、約2.6mL、約2.5mL、約2.4mL、約2.3mL、約2.2mL、約2.1mL或約2.0mL。在一些實施例中，該預凍乾調配物之填充體積為約2.65mL。在一些實施例中，該預凍乾調配物之填充體積小於約5mL。
在一些實施例中，藉由額外純化步驟，例如第二超濾步驟來進一步濃縮該FIX多肽。
在某些實施例中，該減少之復原時間少於1.5分鐘、少於1分鐘、少於50秒、少於40秒、少於30秒、少於20秒或少於10秒。在特定實施例中，該減少之復原時間少於30秒。
在某些實施例中，該預凍乾調配物之減少之凍乾循環時間為約4天或更少、約3天或更少、約2天或 更少或者約1天或更少。
在某些實施例中，該預凍乾調配物中之緩衝劑之濃度介於約3mg/mL與約15mg/mL之間、介於4mg/mL與12mg/mL之間、介於約5mg/mL與約10mg/mL之間或介於約5.82mg/mL與約9.7mg/mL之間。在一個實施例中，該緩衝劑之濃度介於約3.88mg/mL與約9.7mg/mL之間。在一個實施例中，該緩衝劑之濃度為約7.76mg/mL。在一些實施例中，該預凍乾調配物所含有之L-組胺酸之濃度為約7.76mg/mL。
在某些實施例中，該預凍乾調配物中之穩定劑之濃度介於10mg/mL與約50mg/mL之間、介於約13mg/mL與約40mg/mL之間、介於約15mg/mL與約35mg/mL之間或介於約17.85mg/mL與約29.95mg/mL之間。在一個實施例中，該緩衝劑之濃度為約23.8mg/mL。在一些實施例中，該預凍乾調配物所含有之蔗糖之濃度為23.8mg/mL。
在某些實施例中，該預凍乾調配物中之增積劑之濃度介於約20mg/mL與約100mg/mL之間、介於約30mg/mL與約70mg/mL之間、介於約30mg/mL與約60mg/mL之間或介於約35.7mg/mL與約59.5mg/mL之間。在一個實施例中，該增積劑之濃度為約47.6mg/mL。在一些實施例中，該預凍乾調配物所含有之甘露醇之濃度為約47.6mg/mL。
在某些實施例中，該預凍乾調配物中之界面 活性劑之濃度介於約0.01mg/mL與約5mg/mL之間、介於約0.1mg/mL與約4mg/mL之間、介於約0.1mg/mL與約3mg/mL之間、介於約0.01mg/mL與約2mg/mL之間或介於約0.05mg/mL與約1mg/mL之間。在一個實施例中，該界面活性劑之濃度為約0.2mg/mL。在一些實施例中，該預凍乾調配物所含有之聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80之濃度為約0.2mg/mL。
在某些實施例中，該預凍乾調配物中之FIX多肽之濃度介於約80IU/mL與約2,750IU/mL之間。在一些實施例中，該預凍乾調配物中之FIX多肽之濃度為至少約100IU/mL、至少約200IU/mL、至少約300IU/mL、至少約400IU/mL、至少約500IU/mL、至少約600IU/mL、至少約700IU/mL、至少約800IU/mL、至少約900IU/mL、至少約1000IU/mL、至少約1500IU/mL、至少約2000IU/mL或至少約2500IU/mL。
在一個態樣中，本揭示案進一步提供一種預凍乾調配物，其包含：
(a)約80至約2,750IU/mL之rFIXFc；
(b)約7.76mg/mL之L-組胺酸。
(c)約47.6mg/mL之甘露醇；
(d)約23.8mg/mL之蔗糖；及，
(e)約0.2mg/mL之聚山梨醇酯-20。
在某些實施例中，此種預凍乾調配物之填充體積為約3mL、約2.9mL、約2.8mL、約2.7mL、約 2.65mL、約2.6mL、約2.5mL、約2.4mL、約2.3mL、約2.2mL、約2.1mL或約2.0mL。在一個實施例中，此種預凍乾調配物之填充體積為約2.65mL。
另外，本揭示案提供一種凍乾物粉末，其係由上述預凍乾調配物中之任一種凍乾。在一些實施例中，該預凍乾調配物為本文中所描述之任何調配物。
凍乾物粉末
本揭示案亦提供一種包含FIX多肽、緩衝劑、穩定劑、增積劑、界面活性劑或其任何組合之凍乾物粉末。
在某些實施例中，該凍乾物粉末包含介於每小瓶約8mg與約39mg之間、介於每小瓶約9mg與約35mg之間、介於每小瓶10mg與約30mg之間、介於每小瓶約12mg與約25mg之間、介於每小瓶約15mg與約23mg之間的緩衝劑(例如L-組胺酸)。在一個實施例中，該凍乾物粉末包含每小瓶約25mg、每小瓶約24mg、每小瓶約23mg、每小瓶約22mg、每小瓶約21mg、每小瓶約20mg、每小瓶約19mg、每小瓶約18mg、每小瓶約17mg、每小瓶約16mg、每小瓶約15mg之緩衝劑。在另一實施例中，該凍乾物粉末包含每小瓶約20.6mg之緩衝劑。在一些實施例中，該緩衝劑為L-組胺酸。
在某些實施例中，該凍乾物粉末包含介於每小瓶約27mg與約132mg之間、介於每小瓶約30mg與 約120mg之間、介於每小瓶約40mg與約110mg之間、介於每小瓶約50mg與約100mg之間、介於每小瓶約60mg與約90mg之間的穩定劑。在一個實施例中，該凍乾物粉末包含每小瓶約68mg、每小瓶約67mg、每小瓶約66mg、每小瓶約65mg、每小瓶約64mg、每小瓶約63mg、每小瓶約62mg、每小瓶約61mg、每小瓶約60mg、每小瓶約59mg之穩定劑。在另一實施例中，該凍乾物粉末包含每小瓶約63.1mg之穩定劑。在一些實施例中，該穩定劑為蔗糖。
