NO20211305A1

NO20211305A1 - Sammensetning som omfatter et polypeptid

Info

Publication number: NO20211305A1
Application number: NO20211305A
Authority: NO
Inventors: Stefan Nilsson
Original assignee: Takeda Pharmaceuticals Co
Priority date: 2006-04-04
Filing date: 2007-04-04
Publication date: 2008-10-31
Also published as: EP2100898A1; US20180289777A1; NZ588903A; ES2744499T3; EP2100898B1; AU2007234195A1; CA2644642C; EP2631242A2; CA2882501A1; DK2628746T3; EP2628746A2; JP2014058521A; SI2628746T1; CA2632528A1; AU2007234195B2; EP2628746A3; ZA200805346B; EP2631242A3; KR101504969B1; MX2008012748A

Description

OPPFINNELSENS OMRÅDE

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for konsentrering av et polypeptid av interesse, anvendelsen av en sammensetning omfattende et konsentrert polypeptid av interesse som et medikament for subkutan injeksjon og en sammensetning omfattende minst 10 mg/ml polypeptid av interesse.

OPPFINNELSENS BAKGRUNN

Enkelte polypeptider er nyttige som et medikament for forebyggingen og/eller behandlingen av visse sykdommer. Evnen til å injisere et medikament subkutant er en fordel fordi det gjør det enkelt for pasientene å administrere medisinen selv.

Det er fysiologiske begrensninger for hvor stort volum det er mulig å injisere subkutant. Følgelig er det en fordel for medikamenter som skal administreres subkutant at de er tilgjengelige i en høy konsentrasjon for å sikre at pasienten mottar en tilstrekkelig mengde av medikamentet og/eller for å unngå flere subkutane injeksjoner.

WO 99/37325 beskriver fremgangsmåter for behandling og forebygging av sykdom forårsaket av fravær eller mangel på aktivitet av enzymer som tilhører den biosyntetiske heme-veien. WO 03/002731 beskriver en fremgangsmåte for rensing av rekombinant porfobilinogen-deaminase i industriell skala og anvendelsen av det rensede produktet til fremstilling av et medikament. Likeledes tilveiebringer WO 02/099092 og WO 2005/094874 lysosomal alfamannosidase og terapeutisk anvendelse derav. Endelig tilveiebringer WO 2005/073367 en fremgangsmåte for rensing av arylsulfatase A og anvendelse av enzymet i behandlingen av metakromatisk levkodystrofi.

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for konsentrering av et polypeptid av interesse og anvendelsen av en sammensetning omfattende et konsentrert polypeptid av interesse for fremstillingen av et medikament for subkutan injeksjon i pattedyr.

OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

Foreliggende oppfinnelse vedrører i ett aspekt en fremgangsmåte for konsentrering av en sammensetning omfattende et polypeptid av interesse omfattende:

a) sentrifugering og/eller filtrering av en sammensetning omfattende et polypeptid av interesse

b) konsentrering av henholdsvis supernatanten eller retentatet oppnådd i trinn a).

I et annet aspekt vedrører foreliggende oppfinnelse en sammensetning omfattende minst 10 mg/ml polypeptid av interesse.

I enda et annet aspekt vedrører foreliggende oppfinnelse anvendelse av en sammensetning omfattende 75-250 mg/ml polypeptid av interesse for fremstillingen av et medikament for subkutan injeksjon i et pattedyr.

I enda et annet aspekt vedrører foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for behandling av et pattedyr for akutt intermitterende porfyri, omfattende subkutan injisering av en sammensetning med 500-300 mg/ml PBGD.

I enda et annet aspekt vedrører foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for behandling av et pattedyr for metakromatisk levkodystrofi, omfattende subkutan injeksjon av en sammensetning med 50-300 mg/ml arylsulfatase A.

I enda et annet aspekt vedrører foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for behandling av et pattedyr for den lysosomale lagringsforstyrrelsen alfamannosidose, omfattende subkutan injeksjon av en sammensetning med 50-300 mg/ml lysosomal alfamannosidase.

I enda et annet aspekt vedrører foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for behandling et pattedyr for Krabbes sykdom, omfattende subkutan injeksjon av en sammensetning med 50-300 mg/ml galaktosylcerebrosidase.

DEFINISJONER

For formålene i foreliggende oppfinnelse kan tilpasninger av sekvenser og beregning av homologigrad utføres ved anvendelse av en full Smith-Watermantilpasning, nyttig både for protein- og DNA-tilpasninger. Standard skårmatrisene BLOSUM50 og identitetsmatrisen benyttes for henholdsvis protein- og DNA-tilpasninger. Fradraget for det første residuet i et hull (gap) er - 12 for proteiner og -16 for DNA, mens fradraget for ytterligere residuer i et hull er -2 for proteiner og -4 for DNA. Tilpasning kan gjøres med FASTA-pakken versjon v20u6 (W. R. Pearson og D. J. Lipman (1988), "Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85:2444-2448 og W. R. Pearson (1990) "Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA", Methods in Enzymology, 183:63-98).

Multiple tilpasninger av proteinsekvenser kan gjøres ved bruk av "ClustalW" (Thompson, J. D., Higgins, D. G. og Gibson, TJ. (1994) CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research, 22:4673-4680). Multiple tilpasninger av DNA-sekvenser kan gjøres ved bruk av proteintilpasningen som et templat, der aminosyrene byttes ut med det tilsvarende kodonet fra DNA-sekvensen.

I sammenheng med foreliggende oppfinnelse viser begrepet "E. C." (enzymklasse) til det internasjonalt anerkjente enzymklassifiseringssystemet "Recommendations of the Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology", Academic Press, Inc.

