TR201808258T4 - Alfa-mannosidazın tıbbi kullanımı. - Google Patents

Abstract

Mevcut buluşun, lizozomal depolama bozukluğu alfa-mannosidozu enzim replasman terapisi ile tedavi etmek için araçlar ve stratejiler sağlar. Özel olarak, buluş santral sinir sistemindeki hücrelerde depolanmış nötral mannoz açısından zengin oligosakkaritlerin azaltılması ile ilgilidir. Bu doğrultuda, mevcut buluş santral sinir sisteminin bir veya birden fazla bölgesindeki hücrelerde nötral mannoz açısından zengin oligosakkaritlerin intraselüler düzeylerini düşürmek amacıyla bir ilacın preparasyonu için bir lizozomal alfa-mannosidazın kullanımını sağlar. Buluş ilaveten, santral sinir sisteminin bir veya birden fazla bölgesindeki hücrelerde nötral mannoz açısından zengin oligosakkaritlerin intraselüler düzeylerini düşürmek amacıyla bir ilaç olarak kullanılması için lizozomal alfa-mannosidazın bir formülasyonunu sağlar. Ayrıca, buluş bir süjenin santral sinir sisteminin bir veya birden fazla bölgesindeki hücrelerde nötral mannoz açısından zengin oligosakkaritlerin intraselüler düzeylerini düşürmenin bir yöntemini sağlar, söz konusu yöntem söz konusu süjeye lizozomal alfa-mannosidazın bir preparasyonunu uygulamayı içerir. Son olarak, buluş bir alfa-mannosidazı üretmenin, izole etmenin ve saflaştırmanın yöntemleri aynı zamanda bu yöntemlere göre elde edilebilen bir alfa-mannosidazın kullanımı ile ilgilidir.

Description

TARIFNAME ALFA-MANNOSIDAZIN TIBBI KULLANIMI BULUSUN SAHASI Mevcut bulusun, lizozomal depolama bozuklugu alfa-mannosidozu enzim replasman terapisi ile tedavi etmek için araçlar ve stratejiler saglar. Özel olarak, bulus santral sinir sistemindeki hücrelerde depolanmis nötral mannoz açisindan zengin oligosakkaritlerin azaltilmasi ile ilgilidir.

BULUSUN ALTYAPISI Alfa-mannosidoz genelinde meydana gelen bir resesif, otozomal hastaliktir. Mannosidoz, Avrupa'da, Amerika'da, Afrika'da ve ayni zamanda Asya'da tüm etnik gruplarda bulunur. Lizozomal depolama bozukluklari için iyi bir tanisal servisi olan tüm ülkelerde benzer bir siklikla saptanir. Bunlar görünüs olarak saglikla dogarlar, bununla birlikte, hastaliklarin semptomlari progresiftir. AIfa-mannosidoz, çok ciddi ile çok hafif formlar araliginda klinik heterojenlik gösterir. Tipik klinik semptomlar asagidakilerdir: mental retardasyon, iskeletsel degisiklikleri, reküran enfeksiyonlar ile sonuçlanan bozulmus immün sistem, duyma bozuklugu ve siklikla hastalik, bir tipik fasiyal karakteristikler, örnegin, bir kaba yüz, bir çikik alin, bir düzlestirilmis nazal köprü, bir küçük burun v bir genis agiz, ile iliskilidir. En siddetli olgularda (mannosidoz tip 1), çocuklar hepatosplenomegaliden muzdariptir ve bunlar yasamlarinin birinci yilinda ölür. Büyük olasilikla, bu erken ölüm, hastaliktan kaynaklanan immün-yetmezlikten dolayi siddetli enfeksiyonlardan kaynaklanir. Daha hafif olgularda (mannosidoz tip 2), hastalik genel olarak, eriskin yasa erisir. Hastalarin iskeletsel zayifliklari, 20 ila 40 yaslari arasinda tekerlekli sandalye ihtiyaçlari ile sonuçlanir. Hastalik, beynin siklikla, hiç bir seyi dislamayan, ancak en temel basit okuma ve yazma yeteneklerini dâhil eden zayif mental performanslar ile sonuçlanan bir difüz fonksiyon bozukluguna neden olur. Duyma yetisizlikleri ve baska klinik gösterimler ile iliskili olan bu problemler, hastanin bagimsiz bir yasami olmasini önler, bunun sonucu olarak yasam boyu bakiciya gerek duyulur.

Lizozomal alfa-mannosidaz AIfa-mannosidoz, lizozomal alfa-mannosidazin (LAMAN, EC3.2.1.24) bir kusurlu aktivitesinden kaynaklanir. Hastalik, mannoz açisindan zengin oligosakkaritlerin, yani, bunlarin indirgemeyen uçlarinda oi1,2-, 01,3- ve (11,6-mannosil rezidüleri tasiyan oligosakkaritlerin, masif intraselüler birikimi ile karakterize edilir. Bu oligosakkaritler agirlikli olarak, N-bagli oligosakkaritler içeren glikoproteinlerin intra-lizozomal parçalanmasindan köken alir. Bununla birlikte, bazilari, dolikol-bagli oligosakkaritlerin katabolizmasindan ve proteazom tarafindan parçalanmasi için sitosole yönlendirilen yanlis katlanmis glikoproteinlerden köken alir (4, 5). Lizozomal depolama, tüm beyin bölgelerindeki nöronlari içeren, çok çesitli hücre tiplerinde ve dokularda gözlenir.

LAMAN, alfa-D-mannositlerdeki bu uç, indirgemeyen alfa-D-mannoz rezidülerini, N- bagli glikoproteinlerine sirali parçalanmasi sirasinda indirgemeyen uçtan hidrolize eden , 42 ve 70 kDa'luk üç ana glikopeptide islenen 49 rezidülük bir varsayimsal sinyal peptidi ile 1011 amino asitlik bir tek polipeptit olarak sentezlenir (Nilssen et al., LAMAN'i (MANB) kodlayan gen, kromozom 19'da 19 (190en-q12) yer alir (Kaneda et ve 1.011 amino asidi sifreleyen bir açik okuma çerçevesi içerir (GenBank U60266.1).

LAMAN'i sifreleyen insan cDNA'sinin klonlanmasi ve dizilenmesi, üç makalede valinden aspartik aside sübstitüsyon ile sonuçlanan bir TA'dan AT'ye degisim Liao et al. ve Nebes et al., tarafindan bulunmustur.

Mutasyonlar evlilik yapan Filistinli ailede mannosidozu olan iki kardesten elde edilen fibroblastlarda mutasyona neden olan ilk hastaligi bildirmistir. Bu iki hastada, hastaligin nedeni, Timidin ile sübstüte edilmis Adenin nükleotidi ile, gendeki bir nokta mutasyonudur.

Bundan sonra, insanlarda hastalik için bir kaç genetik neden bulunmustur. Alfa- mannosidoza neden neden olan günümüzün mutasyonlari, agirlik olarak Avrupalilar'da, 60'tan fazla hastada karakterize edilmistir. Bu mutasyonlar, nükleotid sübstitüsyonlarini, silinmelerini ve eklenmelerini kapsayan ve genin 24 ekzonunun Protein düzeyindeki mutasyonlarin sonuçlari ayrica, hem aktif yeri hem de katlanmayi etkileyen amino asit sübstitüsyonlari ila bir tam olarak inaktif ürün ile sonuçlanan, erken çerçeve kaymasi ve prematüre durdurma kodonlari arasinda da çesitlilik gösterir. Çok sayida farkli türdeki amino asit dizisi ve enzim yapisi. Türleri karsilastirirken, bulunan insan ve bovin mutasyonlarinin çogu, insan, sigir, kedi, balina, kus, morino baligi ve civik mantar gibi bir kaç tür için mannosidaz polipeptidinin bir hayli oldugunu gösterir.

Mutasyonlarin çok sayida farkli tipine ragmen, mutasyonlarin tümünün hücrelerde enzim aktivitesinin benzer tam kaybina neden oldugu görülür. Böylelikle, görünür bir sekilde, klinik siddet açisindan varyasyonlar, enzim aktivitesindeki varyasyonlar ile açiklanamayabilir. Daha ziyade, bu varyasyonlar, organizmanin biriken oligomannositlerin kötü etkilerini tamponlamaya yönelik genel yetisine atfedilen diger faktörlerden ve hastalarda enfeksiyonlari ve diger klinik semptomlari önlemek için ve tedavi etmek için ortamlardan kaynaklanir.

Alfa-mannosidozun tanisi güncel olarak, klinik degerlendirmeye, idrarda mannoz açisindan zengin oligosakkaritlerin saptanmasina ve çesitli hücre tiplerinde, örnegin, lökositlerde, fibroblastlarda ve amniyositlerde, alfa-mannosidaz aktivitesinin dogrudan ölçümüne dayanir (Chester et al., In: Durand P, O'Brian J (eds) Genetic errors of glycoprotein metabolism. Edi-Ermes, Milan, pp 89-120. 1982; Thomas and Beaudet .

Semptomlar baslangiçta siklikla, hafif-derecede oldugundan ve biyokimyasal tani zor oldugundan, tani siklikla hastaligin seyrinde geç koyulur. Hastalarin ve bunlarin ailelerinin bir erken tanidan büyük ölçüde yarar görecegi açiktir.

Hayvan modelleri olarak, alfa-mannosidaz geninin hedeflenmis bozulmasi ile üretilmistir (Stinchi et al., Insanlarda oldugu gibi, alfa mannosidazin Iizozomal alfa-mannosidazi kodlayan gendeki spesifik mutasyonlardan kaynaklandigi görülür. Berg et al., (Biochem J. bunun cDNA dizisinin belirlenmesini bildirmistir. Aktif enzim, moleküler kütleleri 72, 41 ve 12 kDa olan 3 polipeptitten olusur. Insan enzimine benzer sekilde, felin enziminin, 50 amino asitlik bir varsayimsal sinyal peptidi, akabinde matür enzimin 3 polipeptidine yarilan 957 amino asitlik bir polipeptit zinciri olan bir tek-Zincirli öncül olarak sentezlendigi gösterilmistir. Ortaya çikarilan amino asit dizisi, insan ve bovin dizileri ile sirasiyla %81,1 ve %832 özdestir. Bir 4-bp'lik silinme, bir etkilenmis Iran kedisinde tanimlanmistir; silinme, kodon 583'ten itibaren bir çerçeve-kaymasi ve kodon 645'te prematüre sonlanma ile sonuçlanmistir. Kedinin karacigerinde enzim aktivitesi saptanamayabilir. Daha hafif bir derecede fenotip eksprese eden bir evcil uzun-tüylü kedi, normalin %2'si olan enzim aktivitesine sahiptir; bu kedi 4-bp'lik silinmeye sahip homojenite için saflastirmistir ve geni klonlamistir. Gen, 16 kb'a uzanan 24 ekzon hâlinde organize edilmistir. Gen dizisine göre, bunlar sigirlarda iki mutasyon tanimlamistir.

Bu arada, d-mannosidaz nakavt fareler, ruhsatlandirma arzini desteklemek için oi- mannosidozun arastirmayla ilgili tedavisi için mevcut en iyi farmakolojik modeli saglar.

Güncel olarak canli hayvanlar kullanmayan kabul edilebilir modeller yoktur.

Alfa-mannosidoz terapisine yönelik tibbi ihtiyaç Mannoz açisindan zengin oligosakkaritlerin birikmesinden kaynaklanan siddetli klinik gösterimlerin isiginda, alfa-mannosidoz için etkili tedavinin yoklugu iyi bilinmektedir.

Günümüzde, hastaligin tedavisi için majör terapötik opsiyonlar, kemik iligi naklidir ve enzim replasman terapisidir.

Kemik iligi nakli iligi nakli (BMT) ile tedavi edilen mannosidozu olan 3 yavru kendi hakkinda bir makale yayimlamistir. Kurban edilmis 2 hayvanda, yalnizca vücut içinde degil, ancak daha önemlisi, ayni zamanda beyin içinde bir normalizasyon görülmüstür. 3. kedi, 6 yil sonra iyidir. Normal olarak, tedavi edilmemis bir kedi 3-6 ay içinde ölür. 1987'de, mannosidozu olan bir çocuk, BMT ile tedavi edilmistir BMT (Will et al., Arch Dis Child sonra ölmüstür. Beyinde, çok küçük enzim aktivitesi bulunmustur. Bu hayal kirikligina ugratan sonuç, ölümde önce agir immünosüpresif tedavi ile veya BMT'den sonra beyinde enzim aktivitesinin artmasinin zaman almasi ile açiklanabilir. Donör, (tasiyici olarak %SO'den daha az enzim aktivitesine sahip olmasi beklenmesi gereken) annedir veya bu, beyinde enzim fonksiyonu üzerinde etkiye sahip olmayan insanda BMT olabilir. Degisken sonuçlara sahip olunmasina ragmen, böylelikle bir kaç kemik iligi nakli tesebbüsü, basarili yamanmanin, en azindan kismen, alfa mannosidozun klinik gösterimlerini düzeltebilecegini göstermistir. Bununla birlikte, kemik iligi nakli uygularken ciddi prosedür ile iliskili komplikasyonlari azaltmanin zorlugu, insan terapisinin hâlâ maglup edilmemis olmasidir.

Enzim replasman terapisi Lizozomal depolama hastaliklari kesfedildiginde, bunun enzim sübstitüsyonu ile tedavi edilebilmesi umutlari yükselir. Enzim replasman terapisi, Gaucher hastaliginda kanitlanmis etkiye sahiptir. Ekzojen lizozomal glukoserebrosidaz hastaya enjekte edildiginde, bu enzim enzim-kusurlu hücreler tarafindan alinir (Barton et al., N Engl J ubikuitöz olan mannoz-ö-fosfat reseptörü gibi hücre yüzeyi üzerinde belirli reseptörler ve diger reseptörler, örnegin, belirli hücre tipleri, örnegin, monosit/makrofaj hücre hattinin hücreleri ve hepatositler, ile sinirlandirilan asialoglikoprotein reseptörü ve mannoz reseptörü, tarafindan regüle edilir. Bundan dolayi, enzimin hücresel alimi agirlikli olarak bunun glikosilasyon profiline baglidir. Uygun sekilde tasarlandiginda, kusurlu enzim, diyabetik hastalarin insülin almasi ile ayni sekilde, ekzojen enzimin düzenli enjeksiyonlari ile degistirilebilir. Enzim-kusurlu fibroblastlarin vasatlarina eklenen saflastirilmis aktif lizozomal alfa-mannosidaz ile in vitro çalismalar, lizozomal substrat birikiminin düzeltilmesini göstermistir. Diger taraftan, in vivo tedavi kismen, enzimlerin yeterli miktarini üretme problemi ile ve ekzojen enzime karsi immün reaksiyonlardan kaynaklanan komplikasyonlar ile engellenmistir. Bununla birlikte, en önemlisi, özel mülahazalar, bir majör nörolojik bileseni olan lizozomal depolama hastaliklari, örnegin, alfa-mannosidoz, ile ilgili olarak geçerlidir, burada klinik gösterimler, santral sinir sisteminde arttirilmis lizozomal depolama ile ilgilidir. Böylelikle, enzim replasman terapisinin, Gaucher hastaliginin akut nöronopatik varyantina karsi etkili oldugu kanitlanmamistir (Prows et al., Am J Med Genet 71 :16-21 ).

Terapötik enzimlerin beyne aktarimi, bu büyük moleküllerin kan-beyin bariyeri yoluyla naklinin olmamasi ile önlenir. Kan beyin bariyerinin beyinde terapötik ajanlarin bir etkisini görmek amaciyla alt edilmesi gerektigine yönelik genel düsünceden, aktarim sistemlerinin büyük bir çesitliliginin kullanilmasi tasarlanmistir. Bunlar invasif teknikleri, örnegin, kan beyin bariyerinin örnegin, mannitol, ile ozmotik açilmasini ve invasif- olmayan teknikleri, örnegin, kimerik enzimlerin reseptör aracili endositozunu, içerir.

Enzim replasmaninin düzenli bir sekilde enzimin uygulanmasini gerektirmesi beklendiginden, invasif tekniklerin kullanimindan kaçinilmalidir. Diger taraftan, invasif- olmayan tekniklerin kullanilmasi ümit vadeden sonuçlar saglamamistir. Viseral organlarda ve meninkslerde azaltilmis depolamanin beyne tasinan oligosakkaritlerin miktarini azaltabilecegini düsünülmüstür. Bununla birlikte, bu tarz mülahazalarin, burada nörolojik hasarin primer ve siddetli oldugu lizozomal bozukluklara uygulanabilir oldugu düsünülmez (Neufeld, E. F. Enzyme replacement therapy, in "Lysosomal disorders of the brain (Platt, F. M. Walkley, S. V: eds Oxfor University Press). Bu dogrultuda, alfa-mannosidozun etkili bir tedavisini arama hâlâ devam etmektedir.

WO ve Berg et al., Molecular Genetics and Metabolism, oligosakkaritlerin intraselüler düzeylerini LAMAN'i "hücresel membranlarin üzerine" uygulama ile düsürmek amaciyla bir ilacin preparasyonu için bir Iizozomal alfa- mannosidazin (LAMAN) kullanimini açiklar.

Fogh et al., 2002, enzim replasman terapisini tartisir ve uygun sekilde tasarlandiginda, eksik enzimin diyabetik süjelerin insülini enjekte etmesine benzer olarak düzenli bir sekilde enjekte edilebilecegini açiklar. Dahasi, Fogh et al., 2002 ve Berg et al., 2001, CHO hücrelerinden insan LAMAN'inin ekspresyonunu ve saflastirilmasini açiklar ve mannosidozu olan bir hastanin fibroblastlarinda LAMAN'in alimini in vitro gösterir.

Bununla birlikte, Fogh et al., 2002 ve Berg et al., 2001, spesifik bir siklikta tekrarli intravenöz enjeksiyon ile uygulamayi açiklamaz.

BULUSUN KISA AÇIKLAMASI Mevcut bulusun bir birinci yönü, alfa-mannosidozun tedavisi amaciyla bir ilacin preparasyonu için bir Iizozomal alfa-mannosidazin kullanimini saglar, burada söz konusu Ilaç, intravenöz uygulama ile uygulanacaktir.

Mevcut bulusun bir uygulamasi, kullanim ile ilgilidir, burada ilaç infüzyon veya 1 ila 5 günlük enjeksiyonlara, haftada bir 1 ila 5 enjeksiyona, 2 haftada bir 1 ila 5 enjeksiyona veya ayda bir 1 ila 5 enjeksiyona karsilik gelen bir siklikta tekrarli intravenöz enjeksiyon ile uygulanacaktir.

Mevcut bulusun bir ikinci uygulamasi, kullanim ile ilgilidir, burada söz konusu ilaç santral sinir sistemindeki hücreleri hedef almaya yönelik bilinen bir yetisi olan bir bilesen içermez.

Mevcut bulusun bir üçüncü uygulamasi, kullanim ile ilgilidir, burada Iizozomal alfa- mannosidaz, SEQ ID NO: 1 amino asit dizisini içerir.

Mevcut bulusun ilave bir uygulamasi, kullanim ile ilgilidir, burada söz konusu ilaç, santral sinir sistemindeki hücrelerin hedef alinmasi için bir bilesen içermez ve kan- beyin bariyerini geçis için vehikül olarak etki etme yetisi olan bir bilesen içermez.

Mevcut bulusun bir baska uygulamasi, kullanim ile ilgidir, burada söz konusu ilaç, tedavi edilecek olan süjenin vücut agirliginin her bir grami için 5 ila 300 mU lizozomal alfa-mannosidaz araligindaki bir miktarda uygulanir.

Mevcut bulusun daha baska bir uygulamasi, kullanim ile ilgilidir, burada söz konusu lizozomal alfa-mannosidazin bir fraksiyonu, mannoz 6-fosfat rezidüleri tasiyan bir veya birden fazla N-bagli oligosakkaride sahip olan lizozomal alfa-mannosidazdan olusur.

Mevcut bulusun tercih edilen bir uygulamasi, kullanim ile ilgilidir, burada söz konusu lizozomal alfa-mannosidaz, bir rekombinant enzimdir.

TANIMLAR VE TERIMLER Daha spesifik olarak, terim, bir karisim içinde bulunan bir maddeyi ifade eder. Bu tarz bir madde, kütle olarak belirli oranlarda kimyasal olarak birlestirilmis elemanlardan olusturulan bir materyal olarak tanimlanan bir bilesik olabilir. Bilesiklerin örnekleri, inorganik bilesiklerdir, örnegin, küçük moleküler türlerdir, organik bilesiklerdir, örnegin, basit sekerleri ve kompleks polisakkarit polimerlerini içeren karbonhidratlardir, peptitlerdir, proteinlerdir, peptidomimetiklerdir, nükleik asitlerdir ve antikorlardir. sistemi, kollardaki, bacaklardaki, kaslardaki ve organlardaki periferik sinirleri içermez.

Mevcut baglamda, "beyin" terimi, santral sinir sisteminin, yari-küreler olarak ifade edilen bunun iki (sag ve sol) yarisini içeren kafatasi içinde yer alan kismini ifade eder.

Mevcut baglamda ayrica, ekstra-nöral hücreler, örnegin, koroid pleksusun endotelyasindaki ve epitelyasindaki hücreler, santral sinir sisteminin ve beynin parçalari olarak düsünülmeyecektir. Beyin ve santral sinir sistemi ayrica, meninksleri de içermez. bir vasküler proliferasyonudur veya saçagidir; bu, serebrospinal siviyi salgilar, böylece bir dereceye kadar intraventriküler basinci regüle eder. meninks, dura mater (sert-zar) olarak adlandirilir ve üçünden en çabuk toparlayandir.

Ortadaki tabaka, pia mater (ince zar) olarak adlandirilir ve en-içteki ince tabaka, araknoiddir. ve/veya elektrostatik etkilesimler ile ve/veya kovalent baglar ile birbirine tutunan bir grubu kastedilir. veya sistemin disinda üretilen bir bileseni ifade eder; spesifik olarak, terimi, organizma veya sistem içinde sentezlenmeyen bilesenleri ifade eder. tarz bir yari-geçirgen membranlar, kan-beyin bariyeri ve/veya fötaI-maternal bariyer olabilir. parankimasindan ayiran bariyer sistemini ifade eder. spesifik olarak belirli hücresel Iokasyonlara, örn., Iizozoma, dogru yönlendirmenin, prosesini ifade eder.