在某些實施例中，該凍乾物粉末包含介於每小瓶約50mg與約265mg之間、介於每小瓶約53mg與約265mg之間、介於每小瓶約50mg與約250mg之間、介於每小瓶約53mg與約265mg之間、介於每小瓶約80mg與約200mg之間、介於每小瓶約100mg與約150mg之間或介於每小瓶約110mg與約140mg之間的增積劑。在一個實施例中，該凍乾物粉末包含每小瓶約131mg、每小瓶約130mg、每小瓶約129mg、每小瓶約128mg、每小瓶約127mg、每小瓶約126mg、每小瓶約125mg、每小瓶約124mg、每小瓶約123mg或每小瓶約122mg之增積劑。在另一實施例中，該凍乾物粉末包含每小瓶約126.1mg之增積劑。在一些實施例中，該增積劑為甘露醇。
在某些實施例中，該凍乾物粉末包含介於每小瓶約0.03mg與約13mg之間、介於每小瓶約0.05mg 與約10mg之間、介於每小瓶約0.07mg與約8mg之間、介於每小瓶約0.1mg與約2mg之間的界面活性劑。在一個實施例中，該凍乾物粉末包含每小瓶約1mg、每小瓶約0.9mg、每小瓶約0.8mg、每小瓶約0.7mg、每小瓶約0.6mg、每小瓶約0.5mg、每小瓶約0.4mg、每小瓶約0.3mg、每小瓶約0.2mg或每小瓶約0.1mg之界面活性劑。在另一實施例中，該凍乾物粉末包含每小瓶約0.5mg之界面活性劑。在一個實施例中，該凍乾物粉末包含每小瓶約0.53mg之介面活性劑。在一些實施例中，該界面活性劑為聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80。
在某些實施例中，該凍乾物粉末包含：(a)FIX多肽，其量介於每小瓶約2mg與每小瓶約150mg之間；(b)緩衝劑，其量介於每小瓶約10mg與每小瓶約30mg之間；(c)增積劑，其量介於每小瓶約70mg與每小瓶約200mg之間；(d)穩定劑，其量介於每小瓶約30mg與每小瓶100mg之間；及(e)界面活性劑，其量介於每小瓶約0.05mg與每小瓶約5mg之間。
在一些實施例中，該凍乾物粉末包含：
(a)FIX多肽，其量介於每小瓶約2.2mg與每小瓶約125mg之間；
(b)緩衝劑，其量介於每小瓶約8mg與每小瓶約39mg之間；
(c)增積劑，其量介於每小瓶約53mg與每小瓶約265mg之間。
(d)穩定劑，其量介於每小瓶約27mg與每小瓶132mg之間；及
(e)界面活性劑，其量介於每小瓶約0.03mg與每小瓶約13mg之間。
在某些實施例中，該凍乾物粉末包含：(a)該凍乾之FIX多肽，其量介於每小瓶約2.2mg與每小瓶約125mg之間；(b)該緩衝劑，其量介於每小瓶約12.5mg與每小瓶25mg之間；(c)該穩定劑，其量介於每小瓶約32.5mg與每小瓶80mg之間；(d)該增積劑，其量介於每小瓶約75mg與每小瓶150mg之間；及(e)該界面活性劑，其量介於約0.1mg/mL與約2mg/mL之間。
在一個實施例中，該凍乾物粉末包含：(a)約2.2至約125mg/小瓶之該FIX多肽；(b)約20.6mg/小瓶之L-組胺酸；(c)約126.1mg/小瓶之甘露醇；(d)約63.1mg/小瓶之蔗糖；及 (e)約0.53mg/小瓶之聚山梨醇酯20。
復原調配物
此外，本揭示案提供一種復原調配物，其包含由復原緩衝液復原之上述凍乾物粉末中之任一種。
在某些實施例，該復原緩衝液為NaCl溶液。在一些實施例中，該復原緩衝液為5mL。
在某些實施例中，該復原調配物包含：(a)該FIX多肽，其濃度介於約0.9mg/mL與約50mg/mL之間；(b)該緩衝劑，其濃度介於2mg/mL與約5mg/mL之間；(c)該增積劑，其濃度介於20mg/mL與約30mg/mL之間；(d)該穩定劑，其濃度介於每小瓶8mg/mL與15mg/mL之間；及(e)該界面活性劑，其濃度介於0.05mg/mL與約0.4mg/mL之間。
在某些實施例中，該復原調配物包含：(a)該FIX多肽，其濃度介於約0.9mg/mL與約50mg/mL之間；(b)該緩衝劑，其濃度為約3.88mg/mL；(c)該增積劑，其濃度為約23.8mg/mL；(d)該穩定劑，其濃度為約11.9mg/mL； (e)該界面活性劑，其濃度為約0.1mg/mL；及(f)該復原緩衝液，其包含約3.25mg/mL NaCl。
在某些實施例中，該復原調配物包含：(a)該FIX多肽，其濃度介於約80IU/mL與約2,750IU/mL之間；(b)該緩衝劑，其濃度為約25mM；(c)該增積劑，其濃度為約131mM；(d)該穩定劑，其濃度為約35mM；(e)該界面活性劑，其濃度為0.01%(w/v)；及(f)該復原緩衝液。
調配物組合物之實例進一步提供於表2至表4中。
在一個態樣中，本揭示案進一步提供一種小瓶，其包含本文中所描述之預凍乾調配物、凍乾物粉末或復原調配物。
在另一個態樣中，本揭示案提供一種套組，其包括包含本文中所描述之凍乾物粉末的第一容器及包含復原緩衝液之第二容器，當與該第一容器之凍乾物粉末組合時，該復原緩衝液之體積足以產生復原調配物。在某些實施例中，該套組中之復原緩衝液之體積為約5mL。在一些實施例中，該體積為約5.3mL。在某些實施例中，該套組之復原緩衝液包含NaCl。在一些實施例中，該套組係用於治療B型血友病。