Begrepet "opprinnelse" brukt i forbindelse med aminosyresekvenser, f.eks. proteiner, eller nukleinsyresekvenser skal forstås som en henvisning til den organismen den utledes fra. Nevnte sekvens kan uttrykkes av en annen organisme ved anvendelse av genteknologimetoder som er velkjent for en fagmann. Dette omfatter også sekvenser som er blitt kjemisk syntetisert. Videre kan nevnte sekvenser omfatte mindre endringer som kodonoptimering, dvs. endringer i nukleinsyresekvensene som ikke påvirker aminosyresekvensen.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Polypeptid av interesse

Polypeptidet ifølge foreliggende oppfinnelse kan især være et hormon eller en hormonvariant, et enzym, en reseptor eller en del derav, et antistoff eller en del derav, et allergen eller en reporter. Polypeptidet av interesse kan især være et enzym valgt fra en av seks hovedenzymgrupper, slik som en oksidoreduktase (E.C. 1), en transferrase (E.C. 2), en hydrolase (E.C. 3), en lyase (E.C. 4), en isomerase (E.C. 5) eller en ligase (E.C. 6). I et mer spesielt aspekt kan polypeptidet av interesse være en aminopeptidase, amylase, karbohydrase, karboksypeptidase, katalase, cellulase, cellobiohydrolase, chitinase, kutinase, cyklodekstrin-glykosyltransferase, deoksyribonuklease, endoglukanase, esterase, alfa-galaktosidase, beta-galaktosidase, glukoamylase, alfa-glukosidase, betaglukosidase, invertase, laccase, lipase, mannosidase, mutanase, oksidase, pektinolytisk enzym, peroksidase, fosfolipase, fytase, polyfenoloksidase, proteolytisk enzym, ribonuklease, transglutaminase, xylanase eller betaxylosidase.

Polypeptidet av interesse kan især være et polypeptid som er nyttig som et medikament.

Eksempler på et egnet polypeptid av interesse inkluderer, men er ikke begrenset til ett som er valgt fra gruppen bestående av en porfobilinogen-deaminase, en arylsulfatase, en alfamannosidase og en galaktocerebrosidase.

I prinsippet kan et polypeptid av interesse avledbart fra enhver kilde behandles ifølge fremgangsmåtene av foreliggende oppfinnelse.

I en spesiell utførelsesform kan polypeptidet av interesse være av human opprinnelse. Især i forbindelse med anvendelse av et polypeptid av interesse for fremstillingen av et medikament som skal administreres til mennesker kan polypeptidet være av human opprinnelse siden dette kan minimere risikoen for uønskede allergiske reaksjoner. Naturlige variasjoner av humant polypeptid grunnet f.eks. polymorfisme er i konteksten av foreliggende oppfinnelse inkludert i begrepet "human opprinnelse".

Polypeptidet av interesse kan især produseres som et rekombinant protein, dvs. en nukleotidsekvens som koder polypeptidet av interesse kan introduseres i en celle for ekspresjon av polypeptidet av interesse. Den rekombinante ekspresjonen kan være homolog eller heterolog, dvs. polypeptidet av interesse kan uttrykkes i en celle som det naturlig uttrykkes av (homolog ekspresjon) eller det kan uttrykkes av en celle som det ikke naturlig uttrykkes av (heterolog ekspresjon).

Det rekombinante polypeptidet av interesse kan uttrykkes av enhver celle som er egnet for rekombinant produksjon av det spesielle polypeptidet av interesse.

Eksempler på egnede celler inkluderer, men er ikke begrenset til prokaryote celler slik som en E.coli-celle eller en Bacillus-celle. Eksempler på egnede eukaryote celler inkluderer, men er ikke begrenset til en gjærcelle eller en pattedyrcelle slik som et kinesisk hamster ovarium (CHO). Alternativt kan det være en human celle.

Egnede verstceller for ekspresjonen av glykosylert polypeptid avledes fra flerecellede organismer. Eksempler på invertebratceller inkluderer plante- og insektceller. Imidlertid kan vertscellen også være en vertebratcelle, og formering avvertebratceller i kultur (vevskultur) har blitt en rutineprosedyre.

Begrepet "rekombinant polypeptid" eller “rekombinant polypetid av interesse” angir heri et rekombinant produsert polypeptid.

Referanse til et spesielt polypeptid av interesse inkluderer i konteksten av foreliggende oppfinnelse også funksjonelt ekvivalente deler eller analoger av polypeptidet av interesse. Hvis polypeptidet av interesse er et enzym kunne for eksempel en funksjonelt ekvivalent del av enzymet være et domene eller undersekvens av enzymet som inkluderer det nødvendige katalytiske setet for å gjøre domenet eller undersekvensen i stand til å utføre hovedsakelig den samme enzymatiske aktiviteten som enzymet med full lengde eller alternativt en gen som koder for katalysatoren. Begrepet "hovedsakelig den samme enzymatiske aktiviteten" viser til en ekvivalent del eller analog som har minst 50 %, fortrinnsvis minst 60 %, mer foretrukket minst 70 %, mer foretrukket minst 75 %, mer foretrukket minst 80 %, mer foretrukket minst 85 %, mer foretrukket minst 90 %, mer foretrukket minst 95 % og mest foretrukket minst 97 %, minst 98 % eller minst 99 % av aktiviteten til det naturlige enzymet. Et eksempel på en enzymatisk ekvivalent analog av enzymet kunne være et fusjonsprotein som inkluderer det katalytiske setet i enzymet på en funksjonell form, men det kan også være en homolog variant av enzymet avledet fra en annen art. Dessuten ville også fullstendig syntetiske molekyler som etterligner den spesifikke enzymaktiviteten til det relevante enzymet utgjøre "enzymatisk ekvivalente analoger”.

Generelt vil fagpersoner være i stand til lett å tenke ut egnede assayer for bestemmelsen av enzymatiske aktivitet. For PBGD er imidlertid et egnet assay beskrevet i WO 03/002731, i eksempel 2, samt i den eksperimentelle delen av foreliggende søknader. Arylsulfatase er i tillegg til sine naturlige substrater i stand til å katalysere hydrolysen av det syntetiske, kromogene substratet paranitrokatekolsulfat (pNCS). Produktet, para-nitrokatekol (pNC), absorberer lys ved 515 nm. Et assay for bestemmelse av arylsulfataseaktivitet er beskrevet i detalj i WO 2005/073367 og i Fluharty et al. 1978, Meth. Enzymol. 50:537-47. For LAMAN er et egnet assay for enzymaktivitet beskrevet i WO 02/099092.

Porfobilinogen-deaminase

I en utførelsesform kan polypeptidet av interesse av oppfinnelsen være porfobilinogen-deaminase, (også kjent som porfobilinogenammoniakk-lyase (polymerisering)), E.C. 4.3.1.8. (Waldenström 1937, J. Acta.Med. Scand.

Suppl.8). Porfobilinogen-deaminase er det tredje enzymet i den biosyntetiske heme-veien. E. C. 4.3.1.8 har blitt overført til E.C. 2.5.1.61, så porfobilinogendeaminase (PBGD) er nå plassert under dette E.C.-nummeret.

Porfobilinogen-deaminase katalyserer reaksjonen av 4 porfobilinogen H2O = hydroksymetylbilan 4 NH3.