DETAYLI AÇIKLAMA ci-mannosidozun özelligi, çok çesitli dokularda nötral oligosakkaritlerin depolanmasidir (bakiniz, Sekil 2, sütun 1 ve sütun 2). Bu oligosakkaritler, bunlarin indirgeme ucunda 2- 9 mannoz rezidüleri ve bir N-asetilglukozamin rezidüsü içerir ve bundan dolayi bir endoglukozaminidazin etkisinden kaynaklanir. Santral sinir sisteminin agir tutulumu, alfa-mannosidozun siddetli infantil formlar ila yalnizca orta-derecede mental retardasyonu olan daha hafif derecede jüvenil formlar araligindaki klinik fenotipinde yansitilir. Mevcut bulusun arkasindaki gerekçe, rekombinant alfa-mannosidazin tekrarli intravenöz uygulamasinin beyinde depolanmis nötral mannoz açisindan zengin oligosakkaritlerin düzeylerinde göze çarpan bir düsüs ile sonuçlanmasina yönelik ilginç gözlemden ortaya çikar.

Bunun en genis yönünde, mevcut açiklama, bir rekombinant LAMAN polipeptidi ile ve LAMAN polipeptidini sifreleyen bir nükleotid dizisi ile, polipeptidi ek3prese edebilen bir ekspresyon sistemi ile ayni zamanda bunun polipeptidini veya parçasini içeren farmasötik bilesimler ile ve bir süjede Lizozomal alfa-mannosidaz (LAMAN) enziminin bir eksikliginden kaynaklanan alfa-mannosidoz ile ilgili semptomlarin gelismesini önlemek veya tedavi etmek için polipeptidin kullanimi ile ilgilidir.

Bir ana yönünde, bulus, santral sinir sisteminin bir veya birden fazla bölgesindeki, örnegin, beynin içindeki bir veya birden fazla bölgedeki, hücrelerde nötral mannoz açisindan zengin oligosakkaritlerin intraselüler düzeylerini düsürmek amaciyla bir ilacin preparasyonu için bir lizozomal alfa-mannosidazin kullanimini saglar. Nötral mannoz açisindan zengin oligosakkaritler, bir tek N-asetilglukozamin rezidüsüne baglanmis iki ila dokuz mannoz rezidüsü içerir.

Bulusun bir baska ana yönü, santral sinir sisteminin bir veya birden fazla bölgesindeki hücrelerde nötral mannoz açisindan zengin oligosakkaritlerin intraselüler düzeylerini düsürmek amaciyla bir ilaç olarak kullanilmasi için bir lizozomal alfa-mannosidazin bir formülasyonu ile ilgilidir.

Bulusun her iki ana yönü için, lizozomal alfa-mannosidazin asagidakilerden olusan gruptan seçilmesi ilaveten tercih edilir: (a) SEQ ID NO: 1 amino asit dizisi; (b) (a)'daki dizinin, rekombinant insan lizozomal alfa-mannosidazina enzimatik olarak es-deger olan, bir kismi; (0) (a)'daki veya (b)'deki dizilerin herhangi birine en az %75 dizi özdesligine sahip olan ve ayni zamanda rekombinant insan lizozomal alfa-mannosidazina enzimatik olarak es-deger olan bir amino asit dizisi analogu.

Bulusa göre hücre içine dâhil edilen nükleik asit dizisi ve SEO ID NO: 1 arasindaki dizi özdesliginin derecesinin en az %80, örnegin, en az %85, en az %90, en az %95, en az Mevcut baglamda, rekombinant insan Iizozomal alfa-mannosidazina enzimatik olarak es-deger olan bir amino asit dizisi analogu veya bir amino asit dizisinin bir kismi, en az polipeptittir. Saflik kolaylikla, geleneksel teknikler, örnegin, SDS-PAGE, kullanilarak belirlenir. Spesifik aktivite, mevcut basvurunun örnek 2'sinde tarif edildigi üzere bir enzim analizinde belirlenebilir. Özet olarak, saflastirilmis polipeptit, reaksiyonun 0,4 M glisin/NaOH, pH 10,4, eklenmesi ile durdurulmasindan önce uygun bir süre boyunca 37°C'de substrat, p-nitrofeniI-oi-mannopiranosit ile inkübe edilir. Dönüstürülen Bazi uygulamalarda, Iizozomal alfa-mannosidaz, sistemik aktarim için formüle edilir.

Sistem aktarim için formülasyonlar, liyofilize edilmis formülasyonlar veya sulu çözeltiler formunda çesitli farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyicilar, eksipiyanlar veya stabilazörler (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)) içerebilir. “Farmasötik olarak kabul edilebilir" tasiyicilar, eksipiyanlar veya stabilazörler, kullanilan dozajlarda ve konsantrasyonlarda alicilar için toksik-degildir ve mevcut basvurular için, bunlar ayrica kan-beyin bariyerinin geçirgenligi üzerinde etkiye sahip olmayan konsantrasyonlarda bulunur. Tamponlar, örnegin, fosfat, sitrat ve diger organik asitler; askorbik asidi ve metiyonini içeren antioksidanlar; koruyucular (örnegin, oktadesildimetilbenil amonyum klorür; hekzametonyum klorür; benzalkonyum klorür, benzetonyum klorür; fenol, bütil veya benzil alkol; alkil parabenler, örnegin, metil veya propil paraben; katekol; resorsinol; siklohekzanol; 3-pentanol ve m-kresol); düsük moleküler-agirlikli (yaklasik 10 rezidüden daha az olan) polipeptit; proteinler, örnegin, serum albümin, jelatin veya immünoglobülinler; hidrofilik polimerler, örnegin, polivinilpirrolidon; amino asitler, örnegin, glisin, glutamin, asparajin, histidin, arjinin veya karbonhidratlar; selatlama ajanlari, örnegin, EDTA; sekerler, örnegin, sükroz, mannitol, trehaloz veya sorbitol; tuz-olusturan karsi-iyonlar, örnegin, sodyum; metal kompleksleri (örn., Zn-protein kompleksleri) ve/veya iyonik olmayan sürfaktanlar, örnegin, TWEEN, PLURONICST veya polietilen glikol (PEG), dâhil edilir.

AIfa-mannosidozun basarili terapisi, santral sinir sistemi ve özellikle bu lizozomal enzimlerin beyne girisini engellediginden kan-beyin bariyeri tarafindan neden olunan zorluklara etkili bir sekilde deginmek zorundadir. Kan beyin bariyerinin anatomik bileseni, fenestrasyonlar olmadan ve sivi tasinmasi için bir kaç mikrovillus ve bir kaç vezikül ile siki baglanti yerlerine sahip olan, beyin kapilerleri içindeki essiz endotelyal hücrelerden olusur. Bunun fizyolojik bileseni kismen, beyin endotelyumlari için enzim olan enzimlerden ve tasiyici proteinler vasitasiyla aktif tasimadan olusur.

Kan-beyin bariyerinin ötesinde, ilave bariyerler mevcuttur. Perivasküler bosluklarda, yabanci bilesikleri sikistirabilen fagositler devriye gezer, dahasi, bazal Iaminanin katmanlari, proteinin makro-moleküler elekleri vaskülatür ve santral sinir sistemi parankimasi arasinda uzanir. Bundan sonra, glia Iamintan, astrogliyumlarin ve mikrogliyumlarin uç ayaklarindan yapilan bir kalkan, bir baska fiziksel bariyeri olusturur.

Son olarak, endotelyal bariyerin ötesindeki çözünmüs maddeler de, bitisik bosluklar yoluyla bir disari dogru yigin sivi akisina tabidir. Santral sinir sistemi parankimasindan interstisyel sivi kismen, ventriküler sisteme ve perivasküler bosluklara hareket ve bunu takiben çözünmüs maddeler, burada çözünebilen bilesenlerin kan-dolasimina geri döndügü subaraknoid bosluklara tasinir. Böylelikle, elemanlarin kan dolasimindan beyne girisini sinirlandiran ve regüle eden çok sayida bariyer vardir.

Kan beyin bariyeri probleminin beyin ilaç hedefleme teknolojisinin gelistirilmesi ile çözülebilecegi tasarlanmistir. Bu teknoloji, terapötik proteinlerin, in vivo kan-beyin bariyerini olusturan, beyin kapiler endotelyumu içinde lokalize olmus endojen tasima sistemleri üzerindeki erisim vasitasiyla beyne aktarimina dayanir.

Asagida, santral sinir sistemini hedef almaya veya santral sinir sistemini hedef almaya aracilik etmeye yönelik bir yetisi olan ve/veya kan-beyin bariyeri aktarimini ve/veya hücresel membranlari geçis için vehiküller olarak etki etmeye yönelik bilinen bir yetisi olan bilesenlerin sinirlayici-olmayan örnekleri verilir. 1) Hücre membranlarini ve/veya BBB'yi geçis ile hedef hücrelere LAMAN geçisi için vehiküller olarak peptitler ve proteinler: Hayvanlardaki çok sayida çalisma, belirli proteinlerin ve/veya peptitlerin BBB'nin geçilmesi için vehiküller olarak etki edebildigini göstermistir. Örnegin, insülin fragmani ile modifiye edilmis proteinler (Fukuta et al., bariyerini geçebilir. Ayrica, poliaminlere kuplaj ile modifiye edilmis beyin bariyerini geçebildigi bildirilmistir. Buna ek olarak, peptidomimetik monoklonal antikorlar (MAb), endojen BBB transferrin reseptörü (RfR) veya insülin reseptörü (IR) üzerinde tasima yoluyla in vivo BBB boyunca reseptör-aracin transsitoz (RMT) geçirir. Terapötik proteinler, avidin- biyotin teknolojisi ile veya füzyon proteinler olarak MAb tasima vektörlerine konjuge edilebilir. 2) Hücre membranlarini ve/veya BBB'yi geçis ile hedef hücrelere LAMAN geçisi için vehiküller olarak toksinler: Farkli bakteriler, bitkiler ve hayvanlar toksinler üretir. Toksinler, çok sayida farkli hedefe, örnegin, gut (neterotoksinler), sinirler veya sinapslar (nörotoksinler), sahiptir. Toksinler, reseptör aracili prosesler yoluyla hücre membranlarinin içinden geçebilir ve mevcut bulusun uygulanmasi, hücresel membranlari ve/veya BBB'yi geçis ile hedef hücrelere thAMAN geçisi için vehiküller olarak toksin kullanmaktir.

Tercih edilen hedef hücreler, SSS ve/veya periferik sinir sistemi içindeki hücrelerdir. Toksinin yalnizca, hücresel membranlar ile iliskiden ve hücresel membranlardan translokasyondan sorumlu olan parçasinin kullanildigi anlasilacaktir.

Bir vehikül olarak kullanilan bir toksinin bir örnegi, bir bakteriyel toksindir, örnegin, Coiynebacterium Diptheriae'den, Difteri Toksini'dir (DT).

Bakteriyel toksinler, genis aralikta toksisiteler gösterir v bunlar yapi ve fonksiyon açisindan gruplara ayrilir. Toksin bir hedef hücreyi baglar ve bir reseptör vasitasiyla hücreye girer ve ayri fragmanlara indirgenir. islenmis toksin, asagidaki 3 alana bölünebilir: Katalitik alan (C), reseptör alani (R) ve translokasyon alani (T).

Toksinin veya bunun fragmanlarinin katalitik fragmani ve reseptör fragmani LAMAN ile degistirilir. Bu füzyon proteini, hücresel membranlarin ve/veya BBB'nin içinden geçebilir ve böylelikle LAMAN'i hedef hücrelere aktarabilir. Bir hibrit molekülün mühendisliginin bir örnegi, rekombinant teknolojisi ile olabilir.

Vehiküller olarak kullanilacak olan bakteriyel toksinlerin diger örnekleri, Klostridium Botulinum'dur, Psedomonas aeruginosa tarafindan üretilen Psedomonas Ekzotoksini A'dir, Vibrio cholerae tarafindan üretilen Kolera Toksini'dir ve Bordete/Ia pertussis tarafindan üretilen Pertussis Toksini'dir. Vehiküller olarak kullanilan toksinlerin ilave örnekleri, asagidaki bitki toksinleri listesinden seçilen bitki toksinleridir: kolinesteraz inhibitörleri, proteaz inhibitörleri, amilaz inhibitörleri, tanninler, siyanojenik glikositler, goitrojenler, Iektin proteinleri ve Vehikül olarak kullanilan toksinlerin daha ilave örnekleri, kabuklu deniz hayvanlarindan (saksitoksin) ve yilanlardan (alfa-bungarotoksin) elde edilen toksinlerdir. Uzmanligi olan kisi, bulusun detaylari ve karakteristikleri isiginda ilave örnekler ekleyebilir. 3) Hücre membranlarini ve/veya BBB'yi geçis ile hedef hücrelere thAMAN geçisi için vehiküller olarak bakterilerden veya virüslerden izole edilen proteinler ve Bakterilerden veya virüslerinden is gören eleman ve/veya is gören protein BBB'yi ve/veya hücresel membranlari geçmek için thAMAN ile birlikte kullanilabilir.

Bakterilerin örnekleri, asagidaki listeden seçilir: Ns. meningitidis, S. pneumoniae, Hemophilus influenzae, Staphy/ococcus türleri, Proteus türleri, Pseudomonas türleri, E. coli, Listeria monocytogenes, M.

Tubercu/osis, Neurolues, lodex ri'ci'nus'tan Spi'rochetes Borre/ia burgdorferi'.

Virüslerin örnekleri, virüs familyalarinin asagidaki listesinden seçilir: Parvoviridae, Papovaviridae, Adenovi'ri'dae, Herpesviridae, Poxvi'ri'dae, Picornaviridae, Reoviridae, Togavi'ridae, Arenavi'ri'dae, Coronaviridae, Retroviridae, Bunyaviridae, Orthomyxoviridae, Paramyxoviridae ve Rhabdoviridae. Yukarida bahsedilen listeden seçilen virüslerin ilgili örnekleri, örn., Kizamik virüsüdür, Papova virüsüdür ve JC virüsüdür. 4) Hücre aracili aktarim sistemleri Terapiye bir hücre-aracili yaklasim, birden fazla temel yolda depolama bozukluklarina deginebilir. Birincisi, kusurlu hücre popülasyonlarini normal es-degerler ile degistirmektir veya telafi etmektir. Terapötik yarar elde etmek için bir ikinci yol, çapraz düzeltme yoluyla olabilir. Uygun hücre tipleri, yalnizca kandan endotelyal bariyeri geçme degil ayni zamanda parankima içine aktif bir sekilde göç etme ve hastalikli hücrelerin miliyösü içine yerlesme yetisini de sunar. Tercih edilen insan hücresi, insan monositleri, insan fibroblastlari ve insan lenfositleri arasindan seçilir.

) Kan-Beyin Bariyerini Bozma Arttirilmis SSS ilaç aktarimi için bir baska invasif strateji, geçici BBB bozulmasi (BBBD) ile baglantili olan ilaçlarin sistemik uygulamasini içerir. Teorik olarak, zayiflatilmis 888 ile, sistemik olarak uygulanmis ilaçlar, serebral endotelyumda arttirilmis ekstravazasyon oranlari geçirebilir, bu arttirilmis parankimal ilaç konsantrasyonlarina yol açar.

BBB'yi geçici bir sekilde bozan çesitli teknikler arastirilmaktadir; bununla birlikte, fizyolojik olarak ilginç olmasina ragmen, çogu kabul edilemez bir sekilde toksiktir ve bundan dolayi klinik olarak kullanisli degildir. Bunlar, çözücülerin, örnegin, dimetil sülfoksidin veya etanolün ve metallerin, örnegin, alüminyumun, infüzyonunu; X-irradyasyonunu ve hipertansiyonu, hiperkapniyi, hipoksiyi veya iskemiyi içeren patolojik rahatsizliklarin indüksiyonunu içerir.

Bir bir dereceye kadar daha güvenli teknik, konvülsan ilacin, nöbetlere neden olurken BBB geçirgenligini geçici bir sekilde arttiran, metrazolün, sistemik aktarimini içerir. Anti- konvülsan pentobarbitalin es-zamanli uygulamasi, BBBD'nin devamlilik göstermesine izin verirken, yakalamayi bloke eder. BBB'den ayrica, VP-16'yi, sisplatini, hidroksilüreyi, florourasili ve etoposidi içeren bir kaç anti-neoplastik ajanin sistemik uygulanmasi ile de taviz verilebilir.

Ozmotik Kan-Beyin Bariyeri Bozulmasi Bir inert hipertonik çözeltinin, örnegin, mannitolün veya arabinozun, intrakarotid enjeksiyonu, bir kaç saatlik bir periyot boyunca endotelyal hücre büzülmesini ve 888 siki baglanti yerlerinin açilmasini baslatmak için kullanilmaktadir ve bu, anti-neoplastik ajanlarin beyne aktarima izin verir. Ozmotik bozulma, makro-moleküler ilaçlarin, örnegin, monoklonal antikorlarin, nano-parçaciklarin ve virüslerin, aktarimi için bir strateji olarak test edilmektedir. Bununla birlikte, prosedür, beynin kendi-savunma mekanizmasini bozar ve bunu dolasimdaki tüm kimyasallardan veya toksinlerden hasara veya enfeksiyona savunmasiz düzeye getirir. Risk faktörleri, plazma proteinlerini geçisini, degistirilmis glikoz alimini, isi sok proteinlerinin ekspresyonunu, mikro-embolizmi veya anormal nöronal fonksiyonu içerir. Böylece, çok fazla sayida teknik bilesiklerin kan beyin bariyerinden aktarimini kolaylastirmak için gelistirilmisken, bunlarin çogu yukarida bahsedilen diger bariyerlere deginmede sinirli basari gösterir.

Bundan dolayi, alfa-mannosidozun tedavisinde bunlarin uygulanabilirliginin sinirli oldugu görülür.

Aksine, bununla birlikte, bulusun çok önemli bir yönü, kan-beyin bariyerini geçerek tasimaya ve/veya kan-beyin bariyerine nüfuz etmeye ve/veya kan-beyin bariyerini bozmaya aracilik etmesi için araçlara bagimli olmayan bir teknige dayanarak santral sinir sistemindeki nötral mannoz açisindan zengin oligosakkaritlerin intra-lizozomal birikmesinin azaltilmasi için bir sema ile ilgilidir. Bulusun tercih edilen uygulamalarinda, bundan dolayi, santral sinir sistemine erismek için yukaridaki tarif edilen yaklasimlar talep edilir. Bulusun tercih edilen bir uygulamalarinda, bulusa göre ilaç, santral sinir sistemindeki hücrelerin hedeflenmesine veya hedeflenmesine aracilik etmeye yönelik bilinen bir yetisi olan bir bilesen ve/veya kan-beyin bariyerini geçis için vehikül olarak etki etmeye yönelik bilinen bir yetisi olan bir bilesen içermez.

Daha tam terimlerde ifade edilen söz konusu ilaç veya formülasyon, beynin nöronal ve/veya gliyal hücrelerini hedef almaya yönelik bilinen bir yetisi olan bir bilesen içermez.

Böylelikle, tercih edilen uygulamalar, Iizozomal alfa-mannosidazin kullanimi ile ilgilidir, burada söz konusu ilaç santral sinir sistemine/kan beyin bariyerine nüfuz edebilen bir formda Iizozomal alfa-mannosidaz içermez. Bu dogrultuda ayrica, Iizozomal alfa- mannosidazin kan-beyin bariyerinden tasiyici-aracili tasima elde etmek amaciyla modifiye edilmemis olmasi ve Iizozomal alfa-mannosidazin kan-beyin bariyerinin bozulmasini elde etmek amaciyla formüle edilmemis olmasi da tercih edilir.

Esit olarak tercih edilen uygulamalarda, ilaç bir Iizozomal alfa-mannosidaz içerir ve asagidakileri içermez a) Iizozomal alfa-mannosidazin santral sinir sistemine aktarimi için bir vehikül veya vektör, örnegin, bir peptit veya polipeptit ve b) kan beyin bariyerinin açilmasina veya bozulmasina neden olmaya yönelik bilinen 0) bir aynen hücre Daha spesifik olarak, bir ilacin preparasyonu için bir Iizozomal alfa-mannosidazin kullanimini saglamak mevcut bulusun bir amacidir, burada söz konusu ilaç, insülin fragmanini ve virüsten veya bakterilerden türetilen peptitleri ve proteinleri içeren ekzojen peptitlerden ve proteinlerden, poliaminlerden, fosfolipitleri içeren Iipofilik kisimlardan, antikorlardan veya antikor fragmanlarindan, örnegin, transferrin reseptörü antikorlarindan ve toksinlerden olusan gruptan seçilen bir vehikül içermez.

Bulus ayrica, Iizozomal alfa mannosidazin kullanimi ile de ilgilidir, burada bir ilacin söz konusu preparasyonu, söz konusu Iizozomal alfa-mannosidazin poliaminlerin tutturulmasi ile modifikasyonunu içermez.

Bulusa göre ilaç, bir Izotonik çözelti içinde formüle edilen bir lizozomal alfa-mannosidaz içerebilir veya bundan olusabilir. "Izotonik çözelti" terimi geleneksel olarak, kan ile ayni ozmotik basinca sahip olan bir çözeltiyi ifade eder. Mevcut bulus baglaminda, çözelti bir insan izotonik çözeltisi olabilir, ancak bununla sinirli degildir. Güncel olarak, 3,10- enjeksiyonluk su içeren veya bunlardan olusan formülasyon tamponlari tercih edilir. 3,0-5,0 mM Tween 80 ve enjeksiyonluk su içeren veya bunlardan olusan formülasyon tamponlari tercih edilir. Alternatif olarak, lizozomal alfa-mannosidaz, Fosfat tamponlu salin (0,01 M fosfat tamponu + 0,145 M NaCI, pH=7,2) içinde formüle edilebilir.

Yukarida bahsedildigi üzere, aynen hücrelerin kullanimi, kan-beyin bariyerinden maddelerin aktarimi için araçlar saglayabilir. Bununla birlikte, mevcut bulus bir aynen hücre içermeyen bir ilaç ile ilgilidir.

Bu dogrultuda, bulusun bir ilaveten tercih edilen uygulamasi, lizozomal alfa- mannosidazin kullanimi ile ilgilidir, burada bir ilacin söz konusu preparasyonu, bir hücre-aracili aktarim sisteminin kullanimini içermez. Özel olarak, mevcut bulus bir aktarilmis otolog hücreden, örnegin, bir aktarilmis fibroblasttan veya bir periferik kari enkapsüle edilmis hücre hattindan olusan gruptan seçilen bir aynen hücrenin kullanimina dayanmaz.

Lizozomal alfa-mannosidazin uygulanmasinin santral sinir sistemindeki çok çesitli hücrelerde nötral oligosakkaritlerin azaltilmis birikmesi ile sonuçlanacagi beklenecektir.

Bununla birlikte, bulusun tercih edilen uygulamalarinda, santral sinir sisteminin bir veya birden fazla bölgesindeki söz konusu hücreler, nöronal hücreleri ve/veya gliyal hücreleri içerir. Buna ek olarak, söz konusu hücreler, santral sinir sisteminde bulunan ekstra- nöral hücreler içerebilir.