在另一態樣中，本揭示案提供一種向有需要 之B型血友病患者投與FIX多肽之方法，其包括向該患者投與本文中所描述之復原調配物，其中該投與預防或降低該患者之出血發作之頻率或嚴重程度。
本揭示案進一步提供一種藉由投與本文中所描述之復原調配物來預防、治療、改善或控制有需要之患者之B型血友病的方法。
生產包含FIX多肽之凍乾物粉末的方法
本揭示案提供生產包含FIX多肽之凍乾物粉末的方法。在一個態樣中，本揭示案提供凍乾方法，其包括將本文中所描述之預凍乾調配物凍乾。在另一態樣中，本揭示案提供一種凍乾方法，其包括單一乾燥步驟。
在一個態樣中，本揭示案提供一種凍乾FIX多肽之方法，其包括：(a)「冷凍步驟」，其包括將包含該FIX多肽及水性溶劑之預凍乾調配物冷凍；(b)「真空步驟」，其包括使經冷凍之預凍乾調配物之壓力降低可有效地自該經冷凍之預凍乾調配物中移除該水性溶劑之量；及(c)單一「乾燥步驟」，其包括使該經冷凍之預凍乾調配物之溫度增加至高於塌陷溫度，從而產生凍乾物粉末。在另一態樣中，凍乾制程時間與參考方法(例如具有兩個或更多個乾燥步驟之凍乾制程)相比有所減少。
在其他態樣中，藉由本發明方法生產之凍乾物粉末具有一或多個以下特徵：(1)改良該FIX多肽之穩定性；(2)減少復原時間；(3)減少潑灑至包含該調配物之封塞上；或(4)增加該凍乾物粉末在室溫下之貨架壽命。
在某些實施例中，該塌陷溫度為-1.5℃。
在某些實施例中，該預凍乾調配物在該冷凍步驟期間係冷凍至約-65℃至約-40℃、約-65℃至約-45℃、約-65℃至約-55℃、約-60℃至約-40℃、約-60℃至約-50℃或約-60℃至約-55℃之冷凍溫度。在某些實施例中，該預凍乾調配物在該冷凍步驟期間係冷凍至約-55℃之冷凍溫度。在某些實施例中，該冷凍溫度在該冷凍步驟期間自約5℃緩慢降至約-55℃。
在某些實施例中，在該冷凍步驟期間將該冷凍溫度保持約30分鐘至約5小時、約1小時至約5小時、約1.5小時至約5小時、約1.5小時至約4小時、約1.5小時至約3小時或約1.5小時至約2.5小時。在某些實施例中，在該冷凍步驟期間將該冷凍溫度保持約2小時。
在某些實施例中，使步驟(a)之經冷凍之預凍乾調配物在該「真空步驟」(b)之前進一步經受「退火步驟」(a')。在某些實施例中，步驟(a)之經冷凍之預凍乾調配物之溫度在該退火步驟期間緩慢升至約-15℃至約-2℃之退火溫度。在某些實施例中，步驟(a)之經冷凍之預凍乾調配物之溫度在該退火步驟期間緩慢升至約-6℃之退火溫度。
在某些實施例中，在該退火步驟期間將該退火溫度保持約2小時至約4小時。在某些實施例中，在該退火步驟期間將該退火溫度保持約30分鐘至約5小時、約1小時至約5小時、約2小時至約5小時、約2小時至約4小時或約2.5小時至約3.5小時。在某些實施例中，在該退火步驟期間將該退火溫度保持約3小時。
在某些實施例中，經冷凍之預凍乾調配物之溫度在該退火步驟期間自該退火溫度緩慢降至約-65℃至約-40℃之溫度。在某些實施例中，經冷凍之預凍乾調配物之溫度在該退火步驟期間自該退火溫度緩慢降至-55℃之溫度。
在某些實施例中，該「真空步驟」包括使經冷凍之預凍乾調配物經受介於約0.05與約1毫巴之間、介於約0.05與約0.50毫巴之間、介於約0.10與約0.50毫巴之間、介於約0.15與約0.50毫巴之間、介於約0.20與約0.50毫巴之間或介於約0.25與約0.50毫巴之間的真空。在某些實施例中，該「真空步驟」中之真空為約0.33毫巴。
在某些實施例中，在該「真空步驟」中將真空保持約5小時、約4小時、約3小時、約2小時或約1小時。在一些實施例中，在該「真空步驟」中將真空保持約2小時。
在某些實施例中，該「乾燥步驟」包括使經冷凍之預凍乾調配物之溫度自約-55℃緩慢升至約40℃之 乾燥溫度。在某些實施例中，該乾燥溫度為至少約30℃、至少約32℃、至少約34℃、至少約35℃、至少約36℃、至少約38℃、至少約39℃、至少約40℃。在其他實施例中，該乾燥溫度為約35℃、約40℃、約32℃或約45℃。
在某些實施例中，該乾燥步驟進一步包括將該乾燥溫度保持約10小時至約40小時、約10小時至約30小時或約20小時至約30小時。在某些實施例中，將該乾燥溫度保持約25小時。
在某些實施例中，該乾燥步驟係在約0.05毫巴至約1毫巴、介於約0.05與約0.50毫巴之間、介於約0.10與約0.50毫巴之間、介於約0.15與約0.50毫巴之間、介於約0.20與約0.50毫巴之間或約0.20毫巴至約0.45毫巴之壓力下進行。在某些實施例中，在該乾燥步驟期間將壓力保持在約0.33毫巴。單位毫巴可轉換成托或任何其他單位。舉例而言，1毫巴可轉換成0.75006375541921托。
在一個態樣中，本揭示案提供一種生產包含FIX多肽之凍乾物粉末的方法，其包括：(a)「冷凍步驟」，其包括藉由使溫度經約2小時緩慢降至約-55℃之冷凍溫度且將該冷凍溫度保持約2小時來冷凍包含FIX多肽之預凍乾調配物；(a')「退火步驟」，其包括使該步驟(a)之經冷凍之預凍乾調配物之溫度經約1.5小時緩慢升至約-6℃之退火溫度，將該退火溫度保持約3小時且使該溫度經約1.5小時 緩慢降至約-55℃；(b)「真空步驟」，其包括將步驟(a')之經冷凍之預凍乾調配物在約-55℃下在大氣壓下保持2小時且使該壓力經約2小時緩慢降至約0.33毫巴；及，(c)單一「乾燥步驟」，其包括在將壓力保持在約0.33毫巴的同時使步驟(b)之經冷凍之預凍乾調配物之溫度經3小時緩慢升至約40℃，及在將壓力保持在約0.33毫巴的同時將該經冷凍之預凍乾調配物之溫度在約40℃下保持約25小時，從而產生該凍乾物粉末。在一些實施例中，該凍乾方法花費較少循環時間。