PBDG er viktig med hensyn på akutt intermitterende porfyri (AIP) som er en autosomal dominant lidelse hos mennesker forårsaket av en defekt (50 % aktivitetsreduksjon) av PBDG (se WO01/07065 for flere detaljer med hensyn til dette).

Porfobilinogen-deaminase er kort sagt kjent som PBGD og i konteksten av foreliggende oppfinnelse kan disse to betegnelsene anvendes omvekslende med hverandre.

For rekombinant ekspresjon av PBGD kan en vertscelle spesielt være en gjærcelle eller en E.coli-celle.

For et detaljert eksempel på konstruksjon av en rekombinant E.coli-cell vises det til eksempel 1 i WO01/07065 og for konstruksjon av rekombinante HeLa-celler og NIH 3T3-celler som er i stand til å uttrykke mus-PBGD vises det til eksempel 6 i WO01/07065.

Begrepet "rekombinant porfobilinogen-deaminase (rPBGD)" betegner heri en rekombinant produsert PBGD. I det følgende vil dette enzymet og den rekombinante humane formen bli betegnet henholdsvis “PBGD” og "rhPBGD". Innenfor dette begrepet inkluderes også en enzymatisk ekvivalent del eller analog av PBGD. Et eksempel på en enzymatisk ekvivalent del av enzymet kunne være et domene eller undersekvens av enzymet som inkluderer det nødvendige katalytiske setet for å gjøre domenet eller undersekvensen i stand til å utføre hovedsakelig den samme enzymatiske aktiviteten som enzymet med full lengde eller alternativt et gen som koder for katalysatoren. Begrepet "hovedsakelig den samme enzymatiske aktiviteten" viser til en ekvivalent del eller analogt enzym som har minst 50 %, fortrinnsvis minst 60 %, mer foretrukket minst 70 %, mer foretrukket minst 75 %, mer foretrukket minst 80 %, mer foretrukket minst 85 %, mer foretrukket minst 90 %, mer foretrukket minst 95 % og mest foretrukket minst 97 %, minst 98 % eller minst 99 % av aktiviteten til naturlig humant rhPBGD målt i rhPBGD-aktivitetsassayet beskrevet i eksempel 2 i WO 03/002731. Et eksempel på en enzymatisk ekvivalent analog av enzymet kunne være et fusjonsprotein som inkluderer katalysatorsetet i enzymet i en funksjonell form, men det kan også være en homolog variant av enzymet avledet fra en annen art. Dessuten ville fullstendig syntetiske molekyler som etterligner den spesifikke enzymaktiviteten til det relevante enzymet utgjøre "enzymatisk ekvivalente analoger”.

Et eksempel på PBGD som kan anvendes i forliggende oppfinnelse inkluderer ethvert av dem vist i sekvens 1-10 i foreliggende søknad eller i Genbank nr.

X04217, X04808 eller M95623.

Arylsulfatase

I en annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse kan polypeptidet av interesse være en arylsulfatase A.

Arylsulfatase A katalyserer reaksjonen av cerebrosid-3-sulfat H2O = cerebrosid sulfat.

ASA har blitt renset fra forskjellige kilder inkludert human lever, placenta og urin. Den er et surt glukoprotein med et lavt isoelektrisk punkt. Enzymet finnes som en dimer med en molekylvekt på ca. 110 kDa ved pH over 6,5. ASA gjennomgår en pH-avhengig polymerisasjon som danner en oktamer ved pH 4,5. I human urin består enzymet av to ikke-identiske underenheter på 63 og 54 kDa. ASA renset fra human lever, placenta og fibroblaster består også av to underenheter med noe ulik størrelse som varierer mellom 55 og 64 kDa. Som i tilfellet med andre lysosomale enzymer syntetiseres ASA på membranbundne ribosomer som en glykosylert forløper. Den passerer deretter gjennom det endoplasmiske retikulum og Golgi, hvori dens N-bundne oligosakkarider bearbeides med dannelsen av fosforylert og sulfatert oligosakkarid av den komplekse typen (Waheed A et al.

Biochim Biophys Acta. 1985, 847, 53-61, Braulke T et al. Biochem Biophys Res Commun. 1987, 143, 178-185). I normale dyrkede fibroblaster produseres et forløperpolypeptid på 62 kDa som translokerer via mannose-6-fosfatreseptorbinding (Braulke T et al. J Biol Chem. 1990, 265, 6650-6655) til et surt prelysosomalt endosom (Kelly BM et al. Eur J Cell Biol. 1989, 48, 71-78).

Arylsulfatase A kan spesielt være av human opprinnelse. Lengden (18 aminosyrer) på det humane ASA-signalpeptidet er basert på konsensussekvensen og et spesifikt bearbeidingssted for en signalsekvens. Følgelig bør spaltingen av signalpeptidet gjøres i alle celler etter residunummer 18 (Ala) fra det avledede humane ASA cDNA (EMBL GenBank aksesjonsnumre J04593 og X521151), som resulterer i den modne formen av humant ASA. I det følgende vil rekombinant arylsulfatase A forkortes til rASA, den modne formen av arylsulfatase A inkludert den modne formen av humant ASA vil bli betegnet som "mASA" og den modne rekombinante humane ASA vil bli betegnet som "mrhASA".

En proteinmodifikasjon er blitt identifisert i to eukaryote sulfataser (ASA og arylsulfatase B (ASB)) og for en fra grønnalgen Volvox carteri (Schmidt B et al. Cell. 1995, 82, 271-278, Selmer T et al. Eur J Biochem. 1996, 238, 341-345). Denne modifikasjonen fører til omdannelse av et cysteinresidu som er bevart blant kjente sulfataser i et 2-amino-3-oksopropionsyreresidu (Schmidt B et al. Cell. 1995, 82, 271-278). Det nye aminosyrederivatet gjenkjennes også som C*-formylglysin (FGly). I ASA og ASB avledet fra MSD-celler er Cys-69-residuet beholdt. Følgelig foreslås det at omdanning av Cys-69 til FGly-69 er påkrevd for å generere katalytisk aktivt ASA og ASB og at mangel på denne proteinmodifikasjonen er årsaken til MSD. Cys-69 henvises til forløper-ASA, som har et 18 residusignalpeptid. I mASA er det nevnte cysteinresiduet Cys-51. Ytterligere undersøkelser har vist at en lineær sekvens av 16 residuer som omgir Cys-51 i mASA er tilstrekkelig til å styre omdannelsen og at proteinmodifikasjonen skjer etter eller ved et sent stadium av ko-translasjonell proteintranslokasjon i det endoplasmiske retikulum når polypeptidet ennå ikke er foldet til sin opprinnelige struktur (Dierks T et al. Proc Natl Acad Sci. 1997, 94, 11963-1196, Wittke, D. et al. (2004), Acta Neuropathol. (Berl.), 108, 261-271).