Beyin, dört majör kismi, serebrumu, diensefalonu, beyin-kökünü ve serebellumu, içerir.

AIfa-mannosidazin uygulanmasinin bu kisimlarin birinde veya birden fazlasinda oligosakkaritlerin depolanmasini etkiledigi anlasilacaktir. Bulusun ilaveten tercih edilen uygulamalarinda, santral sinir sistemindeki söz konusu bir veya birden fazla bölge, serebrum, diensefalon, beyin-kökü ve/veya serebellum içinde bir veya birden fazla bölge içerir.

Yukarida-bahsedilen beyin kisimlarinin belirli spesifik bölgelerinde nötral mannoz açisindan zengin oligosakkaritlerin birikmesindeki düsüsün, alfa-mannosidozun klinik gösterimlerini düsürme açisindan özellikle ilgili olmasi olasidir. Bulusun daha özel uygulamalarinda, oligosakkaritlerin birikmesi, serebrum içindeki, serebral korteks içindeki bir veya birden fazla bölgeyi, subkortikal nükleuslar içindeki bir veya birden fazla bölgeyi ve Iimbik sistem içindeki bir veya birden fazla bölgeyi içeren gruptan seçilen bir veya birden fazla bölgede düsürülür. Çok sayida duyusal ve/veya motor fonksiyon, serebral korteks içindeki çesitli spesifik bölgelere yüklenmistir. Genel olarak fonksiyon açisindan motor olan Frontal Lob içinde, Pre-santral Girus (Primer Motor Korteksi), hassas hareketin kontrolünden sorumludur, Motor IIiskiIendirme Korteksi, kompleks hareketler için bilginin entegrasyonundan sorumludur, Konusma-Motor Korteksi, konusma üretmeye dâhil edilir; (Broca alani) ve Pre-Frontal Korteks, karar vermeye; dikkatin yönlendirilmesine dâhil edilir.

Genel olarak, fonksiyon açisindan duyusal olan Parietal Lob içinde, Post-santral Girus (Primer Somatosensori Korteks), ciltten (Kütanöz) ve kastan (propriyoseptif) duyunun algilanmasina dâhil edilir, Duyusal IIiskiIendirme Korteksi, duyusal sinyallerin entegrasyonuna, duyusal dikkatin yönlendirilmesine dâhil edilir; Sol IIiskiIendirme Korteksi, dile anlam üretmeye dâhil edilir; (Wemicke alani) ve Sag IIiskiIendirme Korteksi, uzaysal iliskilere anlam üretmeye dâhil edilir.

Genel olarak fonksiyon açisindan duyusal olan Oksipital Lob içinde, Görme Korteksi, görme duyusunun algilanmasina dâhil edilir, Görsel IIiskiIendirme Korteksi, görsel içerigin ve anlamin algilanmasina dâhil edilir.

Genel olarak fonksiyon açisindan duyusal olan Temporal Lob içinde, Primer Duyma Korteks, duyma duyusunun algilanmasina dâhil edilir, Isitsel IIiskiIendirme Korteksi, isitsel içerigin ve anlamin algilanmasina dâhil edilir; bu, tat alma ve koklama duyusunun algilanmasina dâhil edilen parietal korteks Tat Alma ve Koklama Korteksi'ne uzanir, lateral sulkusun derin kisminda yer alan Insüler Korteks, olaylarin sonucu hakkinda bilgi saglamaya dâhil edilir.

Diger bölgeler, hipokampüs üstünde yer alan Parahipokampal Girus'u, uzun-süreli hafizanin olusmasina dâhil edilen Hipokampüs'ü ve duygunun hissedilmesine dâhil edilen Amigdala'yi içerir.

Bulusun daha da özel uygulamalarinda, oligosakkaritlerin düzeyleri, serebral korteks içindeki, frontal lobu, parietal lobu, temporal Iobu ve oksipital Iobu içeren gruptan seçilen bir veya birden fazla bölgede düsürülür.

Bulusun diger özel uygulamalarinda, oligosakkaritlerin düzeyleri, diensefalon içindeki, talamusu ve hipotalamusu içeren gruptan seçilen bir veya birden fazla bölgede Talamus, beynin merkezi içinde derine gömülmüs diensefalonun bir bileseniir. Kortikal yapilar ile zengin ve resiprokal bir sekilde baglanmis, talamik nükleuslar hem beyin boyunca bilgi aktarimini iletme hem de modüle etme islevi gösterir.

Talamus, asagidaki ana kisimlari içerir: anteriyor nükleer grup, orta-hat nükleer grup, mediyal dorsal nükleus, intra-Iaminer nükleer grup, lateral nükleer grup, ventral nükleer grup, genikulat cisimler, posteriyor nükleer kompleks, talamik retiküler nükleus, talamik ag yollari ve talamusun stratum zonalesi.

Limbik sistem, çesitli duygulara, örnegin, agresyona, korkuya, hosnutluga ve ayni zamanda hafiza olusmasina dâhil edilen beyin yapilarinin bir grubudur. Limbik sistem ayrica, endokrin sistemi ve otonomik sinir sistemini de etkiler. Bu, serebrumun hemen altinda, talamus etrafinda yer alan bir kaç yapidan olusur: Uzun-süreli hafizanin olusmasina dâhil edilen hipokampüs, agresyona ve korkuya dâhil edilen amigdala, singulat girus, fornikat girus, arkikorteks ve otonomik sinir sistemini kontrol eden ve kan basincini, kalp ritmini, açligi, susamayi ve cinsel uyariyi regüle eden hipotalamus.

Pituiter bez ile baglantilidir ve bundan dolayi endokrin sistemi regüle eder.

Beyin-kökünde yer alan nörolojik fonksiyonlar, sag kalim için (nefes alma, sindirim, kalp ritmi, kan basinci) ve uyari için (uyanik ve tetikte olma) gerekli olanlari içerir. Kraniyal sinirlerin çogu, beyin-kökünden gelir. Beyin-kökü, periferik sinirlerden ve omurilikten beynin en yüksek kisimlarina yukariya ve asagiya dogru geçen tüm ag yollari için yoldur. Bulusun ilave özel uygulamalarinda, oligosakkaritlerin düzeyleri, beyin-kökü içindeki, orta-beyni, ponsu ve medulla oblongatayi içeren gruptan seçilen bir veya birden fazla bölgede düsürülür.

Medulla oblongata primer olarak, omurilik ve beyin arasindaki motor yollarinin çaprazlanmasi için bir aktarma istasyonu olarak islev gösterir. Bu ayrica, respiratuvar, vazomotor ve kardiyak merkezleri ayni zamanda refleks aktivitelerini, örnegin, öksürmeyi, ögürmeyi, yutmayi ve kusmayi, kontrol etmek için çok sayida mekanizmayi da içerir. Orta-beyin, serebral yari-kürelerin sinir yolu görevi görür ve isitsel ve görme refleksi merkezlerini içerir. Pons, beynin farkli kisimlarini baglayan ve medulladan beynin daha yüksek kortikal yapilarina bir aktarma istasyonu görevi gören bir köprü- benzeri yapidir. Bu, respiratuvar merkezi içerir.

Serebellar korteksi içeren serebellumun fonksiyonu, katilan çesitli kas gruplarinin eylemini koordine etme ile hareketlerin performansini kolaylastirmaktir. Bulusun diger özel uygulamalarinda, oligosakkaritlerin düzeyleri, serebellum içindeki, serebellar korteksi içeren, bir veya birden fazla bölgede düsürülür.

Mevcut bulusa göre rekombinant Iizozomal alfa-mannosidaz kullaniminin bir primer avantaji, tedavinin beyinde görülen etkilerinin santral sinir sisteminin parçasi olmayan hücrelerdeki etkiler ile birlestirilebilecegi gerçegi ile ilgilidir. Böylelikle, ekzojen gösterimlerinin tümünü olmasa da çogunu düzeltir. Tercih edilen uygulamalarda, Bulus böylelikle, santral sinir sisteminin içinde olmayan nörolojik dokularin hücrelerinde nötral mannoz açisindan zengin oligosakkaritlerin düzeylerini ilaveten düsüren bir ilacin kullanimi ile ilgilidir. Bulusun bu uygulamasinda, söz konusu ilaç ilaveten, santral sinir sisteminin içinde olmayan nörolojik dokularin hücrelerini hedef alabilen bir bilesen içerir. Özel olarak, bu ilacin kullanilmasi, santral sinir sisteminin Içinde olmayan, periferik sinir sisteminin en önde gelen hücrelerini içeren hücrelerde Iizozomal depolamanin düzeltilmesi ile sonuçlanir. Bunlar, nöronal hücreleri ve/veya Schwann hücrelerini içerir.

Alfa-mannosidozun klinik gösterimleri kismen, viseral dokularda kusurlu alfa- mannosidazi degistirmenin izole edilmis etkileri ile hafifletilebilir. Bununla birlikte, mevcut bulusun temelini olusturan, kavramin merkezi bir parçasi, terapinin santral sinir sisteminde Iizozomal depolama üzerindeki yararli etkilerinin santral sinir sistemi disindaki dokularda Iizozomal depolamada bir düsüse sekonder oldugu ve/veya bu düsüse bagli oldugu gerçegi ile ilgilidir. Bu dogrultuda, söz konusu ilacin ayrica, nörolojik-olmayan dokulardaki hücrelerde nötral mannoz açisindan zengin oligosakkaritlerin düzeylerinde bir düsüs elde etmek amaciyla da kullanilmasi ve ilacin bu tarz dokular içindeki hücreleri hedef alabilen bir bilesen içermesi bulusun önemli bir karakteristigidir.

Bu baglamda, viseral dokularda ekzojen alfa-mannosidazin etkilerinin primer önemlilikte olduguna inanilir. Bundan dolayi, bulusun tercih edilen bir uygulamasina göre, ilaç santral sinir sisteminin disindaki nörolojik ve/veya nörolojik-olmayan dokularin hücrelerini hedef alabilen bir bilesen içerir. Daha da tercih edilen bir uygulamada, santral sinir sisteminin disindaki söz konusu nörolojik ve/veya nörolojik- olmayan dokular, karacigeri, dalagi, böbregi ve kalbi içeren gruptan seçilen viseral dokulari içerir.

Ekzojen alfa-mannosidazin, örnegin, reseptör aracili endositoz kullanilmasi ile santral sinir sistemi disindaki ilgili dokularda hücreleri hedef almak için aktarilabilecegi gösterilir. Tercihen, alfa-mannosidaz, bir mannoz- veya mannoz-P-6-reseptörü-aracili alim avantajini elde ederek bu tarz hedef hücrelerin hücresel membranlari üzerinden uygulanir. Bu dogrultuda, hedef alma yetilerine sahip olan yukarida bahsedilen faktör tercihen, mannoz-ö-fosfattir.

Herhangi bir memeli alfa-mannosidazinin bir süjede kusurlu enzimi degistirmek için kullanilabilecegi düsünülür. Bununla birlikte, süje bir insan oldugunda, bir insan gelmesini minimuma indirmek, amaciyla tercih edilecektir. Bu dogrultuda, bulusun tercih edilen uygulamalari, bir insan Iizozomal alfa-mannosidazi olan bir Iizozomal alfa mannosidazin kullanimi ile ilgilidir.

En çok tercih edilen bir uygulamada, Iizozomal alfa-mannosidaz, SEQ ID NO: 1 amino asit dizisini içerir.

Pratik ve ekonomik nedenlerden dolayi, alfa-mannosidazin rekombinant olarak üretilmesi tercih edilir. Dahasi, dokudan saflastirilmis bir lizozomal hidrolaz için, enzimin bir düsük mannoz-G-fosfat içerigine sahip olmasi beklenecektir. Böylelikle, rekombinant üretim ile, enzimin, burada büyük bir fraksiyonun mannoz-6-fosfat içerdigi, bir preparasyonunu elde etmek de mümkün olacaktir. Rekombinant üretim, bir hücrenin sonra basarilabilir.

Alfa-mannosidaz tercihen, örnegin, vücudun viseral organlarinin, hücrelerinde etkili reseptör aracili alimi garanti eden bir glikosilasyon profili saglamak amaciyla bir memeli hücresi sisteminde yapilir. Özel olarak, CHO, 008 veya BHK hücrelerinde enzimin üretilmesinin mannoz-G-fosfat rezidülerinin eklenmesi ile enzimin yeterli post- translasyonel modifikasyonunu garanti ettigi bulunmustur. Buna ek olarak, bir dogru siyalilasyon profili elde edilir. Dogru siyalilasyonun, açiktaki galaktoz rezidülerinden dolayi, karaciger tarafindan alimi önlemek amaciyla önemli oldugu bilinir.

Bundan dolayi, daha çok tercih edilen uygulamalarda, memeli hücresi sistemi, CHO, COS hücrelerini veya BHK hücrelerini içeren gruptan seçilir (Stein et al., J Biol olmasi ilaveten tercih edilebilir.

En çok tercih edilen bir uygulamada, memeli hücresi sistemi, bir CHO hücre hattidir.

Bundan, bulusun esit olarak tercih edilen uygulamalarinin, Iizozomal alfa- mannosidazin, burada söz konusu preparasyonun bir fraksiyonunun mannoz-G-fosfat gruplari tasiyan bir veya birden fazla N-bagli oligosakkaride sahip olan Iizozomal alfa mannosidazdan olustugu, bir preparasyonunun kullanimi ile ilgili oldugu sonucu çikar.

Söz konusu Iizozomal alfa-mannosidazin bir preparasyonunun bir fraksiyonunun mannoz-ö-fosfat reseptörlerini baglayabilmesi ilaveten tercih edilir.

Enzimin mannoz-ö-fosfat reseptörlerini baglama yetisi, mevcut basvurunun örnek 1'inde tarif edildigi sekilde bir in vitro analiz ile belirlenebilir. Burada, enzimin bir MPR afinite 300 Matrix'sini baglamasi, bunun mannoz-ö-fosfat reseptörlerini baglama yetisinin bir ölçüsünü saglar. Bulusun tercih edilen bir uygulamasinda, enzimin mannoz-ö-fosfat reseptörlerini baglamasi, in vitro gerçeklesir.

Bulusun daha çok tercih edilen uygulamalarinda, bu fraksiyon, Iizozomal alfa- mannosidazin bir preparasyonunun aktivitesinin %1'i ila 75'ine, örnegin, %2'si ila örnegin, %20'si ila 40'ina, Örnegin, %30'u ila 35'ine, karsilik gelir.

Bu dogrultuda, Iizozomal alfa-mannosidazin, mannoz 6-fosfat rezidülerinin, enzimin ila 70'inin veya %40'i ila 60'inin bir Man-G-P-reseptörü matriksini mannoz 6-fosfat bagimli baglamasina izin veren bir içerigine sahip olmasi tercih edilir. Bu durumda, fosforilasyon derecesi, enzimin bir kaç serisinde analiz edilmistir ve tipik olarak enzimin Man-G-P-reseptörünü yüksek afinite ile baglamasi ilaveten tercih edilir. Teorik olarak, iki mannoz 6-fosfat grubunun, enzimin bir Man-ö-P-reseptörünü yüksek afinite ile baglamasi için birbirine yakin konumlandirilmasi gerekir. Yakin tarihli gözlemler, fosforile edilmis mannoz rezidüleri arasindaki mesafenin, yüksek afiniteli baglama elde etmek için 40 Â veya daha az olmasi gerektigini öne sürer. SEQ ID NO: 1'e göre insan 766'da asparajin rezidülerinde konumlandirilabilir. Bu dogrultuda, mevcut bulusa göre ilacin, bir fraksiyonunun bu asparajin rezidülerinin her ikisinde mannoz 6-fosfat gruplari tasiyan Iizozomal alfa-mannosidaz içermesi tercih edilir. Çesitli farkli uygulama araçlarinin enzimi aktarmak için kullanilabilecegi anlasilacaktir.

Bunlar, intravenöz, intra-arteriyel, subkütan, intraperitoneal veya intramüsküler enjeksiyonu veya infüzyonu içeren parenteral yollari içerir. Uygulamanin düzenli bir temelde tekrar edilmesi olasi oldugundan, uygulama Için basit tekniklerin kullanilmasi tercih edilir. Bulusun bir güncel olarak en çok tercih edilen uygulamasinda, alfa mannosidaz, intravenöz uygulama için olan bir ilacin preparasyonu için kullanilir. Özel olarak, bu yol vasitasiyla uygulama bir yatan-hasta tarafindan gerçeklestirilemeyeceginden, santral sinir sistemine dogrudan enjeksiyon ile uygulamanin uygun olmadigi düsünülür.

Bulusa göre alfa-mannosidazin kullanilmasi ile hazirlanan ilaci santral sinir sistemini hedef almaya veya hedef almaya aracilik etmeye yönelik bilinen bir yetisi olan bir bilesen içeren bir bilesim ile birlikte-uygulamasi elbette mümkün olacaktir. Mevcut bulusun daha çok-tercih edilen bir uygulamasinda, bu tarz birlikte-uygulama gerekli de degildir arzu da edilmez ve tedavi semasina dâhil edilmeyecektir. Bu uygulama, bulusa göre kullanim ile ilgilidir, burada söz konusu ilaç, santral sinir sistemini hedef almaya yönelik bilinen bir yetisi olan bir bilesen içeren bir bilesimin takviye uygulamasi olmadan uygulama içindir.

Ilacin dozlar hâlinde uygulanacagi görülür, burada Iizozomal alfa-mannosidazin miktari, hakkindaki önceki çalismalardan, kusurlu enzimin bir tam sübstitüsyonunun, böylece saglikli bireylerde görülenlere karsilik gelen düzeylere ulasilmasinin, gerekli olmayabilecegi görülür. Terapinin maliyetini minimuma Indirmek ve büyük olasilikla ayrica varsayimsal advers etkileri de azaltmak için, amaç mümkün oldugu kadar küçük miktarlarda enzim kullanmak olmalidir. Buna ek olarak, münferit süjenin profiline göre uygulanan miktarlari ve uygulama sikligini içeren tedaviyi "uygun hâle getirmenin" mümkün oldugu görülür. Böylelikle, mevcut bulusun tercih edilen uygulamalarinda, ilaç, tedavi edilecek olan süjenin vücut agirliginin her bir grami için 1 ila 400 mU Iizozomal alfa-mannosidaz araligi içinde olan, örnegin, vücut agirliginin her bir grami için 2 ila 50 veya 40 ila 45 mU Iizozomal alfa-mannosidaz araligi içinde olan, bir miktarda uygulanir.

Bulusun bir güncel olarak daha çok tercih edilen uygulamasinda, ilaç, vücut agirliginin her bir grami için 250 mU Iizozomal alfa-mannosidaz olan bir miktarda uygulanir.

Bulusun bir esit olarak tercih edilen uygulamasinda, ilaç, vücut agirliginin her bir grami için 50 mU Iizozomal alfa-mannosidaz olan bir miktarda uygulanir.

Lizozomal alfa-mannosidazin spesifik aktivitesi, yetisini etkileyen bir elzem faktör olabilir, burada söz konusu Iizozomal alfa-mannosidaz, 5 - 100 U/mg, örnegin, 10 - 90 bir spesifik aktiviteye sahiptir.

Mevcut bulusta kullanilan enzim preparasyonunda, Iizozomal alfa-mannosidazin veya %99 dizi özdesligine sahip olan bir amino asit dizisinin 130 kDa'Iuk monomerlerinden olusan bir 260 kDa'Iuk dimer formunda bulunur. Bununla birlikte, indirgeme kosullari altinda analiz edildiginde, enzimin miktarinin bir degisken fraksiyonunun, 70 ve 55 kDa'Iuk formlara islenmis oldugu görülür. Bu, Iizozomal alfa- mannosidazin miktarinin bir fraksiyonunun kismen yarilmis oldugunu, ancak disülfit köprüleri vasitasiyla hâlâ 260 kDa'Iuk formda birlikte tutuldugunu gösterir. Hem 130 kDa'Iuk form hem de islenmis formlar aktiftir, ancak süjeye uygulandiginda, enzimin miktarinin büyük bir fraksiyonunun, 130 kDa'Iuk öncül formda dimerler olarak bir dimer olarak bulunur. Enzim bunu takiben Iizozomlar içine alindiginda, bu 15, 42 ve 70 kDa'Iuk peptitlere islenir. 70 kDa'Iuk peptit, disülfit köprüleri vasitasiyla hâlâ birlikte tutulan daha küçük üç peptide islenir.

Enzim replasman terapisinin yalnizca geçici etkiler üretmesi beklendiginden, ilacin bir kaç günlük enjeksiyon ila haftada veya ayda bir kere veya iki kere araligindaki bir siklikta uygulanabilir olmasi ilaveten görülür. Tercih edilen uygulamalarda, ilaç 1 ila 5 günlük enjeksiyonlara, 1 ila 5 haftalik enjeksiyonlara, 2 hafta bir 1 ila 5 enjeksiyona veya ayda bir 1 ila 5 enjeksiyonla karsilik gelen bir siklikta uygulanabilir. Alternatif karsilik gelebilir.

Esit olarak tercih edilen uygulamalarda, ilaç bir günlük temelde tekrarli intravenöz enjeksiyon ile, 2, 3, 4, 5 veya 6 günde bir tekrarli intravenöz enjeksiyon ile veya bir haftalik, iki-haftalik veya aylik temelde tekrarli intravenöz enjeksiyon ile uygulanir.

Bulusun bir güncel olarak tercih edilen uygulamasinda, Iizozomal alfa-mannosidazin miktari, 3 ila 4 günde bir kere uygulanir.

Mevcut bulusa göre ilacin intravenöz enjeksiyon ile uygulanmasi yalnizca, santral sinir sistemi içinde bulunan Iizozomal alfa-mannosidazin miktarinda anlamsiz artislara yol açar. Bu teori ile sinirlandirilmadan, nötral oligosakkaritlerin azaltilmis düzeylerinin, periferik dokuda ve viseral organlarda enzimin arttirilmis düzeylerine sekonder olabildigi ve bunun bir dogrudan veya dolayli sonucu olabildigi görülür. Lizozomal alfa- mannosidazin dolasimdan çabuk bir sekilde temizlendigi görüldügünden, enzimin uygulanan miktarinin, dolasimdaki enzimin düzeylerinin Man-ö-P reseptörü vasitasiyla veya büyük olasilikla ayrica baska güncel olarak bilinmeyen tasima mekanizmalari yoluyla enzimin uygun miktarlarinin hücresel alimina izin veren bir süre boyunca yeterli bir sekilde arttirilmis olarak kalacagi sekilde olmasi kritik görülür. Buna ek olarak, viseral organlar ve periferik doku içinde enzimin düzeyleri, yalnizca organlarin veya dokunun içinde degil ayni zamanda santral sinir sisteminin içinde de nötral sülfatitlerde bir düsüse neden olmak için yeterli bir süre boyunca yeterli bir sekilde arttirismis olarak kalmalidir. Bu dogrultuda, Iizozomal alfa-mannosidazin uygulanan miktarinin, söz konusu ilacin enjeksiyonunu, örnegin, intravenöz enjeksiyonunu, takiben, asagidaki sekilde olmasi tercih edilir: dakika, boyunca dolasimda sürdürülür ve/veya b) enzimin etkili düzeyleri, böbregi, dalagi ve kalbi içeren viseral organlarda, en az 6, 7, 8, 9 veya 10 gün boyunca sürdürülür.