在某些實施例中，藉由本文中所描述之方法生產之凍乾物粉末具有以下特徵：(1)改良該FIX多肽之穩定性；(2)減少復原時間；(3)減少潑灑至包含該調配物之封塞上；(4)增加凍乾物粉末在室溫下之貨架壽命；或(5)其任何組合，在一些實施例中，該凍幹循環週期可少於約4.5天、約4天、約3.5天、約3天、約2.5天或約2天。在其他實施例中，該凍幹循環週期為約3天或更短。在某些實施例中，該凍乾法中所使用之預凍乾調配物之填充體積小於約5mL。在某些實施例中，該填充體積為約4mL、約3.5mL、約3.0mL、約2.9mL、約2.8mL、約 2.7mL、約2.65mL、約2.6mL、約2.5mL、約2.4mL、約2.3mL、約2.2mL、約2.1mL或約2.0mL。在一個實施例中，該填充體積為約2.65mL。
在某些實施例中，藉由該凍乾法生產之凍乾物粉末之減少之復原時間少於約1.5分鐘、少於約1分鐘、少於約50秒、少於約40秒、少於約30秒、少於約20秒或少於約10秒。在某些實施例中，藉由該凍乾法生產之凍乾物粉末之減少之復原時間少於約30秒。
在某些實施例中，該凍乾法中所使用之預凍乾調配物之減少之凍乾循環時間為約4天或更少、約3天或更少、約2天或更少或者約1天或更少。
在一些實施例中，該凍乾物粉末係在約90小時或更少時間內、約80小時或更少時間內、約70小時或更少時間內、約60小時或更少時間內、約50小時或更少時間內、約45小時或更少時間內、約40小時或更少時間內或約30小時或更少時間內由該預凍乾調配物產生。在某些實施例中，該凍乾物粉末係在約45小時或更少時間內由該預凍乾調配物產生。
在某些實施例中，該凍乾物粉末中之殘餘水分少於約1.0%、約0.7%、約0.6%、約0.5%、約0.4%或約0.3%。在一些實施例中，該凍乾物粉末中之殘餘水分少於約0.5%。
在一個態樣中，本揭示案提供一種使包含FIX多肽之凍乾物粉末穩定之方法，該方法包括根據本文中所 描述之方法將預凍乾調配物凍乾，其中就藉由使用包括多於一個乾燥步驟之凍乾法製備之凍乾物粉末而言，該凍乾物粉末經穩定，如藉由尺寸排除層析法(SEC)所量測。
在另一態樣中，本揭示案提供一種增加包含FIX多肽之凍乾物粉末之貨架壽命之方法，該方法包括根據本文中所描述之方法將預凍乾調配物凍乾，其中就藉由使用包括多於一個乾燥步驟之凍乾法製備之凍乾物粉末之貨架壽命而言，該凍乾物粉末之貨架壽命有所增加，如藉由SEC及/或FIX凝結活性分析法所量測。
本揭示案亦提供一種減少包含FIX多肽之凍乾物粉末之復原時間的方法，該方法包括根據本文中所描述之方法將預凍乾調配物凍乾，其中就藉由使用包括多於一個乾燥步驟之凍乾法製備之凍乾物粉末之復原時間而言，該凍乾物粉末之復原時間有所減少。
本揭示案進一步提供一種減少生產包含FIX多肽之凍乾物粉末之凍乾制程時間的方法，該方法包括根據本文中所描述之方法將預凍乾調配物凍乾，其中就使用包括多於一個乾燥步驟之凍乾法生產凍乾物粉末之凍乾制程時間而言，該預凍乾調配物之凍乾制程時間有所減少。
現已詳細描述本發明，藉由參考以下實例將更清楚地理解本發明，該等實例僅出於說明之目的包括在此而不意欲限制本發明。本文中所提及之所有專利及出版物明確地以引用之方式併入。
實例 實例1：因子IX-Fc原料藥及藥物製品組合物 rFIXFc描述
rFIXFc為由共價連接於人類免疫球蛋白G1(IgG1)之Fc域的人類凝血因子IX(FIX)組成的長效充分重組融合蛋白質。rFIXFc之因子IX部分具有與血漿衍生因子IX之Thr148等位基因形式一致且具有類似於內源因子IX之結構及功能特徵的一級胺基酸序列。rFIXFc之Fc域含有IgG1之鉸鏈區、CH2區及CH3區。rFIXFc含有869個胺基酸，分子量為約98千道爾頓。
在人胚腎(HEK)中藉由重組DNA技術產生rFIXFc且隨後純化。
包含rFIXFc之本發明rFIXFc藥物製品調配 物可允許開發高濃度藥物製品，例如4000+IU/小瓶藥物製品強度。由此需要原料藥中之rFIXFc蛋白濃度較高，如以下比較表1中所示。本發明之rFIXFc藥物製品調配物可增加250及500IU/小瓶藥物製品強度之貨架壽命以允許增加室溫穩定性。開發資料表明，250及500IU/小瓶藥物製品強度在加速條件下與參考藥物製品相比顯著更穩定。
本發明之rFIXFc藥物製品調配物當凍乾時亦可減少復原時間。參考藥物製品復原時間在1至2分鐘之間變化。開發資料表明，LCM藥物製品使復原時間減至少於30秒。
本發明之rFIXFc藥物製品調配物亦可允許減少凍乾制程時間。當前，凍乾循環為約4.5天。在較低小瓶填充體積之情況下，此時間可能減至約3天或更少以達成更經濟之製造。
原料藥(DS)
本發明之rFIXFc調配物之原料藥將使用與參考原料藥相同之調配賦形劑。在原料藥製造期間使用第二超濾步驟將達成較高濃度。參見表1。