Flere former av ASA har blitt vist ved elektroforese og isoelektrisk fokusering av enzympreparater fra human urin, levkocytter, blodplater, dyrkede fibroblaster og lever. Behandling med endoglykosidase H, sialidase og alkalisk fosfatase reduserer molekylstørrelsen og kompleksiteten til det elektroforetiske mønsteret, noe som antyder at mye av ladningsheterogeniteten til ASA skyldes variasjoner i karbohydratinnholdet i enzymet.

Arylsulfatase A kan især være en form av arylsulfatase A som er i stand til å krysse blod-hjerne-barrieren og/eller en form av rASA som har spesifikke merker (tags) for inntreden inn i målceller i hjernen. Især kan det være en rASA som endocytoseres effektivt in vivo via mannose-6-fosfatveien.

Følgelig kan ASA især være kovalent bundet til et såkalt merke, peptider eller proteiner som vehikler eller toksiner som vehikler som er i stand til å øke og/eller lette transporten av ASA over blod-hjerne-barrieren og/eller over cellulære membraner generelt (Schwarze et al.,Trends Cell Biol. 2000; 10(7): 290-295; Lindgren et al., Trends Pharmacol. Sci. 2000; 21(3): 99-103). Et ASA-molekyl som inneholder slike peptidsekvenser kan produseres ved ekspresjonsteknikker. Proteintransduksjonsprosessen er ikke celletypespesifikk, og mekanismen den skjer ved er ikke fullt ut belyst, imidlertid tror man at den finner sted ved en slags membranforstyrrelse og penetreringsprosess som er reseptoruavhengig. En delvis utfoldet tilstand av molekylet kan lette prosessen, men er ikke avgjørende.

Et eksempel på et egnet merke inkluderer, men er ikke begrenset til mannose-6-fosfat-merket.

Eksempler på peptider eller proteiner som vehikkel inkluderer, men er ikke begrenset til såkalte protein-transduksjonsdomener. Eksempler på egnede protein-transduksjonsdomener inkluderer, men er ikke begrenset til de nevnt i WO 2005/073367, som innlemmes heri ved referanse. Derfor kan proteintransduksjonsdomenet være 11-residubasispeptid fra HIV TAT protein – YGRKKRRQRRR (Schwarze et al.,Trends Cell Biol. 2000; 10(7): 290-295), en syntetisk versjon av TAT –YARAAARQARA som gir mer alfa-helisitet og amfipatisk preg på sekvensen (Ho et al., Cancer Res. 2001; 61(2):474-477), et syntetisk ledepeptid sammensatt av poly –R eller en blanding av basis –R- og –K-residuer i kombinasjon med andre aminosyrer og peptider basert på hydrofobe signalsekvensenheter fra enten beta-3-integrin eller Kaposis sarkom FGF (Dunican et al. Biopolymers 2001; 60(1): 45-60).

Eksempler på egnede toksiner som vehikler inkluderer, men er ikke begrenset til de beskrevet i WO 2005/073367, som innlemmes heri ved referanse.

ASA kan især omfatte en nukleinsyresekvens som koder for:

(a) aminosyresekvensen med SEQ ID NO:2 i WO 2005/073367;

(b) en del av sekvensen i (a), som er enzymatisk ekvivalent med rekombinant human arylsulfatase A

(c) en aminosyreekvensanalog som har minst 75 % sekvensidentitet med en hvilken som helst av sekvensene i (a) eller (b) og samtidig omfatter en aminosyresekvens som er enzymatisk ekvivalent med rekombinant human arylsulfatase A.

I den foreliggende kontekst er en aminosyresekvens eller en del av en aminosyresekvens som er et polypeptid i stand til å hydrolysere en mengde arylsulfatase A-substrat pNCS ved 37 °C med en rate som tilsvarer en spesifikk aktivitet på minst 20 U/mg polypeptid (fortrinnsvis 50 U/mg polypeptid) når bestemt i et assay for måling av arylsulfatase A-aktivitet som beskrevet i eksempel 1 i WO 2005/073367, og/eller et polypeptid som er i stand til å hydrolysere minst 40 % av merket arylsulfatase A-substrat, f.eks. 14C-palmitoylsulfatid lastet inn i MLD-fibroblaster, når den blir analysert ved inkubasjon ved et dosenivå på 25 mU/ml i et assay som beskrevet i eksempel 2 i WO 2005/073367.

ASA kan i en annen utførelsesform især omfatte:

(a) nukleinsyresekvensen med SEQ ID NO:1 i WO 2005/073367

(b) en del av sekvensen i (a), som koder for en aminosyresekvens som er enzymatisk ekvivalent med rekombinant human arylsulfatase A

(c) en nukleinsyresekvensanalog som har minst 75 % sekvensidentitet med en hvilken som helst av sekvensene i (a) eller (b) og samtidig koder en aminosyresekvens som er enzymatisk ekvivalent med rekombinant human arylsulfatase A.

Det kan foretrekkes at graden av sekvensidentitet mellom den ovennevnte nukleinsyresekvensen og SEQ ID NO: 1 i WO 2005/073367 er minst 80 %, slik som minst 85 %, minst 90 %, minst 95 %, minst 97 %, minst 98 % eller minst 99 %. Det kan likeledes foretrekkes at graden av sekvensidentitet mellom aminosyresekvensen kodet av den ovennevnte nukleinsyresekvensen og SEQ ID NO: 2 i WO 2005/073367 er minst 80 %, slik som minst 85 %, minst 90 %, minst 95 %, minst 97 %, minst 98 % eller minst 99 %.

For formålet i foreliggende oppfinnelse foretrekkes det at arylsulfatase A er et rekombinant enzym, spesielt foretrukket er rekombinant human arylsulfatase A (rhASA).

Det foretrekkes at rASA produseres i en pattedyrcelle eller -cellelinje og at nevnte pattedyrcelle eller -cellelinje produserer en glykoform av rASA som endocytoseres effektivt in vivo via mannose-6-fosfat-reseptorveien. Spesielt omfatter den foretrukne glykoformen av rASA en mengde eksponert mannose-6-fosfat som tillater effektiv endocytose av rASA in vivo via mannose-6-fosfatveien.

I en spesiell utførelsesform er minst en av de produserte glykoformene av rASA lik en glykoform produsert i CHO-celler.