Mevcut baglamda, "etkili düzeyler" terimi, lizozomal alfa-mannosidazin, mevcut basvurunun örnek 2'sinde tarif edildigi sekilde bir enzim analizinde analiz edildiginde tedavi edilmemis süjelerden elde edilen serumda veya organ ekstraktlarinda görülen enzim düzeyleri ile karsilastirildiginda en az iki kat, en az 5 kat, en az 10 kat, en az 20 kat veya en az 50 kat arttirilmis düzeylerini ifade eder.

Tercihen, söz konusu süjeye uygulanan enzim, intra-Iizozomal oligosakkaritlerin düzeylerinde tercihen %20'ye, daha tercihen %30'a, hatta daha tercihen %40'a, hatta daha da tercihen %50'ye, daha da tercihen %60'a, en tercihen %70'ten fazlasina karsilik gelen bir düsüse yol açacaktir. Özel olarak, lizozomal alfa-mannosidazin uygulanan miktari, söz konusu ilacin enjeksiyonunu, örnegin, intravenöz enjeksiyonunu, takiben, tercihen asagidaki sekildedir: a) karacigeri, dalagi, böbregi ve/veya kalbi içeren viseral organlarda nötral oligosakkaritlerin miktari, tedaviden önceki düzeyler veya tedavi edilmemis azaltilir ve/veya b) b) karacigeri, dalagi, böbregi ve/veya kalbi içeren viseral organlarda nötral oligosakkaritlerin miktari, 1 - 4, 2 - 6 veya 4 - 8 günlük bir periyot boyunca %40- c) c) karacigerde nötral oligosakkaritlerin depolanmasi, sinüs endotelyal hücreleri, Kupffer hücreleri ve hepatositler içinde depolama kofullarinin bir azaltilmis varligi ile belirlendigi üzere, 1 ila 12, 2 - 10 veya 4 - 8 günlük bir periyot boyunca azaltilir.

Mevcut bulusun merkezi, santral sinir sisteminde nötral oligosakkaritlerin düzeylerindeki bir düsüsün yalnizca, Iizozomal alfa-mannosidazin tekrarli uygulamasindan sonra görüldügü gözlemidir. Bundan dolayi, Iizozomal alfa- mannosidazin uygulanan miktarinin, bir günlük temelde ilacin tekrarli enjeksiyonu, örnegin, intravenöz enjeksiyonu ile, 2, 3, 4, 5 veya 6 günde bir tekrarli enjeksiyon, örnegin, intravenöz enjeksiyon ile veya bir haftalik, iki-haftalik veya aylik temelde tekrarli enjeksiyon, örnegin, intravenöz enjeksiyon ile, asagidaki sekilde olmasi tercih edilebilir: a) enzimin etkili düzeyleri, dolasimda sürdürülür ve/veya b) enzimin etkili düzeyleri, böbregi, dalagi ve kalbi içeren viseral organlarda sürdürülür ve/veya c) enzimin etkili düzeyleri, karacigerde sürdürülür.

Lizozomal alfa-mannosidazin uygulanan miktarinin, bir günlük temelde Ilacin tekrarli enjeksiyonu, örnegin, intravenöz enjeksiyonu ile, 2, 3, 4, 5 veya 6 günde bir tekrarli enjeksiyon, örnegin, intravenöz enjeksiyon ile veya bir haftalik, iki-haftalik veya aylik temelde tekrarli enjeksiyon, örnegin, intravenöz enjeksiyon ile, asagidaki sekilde olmasi esit sekilde tercih edilebilir: a) böbrekte ve kalpte nötral oligosakkaritlerin depolanmasi tam olarak düzeltilir boyunca tam olarak düzeltilir ve/veya veya 14 günlük bir periyot boyunca azaltilir ve/veya c) karacigerde ve böbrekte nötral oligosakkaritlerin depolanmasi, karacigerin sinüs endotelyal hücrelerinde, Kupffer hücrelerinde ve hepatositlerinde ve böbregin tübüler epitelyumlarinda depolama kofullarinin bir azaltilmis varligi ile belirlendigi boyunca azaltilir.

Beyinde depolanmis oligosakkaritlerin azaltilmasi, en azindan kismen, beyin endotelyumlarindan ve meninkslerden depolama materyalinin klirensi ile sonuçlanabilir, bu küçük kan dolasimini ve serebrospinal sivinin akisini iyilestirebilir. Böylelikle, mevcut bulusun daha çok tercih edilen bir uygulamasi, beyin endotelyumlarinin ve/veya meninkslerin bir veya birden fazla bölgesindeki hücrelerde nötral mannoz açisindan zengin oligosakkaritlerin intraselüler düzeylerini düsürmek amaciyla bir ilacin preparasyonu için Iizozomal alfa-manosidazin kullanimi ile ilgilidir.

Ilacin yukarida tarif edilen karakteristiklere sahip olabildigi anlasilacaktir. Böylelikle, bulusun bu yönünün tercih edilen bir uygulamasinda, söz konusu ilaç, santral sinir sistemini hedef almaya veya santral sinir sisteminin hedef alinmasina aracilik etmeye yönelik bilinen bir yetisi olan bir bilesen ve/veya kan-beyin bariyerini geçis için bir vehikül olarak etki etmeye yönelik bilinen bir yetisi olan bir bilesen içermez.

Yine, yöntemin alfa-mannosidazin söz konusu ilacini intraserebroventriküler, spinal, intratekal veya intrakraniyal uygulama disindaki bir yol ile uygulamayi içerir.

Ilacin intravenöz veya subkütan enjeksiyon ile uygulanmasi özel olarak tercih edilir.

Mevcut bulusa göre ilacin santral sinir sistemini hedef almaya veya santral sinir sisteminin hedef alinmasina aracilik etmeye yönelik bilinen bir yetisi olan bir bilesen ve/veya kan-beyin bariyerini geçis için bir vehikül olarak etki etmeye yönelik bilinen bir yetisi olan bir bilesen ile birlikte-uygulanmasi ne gereklidir ne de arzu edilebilir ve tedavi semasina dâhil edilmez. Böylelikle, söz konusu ilacin uygulanmasinin santral sinir sistemini hedef almaya yönelik bilinen bir yetisi olan bir bilesen içeren bir bilesimin uygulanmasi ile takviye edilmemesi tercih edilir.

Yakin tarihli bir yayina göre, rekombinant insan alfa-L-idüronidazin (rhIDU) intratekal enjeksiyonu, serebrospinal sivinin içine dogrudan enjeksiyon, mukopolisakkaridozun (MPL) bir kanin modelindeki beyin dokusunda karbonhidrat depolanmasini azaltabilir (Kakkis, 2003). Mevcut bulusa göre ilacin intravenöz uygulanmasi ziyadesiyle tercih edilirken, Kakkis'in gözlemleri, bu tarz uygulamanin en azindan bazi olgularda, diger uygulama yollarini içeren, diger tedaviler ile birlestirilebilecegini öne sürer.

Böylelikle, bulus, intravenöz uygulama amaciyla ayni zamanda intratekal veya spinal enjeksiyon ile uygulama amaciyla bir ilacin preparasyonu için bir Iizozomal alfa mannosidazin kullanimini saglayabilir, burada birlestirilmis intravenöz ve intratekal uygulama, bir süjede periferik sinir sistemindeki hedef hücrelerde ve santral sinir sistemindeki hedef hücrelerde galaktosil sülfatit düzeylerinde bir düsüs ile sonuçlanir. ilaveten, bulus intravenöz uygulama amaciyla bir ilacin preparasyonu için bir lizozozmal alfa-mannosidazin kullanimini saglayabilir, burada ilacin intravenöz uygulanmasi, periferik sinir sistemindeki hedef hücrelerde ve santral sinir sistemindeki hedef hücrelerde galaktosil sülfatit düzeylerinde bir düsüs ile sonuçlanir.

Daha baska bir yönünde, rekombinant Insan alfa-mannosidazinin preparasyonu için bir yöntem saglanir, yöntem a) uygun bir vektör içine SEQ ID NO: 1'de gösterilen amino asit dizisini kodlayan bir DNA fragmanini içeren bir nükleik asit fragmanini uygulamayi; b) bir hücreyi adim a)'da elde edilen vektör ile transforme etmeyi; c) transforme edilmis konak hücreyi nükleik asit dizisinin ekspresyonunu kolaylastiran kosullar altinda kültürlemeyi; d) kültürden ekspresyon ürününü geri-kazanmayi içerir. Yöntem ilaveten, bir dizi bir veya birden fazla saflastirma adimini içerebilir. Özel olarak, burada nükleik asit fragmaninin SEQ ID NO: 2'de gösterilen DNA fragmaninin 3066 baz-çifti EcoRI - Xbal fragmanini içerdigi bir yöntem saglanir.

Mannoz-ö-P olan rekombinant alfa-mannosidazin üretilmesi, asagidaki genel adimlarin (genel hatlari gösterilen bir taslagin) birini veya bir kaçini veya tümünü içerir: A. thAMAN'in sentezi B. Transfeksiyon 2-10 pg thAMAN hibrit vektör DNA'si, memeli hücrelerine (örn., CHO, COS hücrelerine veya BHK hücrelerine) fosfat çökeltme/gliserol sok metodolojisi ile transfeksiyon için kullanilir. Transfeksiyon ayrica, bir elektrik sok metodolojisi ile de yapilabilir.

C. rhI=AMAN'm ekspresvonu Aktif proteinin sentezi ve söz konusu proteininin mannoz-ö-P modifikasyonu memeli hücresi sisteminde ekspresyon sirasinda yapilir.

D. thAMAN'in saflastirilmasi Rekombinant insan alfa-mannosidazi, bir 6 adimli prosedür kullanilarak saflastirilir - bakiniz örnek 1.

E. Mannoz-G-P reseptörü aracili alim için test sistemi Üretilen rekombinant alfa-mannosidazin bir mannoz-ö-P reseptörü aracili alimda aktif olma yetisi, alfa-mannosidazi normal Fibroblastlar veya alfa-mannosidoz hastalarindan elde edilen Fibroblastlar ile inkübe etme ile test edilir. Hücrelere alim, arttirilmis alfa- mannosidaz aktivitesi ile analiz edilir.

Güncel olarak tercih edilen bir uygulamada, alfa-mannosidaz BHK, 008 ve CHO hücrelerinden olusan gruptan seçilen bir memeli hücresi sisteminde üretilir. Yöntemin kritik parametrelerinden biri, nihai preparasyonda alfa-mannosidazin glikosilasyon profilidir. Glikosilasyon profili, bunun reseptör aracili endositoz üzerindeki etkileri ve enzimin kan dolasimindan klirensi vasitasiyla enzimin in vivo düzeltici aktivitesinin majör bir belirleyicisidir. Yukarida bahsedilen tercih edilen memeli hücresi sistemleri kullanildiginda, uygun bir glikosilasyon profili olan alfa-mannosidazin üretildigi bulunmustur; özellikle CHO hücrelerinin kullanilmasi, bir yeterli mannoz-ö-fosfat içerigi olan alfa-mannosidazin üretilmesine yol açar. Mevcut basvurunun örneklerinde, alfa- mannosidazin bir MPR 300 kolonunu baglama yetisi, bunun mannoz-ö-fosfat içeriginin bir ölçüsünü saglar. Mannoz-ö-fosfat içeren alfa-mannosidaz, vasat içine salgilanir ve enzimin saflastirilmasi fermentasyon adiminda amonyum tuzlarinin (NH4CI) kullanilmasi ile kolaylastirilabilir.

Güncel olarak, enzimi izole ederken ve saflastirirken hesaba katilmasi gereken, bir faktör izolasyon sirasinda defosforilasyonun meydana gelmesidir. Burada enzim aktivitesinin %40'ina veya daha fazlasina karsilik gelen bir fraksiyonun MRP 300 kolonunu baglayabildigi, insan alfa-mannosidazinin preparasyonu elde edilirken, bu fraksiyon yüzde bir kaç kadar düsük olabilir. Isleme prosesleri sirasinda defosforilasyonu azaltmak için, bir veya birden fazla fosfataz inhibitörünün varliginin elzem oldugu görülür. Bu tarz fosfataz inhibitörlerine, ticari kaynaklardan erisilebilir.

Bulusun önemli bir yönü, alfa-mannosidozun tedavisi amaciyla bir ilacin preparasyonu için bir rekombinant alfa-mannosidazin kullanimi ile ilgilidir. Özel olarak, alfa- mannosidazin bir rekombinant insan alfa-mannosidazi olmasi tercih edilir.

Bulusa ait yöntem için hedef olan hastalik, aIfa-mannosidozdur ve bundan dolayi, katalizör, alfa-mannosidazdir veya bunun bir enzimatik olarak es-deger parçasidir veya analogudur. Enzimin bir natif kaynaktan saflastirilmasi gerekeceginde, rekombinant üretim, mevcut güncel araçlar ile, uygulanabilir görünmeyen büyük-ölçekte üretime olanak saglayacagindan, katalizörün insan aIfa-mannosidaz enziminin veya bunun enzimatik olarak es-deger parçasinin veya analogunun bir rekombinant formu olmasi en çok tercih edilir.

Tercihen, alfa-mannosidaz, rekombinant teknikler ile yapilir. Ilave bir uygulamada, alfa- mannosidoz, insan (hLAMAN'dir) ve matür insan aIfa-mannosidazi (mhLAMAN) veya bunun bir fragmani daha da çok tercih edilir. Fragman modifiye edilebilir, bununla birlikte enzimin aktif yerleri korunmalidir.

Mevcut bulusa göre aIfa-mannosidozun preparasyonlarinda, enzimin bir fraksiyonunun bunun öncül formu ile temsil edilirken, digerfraksiyonlarin yaklasik olarak 55 ve 70 kDa olan proteolitik olarak islenmis formlari temsil etmesi beklenecektir. Genel olarak, hedef hücre, burada enzimatik aktivitenin, örnegin, aIfa-mannosidaz aktivitesinin hücrenin optimal fonksiyonu için yetersiz oldugu, bir hücredir. AIfa-mannosidazin yetersiz aktivitesi, idrarda mannoz açisindan zengin oligosakkaritlerin arttirilmis düzeylerini görüntüleme, bir süjeden elde edilen materyalde, örnegin, lökositlerde ve/veya cilt fibroblastlarinda, aIfa-mannosidaz aktivitesinin analizi, klinik semptomlarin varligi veya alfa-mannosidozun klinik semptomlarinin gelismesinin hizinda artis arasindan seçilen parametrelerin biri veya birden fazlasi ile ölçülebilir.

Yetersiz alfa-mannosidaz aktivitesinin anlamli bir özelligi, burada mannoz açisindan zengin oligosakkaritlerin bir masif intraselüler birikiminin mevcut oldugu bir hücredir.

Dogal olarak, bu tarz hücre, mevcut bulusa göre bir hedef hücredir. Hedef hücre ayrica, sinir sisteminin bir hücresi de olabilir. Buna ek olarak, enzimi aktarmak için hedef hücreler ayrica, insan monositleri, insan fibroblastlari, insan lenfositleri, insan makrofajlari arasindan seçilen bir veya birden fazla hücre tipini de içerir.

Alfa-mannosidazin bir arttirilmis aktivitesi, bir tedavi planlamasinin basarisini degerlendirmek için bir parametre olarak kullanilabilir. Aktivite, idrarda mannoz açisindan zengin oligosakkaritlerin arttirilmis düzeylerini görüntüleme, hastadan elde edilen materyalde, örnegin, Iökositlerde ve/veya cilt fibroblastlarinda, alfa-mannosidaz aktivitesinin analizi, klinik semptomlarin varligi veya alfa-mannosidozun klinik semptomlarinin gelismesinin hizinda artis arasindan seçilen parametrelerin biri veya birden fazlasi ile ölçülebilir.

Bir olasi enzim kusurunun prenatal olarak tedavisini gerçeklestirmek bulusun çok önemli bir yönüdür. Bulusun bir ilave yönünde, hücresel membran, fetal-maternal bariyerdir (plasentadir). Kan berin bariyeri durumunda oldugu gibi, enzimin fetal- maternal bariyerden gerçek aktariminin veya fetal-maternal bariyerin bozulmasinin gereksiz olmasi ve arzu edilmemesi mevcut bulusun önemli bir karakteristigi olabilir.

Mevcut bulusun çesitli yönlerinin ve bu yönlerin spesifik uygulamalarinin yukaridaki açiklamasi bakimindan, bulusun bir yönü ve/veya bir yönünün bir uygulamasi ile baglantili olarak yukarida tarif edilen veya bahsedilen herhangi bir özelligin ve karakteristigin ayrica kiyas yoluyla, tarif edilen bulusun herhangi bir veya tüm diger yönleri ve/veya uygulamalari için de geçerli oldugu anlasilmalidir.

Mevcut basvuruda, mevcut bulusa göre bir obje veya bunun özelliklerinin veya karakteristiklerinin biri tekil hâlde ifade edildiginde, bu ayrica çogul hâldeki objeyi veya bunun özelliklerini veya karakteristiklerini de ifade eder. Bir örnek olarak, "bir hücre" ifade edildiginde, bunun bir veya birden fazla hücreyi ifade ettigi anlasilacaktir.

Mevcut spesifikasyon boyunca "içermek" sözcügünün veya varyasyonlarinin, örnegin, elemanlar, tam sayilar veya adimlar grubunun dâhil edildigini, ancak herhangi bir baska elemanin, tam sayinin veya adimin veya elemanlar, tam sayilar veya adimlar grubunun dislanmadigini gösterdigi anlasilacaktir.

SEKILLERIN AÇIKLAMASI Sekil 1: Bovin, fare ve insan LAMAN'inin polipeptit paterni Bovin böbreginden veya fare veya insan LAMAN'ini asiri-eksprese eden hücrenin salgilarindan saflastirilan LAMAN'in 10 ug'i, SDS-PAGE ile ayrilmistir ve Coomassie Blue ile boyanmistir. Fare ve insan LAMAN'inda görülen 130 kDa'luk polipeptit, öncüllere ve 11 ila 70 kDa araligindaki polipeptitler LAMAN'in proteolitik olarak islenmis formlarina karsilik gelir. Bovin LAMAN'indaki 46-48 kDa'luk polipeptit, kismen islenmis ara-ürünleri temsil eder.

Sekil 2: Karacigerdeki, dalaktaki, böbrekteki ve kalpteki nötral oligosakkaritlerin ince-tabaka kromatografisi.

Dokularin esit miktarlarindan elde edilen nötral oligosakkaritlerin fraksiyonu, ince-tabaka kromatografisi ile ayrilmistir. Sati 1, kontrol farelerinden; sütun 2, sahte-enjekte edilmis LAMAN farelerinden örnekleri; sütun 3, 4 ve 5, vücut agirliginin her bir g'i için 100 mU fare LAMAN'i enjekte edilmis ve sirasiyla 2, 4 ve 10 saat sonra öldürülmüs a-mannosidoz farelerinden örnekleri içerir (bakiniz, ayrica Tablo 1). Oligosakkaritler, orsinoI/sülfürik asit ile saptanmistir. Kütle spektrometrisi ve Hint baklasi d-mannosidazina duyarlilik, M2 ila M9 arasindaki oligosakkaritlerin indirgeme ucunda 2 ila 9 mannoz rezidüsü ve bir tek N- asetilglukozamin rezidüsü içerdigini göstermistir. Oligosakkaritler, dansitometri ile kantifiye edilmistir. Depolamanin hesaplanmasi için, oi-mannosidoz farelerde nötral oligosakkaritler için degerler, kontrol farelerindeki nötral oligosakkaritler için düzeltilmistir ve sahte-enjekte edilmis a-mannosidoz farelerindekinin yüzdesi olarak ifade edilmistir. Kütle spektrometrisi ve Hint baklasi d- mannosidazina duyarlilik, M2 ila M9 arasindaki oligosakkaritler indirgeme ucunda 2 ila 9 mannoz rezidüsü ve bir tek N-asetilglukozamin rezidüsü içerir.

Sekil 3: Vücut agirliginin her bir g'i için 100 mU fare LAMAN'i enjekte edilmis ci- mannosidoz farelerinin doku ekstraktlarindaki nötral oligosakkaritler.

Farelerde enjeksiyondan 4, 8 ve 16 gün sonra öldürülmüstür ve karacigerin, dalagin, böbregin ve kalbin ekstraktlarindaki nötral oligosakkaritler ince tabaka kromatografisi ile ayrilmadan sonra dansitometri ile kantifiye edilmistir (bakiniz, Sekil 2'nin Iejanti).

Sekil 4: Serumdan LAMAN'in klirensi Bovin (i:i), fare (i) veya insan (o) orijinli LAMAN, 50 mU/g vücut agirligi, 8 haftalik oi-mannosidoz farelerinin kuyruk venine enjekte edilmistir. Kan, enjeksiyondan 5 ila 65 dakika sonra retroorbital pleksustan toplanmistir. Her bir deger, iki hayvanin ortalamasini temsil eder. Aralik, çubuklar ile gösterilir, burada bu sembollerin boyutunu asar.

Sekil 5: Bovin, fare ve insan LAMAN'inin nötral oligosakkaritlerin depolanmasi üzerindeki düzeltici etkisi Fareler, doku analizinden 2 gün önce, vücut agirliginin her bir g'i için 50 mU LAMAN almistir (bakiniz, Sekil 3). Nötral oligosakkaritler, Sekiller 2'de ve 3'te oldugu sekilde kantifiye edilmistir. Çubuklar, iki bagimsiz farede gözlenen araligi gösterir.

Sekil 6: Vücut agirliginin her bir g'i için insan oi-mannosidazinin 250 mU'luk bir tek dozunun enjeksiyondan sonra d-mannosidoz farelerinin doku ekstraktlarindaki nötral oligosakkaritler Fareler, enjeksiyondan 1, 3, 6 ve 12 gün sonra öldürülmüstür. Karacigerin, dalagin, böbregin ve kalbin doku ekstraktlarindaki nötral oligosakkaritler, Sekiller 1'de ve 2'de oldugu sekilde ince-tabaka kromatografisi ve dansitometri ile kantifiye edilmistir.