Figure 104109389-A0202-12-0053-1
藥物製品(DP)
為了實現上述目標，設計參考藥物製品之所有組分(蛋白質及賦形劑)之濃度加倍的藥物製品，同時在凍乾之前減少小瓶之填充體積。由此確保投與患者之所有組分之劑量保持恆定，同時改良上述藥物製品效能參數。
以下表2至表4詳細描述凍乾進料之組成、凍乾後小瓶中固體製品之含量及復原後之組成。重要的是注意到rFIXFc蛋白濃度之廣泛差異。由於各批次因子IX 在其活性(IU/mg)方面稍有不同，故使用所分析之活性混配進料。由此產生一定範圍之蛋白質濃度，且此差異加藥物製品之不同濃度產生下文所述之範圍。
Figure 104109389-A0202-12-0054-2
Figure 104109389-A0202-12-0054-3
Figure 104109389-A0202-12-0055-4
實例2：用於第二代rFIXFc藥物製品之凍乾週期參數之開發 概述
本研究之目的在於評估本發明rFIXFc藥物製品之凍乾循環之乾燥階段制程參數之範圍。
本報導彙總評估凍乾制程參數(乾燥擱板溫度、腔室真空度及乾燥時間)及其對乾燥期間之製品溫度、藥物製品之所得殘餘水分及乾燥速率之作用的統計實驗設計(DOE)研究。
關於第二代rFIXFc藥物製品之初步凍乾循環設計實驗顯示，由於調配物之約-1.5℃之高塌陷溫度而不 必要存在不同的初次及二次乾燥步驟。開發12實驗實驗設計(DOE)研究以評估擱板溫度、真空度及乾燥時間對殘餘水分含量及安慰劑對凍乾制程中之製品溫度的作用。對資料之分析顯示，為了達成殘餘水分含量低於1%，在乾燥階段期間需要30℃之最低擱板溫度。分析亦顯示長於25小時之乾燥時間不會進一步減少小瓶中之殘餘水分，且腔室真空度對殘餘水分僅具有較小影響。擱板溫度及腔室真空度顯著影響乾燥期間之製品溫度，但該研究中最具侵襲性之乾燥條件(40℃擱板溫度，1000毫托腔室真空度)導致製品溫度比塌陷溫度低10℃以上。小瓶品質流主要隨擱板溫度而變化，且為了維持真空控制，將需要市售凍乾器能夠處理0.7g/h/小瓶之水分流率。建議使用40℃之擱板溫度、250毫托(0.33毫巴)之腔室真空度及25小時之乾燥時間來進行凍乾循環以達成製品具有<0.5%殘餘水分。
引言
設計第二代因子IX-Fc(rFIXFc-2G)藥物製品組合物以允許改良加速儲存期間之蛋白質穩定性、改良復原時間及減少填充體積以減少潑灑至封塞上。此係藉由將填充體積自5.3mL減至2.65mL且使調配物中之蛋白質及賦形劑之濃度加倍，從而使復原產物與第一代組合物相同來實現。減少填充體積之另一益處為減少凍乾制程中需要移除之水的量。
由於新藥物製品設計需要再驗證藥物製品制 程，故再開發凍乾循環。據量測安慰劑調配物之塌陷溫度為約-1.5℃，由此將允許使用比針對參考rFIXFc凍乾制程所設計之凍乾循環短的凍乾循環。由初步實驗確定，不需要進行單獨初次乾燥步驟，因為製品即使在擱板溫度超過40℃時亦不發生塌陷。使用參考藥物製品之冷凍概況設計循環，與直接步驟組合在施加真空之後達到初次乾燥溫度。安慰劑為活性rFIXFc-2G小瓶之良好替代物，因為甘露醇為餅體提供結晶結構，使得外觀與活性小瓶相同。與蛋白質相比，非晶糖亦更難以乾燥，因此所得殘餘水分略高，從而提供該制程之最壞情況值。自小瓶中移除蛋白質亦降低水蒸氣耐受性，從而獲得小瓶品質流率之最壞情況估計值。
進行統計實驗設計(DOE)研究以評估凍乾制程參數(乾燥擱板溫度、腔室真空度及乾燥時間)及其對乾燥制程期間之製品溫度、藥物製品之所得殘餘水分及乾燥速率的影響。
材料及方法
本研究之目的在於評估第二代rFIXFc藥物製品之凍乾循環之乾燥階段制程參數之範圍。JMP 9中用於設計DOE研究之乾燥階段參數及範圍示於表5中。顯示個別運作參數設定點之所得12實驗DOE計畫示於表6中。
Figure 104109389-A0202-12-0058-5
Figure 104109389-A0202-12-0058-6
對於本研究中之各凍乾循環，將80個10mL Schott小瓶(P/N：68000320)填充2.75mL如表7中所示之第二代rFIXFc安慰劑，由此提供最壞情況填充體積用於殘餘水分評估。對於各實驗，將經填充之小瓶排列在具有三個熱電偶之單一擱板上，如圖1中所示。
Figure 104109389-A0202-12-0059-7
所使用之凍乾循環為表8中所示之循環變化。凍乾器擱板乾燥溫度、乾燥步驟時間及乾燥真空度係基於表6中所示之實驗設計表而變化。將SP工業用Lyostar II用於各凍乾循環，且將小瓶置於中間擱板上。
Figure 104109389-A0202-12-0059-8
在各凍乾循環之後，從角落及中間位置選擇五個小瓶且使用程式TDMP-74量測殘餘水分，並且求取擱板上之平均值。使用熱電偶且藉由Lyostar II軟體中之 壓力溫度量測來量測乾燥期間之製品溫度及小瓶品質流率。使用JMP 9軟體分析此等輸出以評估乾燥參數對第二代rFIXFc凍乾制程之影響。進行JMP逐步分析以確定重要變數，且隨後使用可顯示制程輸出(殘餘水分、製品溫度及乾燥期間之品質流)如何回應於輸入變數的標準最小平方效應篩選演算法分析此等變數。
結果及論述
十二個凍乾實驗之結果示於表9中。
Figure 104109389-A0202-12-0060-9
1. 分析凍乾週期參數對殘餘水分之影響