Den post-translasjonelle modifikasjonen av cysteinresiduet i posisjon 51 i moden human arylsulfatase A er relevant for enzymaktiviteten. I en foretrukket utførelsesform av foreliggende oppfinnelse skjer følgelig produksjon av arylsulfatase A eller dens ekvivalent ved en rate og under betingelser som resulterer i et produkt som omfatter en isoform av enzymet der aminosyren som tilsvarer Cys-69 i SEQ ID NO: 2 i WO 2005/073367 omdannes til formylglysin, tilsvarende Fgly-51 i SEQ ID NO: 3 i WO 2005/073367. SEQ ID NO: 4 i WO 2005/073367 representerer moden human arylsulfatase A etter spalting av det 18. aminosyresignalpeptidet, men før modifikasjonen av C-51.

Følgelig kan ASA eller dets enzymatiske ekvivalent i en annen utførelsesform av foreliggende oppfinnelse velges fra en gruppe som består av

(a) aminosyresekvensen med SEQ ID NO:3 i WO 2005/073367;

(c) en aminosyresekvensanalog som har minst 75 % sekvensidentitet med en hvilken som helst av sekvensene i (a) eller (b) og samtidig er enzymatisk ekvivalent med rekombinant human arylsulfatase A.

Det kan foretrekkes at graden av sekvensidentitet mellom enzymet produsert ifølge oppfinnelsen og SEQ ID NO: 3 i WO 2005/073367 eller SEQ ID NO: 4 i WO 2005/073367 er minst 80 %, slik som minst 85 %, minst 90 %, minst 95 %, minst 97 %, minst 98 % eller minst 99 %.

For at den biologiske aktiviteten og effektene av enzymet in vivo skal være optimale er det en fordel dersom en tilstrekkelig mengde av enzymet har oppnådd et glykosylasjonsmønster som beskrevet over og har blitt modifisert posttranslasjonelt ved posisjon 51. Følgelig kan minst 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % eller 98 % av ASA ifølge foreliggende oppfinnelse være i den over beskrevne glykoformen/isoformen.

ASA ifølge foreliggende oppfinnelse kan hva angår dens struktur være forskjellig fra rASA ifølge SEQ ID NO: 3 i 2005/073367. Det kan være en fordel at sekvensen for aminosyreresiduene som omgir Cys-51 er identiske eller har en høy grad av sekvensidentitet med den tilsvarende sekvensen i SEQ ID NO: 3. Følgelig kan det foretrekkes at en lineær sekvens på 20 aminosyrer, slik som 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5 eller 4 aminosyreresiduer som omgir Cys-51 i arylsulfatase A er identisk eller minst 90 % identisk, slik som 95 %, 96 %, 97 %, 98 % eller 99 % identisk med tilsvarende sekvens i SEQ ID NO: 3 i 2005/073367. Siden den aktive formen av rASA innen lysosymene er en oktamer, kan ASA ifølge foreliggende oppfinnelse især være en rASA som er en oktamer eller samles til en oktamer under fysiologiske betingelser.

Enzymaktiviteten av ASA, som skal forstås som den katalytiske aktiviteten av rASA, kan måles i et enzymassay basert på rASA-mediert hydrolyse av enten et påvisbart substrat eller et substrat som fører til et påvisbart sluttprodukt. I et foretrukket aspekt er assayet basert på hydrolyse av det syntetiske, kromogene substratet para-nitrokatekolsulfat (pNCS) som har et sluttprodukt, paranitrokatekol (pNC), som absorberer lys ved 515 nm.

Lysosomal alfamannosidase

I enda en annen utførelsesform kan det interessante polypeptide være en lysosomal alfamannosidase (LAMAN). Lysomal alfamannosidase tilhører EC 3.2.1.24 og er en eksoglykosidase som hydrolyserer de terminale, ikkereduserende alfa-D-mannoseresiduene i alfa-D-mannosider fra den ikkereduserende enden under den sekvensielle degraderingen av N-bundne glykoproteiner (Aronson og Kuranda FASEB J 3:2615–2622. 1989). I konteksten av foreliggende oppfinnelse kan begrepet lysosomal alfamannosidase anvendes omvekslende med kortnavnet LAMAN.

LAMAN ifølge foreliggende oppfinnelse kan spesielt være av human opprinnelse. Det humane enzymet syntetiseres som et enkelt polypeptid på 1011 aminosyrer med et antatt signalpeptid på 49 residuer som bearbeides til tre hovedglykopeptider på 15, 42 og 70 kD (Nilssen et al. Hum.Mol.Genet. 6, 717-726. 1997).

Genet som koder for LAMAN (MANB) befinner seg ved kromosom 19 (19cen-q12), (Kaneda et al. Chromosoma 95:8–12. 1987). MANB består av 24 eksoner som måler 21,5 kb (GenBank aksesjonsnumre U60885–U60899; Riise et al. Genomics 42:200–207. 1997). LAMAN-transkriptet er » 3500 nukleotider (nts) og inneholder en åpen leseramme som koder for 1011 aminosyrer (GenBank U60266.1).

Kloningen og sekvenseringen av humant cDNA som koder for LAMAN har blitt publisert i tre artikler (Nilssen et al. Hum.Mol.Genet. 6, 717-726. 1997; Liao et al. J.Biol.Chem. 271, 28348-28358. 1996; Nebes et al.

Biochem.Biophys.Res.Commun. 200, 239-245. 1994). Merkelig nok er de tre sekvensene ikke identiske. Sammenlignet med sekvensen til Nilssen et al.

(aksesjon # U60266.1) fører en endring av TA til AT i posisjonene 1670 og 1671 til en valin- til asparginsyresubstitusjon, noe som ble funnet av Liao et al. og Nebes et al.

I en mest foretrukket utførelsesform omfatter lysosomal alfamannosidase aminosyresekvensen med SEQ ID NO.: 1 i WO 2005/094874.

Av praktiske og økonomiske grunner er det foretrukket at LAMAN ifølge foreliggende oppfinnelse produseres rekombinant. Ved rekombinant produksjon kan det også være mulig å oppnå et preparat av enzymet hvori en stor del inneholder mannose-6-fosfat. Rekombinant produksjon kan oppnås etter transfeksjon av en celle ved anvendelse av en nukleinsyresekvens som omfatter sekvensen med SEQ ID NO.: 2 i WO 2005/094874.