Sekil 7: Karacigerde A, C, E, isik mikroskobu (yari-önce kesitler); B, D, F, Kupffer hücrelerinin ultra-yapisinda depolama kofullarinin kaybolmasi ve yeniden-görülmesi; A, B, sahte-enjekte edilmis o-mannosidoz fareleri (14 haftalik).

Hepatositler, safra kanalikülü boyunca net kofullar gösterir (A, oklar). Agir bir sekilde kofullanmis sinüs duvari hücreleri, (B)'de görüldügü sekilde kofullar arasindaki hayli dar sitoplazma köprülerinden dolayi, isik mikroskobu düzeyinde (A) net bir sekilde ayrit edilmez. C, D, d-mannosidoz faresi, vücut agirliginin her bir g'i için 250 mU insan LAMAN'inin enjeksiyonundan 1 gün sonra. Kofullar, hepatositlerden kaybolmustur. Çok az kofullanmis sinüs duvari hücreleri görülür (C, ok). Kupffer hücrelerindeki kofullar, sahte-muamele edilmis hayvandakine kiyasla daha küçüktür ve bir elektron-yogun matriks içerebilir (D). E, F, 0- mannosidoz faresi, vücut agirliginin her bir g'i için 250 mU insan LAMAN'inin enjeksiyonundan 12 gün sonra. Kofullar, sinüs duvari hücrelerinde yeniden görülmüstür (E, oklar) ve hepatositlerde olandan daha azdir. Kupffer hücrelerinde (F) kofullar sahte-enjekte edilmis farelerdekine kalitatif olarak benzer. A'da, C'de ve E'de gösterilen hepatositlerdeki yogun kalintilar, karsilik gelen dogal tip farelerde (gösterilmemistir) esit sekilde karsilasilan Iipit damlaciklarini temsil eder. Çubuklar, sirasiyla 20 pm'yi ve 2 um'yi temsil eder.

Sekil 8: Vücut agirliginin her bir g'i için 250 mU insan LAMAN'i iki kere enjekte edilmis d-mannosidoz farelerinin doku ekstraktlarindaki nötral oligosakkaritler Kontrol (sütun 1) ve d-mannosidoz farelerine (sütun 2 ve 3), analizden 7 ve 3,5 gün önce PBS (sütun 1 ve 2) veya vücut agirliginin her bir g'i için 250 mU insan LAMAN'i (sütun 3) enjekte edilmistir. Nötral oligosakkaritler hazirlanmistir ve Sekil 1'de ve 2'de oldugu sekilde kantifiye edilmistir. 2 ila 9 mannoz rezidüsünden ve bir tek N-asetilglukozamin rezidüsünden olusan oligosakkaritlerin (M2 ila M9) göçü gösterilir. Oklar, LAMAN'a duyarsiz olan orsinoI-pozitif materyali isaretler. Farelerin bir iki kopya-hâlindeki setindeki sonuçlar (gösterilmemistir), %15'ten daha az çesitlilik göstermistir.

Sekil 9: d-mannosidoz farelerinde böbregin isik mikroskobu d-Mannosidoz farelerine, öldürülmeden 7 ve veya vücut agirliginin her bir g'i için enjekte edilmistir. Dis medullanin dis seridi gösterilir. Çok sayida net koful, LAMAN ile muamele edilmis fareye (B) kiyasla sahte-enfekte edilmis farenin (A, oklar) Henle kulbunun kalin asendan kolunda (TAL) görülür. Proksimal düz tübüller (PST), her iki hayvanda da patolojik kofullardan yoksundur. Çubuklar, 20 pm'yi temsil Sekil 10: Beyinden elde edilen 2-antranilamid türevlendirilmis nötral oligosakkaritlerin HPLC ile ayrilmasi Öldürülmeden 7 ve veya vücut agirliginin her bir g'i için enjekte edilmis oi-mannosidoz farelerinin beyninden elde edilen nötral oligosakkaritler, bir iç standart olarak 220 pmol GIcNAC4Man3GaI3 ile karistirilmistir, 2-antranilamid ile türevlendirilmistir ve HPLC ile ayrilmistir. Iç standardin ve 2 ila 9 mannoz rezidüsünden ve bir tek N-asetilglukozamin rezidüsünden olusan oligosakkaritlerin (M2 ila M9) pozisyonu gösterilir. ÖRNEKLER Örnek 1: LAMAN'in üretilmesi ve karakterizasyonu Deneysel prosedürler CHO hücrelerinde rekombinant insan LAMAN'inin ekspresyonu ve saflastirilmasi HepG2 CDNA kütüphanesinden izole edilmis ve insan CMV-promotörü kontrolü altinda bir dihidrofolat redüktaz geni ve LAMAN cDNA'si tasiyan bir ekspresyon vektörüne alt- klonlanmis insan LAMAN cDNA'si, dihidrofolat redüktazdan yoksun olan Çin Hamsteri Over (CHO) hücrelerinde eksprese edilmistir. CHO hücreleri, 20 nM metotreksat ile takviye edilmis serumsuz ExCeII içinde bir iki- kompartimanli CELLine flask (Integra Biosciences Inc.) içinde %5 002 içeren bir nemlendirilmis atmosferde 37°C'de kültürlenmistir. Vasat, 4 hacim 0,02 M Tris-HCI'ye, pH 7,6, karsi bir 100 kDa'luk kesim degeri ile bir Pellicon Biomax polisülfon filtre kullanilarak diyafiltre edilmistir. iyon-degisim kromatografisi, 0,02 M Tris-HCI, pH 7,6, içinde bir NaCI gradyani kullanilarak DEAE-Sepharose FF (Amersham Pharmacia Biotech AB) üzerinde gerçeklestirilmistir. Aktif fraksiyonlar, bir 30 kDa'luk kesim degeri ile bir Amicon Centricon Plus-80 sentrifügasyon filtresi kullanilarak konsantre edilmistir Resolution kolon (Amersham Pharmacia Biotech AB) içinde jel filtrasyonuna tabi tutulmustur. Konsantrasyondan sonra, nihai preparasyon, 9/15 U/mg'lik bir spesifik aktiviteye sahiptir.

Rekombinant fare LAMAN'inin ekspresyonu ve saflastirilmasi Fare LAMAN'ini sifreleyen cDNA (16), pMPSVEH ekspresyon vektörüne alt- klonlanmistir (17). Bir polihistidin kuyrugu (6 rezidü), enzimin C-ucu parçasina eklenmistir. Küçük ve büyük mannoz ö-fosfat reseptörleri açisindan kusurlu olan fare embriyonik fibroblastlari (mpr-/- MEF) (18) transfekte edilmistir ve kalici bir sekilde eksprese eden klonlar, 50 uI/ml higromisin ile seçilmistir. Rekombinant fare LAMAN'inin üretilmesi için, hücreler, %10 FCS ile takviye edilmis vasat içinde %5 C02 içeren bir nemlendirilmis atmosfer içinde kültürlenmistir. Salgilanmis rekombinant fare LAMAN'i, sartlandirilmis vasattan bir üç adimli prosedür kullanilarak saflastirilmistir.

Birinci adimda, vasat, 500 mM sodyum klorür içeren 20 mM sodyum fosfat tamponuna, pH 7,8, karsi diyalize edilmistir ve akabinde bir Probond kolona (lnvitrogen) yüklenmistir. Alikonulmus enzim, 500 mM sodyum klorür içeren 20 mM sodyum fosfat tamponu, pH 6,0, içinde bir 0 ila 0,35 M araliginda imidazol gradyani (toplam hacim 80 ml) ile ayristirilmistir. Fraksiyonlar içeren LAMAN, 10 mM sodyum fosfata, pH 6,0, karsi diyalize edilmistir ve bir DEAE-selüloza yüklenmistir. Enzim, 10 mM sodyum fosfat tamponu içinde bir 0 ila 0,25 M araliginda sodyum klorür gradyani (toplam hacim 80 ml) içinde ayristirilmistir. Son olarak, fare LAMAN'i, ConA-Sepharose'a (1 mM MgCIz, 1mM MnCIz, 1 mM CaCl2 ve 0,5 M NaCI içeren yükleme tamponu 20 mM Tris-HCI, pH 7,4) adsorbe edilmistir ve ayni tampon içinde d-mannopiranosit (0,0-1,0 M) ile ayristirilmistir. Nihai preparasyon, 17/25 U/mg olan bir spesifik aktiviteye sahiptir.

Bovin LAMAN'inin saflastirilmasi Bovin LAMAN'i, tarif edildigi sekilde (19) böbrekten saflastirilmistir. Nihai preparasyon, U/mg olan bir spesifik aktiviteye sahiptir.

Insan LAMAN'inin saflastirilmasi LAMAN, %5 C02 içeren bir nemlendirilmis atmosfer içinde 37°C'de bir iki- kompartimanli CELLine flask içinde kültürlenmistir. CHO-hücrelerinden elde edilen enzim, 4 adimdan olusan bir saflastirma prosedürüne göre saflastirilmistir: Diyafiltrasyon Diyafiltrasyon, bir 100 kDa'Iuk kesim degeri olan bir Pellicon Biomax polisülfon filtre kullanilan TFF modeline göre yapilmistir. Örnek, 0,02 M Tris-HCI, pH 7,6, ile yaklasik olarak 3 x örnek hacmine karsi diyafiltre edilmistir.

Iyon degisim kromatografisi Iyon degisim kromatografisi, DEAE Sepharose akis filtrasyonu kullanilarak gerçeklestirilmistir. Tampon, 0,02 M Tris-HCl'dir, pH 7,6. Jel, Amersham Pharmacia Biotech AB firmasindan bir XK 16/20 kolon içine dolgulanmistir. Ayristirma, NaCl'nin bir gradyani ile gerçeklestirilmistir. Örnegin konsantrasyonu Jel filtrasyonundan önce, örnek, ~6 mg/mL olan bir protein konsantrasyonuna ve 10 mL'Iik bir nihai hacme konsantre edilmistir. Bu, bir 30 kDa'Iuk kesim degeri olan bir Amicon Centricon Plus-80 sentrifügasyon filtresi kullanilarak yapilmistir.

Jel filtrasyonu Jel filtrasyonu, Amersham Pharmacia Biotech AB firmasindan bir HiPrep 26/60 Sephacryl High Resolution kolonunda yürütülmüstür. Örnek, 0,15 M NaCI, pH 7,6, ile takviye edilmis 0,02 M Tris-HCI ile ayristirilmistir.

Bir LAMAN saflastirmasinin örnegi, asagidaki tabloda özetlenir. Normal olarak, Verim, LAMAN saflastirilmasinin özeti Saflastirma Protein Spesifik Saflastirma Verim adimi konsantrasyonu aktivite faktörü (%) Saflastirma Protein Spesifik Saflastirma Verim adimi konsantrasyonu aktivite faktörü (%) Saflastirilmis LAMAN, -80°C'de saklanir.

Buna ek olarak, 20-200 ml'lik ölçekte thAMAN için bir saflastirma prosesi, büyük ölçekte üretime ölçek-büyütmek için gelistirilir. Nihai ürünün (thAMAN) kalitesi ve safligi, çok yüksektir ve (klinik çalismalar için onaylanmis) spesifikasyonlara göredir.

Proses, bir yakalama adimi, 1-2 ara saflastirma adimi, 1 parlatma adimi, 1-2 virüs uzaklastirma adimi ve 1 formülasyon adimi içerir. 1 veya daha fazla tampon degistirme adimi da dâhil edilir (diyafiltrasyon). Küçük-ölçekli proses, ara ve nihai olarak büyük- ölçekte üretime transfer edilir.

Deneysel tasarim: Bir kaç farkli kromatografi jeli test edilir ve farkli adimlarin performansi, asagida kisaca tarif edilen bir dizi analitik yöntem ile analiz edilecektir: Enzim aktivitesi: AIfa-mannosidaz analizi Toplam protein konsantrasyonu: BCA analizi thAMAN konsantrasyonu: thAMAN ELISA m: HPLC ve SDS-PAGE HCP proteinleri: ELISA Endotoksin düzeyi: Sözlesme Lab'i disindan destek alinir mI'Iik kolon ölgeginde saflastirma prosesinin genel hai_üariyla özeti Eksprese edilmis thAMAN ile T-500'lük flasklar (0,06 U/ml) içinde üretilen vasatlar, 100 kDa'Iuk kesim degeri olan bir Pellicon Biomax polisülfon filtresine karsi Tegetsel akis filtrasyonu (TFF) kullanilarak yaklasik olarak 10x'e konsantre edilir. filtreye karsi TFF kullanilarak 50 - 100 ml'ye konsantre edilir. Transmembran basinci (TMP), 25'dir (Pin = 30 psi; Pout = 20 psi).

Bundan sonra, 25'lik TMF ile 7 hacim 20 mM Tris-HCI'ye, pH 7,6, karsi diyafiltrasyon uygulanir. Konsantre edilmis örnegin spesifik aktivitesi, 0,5 - 1,5 U/mg'dir. Verim, %70 - 90'dir.

Adim 2: Yakalama adimi - DEAD sefaroz FF Adim 1'den konsantre edilmis örnek, 20 mM Tris-HCl pH 7,6, (standart tampon olarak ifade edilir) ile dengelenmis bir 16 mm çapli kolon (Pharmacia XK 16) içine dolgulanmis bir 20 ml DEAE sefaroza uygulanir. Akis hizi, 3 ml/ dakika 'dir. DEAE jeline baglanmis protein sonrasinda, standart tamponun 2-4 kolon hacmi (CV) akabinde standart tampon içinde 30 mM NaCI'Iik 2-4 CV ile yikanir. thAMAN, 20 dakika boyunca standart tampon içinde 30 - 300 mM NaCI araliginda bir lineer gradyan ile ayristirilir. Büyük ölçekte üretim için alternatif olarak: Ayristirma, standart tampon içinde 75 - 150 mM NaCI uygulama ile basarilir. DEAE jeli, standart tampon içinde 0,5 M NaCI'nin 2-4 CV'si akabinde 1,0 M NaOH'in 2,4 CV'si (temas süresi 40 - 60 dakika) ile yikanir. thAMAN aktivitesi içeren fraksiyonlar, havuzlanir (spesifik aktivite: 2 - 5 U/mg) ve ilave saflastirma için kullanilir. Verim, %70 - 90.

Adim 3: Ara adim 1 1. Hidrofobik etkilesim kromatografisi'.' bütil, fen/I veya oktil sefaroz FF. Adim 2'den elde edilen örnek havuzu 2,0 M Na2804 ile 111 karistirilir ve standart tampon + dolgulanmis bir 20 ml HIC kolonuna (bütiI-, fenil- veya oktiI-sefaroz) uygulanir.

Akis hizi, 3-4 ml/ dakika 'dir. Kolon, ayni tamponun 2-4 CV'si ile yikanir. thAMAN, standart tampon ile ayristirilir ve aktivite içeren fraksiyonlar havuzlanir ve ilave saflastirma için kullanilir. 2. Makroprep, Seramik hidroksi'apatit tip 1 veya II. Özet açiklama: 10 mM Sodyum fosfatin, pH 7,6, (Tampon A) 4-6 CV'si ile Denge kolonu (Jel hacmi = 20 ml). Akis hizi, 2-5 ml/ dakika 'dir. Adim 3'ten elde edilen örnegin TFF ile Tampon A'ya tamponu degistirilir. Adim 3'ten elde edilen elde edilen örnek, kolona yüklenir. Tampon A'nin 2-4 CV'si ile yikanir. 100 mM NaCI içeren tampon A ile ayristirilir. thAMAn aktivitesi içeren pik toplanir.

Adim 4: Ara adim 2 1. Makro prep, Seramik hidroksiapatit tip 1 veya II, 40 pm. 2. Source 15 O - anyon-degi'stirici' 200 mM Tris-HCI'nin, pH 7,6, 4 CV'si ile kolon dengelenir. 20 mM Tris-HCI'nin, pH 7,6, (standart tampon) 5 CV'sine degistirilir. Akis hizi: 2 - 5 ml/ dakika . Adim 3'ten elde edilen örnek (uygulamadan önce standart tampon içinde olmalidir) kolona yüklenir. Standart tamponun 2-4 CV'si ile yikanir. Standart tampon içinde 1 M NaCI'nin %0 ila 100 araligindaki bir sig gradyani (akis hizi 2 ml/ dakika, gradyan süresi 50 dakika) uygulanir. thAMAn aktivitesi içeren fraksiyonlar toplanir. 3. Source 15 S - katyon degistir/'ci Asidik pH içinde yürütülmelidir. Denge tamponu = 20 mM Sodyum Asetat, pH 4,5.

Bir NaCI (artan tuz konsantrasyonu) veya pH (artan pH) gradyani ile ayristirilir.

Adim 5: Parlatma adimi 1. Makro prep, Seramik hidroksi'apatit tip II, 40 pm.

Parametrelerin açiklamasi: bakiniz, Adim 3. 2. Source 15 Q - anyon degistir/'ci` Parametrelerin açiklamasi: bakiniz, Adim 4. 3. Source 15 S - katyon degistirici Parametrelerin açiklamasi: bakiniz, Adim 4. 4. Afini'te kromatografisi Adim 6: Divafiltrasvon/ Formülasvon adimi Formülasyon adiminin 5-10 x Hacme karsi 100 kDa'Iuk kesim degeri olan bir Pellicon Biomax polisülfon filtreye karsi Tegetsel akis filtrasyonu (TFF) gerçeklestirilir. Iki formülasyon tamponu test edilir: Formülasyon tamponu 1.

Na2HP04 3,10-3,50 mM NaH2PO4 0,4-0,6 mM Glisin 25-30 mM Mannitol 220-250 mM Enjeksiyonluk su (WFI) Formülasyon tamponu 2.

Sodyum Sitrat 4,0-5,0 mM Sitrik Asit O,3-0,8 mM Mannitol 200-250 mM Tween 80 3,0-5,0 mM Enjeksiyonluk su (WFI) Her iki Formülasyon tamponunda pH ve ozmolalite sirasiyla, 7,5 ± 0.2'ye ve 300 ± 50 mOsm/kg'a dengelenir. Nihai protein konsantrasyonu, spesifikasyona göredir (>5 Adim 7: Formülasyon, Doldurma ve Dondurarak-kurutma Formülasyon ve dozaj formu Dozaj formunun gelistirilmesinde, thAMAN'in kararliligina odaklanilir. Gelistirme prosesi, bir sulu çözelti ile baslar ve büyük olasilikla bir dondurarak-kurutulmus ürün olarak sonlanacaktir. Iki farkli formülasyon test edilir: Formülasyon tamponu 1 ve Formülasyon tamponu 6, bakiniz, Adim 6.

Bu her iki formülasyonun, sulu çözeltiler içinde ayni zamanda dondurarak-kurutulmus tozlar içinde proteinleri stabilize ettigi bilinir. Her iki Formülasyon tamponunda pH ve ozmolalite sirasiyla, 7,5 ± 0,2'ye ve 300 ± 50 mOsm/kg'a dengelenecektir. Nihai protein konsantrasyonu, spesifikasyona göre ve 4-10 mg/ml araliginda olmalidir. thAMAN'in bir dondurarak-kurutulmus ürünü, EU GMP uygulamasina göre bir üretim biriminde üretilecektir. Doldurma ve dondurarak-kurutma, Sinif A olarak siniflandirilmis bir odada gerçeklestirilecektir. Üretim sirasinda, doldurma alani, parçacik sayimi ve çökelme plakasi ile izlenir. Personel, EU GMP'ye göre düzenli olarak egitilir ve eldiven izleri ile her bir üretimden sonra izlenir. Ekipmanin ve materyallerin sterilitesi, valide edilmis sterilizasyon prosedürleri ile güvence altina alinir.

Doldurma thAMAN'in yigin ilaç maddesi, steril tip 1 cam viyallere aseptik olarak doldurulur.

Dondurarak-kurutma Viyaller, yukarida tarif edilen iki farkli formülasyon içinde thAMAN için spesifik olarak gelistirilmis dondurarak-kurutma sikluslari ile dondurarak-kurutulur. Nitrojen gazi, siklus sonunda viyallere doldurulur ve nihayetinde tapalar ile kapatilir ve baslik takilir. Seri son olarak analiz edilir ve spesifikasyona göre piyasaya sürülür.

LAMAN fosforilasyonunun belirlenmesi LAMAN, tarif edildigi üzere (20) bir MPR 300 afinite matriksi ile gece boyu inkübe edilmistir. LAMAN aktivitesi, bagli olmayan fraksiyonda belirlenmistir ve fraksiyonlar, 5 mM glikoz 6-fosfat ve 5 mM mannoz 6-f0sfat ile ayristirilmistir.

Sonuçlar Üç farkli türden saflastirilan LAMAN, d-mannosidoz farelerde enzim replasmani için kullanilmistir (Sekil 1). Bovin böbreginden elde edilen LAMAN, bir ortak öncülden sinirlandirilmis proteoliz ile üretilen polipeptitlerin ( bir karisimi ile temsil edilir (19). Dokudan saflastirilmis ve böylece endozomaI/lizozomal fosfataz aktivitesine maruz birakilmakta olan bir Iizozomal hidrolaz için beklenildigi üzere, enzim bir düsük ManöP-tanima belirteci içerigine sahiptir. Bir ManöP-reseptörü afinite matriksi ile inkübe edildiginde, LAMAN aktivitesinin %6,4'ü, bir ManöP-bagimli sekilde matrikse baglanmistir.

Rekombinant fare ve insan LAMAN'i sirasiyla, ManöP-reseptörü kusurlu fare fibroblastlarinin ve CHO hücrelerinin salgilarindan izole edilmistir. Enzimler büyük ölçüde, bunlarin öncül formlari ile temsil edilmistir, ancak 55 ve 70 kDa'Iuk proteolitik olarak islenmis formlarin bir degisken fraksiyonunu (%5-35) içermistir (Sekil 1). Fare LAMAN'i, aktivitenin %73,6'sinin afinite matriksini baglamasina aracilik eden daha yüksek bir ManGP-tanima belirteci içerigine sahiptir. Insan LAMAN'inin yalnizca %4,2'si bir ManöP-bagimli sekilde ManGP-reseptörü afinite matriksini baglamistir, bu ManGP- tanima belirtecinin bovin LAMAN'i için oldugu kadar düsük oldugunu gösterir.

Bir kaç seri, örnegin, asagidakiler, bunu takiben analiz edilmistir: Genel olarak, enzimin miktarinin yaklasik olarak %40'i, afinite matriksini baglar. Insan ve bovin LAMAN'i için gözlenen düsük fosforilasyon derecesinin enzimlerin uzatilmis depolanmasindan kaynaklandigina inanilir. Örnek 2: LAMAN'in in vivo uygulanmasinin depolanmis oligosakkaritlerin düzeyleri üzerindeki etkileri Deneysel prosedürler Farelerin enjeksiyonu LAMAN, 8-14 haftalik d-mannosidoz farelerinin kuyruk venine enjekte edilmistir (nihai hacim en fazla içinde ayni hacimde 10 mM fosfat, pH 7,4, almistir. Bir tek deneyde, en fazla üç yavrudan köken alan fareler, yas açisindan farkli degildir. Enjeksiyondan 5 dakika sonra, kan, enjekte edilmis enzimin miktari için kontrol etmek için retroorbital pleksustan alinmistir. Serum hazirlanmistir ve -20°C'de saklanmistir.