使用rFIXFc-2G安慰劑作為藥物製品之最壞情況替代物，因為與蛋白質相比，在二次乾燥期間一般更難以自糖中移除殘餘水分。顯示DOE分析結果之所得預測分佈示於圖2中。顯而易見若干觀察結果：擱板溫度對 藥物製品中之殘餘水分具有最顯著之影響。基於移除強結合水之二次乾燥為擴散及解吸控制制程，此結果為預期的。該模型以高信賴度預計需要擱板溫度高於30℃來達成殘餘水分含量低於1%。真空度看似對所得殘餘水分具有較小但可量測之影響。乾燥時間看似顯示收益遞減點起始於25小時，其中進一步增加乾燥時間不會繼續降低殘餘水分含量。此種特性與動力學性質接近由擱板溫度決定之平衡邊界一致，且殘餘水分接近不可能進一步乾燥之漸近線。基於此殘餘水分DOE分析，乾燥擱板溫度應為30℃或更高，且乾燥時間應固定在25小時或更少。
2. 分析凍乾循環參數在昇華期間對製品溫度之影響
據量測，rFIXFc-2G藥物製品安慰劑之冷凍乾燥塌陷溫度為約-1.5℃。實際上，此意謂藥物製品將維持精緻餅體結構，只要在凍乾期間自小瓶中移除體積水時維持製品溫度低於此塌陷溫度即可。DOE分析確定擱板溫度及腔室真空度兩者均對製品溫度具有顯著影響，如圖3中所示。腔室真空具有最大影響，其中在昇華期間，壓力愈高，製品溫度愈高。即使在1000毫托(1.33毫巴)下，最高量測製品溫度為-15.2℃，比製品塌陷溫度低約13℃。擱板溫度亦對製品溫度具有中度影響，但結果與真空效果相比不那麼明顯。此分析顯示，即使在40℃之擱板溫度及1000毫托之腔室真空度下，亦存在極小塌陷風險，從而基本上消除任何實際凍乾循環設計空間的塌陷可能性。
3. 分析凍乾循環參數在昇華期間對小瓶品質流率之影響
小瓶品質流率(dm/dt)為在昇華制程期間水自小瓶中移除之速率的量度。儘管需要快速乾燥以減少凍乾循環所需之時間，但過多水分可能覆沒製造規模冷凍乾燥機中之冷凝器，且導致喪失製品腔室中的真空控制。安慰劑代表最壞情況小瓶品質流條件。因為調配物中不存在蛋白質，故餅體中之固體百分比得以最小化且由此導致對來自經冷凍乾燥之餅體的品質流的耐受性較低。擱板溫度對小瓶品質流具有顯著影響，如圖4中所示，其中增加溫度導致更快昇華。將腔室真空度包括在DOE分析模型中，但p值為0.136，在95%信賴度下並不顯著。本研究中之最高量測dm/dt為0.7g/h/小瓶。
4. 基於安慰劑DOE研究之建議第二代rFIXFc凍乾循環
得自安慰劑DOE研究之資料表明，設計凍乾循環以使用單一乾燥步驟達成<0.5%之殘餘水分目標同時維持製品低於其塌陷溫度具有可行性。建議凍乾循環示於表10中，且來自在與建議rFIXFc-2G凍乾循環類似之條件進行的DOE運作8的資料示於圖5中。選擇0.5%殘餘水分目標係因為此為第一代rFIXFc藥物製品強度系列之平均值。此水分含量提供緩衝，使得在該製品在加速穩定性期間吸收水分時，製品品質屬性不會受到影響。
依原樣使用針對參考rFIXFc藥物製品凍乾循 環開發之凍乾循環之冷凍及退火部分，且已利用在40℃擱板溫度及250毫托真空下持續25小時之單一乾燥步驟替換單獨初次乾燥及二次乾燥步驟。
Figure 104109389-A0202-12-0063-11
結論
完成12實驗DOE研究，從而評估第二代rFIXFc藥物製品凍乾制程參數對安慰劑之殘餘水分、製品溫度及小瓶品質流率之影響。對資料之分析顯示為了達成殘餘水分含量低於1%，需要乾燥階段期間之最低擱板溫度為30℃。該分析亦顯示長於25小時之乾燥時間不會顯著減少小瓶中之殘餘水分，且真空度對殘餘水分僅具有較小作用。乾燥期間之製品溫度顯著受擱板溫度及腔室真空度影響。該研究中最具侵襲性之條件(40℃擱板溫度，1000毫托腔室真空)導致製品溫度比塌陷溫度低10℃以上。
建議使用40℃之擱板溫度、250毫托(0.33毫 巴)之腔室真空及25小時之乾燥時間進行凍乾循環以達成製品具有<0.5%殘餘水分。
對特定實施例之上述描述因此將充分顯示本發明之一般特性，從而他人可在不過度實驗、不背離本發明之一般概念的情況下藉由應用熟習此項技術者能力範圍內之知識針對各種應用容易地修改及/或改適該等特定實施例。因此，基於本文中所提供之教示及指導，該等改適及修改意欲在所揭示之實施例之等效物的含義及範圍內。應理解，本文中之措辭或術語係出於描述而非限制之目的，從而熟練技術人員將根據該等教示及指導來解釋本說明書之術語或措辭。
本發明之範圍及範疇不應受任何上述例示性實施例限制，而是應僅根據以下申請專利範圍及其等效物加以限定。由考慮本說明書及本文中所揭示之對本發明之實施，本發明之其他實施例對於熟習此項技術者將顯而易見。
本說明書中所提及之所有文獻、論文、出版物、專利及專利申請案係以引用之方式併入本文中，其程度如同特定且個別地指示各個別出版物或專利申請案以引用之方式併入。
本申請案主張2015年3月24日申請之美國臨時申請案第61/969,801號之優先權，該案係以全文引用之方式併入本文中。
Figure 104109389-A0202-12-0065-12
Figure 104109389-A0202-12-0066-13
Figure 104109389-A0202-12-0067-14
Figure 104109389-A0202-12-0068-15
Figure 104109389-A0202-12-0069-16