Alfamannosidasen lages fortrinnsvis i et cellesystem fra pattedyr siden dette vil føre til en glykosyleringsprofil som sikrer effektivt reseptormediert opptak i celler av f.eks. indre organer i kroppen. Især har det blitt funnet at produksjon av enzymet i CHO-, COS- eller BHK-celler sikrer tilstrekkelig post-translasjonell modifikasjon av enzymet ved tilsetting av mannose-6-fosfatresiduer. I tillegg oppnås en korrekt sialyleringsprofil. Korrekt sialylering er kjent for å være viktig for å forebygge opptak av leveren, på grunn av ubeskyttede galaktoseresiduer.

I enda mer foretrukne utførelsesformer velges derfor cellesystemet fra pattedyr fra gruppen omfattende CHO-, COS-celler eller BHK-celler (Stein et al. J Biol Chem.1989, 264, 1252-1259). Det kan videre foretrekkes at cellesystemet fra pattedyr er en human fibroblastcellelinje.

I en mest foretrukket utførelsesform er cellesystemet fra pattedyr en CHO-cellelinje.

I en annen utførelsesform kan den lysosomale alfamannosidasen være et preparat av lysosomal alfamannosidase hvori en del av nevnte preparat består av lysosomal alfamannosidase som har en eller flere N-bundne oligosakkarider som bærer mannose-6-fosfatgrupper.

Det er videre foretrukket at en del av et preparat av nevnte lysosomale alfamannosidase er i stand til å binde til mannose-6-fosfatreseptorer.

Enzymets evne til å bindes til mannose-6-fosfatreseptorer kan bestemmes i et in vitro-assay som beskrevet i eksempel 1 i WO 2005/094874. Her gir binding av enzymet til en MPR-affinitet 300 Matrix et mål for dets evne til å binde til mannose-6-fosfatreseptorer. I en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen skjer binding av enzymet til mannose-6-fosfatreseptorer in vitro.

I mer foretrukne utførelsesformer av oppfinnelsen tilsvarer denne delen fra 1 til 75 % av aktiviteten til et preparat av lysosomal alfamannosidase, slik som fra 2 til 70 %, slik som fra 5 til 60 %, slik som fra 10 til 50 % slik som fra 15 til 45 %, slik som fra 20 til 40 %, slik som fra 30 til 35 %.

Følgelig foretrekkes det at den lysosomale alfamannosidasen har et innhold av mannose-6-fosfatresiduer som tillater mannose-6-fosfat-avhengig binding av fra 2 til 100 %, 5 til 95 %, 10 til 90 %, 20 til 80 %, 30 til 70 % eller 40 til 60 % av mengden av enzym til en Man-6-P-reseptormatriks. For øyeblikket har fosforyleringsgraden blitt analysert i flere enzymbatcher og typisk er fra 30 til 45 % av enzymet fosforylert og binder affinitetsmatriksen.

Det foretrekkes videre at en del som utgjør 2–100 %, 5–90 %, 10–80 %, 20– 75 %, 30- 70 %, 35–65 % eller 40- 60 % av mengden av nevnte lysosomale alfamannosidase binder til Man-6-P-reseptoren med høy affinitet. Teoretisk må to mannose-6-fosfatgrupper plasseres nær hverandre for at enzymet skal binde en Man-6-P-reseptor med høy affinitet. Nyere observasjoner antyder at avstanden mellom de fosforylerte mannoseresiduene må være 40 Å eller mindre for å oppnå høy affinitetsbinding. I den humane lysosomale alfamannosidase ifølge SEQ ID NO: 1 i WO 2005/094874 kan de to mannose-6-fosfatresiduene være plassert ved asparaginresiduene i posisjonene 367 og 766. Følgelig er det foretrukket at medikamentet ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter lysosomal alfamannosidase der en del av denne bærer mannose-6-fosfatgrupper ved begge disse asparaginresiduene.

Fortrinnsvis fremstilles alfamannosidasen ved rekombinante teknikker. I en ytterligere utførelsesform er alfamannosidase av human opprinnelse (hLAMAN) og enda mer foretrukket en moden human alfamannosidase (mhLAMAN) eller et fragment derav. Fragmentet kan modifiseres, men de aktive setene på enzymet må bevares.

Det forventes at i preparater av alfamannosidase ifølge foreliggende oppfinnelse er en del av enzymet representert ved sin forløperform, mens andre deler representerer de proteolytisk bearbeidede formene på ca. 55 og 70 kDa.

Galaktocerebrosidase

I en annen utførelsesform kan polypeptidet av interesse være en galaktocerebrosidase, som kan forkortes til GALC. Galaktocerebrosidase tilhører E.C. 3.1.6.46 og er enzymer som er i stand til å katalysere reaksjonen av D-galaktosyl-N-acylsfingosin H2O = D-galaktose N-acylsfingosin således katalyserer GALC degraderingen av galaktolipider i f.eks. myelin.

GALC-enzymet avledet fra mennesker er et glykosylert lysosomalt enzym omfattende 643 aminosyrer og med en molekylvekt på 72,8 kDa. GALC ifølge foreliggende oppfinnelse kan spesielt være av human opprinnelse. I en ytterligere utførelsesform kan GALC være uttrykt rekombinant i en av de tidligere nevnte vertscellene. Vertscellen for rekombinant ekspresjon av GALC kan spesielt være en CHO-celle.

I beskrivelsen og i kravene gjøres referanse til de følgende aminosyre- og nukleinsyresekvensene:

Med henvisning til disse sekvenser omfatter polypeptidet av interesse ifølge foretrukne utførelsesformer av oppfinnelsen en aminosyre valgt fra gruppen bestående av:

i) en aminosyresekvens som definert av en hvilken som helst av SEQ ID NO.: 14, 15, 18, 19, 20, 21 og 24;

ii) en funksjonelt ekvivalent del av en aminosyresekvens som definert i i); og iii) en funksjonelt ekvivalent analog av en aminosyresekvens som definert i) eller ii), der aminosyresekvensen av nevnte analog er minst 75 % identisk med en aminosyresekvens som definert i i) eller ii).

I særlige utførelsesformer er analogen i iii) minst 80 % identisk med en sekvens som definert i i) eller ii), slik som minst 85 %, minst 90 %, minst 95 %, minst 98 %, minst 99 % eller slik som minst 99,5 % identisk med en sekvens som definert i i) eller ii).

Videre kan polypeptidet av interesse oppnås ved rekombinant ekspresjon ved anvendelse av en nukleinsyresekvens omfattende en sekvens valgt fra gruppen bestående av:

i) en nukleinsyresekvens som definert av en hvilken som helst av SEQ ID NO.: 1-13, 16, 17, 22 og 23;

ii) en nukleinsyresekvens som er minst 75 % identisk med en nukleinsyresekvens som definert i i).