Organ ekstraktlarinin preparasyonu Farelere, 0,15 M NaCl içinde bir 10 mg/ml Ketavet (Parke Davis) ve 2 mglml Rompun (Bayer) çözeltisinin 20 pl'si ile anestezi uygulanmistir ve fareler PBS ile perfüze edilmistir. Organlar (karaciger, dalak, böbrek, kalp ve beyin) alinmistir ve -78°C'de saklanmistir. Her bir organin yaklasik 50-70 mg'i, (agirlik olarak) 9 hacim 10 mM Tris/HCI, , 1 mM iyodoasetamid, 5 mM EDTA içinde 4°C'de homojenize edilmistir. Triton X-100, ag/hacim %0,5 (karaciger için inkübasyondan sonra, örnekler sonike edilmistir ve akabinde 13000 g'de 15 dakika boyunca sentrifüj edilmistir. Süpernatant, -20°C'de saklanmistir.

Enzim analizleri Organ ekstraktlarinda ve serumda LAMAN aktivitesinin belirlenmesi için, enzim mannopiranosit içinde inkübe edilmistir. 1 ml 0,4 M glisin/NaOH, pH 10,4, reaksiyonu Tüm belirlemeler iki kopya hâlinde ve uygun kör-çözeltiler ile yapilmistir.

Western blotlama Insan LAMAN'inin Western blotlanmasi için, proteinin 20-40 ug'i, bir %10'luk SDS- poliakrilamid jel üzerinde ayrilmistir. SDS-PAGE elektroforezinden sonra, proteinler bir yari-kuru blotlama sistemi kullanilarak PVDF membranlarina transfer edilmistir.

Transfer etkililigi, Ponceau boyama ile kontrol edilmistir. Membranlar bunu takiben, içinde primer antikor ile inkübe edilmistir. PBS, %0,1 Tween 20, içinde yikandiktan sonra, blotlar sekonder antikorlara kuple edilmis yaban turpu peroksidazi (HRP) (1 :20.000) ile inkübe edilmistir. Sinyaller, ECL-Detection System (Amersham, Freiburg, Germany) kullanilarak görsellestirilmistir.

Nötral oligosakkarit/erin izolasyonu Doku örnekleri (50-60 mg), küçük parçalara kesilmistir ve 4°C'de 0,6 ml H2O (HPLC derecesinde) ile homojenize edilmistir. Iki here dondurmadan (-20°C) ve çözülmeden ve ultrasonik muameleden sonra, proteinler 4 hacim metanol eklenmesi ile çökeltilmistir ve 4 hacim kloroform/H20 (1:3) eklenmesi ile ekstrakte edilmistir (21). Süpernatant, inkübasyon ile tuzundan arindirilmistir. Baglanmamis materyal Iiyofilize edilmistir ve su (dokunun her bir mg'i için 1 ml) içinde yeniden-süspanse edilmistir.

Mannoz oligosakkaritlerinin ince tabaka kromatografisi (TLC) ile ayrilmasi Dokunun esit alikotlarindan ekstrakte edilen nötral oligosakkaritler. TLC plakalarina (20x20 Silica gel F60, Merck) yüklenmistir. Plakalar oda sicakliginda ~1 saat kurutulduktan sonra, oligosakkaritler n-bütanol/ asetik asit/ H20 (100:50:50) ile gece boyu gelistirme ile ayrilmistir. (Oda sicakliginda ~1 saat ve akabinde 110°C'de 5 dakika) kurutulduktan sonra, plakalar n-propanol/ nitrometan/ HzO (100:80:60) içinde 4 saat boyunca gelistirilmistir. Boyama için, plakalara H2804 (su içinde %20) içinde %02 orsinol püskürtülmüstür ve plakalar 110°C'de isitilmistir. Oigosakkaritlerin boyutu, MALDI-TOF ile belirlenmistir (asagiya bakiniz).

Karaciger oligosakkaritlerinin a-glukosidaz veya Hint bak/asi a-mannosidazi ile sindirilmesi Glikojen kaynakli oligosakkaritler ile girisimden kaçinmak için, karacigerden ve kalpten elde edilen oligosakkarit ekstraktlarinin 20 ul'si, 20 mM fosfat, pH 6,8, içinde Bacillus stearothermophilus'tan (Sigma) elde edilen 40 U/ml d-glukosidaz ile 37°C'de gece boyu inkübe edilmistir. Inkübasyon karisimi, proteinleri denatüre etmek için 96°C'ye isitilmistir. 13000 g'de 10 dakika Sentrifügasyondan sonra, süpernatant bir iyon- arindirilmistir, Iiyofilize edilmistir ve 20 ul su içinde yeniden-süspanse edilmistir ve akabinde TLC ile ayrilmistir.

Oligosakkaritlerin dogasini dogrulamak için, oligosakkarit ekstraktlarinin 20 ul'si 2 mM ZnCI2 içeren 0,1 M sodyum asetat, pH 5,0, içinde Hint baklasindan elde edilen 30 U/ml a-mannosidaz (Sigma) ile 37°C'de gece boyu inkübe edilmistir. Inkübasyondan sonra, Oligosakkaritler, d-glukosidaz ile sindirilmis örnekler için tarif edildigi sekilde hazirlanmistir ve TLC ile ayrilmistir.

Organlardaki nötral oligosakkaritlerin kantitatif analizi Oligosakkaritler (0,3 pl), bir iç standart görevi gören ve GICNAC4Man3GaI3 bilesimine sahip olan 220 pmol bir dekasakkarit ile karistirilmistir. Karisim Iiyofilize edilmistir ve 0,34 M 2-antranilamid (Aldrich) ve 1 M NaBH3CN (Fluka) içeren 5 pl bir DMSO/ asetik asit (7:3) içinde yeniden-süspanse edilmistir. 65°C'de 2 saat inkübasyondan sonra, örnekler (etil asetat ile gelistirilen) kâgit kromatografisi ile saflastirilmistir. Baslangiç noktasinda lokalize olmus oligosakkaritler, kâgidi su içinde sonike etme ile ekstrakte edilmistir, Iiyofilize edilmistir, 300 pl asetonitril/ 80 mM amonyum format, pH 4,4, (65:35) içinde yeniden-süspanse edilmistir, bir GIuco-Sepharose kolonuna (Ludger) yüklenmistir ve asetonitril/ amonyum format tamponu ile 0,4 ml/ dakika olan bir akis hizinda ayristirilmistir. Flüoresans (eksitasyon 350 nm, emisyon450 nm) kaydedilmistir (Shimadzu, RF-10A XL) ve oligosakkaritlerin kütlesi MALDI-TIF ile belirlenmistir.

MALDI- TOF HPLC fraksiyonlarindan elde edilen örnekler Iiyofilize edilmistir ve 2-3 ul su içinde çözünmüstür. TLC plakalarindan su ekstraktlari 1-feniI-3-metiI-5-pirazolon ile türevlendirilmistir ve 2-3 ul su içinde çözünmüstür. 2,5-dihidroksibenzoik asit (DHB, su içinde 5 mg/ml) matriks olarak kullanilmistir. 0,5 ul DHB ve 1 ul örnek Anchorchip hedefi (Bruker Daltonik) üzerine noktalanmistir ve oda sicakliginda kurutulmustur.

Kütle spektrometrik analiz, bir 337 nm'lik UV lazeri ile bir Reflex III MALDI-TOF (Bruker Daltonik) cihazinda gerçeklestirilmistir.

Histolojik incelemeler Elektron mikroskobu için, öldürme zamaninda toplanan karacigerin ve dalagin küçük kesitleri 0,1 M fosfat, %6 gluteraldehit, pH 7,4, içine daldirilmistir. Doku örnekleri, %2 osmiyum tetroksit ile post-fikse edilmistir, dehidrate edilmistir ve Araldite içine gömülmüstür. Yari-ince kesitler, toluidin mavisi ile boyanmistir. Ultra-ince kesitler, standart tekniklere göre islenmistir. Histokimyasal arastirmalar için, kesitler, 10 mM fosfat, pH 7,4, 0,15 M NaCI içinde seyreltilmis Bouin çözeltisine daldirilmistir. Gömme, düsük erime noktali parafin (Wolff, Wetzlar, Germany) içine yapilmistir. Seri kesitler (7 um) kesilmistir ve Biobond (British Biocell, London, UK) ile kaplanmis cam Iamlar üzerine yerlestirilmistir. Her bir serinin merkezi kesitleri standart isik mikroskobu için hematoksilin ve eosin ile boyanmistir.

Sonuçlar Fare LAMAN'inin bir tek intravenöz enjeksiyonunun düzeltici etkisi LAMAN'in bir tek dozunun nötral oligosakkaritlerin saklanmasi üzerindeki kisa ve uzun süreli etkisini çalismak için, 9 haftalik d-mannosidoz fareleri intravenöz olarak, vücut agirliginin her bir g'i için 100 mU fare LAMAN'i almistir. Enjekte edilmis enzimin miktari ve bunun dolasimdan klirensi için kontrol etmek için, kan enjeksiyondan 5, 30 ve 60 dakika sonra alinmistir. Enjeksiyondan 5 dakika sonra, LAMAN aktivitesi ± %G'dan daha az çesitlilik göstermistir, bu farelerin karsilastirilabilir miktarlarda enzim almis oldugunu gösterir. Enzim, 20 dakika 'dan daha az olan bir yari ömür ile dolasimdan temizlenmistir. Fareler enjeksiyondan 2, 4 ve 10 saat sonra öldürülmüstür ve organ ekstraktlari, LAMAN aktivitesinin ve nötral oligosakkaritlerin belirlenmesi için hazirlanmistir. Organlarda LAMAN'in maksimum aktivitesi, enjeksiyondan 2-4 saat sonra gözlenmistir (Tablo 1). Karacigerde, aktivite kontrol farelerinde olana kiyasla 6-7 kat daha yüksektir, ancak ayrica dalakta ve kalpte de maksimum degerler kontrollerinkileri asmistir. Böbrekte, maksimum, kontrol farelerindeki aktivitenin dörtte birine ulasilmistir. Beyinde görülen küçük aktivite büyük olasilikla, vasküler sistemde bulunan LAMAN'dan kaynaklanir. Enjeksiyondan 4 ve 10 saat sonra araliginda, enzim aktivitesi karaciger, dalakta ve böbrekte yaklasik 3 saat olan bir görünür yari ömür ile çabucak düsmüstür. Western blot, LAMAN'in içsellestirilmis öncülünün matür formlara (gösterilmemistir) çabucak islendigini göstermistir. ci-mannosidozun özelligi, çok çesitli dokularda nötral oligosakkaritlerin depolanmasidir (bakiniz, Sekil 2, sütun 1 ve 2). Bu oligosakkaritler, bunlarin indirgeme ucunda 2-9 mannoz rezidüsü ve bir N-asetilglukozamin rezidüsü içerir ve bundan dolayi, bir endoglukozaminidazindan etkisinden kaynaklanir. Karacigerde ve dalakta nötral oligosakkaritlerin miktari zamanla progresif olarak, sahte-enjekte edilmis hayvanlarda olanin %15'ine ve %7'sine düsmüsken, böbrekte ve kalpte depolama yalnizca yaklasik TABLO 1: Vücut agirliginin her bir g'i için 100 mU fare LAMAN'i enjeksiyonundan önce ve sonra kontrol ve d-mannosidoz farelerinin doku ekstraktlarinda LAMAN aktivitesi. *+/+, kontrol farelerini, -/-, oi-mannosidoz fareleri ve ri, arastirilan hayvanlarin sayisini ifade eder. +Tüm degerler, tsmr'da ( serumda ortalama 0(- mannosidaz aktivitesi için düzeltilmistir. Düzeltme faktörleri, 2, 4 ve 10 saat için sirasiyla, 0,98'dir, 1,07'dir ve 0,96'dir.

Enjekte LAMAN (mU/g islak agirlik) edilmis Genotip LAMAN ( 1 OOmU lg Karaciger Dalak Bobrek Kalp Beyin vücut agirligi) (21) (10) (3) (3) LAMAN'in bir tek dozunun düzeltici etkisinin ne kadar sürdügünü belirlemek için, fareler vücut agirliginin her bir g'i için 100 mU fare LAMAN'inin enjeksiyonundan 4, 8 ve 16 gün sonra incelenmistir. Tüm zaman noktalarinda, organlardaki (dalak, böbrek, kalp, beyin) LAMAN aktivitesi, burada enjeksiyondan 4 gün sonra LAMAN aktivitesinin ( sahte-enjekte edilmis farelerde olana kiyasla hâlâ yaklasik 5-kat daha yüksek oldugu karaciger disinda, muamele edilmemis veya sahte-enjekte edilmis oi-mannosidoz fareleri araligi içindedir. Karacigerde, dalakta ve böbrekte enjeksiyondan 4 gün sonra nötral oligosakkaritlerin depolanmasi enjeksiyondan 10 saat sonra görülen aralik içindedir (Sekil 2'yi ve Sekil 3'ü karsilastirin). Kalpte, depolama, 10 saat sonra kalpte, enjeksiyondan 10 saat sonra çok az LAMAN aktivitesinin saptanabildigi veya hiç LAMAN aktivitesinin saptanamadigi gerçegine ragmen, 10 saat sonra görülen düzeltici etkinin yaklasik 4 gün boyunca sürdügünü gösterir. 4 gün sonra, oligosakkaritlerin depolanmasi yeniden net bir sekilde yükselmeye baslamistir. Enjeksiyondan sonraki gün 4 ila gün 16 arasinda gözlenen artis, sahte-enjekte edilmis oi-mannosidoz farelerinde görülen depolamanin %20-40'ina karsilik gelir (Sekil 3).

Bovin, fare ve insan LAMAN'inin klirensinin ve düzeltici etkisinin karsilastirilmasi Üç kaynaktan LAMAN preparasyonlarinin düzeltici etkisini karsilastirmak için, farelere, LAMAN'in bir parsiyel düzelme saglamasi beklenen bir dozu enjekte edilmistir.

Böylelikle, vücut agirliginin her bir g'i için 50 mU LAMAN enjekte ettik. Bovin ve insan LAMAN'i sirasiyla 4 dakika ve 8 dakika olan yari ömürler ile dolasimdan çabucak temizlenmistir (Sekil 4). Hayli fosforile edilmis fare LAMAN'inin klirensi daha yavastir ve en azindan bifaziktir. Enzimin yaklasik %85'i, 12 dakika olan bir görünür yari ömür ile temizlenirken, kalan fraksiyonun görünür klirensi yaklasik 47 dakika 'dir (Sekil 4).

Fareler, enjeksiyondan 2 gün sonra öldürülmüstür ve karacigerden, dalaktan, böbrekten ve kalpten elde edilen ekstraktlar nötral oligosakkaritler için incelenmistir (Sekil 5). Karaciger disinda, düzeltici etki insan LAMAN'i için en yüksektir ve bovin LAMAN'i için en düsüktür. Fare enziminin düzeltici etkisi aradadir. Yalnizca karacigerde, bovin enziminin düzeltici etkisi (kalan depolamanin %4'ü) insan enziminkine (kalan depolamanin %14'ü) kiyasla daha çok belirgindir. Karacigerde, insan LAMAN'inin düzeltici etkisi, en zayiftir (kalan depolamanin %23'ü).

Yüksek dozda insan LAMAN'inin düzeltici etkisi Bovin, fare ve insan LAMAN'inin karsilastirmasi, zayif bir sekilde fosforile edilmis insan LAMAN'inin, böbrekte ve kalpte, karacigere ve dalaga kiyasla metabolik düzeltmeye daha çok dirençli olan iki organda, görece daha yüksek bir düzeltici potansiyeline sahip oldugunu göstermistir. Insan enziminin düzeltici potansiyelini degerlendirmek için, 250 mU LAMAN'in bir tek dozunu enjekte ettik ve fareleri enjeksiyondan 1 ila 12 gün sonra analiz ettik. Karacigerde, depolama enjeksiyondan 1 ve 3 gün sonra tam olarak düzeltilmistir. 6 ve 12 gün sonra, nötral oligosakkaritler, yeniden birikmeye baslamistir, ancak tedaviden önceki depolama düzeyinin yalnizca yaklasik %30'una ulasmistir (Sekil 6). Karacigerin isik mikroskobu ile incelenmesi, muamele-edilmemis o- mannosidoz farelerinin sinüs endotelyal hücrelerinde, Kupffer hücrelerinde hepatositlerinde göze çarpan depolama kofullarinin neredeyse tamamen kayboldugunu ve enjeksiyondan 12 gün sonra yeniden-görüldügünü ortaya çikarmistir (Sekil 7).

Dalakta ve böbrekte, nötral oligosakkaritlerin depolanmasi sirasiyla %12'ye ve %18'e düsmüstür. Dalakta ve böbrekte maksimum düzeltmenin sirasiyla 3 ve 6 gün sonra gözlenmesi kayda degerdir. Her iki organda, nötral oligosakkaritler enjeksiyondan 3 ve 6 gün sonra yeniden-birikmeye baslamistir (bakiniz, Sekil 5). d-mannosidoz farelerinin beynindeki nötral oligosakkaritler, tedaviden etkilenmemistir (gösterilmemistir).

Enjeksiyondan 24 saat sonra geri-kazanilan insan LAMAN'i aktiviteleri, fare LAMAN'i ile yapilan deneylerden beklenene kiyasla çok daha yüksektir. Karacigerde, insan LAMAN'i aktivitesi, kontrol karacigerine kiyasla hâlâ 6 kat daha yüksektir. Dalakta ve böbrekte, bu, kontrolünkinin %10-15'ine tekabül etmistir. Insan enziminin alimini ve kararliligini izlemek için, LAMAN aktivitesi, vücut agirliginin her bir g'i için 250 mU insan LAMAN'inin enjeksiyonundan 4, 16 ve 24 saat sonra hazirlanan doku ekstraktlarinda belirlenmistir. Enjekte edilmis LAMAN'in %20'sinden daha azi, incelenen dokuda 4 saat sonra geri-kazanilmistir (karacigerde %18, böbrekte %0,4, dalakta %0,12 ve kalpte %0,04). Fare LAMAN'inin alimi ile karsilastirildiginda ve insan LAMAN'inin bir 2,5 kat daha yüksek olan miktarinin enjekte edildigi hesaba katildiginda, enjeksiyondan 4 saat sonra karacigerde, böbrekte ve kalpte geri- kazanilan aktivite her iki enzim preparasyonu için karsilastirilabilirdir (Tablo 1'i ve Tablo 2'yi karsilastirin). Dalak tarafindan alimin, insan enzimi için 2-3 kat daha az etkili oldugu görülmüstür. Insan ve fare enzimi arasindaki en büyük farklilik, karaciger, böbrek ve dalak tarafindan içsellestirilen insan LAMAN'inin daha yüksek kararliligidir.

Insan LAMAN'inin aktivitesi bu organlarda 24 saat sonra 4 saat sonraki degerin %17- 33'üne düserken (bakiniz, Tablo 2), fare enzimininki hâlihazirda 10 saat sonra 4 saat sonraki degerin %20-26'sina düsmüstür (bakiniz, Tablo 1).

Fare (bakiniz, Sekil 3) ve insan LAMAN'inin düzeltici etkisi yalnizca geçicidir. Nötral oligosakkaritler, enjeksiyondan 3 ila 6 gün sonra yeniden-birikmeye baslamistir.

Enjekte edilmis enzimin miktarini arttirma, yeniden-birikmeyi geciktirmek için bir araç olacaktir. LAMAN'in verilen bir dozunun düzeltici etkisinin, bir tek doz olarak uygulanmasina kiyasla bir uygun aralikla ayrilmis iki yarim doz olarak uygulandiginda daha yüksek olmasi beklenir. LAMAN'in miktarini 500 mU/g vücut agirligi'na arttirmaktan ziyade, analizden önce gün 7'nin ve 3,5'in her birinde vücut agirliginin her bir g'i için iki kere 250 mU insan LAMAN'i uyguladik. Bu, böbrekte ve kalpte depolamanin bir tam düzeltilmesi ile sonuçlanmistir (Sekil 8). Isik mikroskobu ile inceleme, karacigerde (gösterilmemistir) ve böbregin tübüler epitelyumlarinda depolama kofullarinin olmadigini göstermistir (Sekil 9). Dalaktaki rezidüel depolama, sahte-enjekte edilmis a-mannosidoz farelerindekinin %20'sinden daha azdir. En göze çarpan sekilde, beyinde TLC ile kantifiye edildigi üzere nötral oligosakkaritlerin düzeyi, sahte-enjekte edilmis oi-mannosidoz farelerinin beynindekinin yalnizca yarisidir (Sekil TABLO 2: Vücut agirliginin her bir g'i için 250 mU insan oi-mannosidozi enjeksiyonundan 4-24 saat sonra oi-mannosidoz farelerinin doku ekstraktlarinda LAMAN aktivitesi. +Tüm degerler, tsmr'da ( serumda ortalama LAMAN aktivitesi için düzeltilmistir. Düzeltme faktörleri, 0,903 ve 1,222 araliginda çesitlilik göstermistir. Kontrol farelerinin ve enjekte edilmemis farelerin doku ekstraktlarinda LAMAN aktivitesi için, bakiniz Tablo 1.

LAMAN (mU/g islak agirlik)* Enjeksiyondan sonraki saatler Karaciger Dalak Böbrek Kalp Beyin Bir molar temele nötral oligosakkaritleri kantifiye etmek için, sahte- ve LAMAN enjekte edilmis d-mannosidoz farelerinin beyninden ekstrakte edilen nötral oligosakkaritler, oligosakkaritlerin indirgeme uçlarina bir flüoresan etiket uygulayan 2-antranilamid ile reaksiyona sokulmustur. Flüoresan olarak etiketlenmis oligosakkaritler, HPLC ile ayrilmistir ve 2-antranilamid ile türevlendirmeden önce eklenen bir iç standart oligosakkarit ile karsilastirma ile kantifiye edilmistir (Sekil 10). oi-mannosidoz farelerin beynindeki majör oligosakkarit türleri, 2, 3 veya 4 mannoz rezidüsü içerir. Bunlar sirasiyla 319, 87 ve 164 pmoI/g olan konsantrasyonlarda bulunur ve beyindeki tüm nötral oligosakkaritlerin %61'ine tekabül eder. Muamele edilmis d-mannosidoz farelerinin beyninde, nötral oligosakkaritlerin konsantrasyonu, sahte-enjekte edilmis farelerin %26'sina düsmüstür. Düzeltici etki, oligosakkarit türlerinin her biri için bildirilmistir, ancak 9, 7 ve 4 mannoz rezidüsü olan türler için görece en yüksektir (bakiniz, Sekil 10).