Figure 104109389-A0202-12-0070-17
Figure 104109389-A0202-12-0070-18
Figure 104109389-A0202-12-0071-19
Figure 104109389-A0202-12-0071-20
<110> BIOGEN IDEC MA INC. Thome,Brian M. Parkhurst-Lang,Cherie Leveille,Brandon W.
<120> 凍乾之因子IX調配物
<130> 2159.397PC01/C-K/E-H
<140> 待提交
<141> 隨附
<150> 61/969,801
<151> 2014-03-24
<160> 14
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 7583
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> FIX-Fc鏈
<400> 1
Figure 104109389-A0202-12-0072-21
Figure 104109389-A0202-12-0073-22
Figure 104109389-A0202-12-0074-23
Figure 104109389-A0202-12-0075-24
<210> 2
<211> 642
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FIX-Fc鏈
<400> 2
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Figure 104109389-A0202-12-0076-26
Figure 104109389-A0202-12-0077-27
Figure 104109389-A0202-12-0078-28
<210> 3
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc部分
<400> 3
Figure 104109389-A0202-12-0078-29
<210> 4
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc部分
<400> 4
Figure 104109389-A0202-12-0078-30
Figure 104109389-A0202-12-0079-31
<210> 5
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 白蛋白結合肽之核心序列
<400> 5
Figure 104109389-A0202-12-0079-32
<210> 6
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CTP肽
<400> 6
Figure 104109389-A0202-12-0079-33
<210> 7
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CTP肽
<400> 7
Figure 104109389-A0202-12-0080-34
<210> 8
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAS肽
<400> 8
Figure 104109389-A0202-12-0080-35
<210> 9
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAS肽
<400> 9
Figure 104109389-A0202-12-0080-36
<210> 10
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAS肽
<400> 10
Figure 104109389-A0202-12-0080-37
<210> 11
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAS肽
<400> 11
Figure 104109389-A0202-12-0081-38
<210> 12
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAS肽
<400> 12
Figure 104109389-A0202-12-0081-39
<210> 13
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAS肽
<400> 13
Figure 104109389-A0202-12-0081-40
<210> 14
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PAS肽
<400> 14
Figure 104109389-A0202-12-0081-41

Claims (20)