For rekombinant produksjon av polypeptidet kan det videre være foretrukket at syresekvensen i ii) er minst 80 % identisk med en sekvens som definert i i), slik som minst 85 %, minst 90 %, minst 95 %, minst 98 %, minst 99 % eller slik som minst 99,5 % identisk med en sekvens som definert i i).

Sammensetning omfattende et polypeptid av interesse

Den følgende beskrivelsen av en sammensetning omfattende et polypeptid av interesse vedrører både en sammensetning omfattende et polypeptid som er konsentrert ifølge en fremgangsmåte ifølge foreliggende oppfinnelse og den vedrører også en sammensetning ifølge foreliggende oppfinnelse omfattende minst 10 mg/ml polypeptid av interesse.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også en sammensetning omfattende minst 10 mg/ml polypeptid av interesse, hvori polypeptidet av interesse kan være ethvert polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse slik som spesielt rhPBGD, arylsulfatase, alfamannosidase eller galaktocerebrosidase. Nevnte sammensetning kan spesielt omfatte minst 25 mg/ml polypeptid av interesse, slik som minst 50 mg/ml eller minst 75 mg/ml eller minst 100 mg/ml polypeptid av interesse. Følgelig kan nevnte sammensetning spesielt omfatte mellom 10-1000 mg/ml polypeptid av interesse, slik som mellom 10-500 mg/ml eller mellom 10-300 mg/ml eller mellom 10-200 mg/ml eller mellom 25-500 mg/ml eller mellom 25-400 mg/ml eller mellom 40-400 mg/ml eller mellom 40-300 mg/ml eller mellom 50-400 mg/ml eller mellom 50-300 mg/ml eller mellom 75-400 mg/ml eller mellom 75300 mg/ml eller mellom 100-200 mg/ml eller mellom 100-150 mg/ml polypeptid av interesse.

Sammensetningen omfattende et polypeptid av interesse kan spesielt være en vandig løsning.

I tillegg til å omfatte en høy konsentrasjon av polypeptid av interesse kan nevnte sammensetning især ytterligere ikke omfatte aggregater av polypeptidet av interesse eller i det minste kun svært få aggregater. Følgelig kan mengden polypeptid av interesse til stede som aggregater især utgjøre mindre enn 5 vekt/vekt-% av den totale mengden av polypeptid av interesse i sammensetningen. Især kan nevnte aggregater utgjøre mindre enn 4 vekt/vekt-%, slik som mindre enn 3 vekt/vekt-%, eller mindre enn 2 vekt/vekt-%, eller mindre enn 1 vekt/vekt-%, eller mindre enn 0,5 vekt/vekt-%, eller mindre enn 0,1 vekt/vekt-% av den totale mengden polypeptid av interesse. I foreliggende kontekst betyr betegnelsen “aggregater” enhver form av polypeptidet av interesse som ikke er monomert. Følgelig omfatter begrepet enhver dimer eller multimer av polypeptidet av interesse.

Videre er det en fordel dersom nevnte sammensetning omfatter kun polypeptidet av interesse eller minst kun mindre spor av andre proteiner, dvs. proteiner forskjellig fra polypeptidet av interesse. Følgelig omfatter sammensetningen i en spesiell utførelsesform mindre enn 1 vekt/vekt-%, slik som mindre enn 0,5 vekt/vekt-%, eller mindre enn 0,1 vekt/vekt-%, eller mindre enn 0,05 vekt/vekt-%, eller mindre enn 0,01 vekt/vekt-% av andre proteiner enn polypeptidet av interesse.

En rekke faktorer påvirker stabiliteten og aktiviteten til polypeptider og sammensetningen som omfatter et polypeptid av interesse kan derfor især være optimalisert for å holde polypeptidet av interesse så stabilt som mulig.

pH påvirker generelt stabiliteten til et polypeptid av interesse og derfor kan pH i en sammensetning omfattende et polypeptid av interesse spesielt være i området 7,5-8,5, slik som især mellom pH 7,7-8,2, mer spesielt mellom pH 7,8-8,0 eller mellom pH 7,85-7,95, slik som pH 7,8 eller pH 7,9. Dette kan især være tilfellet hvis polypeptidet av interesse er PBGD.

Derfor kan sammensetningen omfattende et polypeptid av interesse især omfatte en buffer som er i stand til å holde sammensetningen innenfor det beskrevne pH-området. Eksempler på slike buffere inkluderer, men er ikke begrenset til TRIS-HCl, Na-citrat og Na2HPO4. Konsentrasjonen av en slik buffer kan avhenge av valget av den spesielle bufferen og nærvær av andre komponenter i sammensetningen. Dersom bufferen er Na2HPO4 kan konsentrasjonen av Na2HPO4 vær i området 0,5-15 mM, slik som i området 1-10 mM, eller i området 1,5-7,5 mM, slik som i området 1,83-7,4 mM, eller i området 1,5-3 mM, slik som i området 1,83-3,7 mM, eller i området 1,83-2,45 mM, eller i området 3,5-7,5 mM, slik som i området 3,6-7,4 mM, eller i området 5,4-7,4 mM, slik som 1,84 mM eller 2,45 mM eller 3,67 mM eller 5,51 mM eller 7,34 mM.

Dersom bufferen er TRIS-HCl kan konsentrasjonen av TRIS-HCl især være i området 2-50 mM, slik som 2-40 mM eller 2-30 mM eller 2-20 mM eller 2-10 mM eller 5-25 mM eller 5-20 mM eller 8-12 mM eller 9-11 mM, f.eks. 10 mM.

Eksempler på andre forbindelser som sammensetningen omfattende et polypeptid av interesse kan omfatte inkluderer, men er ikke begrenset til aminosyrer, sukre, alkoholer og detergenter. Eksempler på slike egnede forbindelser inkluderer, men er ikke begrenset til glysin, mannitol, sukrose, L-serin, Tween 80 eller en kombinasjon av en eller flere av nevnte forbindelser. Konsentrasjonen av disse forbindelsene avhenger av den spesielle forbindelsen, men for glysin kan konsentrasjonen især være i området 1-200 mM, slik som i området 5-190 mM, eller i området 10-180 mM, eller i området 10-170 mM, eller i området 20-160 mM, eller i området 20-150 mM, eller i området 25-125 mM, eller i området 5-100 mM, eller i området 5-90 mM, eller i området 5-80 mM, eller i området 5-70 mM, eller i området 5-60 mM, eller i området 10-100 mM, eller i området 10-90 mM, eller i området 10-80 mM, eller i området 10-70 mM, eller i området 10-60 mM, eller i området 12-60 mM, eller i området 12-55 mM, eller i området 13,5-54 mM, eller i området 10-30 mM, slik som i området 13,5-27 mM, eller i området 13,5-18 mM, eller i området 25-55 mM, slik som i området 27-54 mM, eller i området 40-55, slik som i området 40,5-54 mM, slik som 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 39,5, 40, 40,5, 41, 41,5 eller 53, 53,5, 53, 54,5 eller 55 mM.