Mevcut çalismada, bovin böbreginden saflastirilmis LAMAN kullanilmistir. Bu enzim preparasyonu, bir düsük mannoz 6-fosfat içerigi olan matür polipeptitlerden olusmustur.

CHO hücrelerinin salgisindan izole edilen rekombinant insan LAMAN'i agirlikli olarak, öncül formdan olusmustur, ancak ayrica zayif bir sekilde fosforile edilmistir. Bu preparasyonun düsük mannoz 6-fosfat içerigi büyük olasilikla, izolasyon sirasindaki defosforilasyondan kaynaklanir. Arada sirada, en fazla %40'i MRP 300 kolonuna baglanmis insan LAMAN'i preparasyonlari elde edilmistir (C. Andersson, D. P. Roces, yayimlanmamis gözlem). Mannoz 6-fosfat reseptörlerinden yoksun olan fare embriyonik fibroblastlarinin salgilarindan saflastirilan rekombinant fare LAMAN'i büyük oranda fosforile edilmistir ve öncül form ile temsil edilmistir. Dolasimdaki klirens, hayli fosforile edilmis fare LAMAN'i için olana kiyasla bovin böbreginden ve CHO hücrelerinden elde edilen iki zayif bir sekilde fosforile edilmis LAMAN preparasyonu için daha hizlidir. Farkli LAMAN preparasyonlarinin organlar tarafindan alimi dogrudan karsilastirilmamistir. Bununla birlikte, farkli deneylerin verilerini karsilastirma, zayif bir sekilde fosforile edilmis insan ve zayif bir sekilde fosforile edilmis fare LAMAN'inin benzer fraksiyonlarinin karaciger, böbrek ve kalp tarafindan alindigini öne sürer.

Yalnizca dalakta, alim farklidir ve daha yüksek fosforilasyon ile kolaylastirilmistir.

Farelerde fosforile edilmis ve fosforile edilmemis ß-glukuronidaz alimi konusundaki ilgili bir çalismada, karacigere ve dalaga alim için farklilik gözlenmemisken, böbrege ve kalbe alim fosforile edilmis enzim için daha yüksektir (26). Glikosilasyon ve fosforilasyon açisindan farkli olan oi-galaktosidaz preparasyonlari için, karaciger, dalak ve böbrek tarafindan benzer bir alim gözlenmistir (27). Bu, glikosilasyonun ve fosforilasyonun Iizozomal enzimlerin farkli organlara alimi üzerindeki etkisinin enzime bagli oldugunu gösterir.

Farkli kaynaklardan elde edilen LAMAN preparasyonlari arasindaki bir majör farklilik, bunlarin kararliligidir. Birinci derece kinetikler varsayilarak, fare (bakiniz, Tablo 1) ve bovin (gösterilmemistir) LAMAN'inin aktivitesi 3 saat veya daha az olan bir görünür yari ömür ile karacigerde, böbrekte ve dalakta düsmüsken, insan LAMAN'inin görünür yari ömrü 3 kattan daha fazla uzundur. Bu, dalakta, böbrekte ve kalpte insan LAMAN'inin oligosakkarit depolanmasi üzerindeki daha yüksek düzeltici etkinligini açiklayabilir (bakiniz, Sekil 5).

LAMAN'in bir tek intravenöz enjeksiyonu, enzimin kaynagina bakilmaksizin nötral oligosakkaritlerin Iizozomal depolanmasinin bir çabuk ve belirgin düsüsüne yol açmistir. Düzeltici etki, karacigerde en çok belirgindir. Bu ayrica, burada dogal tip farelerde olana kiyasla LAMAN aktivitesinin artisinin en yüksek oldugu dokudur.

Histolojik inceleme, hem parankimal olan hem de parankimal-olmayan karaciger hücrelerinde depolamanin bir düzelmesini ortaya çikarmistir. Bu, hayli fosforile edilmis fare LAMAN'i için (gösterilmemistir) ve zayif bir sekilde fosforile edilmis insan LAMAN'i için (bakiniz, Sekil 7) dogrudur. Bu, ß-glukuronidaz ile yapilan daha erken bir çalisma fosforile edilmemis enzim formlarinin neredeyse özellikle parankimal-olmayan karaciger hücrelerine lokalize olurken, fosforile edilmis formlarin hem parankimal olan hem de parankimal-olmayan hücrelere lokalize oldugunu gösterdiginden, beklenmedik bir durumdur (26). LAMAN'in düzeltici etkisi, tüm dokularda geçicidir. Nötral oligosakkaritler, enjeksiyondari 2 ila 6 gün sonra yeniden-birikmeye baslamistir.

Depolamanin göze çarpan bir düzelmesi, dalakta ve böbrekte depolamayi %80-90 azaltan, vücut agirliginin her bir g'i için 250 mU insan LAMAN'inin enjeksiyonu 3,5 günde tekrarlandiginda gözlenmistir. Bir hafta içinde, depolama yalnizca karacigerde degil ayni zamanda böbrekte ve kalpte de kaybolmustur. Daha önemlisi, nötral oligosakkaritlerin konsantrasyonu ayrica, beyinde yaklasik dörtte birine de düsmüstür.

Son bahsedilen durum, nöral hücrelere bir LAMAN alimina atfedilemez. Farelerde, kan- beyin bariyeri, yasamin ilk iki haftasi içinde olgunlasir ve bu periyottan sonra intravenöz olarak uygulanan Iizozomal enzimler kan-beyin bariyerini geçmez (28-31). Bu gözlemlere uygun sekilde, muamele edilmis farelerin beyin homojenatlarinda iz miktarlarda LAMAN gözlemledik (bakiniz, Tablo 1 ve 2). Bu aktiviteler, ekstra-nöral hücrelere, örnegin, endotelyumlara, koroid pleksus epitelyumuna ve tam olmayan bir sekilde çikarilmis meninkslere, atfedilir. Uygulanan LAMAN'in nöronal ve gliyal hücrelerde depolanan oligosakkaritlere erisim saglamasi olasi olmadigindan, alternatif mekanizmalar düsünülmelidir. Kan dolasimi yoluyla veya serebrospinal sivinin bir iyilestirilmis akisi yoluyla oligosakkaritlerin klirensi, beyinde nötral oligosakkarit depolanmasinin azaltilmasina katki saglayabilir. Örnek 3: thAMAN - a-mannosidoz farelerde tekrarli doz replasman terapisinin etkinligi Çalismanin amaci asagidakilerdir - Tüm periferik dokularda mannoz oligosakkaritleri depolanmasinin bir toplam düzeltilmesini göstermek ve beyinde depolamanin düzeltilmesini dogrulamak. - thAMAN'in bir tekrarli dozunun enjeksiyonunun ayrica farkli periferik dokularda ölçülen LAMAN aktiviteleri üzerinde de bir etkiye sahip olup olmadigini belirlemek.

- Tekrarli enjeksiyonlardan sonra antikorlarin gelisimini Izlemek ve bunlarin enzimi çökeltip çökeltmedigini kontrol etmek. Fare antikorlar gelistirdiginde, bunlarin enzimin klirensi üzerinde bir etkiye sahip olup olmadigini belirlemek.

- Antikorlarin bir arttirilmis düzeyinin kan beyin bariyerinin (BBB) geçirgenligi üzerinde bir etkiye sahip olup olmadigini belirlemek. - 1 ve 4 haftalik tedaviden sonra, nakavt, enjekte edilmis nakavt ve dogal tip farelerin gen ekspresyonunu karsilastirmak. Karacigerden elde edilen RNA ile bir mikro-dizilim deneyi gerçeklestirilecektir. Bu deney için kullanilan fareler, heterozigot beslemelerden seçilir (asagiya bakiniz).

Test sisteminin dogrulanmasi Test maddesi saglandigi sekilde kullanilir. Test maddesi, kullanilmadiginda dispanserde dondurulur (yaklasik -20°C).

Hayvanlar ve yönetim Deney için farelerin 5 farkli grubu kullanilir: (-/-) a-mannosidoz fareler (+/+) C57/Bö (dogal tip fareler) (+/-) d-mannosidoz fareleri (-/-) ve 057186 fareleri (+/-) arasinda bir çaprazlamanin yavrulari olan heterozigot fareler (-/-) heterozigot çaprazlamalardan (+/- fareler) d-mannosidoz (+/+) heterozyigot çaprazlamalardan (+/- fareler) dogal tip fareler Yas: Çalismanin baslangicinda 8 haftalik.

Hayvanlarin 64 (erkek ve/veya disi) fare Saglik durumu: Hastalikli oldugundan süphe edilen hayvanlar çalismadan çikarilmistir. Anlamli sayida hayvan uygun olmadiginda, hayvanlarin tüm serisi reddedilir ve yeni bir seri elde edilir.

Aklimatizasyon: Hayvanlarin, dozlamanin baslamasindan önce minimin 3 gün boyunca kaldiklari yere alismasina izin verilir.

Doz Gruplarina Dagitma: Tüm hayvanlar tartilmistir ve gerekli sayida hayvan 5 doz grubuna rastgele tayin edilmistir. Doz agirliga göre ayarlandigindan ve bu güne kadar cinsiyet-spesifik farkliliklar bulunmadigindan, bir agirlik ve/veya cinsiyet stratifikasyonu gerekli degildir. Gen ekspresyonu çalismalarinda, cinsiyet siklikla bir ilgili faktör olarak tarif edildiginden, Mikro-dizilim deneyinde yalnizca erkekler kullanilir (gruplar 2*, 4* ve *, asagiya bakiniz).

Oda Ortami: Hayvanlar, paslanmaz çelik elek tavanlari ve yatak materyali olarak tahta talaslar bulunan kati tabanlari olan bir polipropilen kafes içinde 4/kafes veya 8/kafes gerektiginde degistirilir.

Kafeslere, bir paslanmaz çelik ibrik agzi ve basligi olan bir polikarbonat su sisesi (kapasitesi 250 ml) saglanir. Su siseleri gerektiginde doldurulur ve haftada en az bir kere degistirilir/yikanir.

Otomatik sicaklik ve nem kontrolü vardir, hedef araliklar, her bir saat için minimum 15 hava degisimi vermesi amaçlanan bir oda hava akimi ile, sirasiyla, 20°C± 2°C'dir ve siklusu kontrolü vardir, aydinlik saatler normal olarak, 06.00-18.00'dir.

Diyet ve Su Tedariki Besin ve su hayvanlar arzu ettiklerinde kullanabilecekleri sekilde mevcuttur. Besinin ve suyun, çalismanin sonucu üzerinde herhangi bir etkiye sahip olmaya yetecek konsantrasyonda herhangi bir ilave madde içerdigi düsünülmemektedir.

Tedavi (Muamele) Doz Gruplari/Doz Düzeyi Grup 1 (biyokimya arastirmalari için, 16 LAMAN fare). Farelere bir haftada iki kere intravenöz olarak 250 mU/g vücut agirligi thAMAN ile muamele edilmistir ve 4 farelik grup 1, 2 ve 4 haftalik tedaviden sonra öldürülür.

Grup 2*'ye (mikro-dizilim arastirmalari için, heterozigot çaprazlamadan 8 LAMAN fareye) bir haftada iki kere intravenöz olarak 250 mU/g vücut agirligi thAMAN ile muamele edilmistir ve 3 farelik grup 1 ve 4 haftalik tedaviden sonra öldürülür.

Grup 3'e (kan-beyin bariyeri, Antikor ve plazma klirensi arastirmalari için, 12 LAMAN fareye) haftada bir kere 250 mU/g vücut agirligi thAMAN ile muamele edilmistir.

Farelerin her iki grubu, BBB arastirmalari için kullanilan 4 fare ve klirens arastirmasi için kullanilan 4 fare 4 haftalik tedaviden sonra öldürülür. we (Sahte muamele edilmis fareler, 12 LAMAN fareye) Grup 3'te/Grup 1'de muamele edilen hayvanlar ile ayni doz hacminde thAMAN için vehikül ile haftada bir ere/iki kere muamele edilir. 4 farelik bir gruba haftada bir kere enjekte edilir ve bunlar (grup 3'ten fareler ile karsilastirilmasi için) 4 haftalik tedaviden sonra öldürülür ve 2 farelik gruplar (grup 1 ila karsilastirilmasi için) 1, 2 ve 4 haftalik tedaviden sonra Grug 4*'e (Sahte muamele edilmis fareler, heterozigot çaprazlamadan 8 LAMAN fareye) ve Grup 5*'e (heterozigot çaprazlamadan 8 dogal fareye), Grup 2*'de muamele edilen hayvanlar ile ayni doz hacminde thAMAN için vehikül ile bir haftada iki kere muamele edilir. 3 farelik grup, 1 ve 4 hafta sonra öldürülür.

*Heterozigot beslemelerden (+/-), d-mannosidoz fareler (-/-) ve dogal tip C57/Bö (+/+) arasinda bir beslemenin yavrularindan, d-Mannosidoz fareler.

TABLO 3: Hayvanlarin doz gruplarina dagitilmasi: LAMAN nakavt fareler (LAMAN Enjeksiyonlarin Hayvanlar enjekte edilmis) sayisi Grup No 1A 10 2A* 28* 3A BB Tedavi Öldürme Mikro- Evans Ab- süresi zamanlari dizilim Blue fareler I1,5w 17X + + + 17X t2w t2w 25x 4 + + + + 25x t2,5w 13X + + 13X I3,5w 13X + + 13X I4w t4w - 4 3* 4 4 - LAMAN nakavt fareler (LAMAN Enjeksiyonlarin Hayvanlar _ _ . enjekte edilmis) sayisi Grup No 1A 10 2A* 28* 3A 3B Tedavi Öldürme Mikro- Evans Ab- süresi zamanlari dizilim Blue fareler No 4 4 3 3 4 4 Ayirma +4 +2 +4 TABLO 3: Hayvanlarin doz gruplarina dagitilmasi (devami) Dogal Tip Enjeksiyonlarin fareler sayisi Grup No 4A 48 4C 4D 4E* 4F* 5A* 5B* Tedavi Öldürme Kontrol Sahte Muamele Kontrol Muamele edilmis I1,5w + + + + 17X I2,5w + + + 13x t3w + + + + 25x t3,5w + + + 13X t4w t4w 2 4 3* 3* - No 22423333 Dogal Tip Enjeksiyonlarin fareler sayisi Grup No 4A 48 40 4D 4E* 4F* 5A* SB* Tedavi Öldürme Kontrol Sahte Muamele Kontrol Muamele edilmis Ayirma +4 +2 Uygulama Yolu, Süresi ve Yöntemi Test maddesi, hedef doz düzeylerinde lateral kuyruk venlerinin birine bir intravenöz (bolus) enjeksiyon yoluyla uygulanir. Zorunlu doz hacmi, hayvanlarin en güncel kaydedilmis vücut agirligina göre hesaplanir.

Uygulamadan önce, farelere vücut agirliginin her bir 100 g'i için bir 10 mg/ml Ketavet (Parke Davis) ve 2 mg/ml Rompun (Bayer) çözeltisinin 75 ul'si ile anestezi uygulanir (intra-peritoneal) ve fareler anesteziden derlenene kadar 37°C'de tutulur.

Gözlemler Viabilite Tüm hayvanlar Viabilite için her gün sabah erkenden ve mümkün oldugu kadar geç kontrol edilir. Siddeti güçsüzlük veya intoksikasyon bulgulari gösteren ve bir can çekisme hâlinde oldugu düsünülen herhangi bir hayvan öldürülür. Ölmek üzereyken öldürülen veya ölü bulunan herhangi bir hayvan, mümkün oldugunda, ölüm gününde bir makroskobik post mortem incelemeye tabi tutulur. Ölüm gününde makroskobik post mortem inceleme yapmak uygulanabilir olmadiginda (örn.. geç ögleden sonra veya hafta sonlari), karkas bir polietilen poset içine yerlestirilir ve sonraki gün incelemeye kadar bir buzdolabinda (4°C) tutulur.

Klinik Bulgular Tüm hayvanlar tedaviye reaksiyon için dozlama günlerinde gözlenir. Herhangi bir bulgunun baslamasi, yogunlugu ve süresi gözlenir ve kaydedilir.

Vücut Agirligi Dozlamadan önce tüm hayvanlar haftalik olarak tartilir ve kaydedilir ve tablo hâline getirilir.

Laboratuvar arastirmalari Tedavi dogrulamasi Enjeksiyondan bes dakika sonra, (iç prosedür no 2'ye göre) thAMAN plazma düzeylerinin ölçülmesi için retroorbital pleksustan kan alinir. Bir hayvan tam doz almadiginda, eksik miktarin %'si hesaplanir ve ayni gün hayvana verilir.

Kinetikler Grup 3'ten 4 fareden, enjeksiyondan bir gün önce ve ayrica Ab'nin enzimin klirensi üzerindeki olasi bir etkisini arastirmak için her bir enjeksiyondan 5, 15 ve 30 dakika sonra retroorbital pleksustan kan alinir.

Enzim çalismanin sonunda (4 hafta) hâlâ mevcut oldugunda, bu farelerin tedavisi 8 Antikor belirlenmesi Dozlamadan önce, antikor titrelerini ölçmek için grup 2 hayvanlarindan ayni zamanda çalisma sonlandiginda diger tüm hayvanlardan retroorbital pleksustan kan alinir.

Terminal çalismalar Öldürme yöntemi Farelere, 0,15 M NaCI içindeki bir 10 mg/ml Ketavet (Parke Davis) ve 2 mg/ml Rompun (Bayer) çözeltisinin 600 ul'si ile anestezi uygulanir, fareler PBS ile perfüze edilir ve kanatma ile öldürülür.

Grup 3 disindaki tüm gruplar için, öldürme son tedaviden üç buçuk gün sonra gerçeklesir. Grup 3 için, fareler son tedaviden 1 hafta sonra öldürülür (bakiniz, Tablo Histopatoloji Asagidaki organlar toplanir ve pH 7.4'e tamponlanmis 0.1 mM NaPi/%6 Gluteraldehit ile fikse edilir: karaciger, böbrek, beyin.

Jilet ile küçük kesitlere kesilir ve fikse edilmis Iamlar elektron mikroskobu analizine tabi Doku LAMAN konsantrasyonlari TBS/PI (Proteaz inhibitörleri) içindeki Karaciger, Dalak, böbrek, kalp ve beyin homojenatari, substrat olarak p-nitrofeniI-oi-mannopiranosit ve tampon olarak 0,2 M sodyum sitrat, pH 4,6, %0,08 NaN3, %O,4 BSA kullanilarak LAMAN aktivitesi için LAMAN'in islenmesi Western Blot ile izlenir (~1 mU gereklidir).

Doku Oligosakkaritleri .3'te tarif edilen organlardan, Prosedür no 4'e ve 5'e göre TLC ile organlardaki depolamanin normalizasyonunu çalismak için nötral oligosakkaritlerin ekstraktlarinin bir preparasyonu hazirlanir ve dansitometri ile kantifiye edilir.

Karacigerden ve kalpten elde edilen nötral oligosakkaritler, glikojen girisiminden kaçinmak için, a-glukosidaz ile sindirilecektir.

Sonuçlarin istatistiksel analizi Aksi ifade edilmedikçe, tüm istatistiksel testler iki-taraflidir ve kurum-içi yazilim kullanilarak %5 anlamlilik düzeyinde gerçeklestirilir.

Asagidaki ikili karsilastirmalar yapilir: Grup 1A'ya karsi Vehikül Kontrol Grubu 4A Grup 1B'ye karsi Vehikül Kontrol Grubu 4B Grup 1C'ye karsi Vehikül Kontrol Grubu 40 Grup 3A'ya karsi Vehikül Kontrol Grubu 4D Grup 4E*'a, 4F*'a karsi Vehikül Kontrol Grubu 5A*, 5B* Grup 2A*'a, 2B*'a karsi Vehikül Kontrol Grubu 5A*, 5B* Grup 2A*'a, 2B*'a karsi Vehikül Kontrol Grubu 4E*, 4F* Veriler, Shapiro-Wilk testi ve dagilim-dagilim-egrileri kullanilarak dagilimin normalitesi için analiz edilir. Bir normal dagilim varsayilabildiginde, gruplar arasindaki farkliliklar ayni-serpilimsellik varsayimi ile veya ayni-serpilimsellik varsayimi olmadan lineer modeller (ANOVA) kullanilmasi için test edilir. Veriler (veya Iog'a dönüstürülmüs veriler) normal olarak dagilmadiginda, bir KruskaI-Wallis-Test'i kullanilir. Ilave veri analizi adimlari, verilere bagli olarak yapilabilir. (* heterozigot beslemeler, asagiya bakiniz) REFERANSLAR 1. Ockerman, P. A. (1967) A generalized storage disorder resembling Hurler's syndrome. Lancet 2, 239-241 2. Hocking, J.D., Jolly, R.D,. and Blatt R.D. (1972) Deficiency of d-mannosidase in Angus cattle. An inherited Iysosomal storage disease. Biochem. J. 128, 69-78 3. Burditt, L.J., Chtai, K., Hirani, S., Nugent, P.G., Winchester, B. and Blakmore, W.F. 4. Hirsch, C., Blom, D. and Ploegh, H.L. (2003) A role for N-glycanase in the cytosolic . Saint-Pol, A., Cordogno, P. and Moore, S.E.H. (1999) Cytosol to Iysosome transport 6. Thomas, G.H. (2001) Disorders of glycoprotein degradation: d-mannosidosis, ß- mannosidosis, fucosidosis and sialidosis in "The Metabolic Bases of Inherited Disease (Scriver, C., Beaudet, A., Sly, W., Valle, D., Childs, B., Kinzler, K., Vogelstein, B., eds.) 8th ed., pp. 3507-3533, MCGraw-Hill, New York 7. Berg, T., Riise, H.M., Hanse, G.M., Malm, D., Tranebjarg, L., Tollersrud, O.K. and Nilssen, O. (1999) Spectrum of mutations in d-mannosidosis. Am J. Hum. Genet. 64, 77-88 8. Neufeld, E.F. (2004) Enzyme replacement therapy. In "Lysosomal disorders of the brain" (Platt, F.M., Walkley, S.V., eds.) pp. 327-338, Oxford University Press 9. Dobrenis, K. (2004) Cell-mediated delivery systems. In "Lysosomal disorders of the brain" (Platt, F.M., Walkley, S.V., eds.) pp. 339-380, Oxford University Press . Barton, N.W., Brady, R.O., Dambrosia, J.M., Di Bisceeglie, A.M., Doppelt, S.H., Hill, S.C., Mankin, H.J., Murray, G.J., Parker, R.I., Argoff, C.E., Grewal, R.P., Yu, K.-T. et al. (1991) Replacement therapy for inherited enzyme deficiency-macrophage- 11. Will, A., Cooper, A., Hatton, C., Sardhawalla, I.B., Evans, D.I.K. and Stevens, R.F. (1987) Bone marrow transplantation in the treatment of d-mannosidosis. Arch. Dis. 12. Wall, D.A., Grange, D.K., Goulding, P., Danies, M., Luisiri, A. and Kotagal, S. (1998) Bone marrow transplantation for the treatment of or-mannosidase. J. Pediatr. 133, 282-285 13. Malm, P. (2004) Prologue. The doctor as parent. In "Lysosomal disorders of the brain“ (Platt, F.M., Walkley S.U., eds.) pp. XXI-XXVII, Oxford University Press 14. Walkely, S.U., Thuall, M.A., Dobrenis, K., Huang, M., March, .A., Siegel, D.A. and Wurzelmann, S. (1994) Bone marrow transplantation corrects the enzyme defect in neurons of the central nervous system in a lysosomal storage disease. Proc. Natl.