  1. 一種預凍乾調配物，其包含：(a)濃度介於220IU/小瓶與1,000IU/小瓶之間之具有FIX凝結活性的因子IX(FIX)多肽，其包含FIX及FcRn結合搭配物；(b)濃度介於3mg/mL與15mg/mL之間之L-組胺酸；(c)濃度介於10mg/mL與50mg/mL之間之蔗糖；(d)濃度介於20mg/mL與100mg/mL之間之甘露醇；及(e)濃度介於0.01mg/mL與5mg/mL之間之聚山梨醇酯20，其中該調配物具有2mL至3mL之填充體積。
  2. 如申請專利範圍第1項之預凍乾調配物，其中L-組胺酸之濃度介於3.88mg/mL與9.7mg/mL之間；其中蔗糖之濃度介於17.85mg/mL與29.95mg/mL之間；且其中甘露醇之濃度介於35.7mg/mL與59.5mg/mL之間。
  3. 如申請專利範圍第1項之預凍乾調配物，其中L-組胺酸之濃度為7.76mg/mL；其中蔗糖之濃度為23.8mg/mL；其中甘露醇之濃度為47.6mg/mL；且其中聚山梨醇酯20之濃度為0.2mg/mL。
  4. 如申請專利範圍第1項之預凍乾調配物，其中該填充體積為3.0mL、2.9mL、2.8mL、2.7mL、2.65mL、2.6mL、2.5mL、2.4mL、2.3mL、2.2mL、2.1mL或 2.0mL。
  5. 如申請專利範圍第1項之預凍乾調配物，其中該填充體積為2.65mL。
  6. 如申請專利範圍第1項之預凍乾調配物，其中該填充體積為2.5mL。
  7. 如申請專利範圍第1至6項中任一項之預凍乾調配物，其中該FcRn結合搭配物為Fc或白蛋白。
  8. 如申請專利範圍第7項之預凍乾調配物，其中該FcRn結合搭配物為Fc。
  9. 如申請專利範圍第1至6項中任一項之預凍乾調配物，其中該FIX多肽與SEQ ID NO：2具有100%一致性。
  10. 如申請專利範圍第1至6項中任一項之預凍乾調配物，其中該FIX多肽包含SEQ ID NO：2之FIX-Fc單鏈(FIXFc-sc)多肽及SEQ ID NO：4之Fc單鏈(Fc-sc)多肽。
  11. 如申請專利範圍第1至6項中任一項之預凍乾調配物，其中該FIX多肽包含不存在C末端離胺酸之SEQ ID NO：2之FIXFc單鏈(FIXFc-sc)多肽，及不存在C末端離胺酸之SEQ ID NO：4之Fc單鏈(Fc-sc)多肽，其中該FIXFc-sc多肽及Fc-sc多肽係由Fc之鉸鏈區中之兩個二硫鍵結合在一起。
  12. 一種預凍乾調配物，其包含濃度介於220IU/小瓶與1,000IU/小瓶之間之FIX多肽，其包含SEQ ID NO：2之FIXFc單鏈(FIXFc-sc)多肽 及SEQ ID NO：4之Fc單鏈(Fc-sc)多肽，濃度為7.76mg/mL之L-組胺酸，濃度為23.8mg/mL之蔗糖，濃度為47.6mg/mL之甘露醇，濃度為0.2mg/mL之聚山梨醇酯20，及其中該調配物之填充體積為2.65mL。
  13. 一種凍乾物粉末，其係由如申請專利範圍第1至6項中任一項之預凍乾調配物凍乾。
  14. 一種復原調配物，其包含藉由復原緩衝液復原之如申請專利範圍第13項之凍乾物粉末。
  15. 一種小瓶，其包含如申請專利範圍第13項之凍乾物粉末。
  16. 一種套組，其包括包含如申請專利範圍第13項之凍乾物粉末之第一容器及包含復原緩衝液之第二容器，該復原緩衝液之體積當與該第一容器之凍乾調配物組合時足以產生如申請專利範圍第14項之復原調配物。
  17. 一種包含如申請專利範圍第14項之復原調配物之醫藥組成物用於製造供預防或降低B型血友病患者之出血發作之頻率或嚴重程度之藥物的用途。
  18. 一種由如申請專利範圍第1至6項中任一項之預凍乾調配物製造凍乾FIX多肽之方法，其包括：(a)「冷凍步驟」，其包括將包含該FIX多肽及水性溶劑之預凍乾調配物冷凍至-65℃至-40℃之冷凍溫度；(b)「真空步驟」，其包括使經冷凍之預凍乾調配物 之壓力降低可有效地自該經冷凍之預凍乾調配物中移除該水性溶劑之量；及(c)單一「乾燥步驟」，其包括使該經冷凍之預凍乾調配物之溫度增加至高於-1.5℃的塌陷溫度，從而產生凍乾物粉末。
  19. 如申請專利範圍第18項之方法，其中該預凍乾調配物之溫度在該冷凍步驟期間自5℃緩慢降至冷凍溫度，且其中在該冷凍步驟期間將該冷凍溫度保持30分鐘至5小時，其中步驟(a)之該經冷凍之預凍乾調配物在該「真空步驟」(b)之前進一步經受「退火步驟」(a’)，其中該步驟(a)之經冷凍之預凍乾調配物之溫度在該退火步驟期間緩慢升至-15℃至-2℃之退火溫度，且其中在該退火步驟期間將該退火溫度保持30分鐘至5小時，其中該經冷凍之預凍乾調配物之溫度在該退火步驟期間自該退火溫度緩慢降至-65℃至-40℃之溫度，其中該「真空步驟」包括使該經冷凍之預凍乾調配物經受介於0.05毫巴與1毫巴之間的真空2小時，且/或其中該「乾燥步驟」包括使該經冷凍之預凍乾調配物之溫度自-55℃緩慢升至40℃之乾燥溫度，其中將該乾燥溫度保持10小時至40小時，且其中在0.05毫巴至1毫巴之壓力下進行該乾燥步驟。
  20. 如申請專利範圍第18或19項之方法，其中該預凍乾調配物在步驟(a)之前經無菌過濾且無菌填充至小瓶 中；其中該凍乾物粉末係在45小時或更短時間內由該預凍乾調配物產生；且/或其中該凍乾物粉末中之殘餘水分少於0.7%。
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