. Stinchi, S., Lüllmann-Rauch, R., Hartmann, D., Coenen, R., Beccari, T., Orlaccio, A., von Figura, K., and Saftig, P. (1999) Targeted disruption of the lysosomal 0t- mannosidase gene results in mice resembling a mild form of human ci-mannosidosis.

Hum. Mol. Gen. 8, 1365-1372 16. Beccari, T., Apollini, MG., Constanzi, E., Stinchi, S., Stirling, J.L., della Fazia, M.A., Servillo, G., Viola, M.P., and Orlacchio, A. (1997). Lysosomal alpha-mannosidases of mouse tissues: characteristics of the isoenzymes, and cloning and expression of a full- 17. Artelt, P., Morelle, C., Ausmeier, M., Fitzek, M., and Hauser, H. (1988). Vectors for efficient expression in mammalian fibroblastoid, myeloid and Iymphoid cells via transfection or infection. Gene 68, 213-219 18. Dittmer, F., UIbrioh, E.J., Hafner, A., Schmahl, W., Meister, T., Pohlmann, R., and von Figura, K. (1999). I-cell disease-like phenotype in mice deficient in mannose 6- phosphate receptors. Transgenic Res. 7, 473-483 19. Tollersrud, O.K., Berg, T., Healy, P., Evjen, G., Ramachandran, U. and Nilssen, O. (1997) Purification of bovine Iysosomal a-mannosidase, characterization of its gene and determination of two mutations that cause o-mannosidosis. Eur. J. Biochem. 246, 410-419 . Pohlmann, R., Wendland, M., Boeker, C. and von Figura, K. (1995) The two mannose 6-phosphate receptors transport distinct complements of Iysosomal proteins. 21.Wessel, D. and Flügge, U.I. (1984). A method for the quantitative recovery of protein in dilute solution in the presence of detergents and Iipids. Anal. Biochem. 138, 141-143 22. Kakkis, E.D., Muenzer, J., and Tilller, G.E. (2001) Enzyme replacement therapy in mucopolysaccharidosis. N. Engl. J. Med. 344, 182-188 23. Ghosh, P., Dahms, N.M. and Kornfeld, S. (2003) Mannose 6-phosphate receptors: new twists in the tale. Nature reviews 4, 202-212 24. Pontow, SE., Kery, V., and Stahl, P.D. (1992) Mannose receptor. Int. Rev. Cytol. 137B, 221-244 . Ashwell, G. and Harford, J. (1982) Carbohydrate-specific receptors of the liver. 26. Sands, MS., Vogler, C.A., Ohlemiller, K.K., Roberts, MS., Grubb, J.H., Levy, B. and Sly, W.S. (2001) Biodistribution, kinetics and efficacy of highly phosphorylated and non-phosphorylated ß-glucuronidase in the murine model of mucopolysaccharidosis 27. Ioannu, Y.A., Zeidner, KM., Gordon, R.E. and Desnick, R.J. (2001) Fabry disease: preclinical studies demonstrated the effectivness of a-galacosidase replacement in enzyme-deficient mice. Am. J. Hum. Genet. 68, 14-25 28. Vogler, C., Levy, B., Galvin, N.J., Thorpe, C., Sands, MS., Barker, J.E., Barty, J., Birkenmeier, E.H., and Sly, W.S. (1999) Enzyme replacement therapy in murine mucopolysaccharidosis type VII: neuronal and glial response to ß-glucuronidase requires early initiation of enzyme replacement therapy. Pediatr. Res. 45, 838-844 29. Yu, W.H., Zhao, K.W., Ryanzantsev, S., Rozengurt, N., and Neufeld, E.F. (2000) Short term enzyme replacement in the murine model of Sanfilippo syndrome type B.

. Miranda, SR., He, X., Simonara, C.M., Gatt, S, Desnick, R.J., and Schuchman, E.H. (2000) Infusion of recombinant human acid sphingomyelinase into Niemann-Pick disease mice Ieads to visceral, but not neurological correction of the pathophysiology. 31. Du, H., Schiavi, S., Levine, M., Mishra, J., Heur, N., and Grabowski, G.A. (2001) Enzyme therapy for Iysosomal acid lipasi deficiency in the mouse. Hum. Mol. Genet. 32. Aebischer P, Goddard M, Signore AP, Timpson RL. 1994. Functional recovery in hemiparkinsonian primates transplanted with polymer-encapsulated PC12 cells. Exp Neurol 126:151-158 33. Aebischer P, Schluep M, Deglon N, Joseph JM, Hirt L, Heyd B, Goddard M, Hammang JP, Zurn AD, Kato AC, Regli F, Baetge EE. 1996. Intrathecal delivery of CNTF using encapsulated genetically modified xenogeneic cells in amyotrophic lateral sclerosis patients. Nat Med 2:696-699 34. Austin J, McAfee D, Armstrong D, O'Rourke M, Shearer L, Bachhawat B. 1964.

Abnormal sulphatase activities in two human diseases (metachromatic leucodystrophy and gargoylism). Biochem J 93:150-17C . Barth ML, Fensom A, Harris A. 1995. Identification of seven novel mutations associated with metachromatic Ieukodystrophy. Hum Mutat 6(2):170-176 36. Bayever E, Ladisch S, Philippart M, Brill N, Nuwer M, Sparkes RS, Feig SA. 1985.

Bone-marrow transplantation for metachromatic Ieucodystrophy. Lancet 2(8453):471- 37. Bradley RT, Manowitz P. 1988. Electrochemical determination of Iysosomal alpha- mannosidasectivity using high-performance quuid chromatography. Anal Biochem 173(1):33-38 38. Braulke T, Hille A, Huttner WB, Hasilik A, von Figura K. 1987. Sulfated oligosaccharides in human Iysosomal enzymes. Biochem Biophys Res Commun 39. Braulke T, Tippmer S, Chao HJ, von Figura K. 1990. lnsulin-like growth factors I and II stimulate endocytosis but do not affect sorting of Iysosomal enzymes in human 40. Deglon N, Heyd B, Tan SA, Joseph JM, Zurn AD, Aebischer P. 1996. Central nervous system delivery of recombinant ciliary neurotrophic factor by polymer 41. Dierks T, Schmidt B, von Figura K.1997. Conversion of cysteine to formylglycine: a protein modification in the endoplasmic reticulum. Proc Natl Acad Sci USA 42. Draghia R, Letourneur F, Drugan C, Manicom J, Blanchot C, Kahn A, Poenaru L, Caillaud C. 1997. Metachromatic Ieukodystrophy: identification of the first deletion iri exon 1 and of nine novel point mutations in the Iysosomal alpha-mannosidase gene.

Hum Mutat 9(3):234-242 43. Draper RK, Fiskum GM, Edmond J. 1976. Purification, molecular weight, amino acid, and subunit composition of Iysosomal alpha-mannosidase from human liver. Arch 44. Dubois G, Turpin JC, Baumann N. 1975. Arylsulfatases isoenzymes in metachromatic leucodystrophy/detection of a new variant by electrophoresis improvement of quantitative assay. Biomedicine 23(3):116-119 45. Eto Y, Tokoro T, Liebaers I, Vamos E. 1982. Biochemical characterization of neonatal multiple sulfatase deficient (MSD) disorder cultured skin fibroblasts. Biochem Biophys Res Commun 106(2):429-34 46. Farooqui AA. 1976. Purification and properties of human placenta arylsulphatase A.

Arch lnt Physiol Biochim 84(3):479-492 47. Farrell DF, MacMartin MP, Clark AF. 1979. Multiple molecular forms of Iysosomal alpha-mannosidase in different forms of metachromatic Ieukodystrophy (alpha- mannosidosis). Neurology 29(1):16-20 48. Fujii T, Kobayashi T, Honke K, Gasa S, lshikawa M, Shimizu T, Makita A. 1992.

Proteolytic processing of human Iysosomal Iysosomal alpha-mannosidase. Biochim Biophys Acta 1122(1):93-98 49. Gieselmann V, Polten A, Kreysing J, Kappler J, Fluharty A, von Figura K. 1991.

Molecular genetics of metachromatic Ieukodystrophy. Dev Neurosci 13:222-227 50. Gieselmann V, Zlotogora J, Harris A, Wenger DA, Morris CP. 1994. Molecular genetics of metachromatic leukodystrophy. Hum Mutat 4:233-42 51. Gieselmann V, Matzner U, Hess B, Lullmann-Rauch R, Coenen R, Hartmann D, D'Hooge R, DeDeyn P, Nagels G. 1998. Metachromatic Ieukodystrophy: molecular genetics and an animal model. J Inherit Metab Dis 21 :564-574 52. Gniot-Szulzycka J. 1974. Some properties of highly purified arylsulphatase A from human placenta. Acta Biochim Pol 21(3):247-254 53. Gustavson KH, Hagberg B. 1971. The incidence and genetics of metachromatic 54. Hess B, Saftig P, Hartmann D, Coenen R, Lullmann-Rauch R, Goebel HH, Evers M, von Figura K, D'Hooge R, Nagels G, De Deyn P, Peters C, Gieselmann V. 1996.

Phenotype of Iysosomal alpha-mannosidase-deficient mice: relationship to human 55. Hickey WF, Kimura H. 1988. Perivascular microglial cells of the CNS are bone 56. Hickey WF, Hsu BL, Kimura H. 1991. T-Iymphocyte entry into the central nervous system. J Neurosci Res 28(2):254-60 57. lnoue H, Seyama Y, Yamashita S. 1986. Specific determination of Iysosomal alpha- mannosidase activity. Experientia 15;42(1):33-35 58. James GT. 1979. Essential arginine residues in human liver Iysosomal alpha- mannosidase. Arch Biochem Biophys 197(1):57-62 59. James GT, Thach AB, Klassen L, Austin JH Studies in metachromatic 60. Joss V, Rogers TR, Hugh-Jones K, Beilby B, Joshi R, Williamson S, Foroozanfar N, Riches P, Turner M, Benson PD, Hobbs JR. 1982 Exp Hematol 10, 52 61. Kelly BM, Yu CZ, Chang PL. 1989. Presence of a Iysosomal enzyme, arylsulfatase- A, in the prelysosome-endosome compartments of human cultured fibroblasts. Eur J Cell Biol 48(1):71-78 62. Klein MA, Frigg R, Flechsig E, Raeber AJ, Kalinke U, Bluethmann H, Bootz F, Suter M, Zinkernagel RM, Aguzzi A. 1997. A crucial role for B cells in neuroinvasive 63. Kreysing J, Polten A, Hess B, von Figura K, Menz K, Steiner F, Gieselmann V. 1994. Structure of the mouse Iysosomal alpha-mannosidase gene and cDNA.

Genomics 19(2):249-256 64. Kreysing J, von Figura K, Gieselmann V. 1990. Structure of the Iysosomal alpha- 65. Krivit W, Shapiro E, Kennedy W, Lipton M, Lockman L, Smith 8, Summers CG, Wenger DA, Tsai MY, Ramsay NK, et al. 1990. Treatment of late infantile metachromatic Ieukodystrophy by bone marrow transplantation. N Engl J Med 322:28- 66. Krivit W, Shapiro E, Hoogerbrugge PM, Moser HW. 1992. State of the art review.

Bone marrow transplantation treatment for storage diseases. Keystone. January 23, 67. Laidler PM, Waheed A, Van Etten RL. 1985. Structural and immunochemical characterization of human urine IySOSOmaI alpha-mannosidase purified by affinity chromatography. Biochim Biophys Acta 827(1):73-83 68. Lee GD, van Etten RL. 1975. Evidence of an essential histidine residue in rabbit 69. Luijten JAFM, Van Der Heijden MCM, Rijksen G, Staal GEJ. 1978. Purification and characterization of lysosomal alpha-mannosidase from human urine. J Mol Med. 1978, 3, 213 70. Manowitz P, Fine LV, Nora R, Chokroverty 8, Nathan PE, Fazzaro JM. 1988. A new electrophoretic variant of lysosomal alpha-mannosidase. Biochem Med Metab Biol 39(1):117-120 71. Mould DL, Dawson AM, Rennie JC. 1970. Very early replication of scrapie iri 72. Ohashi T, Watabe K, Sato Y, Saito I, Barranger JA, Matalon R, Eto Y. 1996. Gene therapy for metachromatic Ieukodystrophy. Acta Paediatr Jpn 38(2):193-201 73. Oya Y, Nakayasu H, Fujita N, Suzuki K, Suzuki K. 1998. Pathological study of mice with total deficiency of sphingolipid activator proteins (SAP knockout mice). Acta 74. Poretz RD, Yang RS, Canas B, Lackland H, Stein S, Manowitz P. 1992. The structural basis for the electrophoretic isoforms of normal and variant human platelet arylsulphatase A. Biochem J :979-983 75. Porter MT, Fluharty AL, Kihara H. 1971. Correction of abnormal cerebroside sulfate metabolism in cultured metachromatic Ieukodystrophy fibroblasts. Science 1971,172, 1263-1265 76. Sangalli A, Taveggia C, Salviati A, Wrabetz L, Bordignon C, Severini GM. 1998.

Transduced fibroblasts and metachromatic Ieukodystrophy Iymphocytes transfer lysosomal alpha-mannosidase to myelinating glia and deficient cells in vitro. Hum Gene 77. Sarafian TA, Tsay KK, Jackson WE, Fluharty AL, Kihara H. 1985. Studies on the charge isomers of Iysosomal alpha-mannosidase. Biochem Med 33(3):372-380 78. Schmidt B, Selmer T, lngendoh A, von Figura K. 1995. A novel amino acid modification in sulfatases that is defective iri multiple sulfatase deficiency. Cell 82(2):271-278 79. Selmer T, Hallmann A, Schmidt B, Sumper M, von Figura K. 1996. The evolutionary conservation of a novel protein modification, the conversion of cysteine to serinesemialdehyde in arylsulfatase from Volvox carteri. Eur J Biochem 238z341-345 80. Shapira E, Nadler HL. 1975. Purification and some properties of soluble human 81. Shapiro EG, Lockman LA, Balthazor M, Krivit W. 1995. Neuropsychological outcomes of several storage diseases with and without bone marrow transplantation. J 82. Stein C, Gieselmann V, Kreysing J, Schmidt B, Pohlmann R, Waheed A, Meyer HE, O'Brien JS, von Figura K. 1989. Cloning and expression of human Iysosomal 83. Stevens RL, Fluharty AL, Skokut MH, Kihara H. 1975. Purification and properties of 84. Stevens RL, Fluharty AL, Killgrove AR, Kihara H. 1976. Microheterogeneity of 85. von Figura K, Steckel F, Conary J, Hasilik A, Shaw E. 1986. Heterogeneity in late- onset metachromatic Ieukodystrophy. Effect of inhibitors of cysteine proteinases. Am J Hum Genet, 39, 371-382 86. Waheed A, Hasilik A, von Figura K. 1982. Synthesis and processing of Iysosomal alpha-mannosidase in human skin fibroblasts. Hoppe Seylers Z Physiol Chem 87. Waheed A, van Etten RL. 1985. Phosphorylation and sulfation of Iysosomal alpha- mannosidase accompanies biosynthesis of the enzyme in normal and carcinoma cell lines. Biochim Biophys Acta 847(1): 53-61 88. WO 02/99092 A (Fogh Jens; Hemebiotech AS (DK); Andersson Claes (SE); Weigelt Cecilia) 12 December 2002 89. Berg Thomas et al.: "Purification and characterization of recombinant human lysosomal alpha-mannosidase", Molecular Genetics and Metabolism, vol. 73, no. 1, April 2001, pages 18-29 DIZI LISTESI <110> Jens Fogh Claes Anderson Cecilia Weigelt Diego Prieto Roces Kurt von Figura Meher Irani <120> CNS'de anormal Iizozomal depolamanin düzeltilmesi için alfa-mannosidaz kullanimi <150> US (SO/558,108 <160> 2 <170> Windows Versiyonu 4.0 için FastSEQ <210> 1 <211> 1011 <212> PRT <213> Homo Sapiens <400>1 3. "_:I ':2 v." i: :-i'. ..'..- i'."._: .Fi-al "Il'i .`.r1 ..'.. ivf.? -I`_ '..: i îii_i ..:11 i.".". .5 F i '1' iiî EL' _, r' _› '_<-:' '.'1' I._5 ":I' v'.': II ' J.".i ßi?' J'T '.'i'g' I"l ›, I› i'-'- 'Il . PC" T:. `ßu -.i i -fl giu H.: &wc 5-3 'aL : , Ulu mr“ :F: ;iy .2 ::J 4_ 4" T' .A. , .4 I_I ' _ 'j_l <210> 2 <211> 8079 <212> DNA <213> Yapay Dizi <220> <223> Ifade plazmidi pLamanExp1 <400> 2 |.i'iî.'_L.-.". '_'i.t<.:"..:v~_i "";_i"_"î'; J'I' .Pîg'c -_›i - 1? r! .: dur.: ~i 'I.. -.'J'.«'. :0' ~i v.:-.-I, ;iç-e', .i' Mi 1...' .'.iiz:;_'.:i-~_i.:-_ `l`_'_:'_'î`1.".uî. _'_t'i'î'iîi;) .::jfLic'T-;is 'IK-ID 68.2- M3::- N15 4“ M7 «7 7 KARACIGER ME 4_- 100.4 BÖBREK KALP 611.. 4d 80 1% 4d 8d 'I 8d Nötral oligosakkaritler (sahte enjekte edilmis a-mannosidoz farelerinin %'si) Enjeksiyondan sonraki günler (d) a-mannosidaz (mU/ml serum) g. i Fare 1'5 3.0 is su ':5 Zaman (dakika) Nötral oligosakkaritler (sahte enjekte edilmis a-mannosidoz farelerinin %'si) KARACIGER Bovin Fare Insan Bovin KARACIGER Günler Emisyon YogunIUGU /10 900 . GM2 800 ' / GM4 GlCßVÄC4I`1/IÖÜ3GÖI3 700 - i i; 500- cw43 500- I i .100 ' 200- K\J (îdö ` CW”9

Claims (1)

1. ISTEMLER . AIfa-mannosidozun tedavisi amaciyla bir ilacin preparasyonu için bir lizozomal alfa-mannosidazin kullanimi olup, özelligi söz konusu ilaç intravenöz uygulama ile uygulanacak olmasidir. . Istem 1'e göre kullanim olup, özelligi ilaç infüzyon veya 1 ila 5 günlük enjeksiyonlara, haftada bir 1 ila 5 enjeksiyona, 2 haftada bir 1 ila 5 enjeksiyona veya her ay bir 1 ila 5 enjeksiyona karsilik gelen bir siklikta tekrarli intravenöz enjeksiyon ile uygulanacak olmasidir. . Istem 1'e veya istem 2'ye göre kullanim olup, özelligi söz konusu ilaç santral sinir sistemindeki hücreleri hedef almaya yönelik bilinen bir yetisi olan bir bilesen içermemesidir. . Istemler 1-3'ten herhangi birine göre kullanim olup, özelligi lizozomal alfa- mannosidaz SEQ ID NO: 1 amino asit dizisini içermesidir. . Istemler 1-4'ten herhangi birine göre kullanim olup, özelligi söz konusu ilaç haftada bir 1-5 enjeksiyona karsilik gelen bir siklikta uygulanacak olmasidir. . Istemler 1-5'ten herhangi birine göre kullanim olup, özelligi söz konusu ilaç, santral sinir sistemindeki hücrelerin hedef alinmasi için bir bilesen içermemesidir ve kan-beyin bariyerini geçis için vehikül olarak etki etme yetisi olan bir bilesen içermez. . Önceki istemlerin herhangi birine göre kullanim olup, özelligi söz konusu ilaç, tedavi edilecek olan süjenin vücut agirliginin her bir grami için 5 ila 300 mU lizozomal alfa-mannosidaz araligindaki bir miktarda uygulanmasidir. . Önceki istemlerin herhangi birine göre kullanim olup, özelligi söz konusu ilaç, tedavi edilecek olan süjenin vücut agirliginin her bir grami için 20 ila 100 mU lizozomal alfa-mannosidaz araligindaki bir miktarda uygulanmasidir. Önceki istemlerin herhangi birine göre kullanim olup, özelligi söz konusu lizozomal alfa-mannosidazin bir fraksiyonu, mannoz 6-fosfat rezidüleri tasiyan bir veya birden fazla N-bagli oligosakkaride sahip olan lizozomal alfa- mannosidazdan olusmasidir. Önceki istemlerin herhangi birine göre kullanim olup, özelligi lizozomal alfa- mannosidazin bir preparasyonunun aktivitesinin %1'i ila 75'ine karsilik gelen bir fraksiyon mannoz-ö-fosfat-reseptörünü baglanmasidir. istem 10'a göre kullanim olup, özelligi söz konusu fraksiyon, lizozomal alfa- mannosidazin bir preparasyonunun aktivitesinin %10'u ila %50'sine karsilik gelmesidir. Istem 10'a göre kullanim olup, özelligi söz konusu fraksiyon, lizozomal alfa- mannosidazin bir preparasyonunun aktivitesinin %20'si ila %40'ina karsilik gelmesidir. Önceki istemlerin herhangi birine göre kullanim olup, özelligi söz konusu lizozomal alfa-mannosidaz, bir rekombinant enzim olmasidir. Önceki istemlerin herhangi birine göre kullanim olup, özelligi söz konusu lizozomal alfa-mannosidaz bir memeli hücresi sisteminde üretilmesidir. istem 14'e göre kullanim olup, özelligi söz konusu memeli hücresi sistemi, bir CHO hücre hatti olmasidir.