Konsentrasjonen for mannitol kan især være i området 50-1000 mM, slik som i området 50-900 mM, eller i området 50-800 mM, eller i området 50-700 mM, eller i området 50-600 mM, eller i området 100-900 mM, eller i området 100-800 mM, eller i området 100-700 mM, eller i området 100-600 mM, eller i området 100-500 mM, eller i området 120-525 mM, eller i området 125-500 mM, eller i området 100-300 mM, slik som i området 120-275 mM, eller i området 120-170 mM, eller i området 200-600 mM, slik som i området 225-550 mM, eller i området 240-510 mM, eller i området 370-525 mM, slik som 120, 125, 130, 160, 165, 166,7, 170, 175, 200, 221, 225, 250, 275, 300, 365, 370, 375, 380, 385, 490, 495, 500, 505 eller 510 mM.

Konsentrasjonen av sukrose kan især være i området 1-200 mM, slik som i området 5-190 mM, eller i området 10-180 mM, eller i området 10-170 mM, eller i området 20-160 mM, eller i området 20-150 mM, eller i området 25-125 mM, eller i området 5-100 mM, eller i området 5-90 mM, eller i området 5-80 mM, eller i området 5-70 mM, eller i området 5-60 mM, eller i området 10-100 mM, eller i området 10-90 mM, eller i området 10-80 mM, eller i området 10-70 mM, eller i området 10-60 mM, eller i området 12-60 mM, eller i området 12-55 mM, eller i området 13,5-54 mM, eller i området 10-30 mM, slik som i området 13,5-27 mM, eller i området 13,5-18 mM, eller i området 25-55 mM, slik som i området 27-54 mM, eller i området 40-55, slik som i området 40,5-54 mM, slik som 12,5, 13, 13,5, 14, 14,5, 17, 17,5, 18, 18,5, 19, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 39,5, 40, 40,5, 41, 41,5 eller 53, 53,5, 53, 54,5 eller 55 mM. Hvis sukrose er inkludert i en sammensetning som også omfatter mannitol, kan konsentrasjonen av mannitol især senkes tilsvarende konsentrasjonen av sukrose; dvs. konsentrasjonen av mannitol og sukrose sammen kan især være den samme som konsentrasjonen av mannitol, hvis denne skulle anvendes alene.

Konsentrasjonen av Tween 80 kan især være i området 0,001-1 vekt/volum-%, slik som i området 0,005-1 vekt/volum-%, eller i området 0,01-1 vekt/volum-%, eller i området 0,001-0,5 vekt/volum eller i området 0,005-0,5 vekt/volum-%, eller i området 0,01-0,5 vekt/volum-%, eller i området 0,05-0,4 vekt/volum-%, eller i området 0,05-0,3 vekt/volum-%, eller i området 0,05-0,2 vekt/volum-%, eller i området 0,075-0,4 vekt/volum-%, eller i området 0,075-0,3 vekt/volum-%, eller i området 0,075-0,2 vekt/volum-%, eller i området 0,09-0,2 vekt/volum-%, slik som 0,075, 0,08, 0,09, 0,1, 0,125, 0,15, 0,175 eller 0.2 vekt/volum-%.

Sammensetningen omfattende et polypeptid av interesse hvori polypeptidet især kan være PBGD, en arylsulfatase, en lysosomal alfamannosidase eller en galaktocerebrosidase, kan især omfatte en kombinasjon av en eller flere av de ovennevnte forbindelsene. Et egnet eksempel på en slik sammensetning kan være en som i tillegg til polypeptidet av interesse omfatter Na2HPO4, glysin og mannitol. Sammensetningens pH og konsentrasjonen av de forskjellige forbindelsene kan være som beskrevet ovenfor. Nevnte sammensetning kan derfor i en utførelsesform omfatte 0,5-15 mM Na2HPO4, 1-200 mM glysin, 50-1000 mM mannitol og en pH i området 7,5-8,5. Enhver kombinasjon av de ovennevnte konsentrasjonene av forbindelser og pH er omfattet av foreliggende oppfinnelse. Et spesifikt eksempel på en egnet kombinasjon av andre forbindelser og pH i sammensetningen omfattende et polypeptid av interesse er en som omfatter 3,67 mM Na2HPO4, 27 mM glysin, 250 mM mannitol og har en pH i området 7,7 til 7,9.

Andre eksempler på egnede sammensetninger inkluderer, men er ikke begrenset til enhver av de følgende:

● 1,84 mM Na2HPO4, 13,5 mM glysin, 125 mM mannitol og pH i området 7,7 til 7,9.

● 2,45 mM Na2HPO4, 18 mM glysin, 167 mM mannitol og pH i området 7,7 til 7,9.

● 5,51 mM Na2HPO4, 40,5 mM glysin, 375 mM mannitol og pH i området 7,7 til 7,9.

● 7,34 mM Na2HPO4, 54 mM glysin, 500 mM mannitol og pH i området 7,7 til 7,9.

● 3,67 mM Na2HPO4, 27 mM glysin, 220 mM mannitol, 30 mM sukrose og pH i området 7,7 til 7,9.

● 3,67 mM Na2HPO4, 245 mM mannitol, 32 mM sukrose og pH i området 7,7 til 7,9.

● 3,67 mM Na2HPO4, 27 mM L-serin, 250 mM mannitol og pH i området 7,7 til 7,9.

● 10 mM TRIS-HCl, 27 mM glysin, 250 mM mannitol og pH i området 7,7 til 7,9.

● 3,67 mM NaCitrat, 27 mM glysin, 250 mM mannitol og pH i området 7,7 til 7,9.

● 3,67 mM Na2HPO4, 27 mM glysin, 220 mM mannitol, 29 mM sukrose, 0,1 vekt/volum-% Tween 80 og pH i området 7,7 til 7,9.

Sammensetningen omfattende et polypeptid av interesse kan især anvendes for terapeutisk applikasjoner hos pattedyr. Sammensetningen omfattende et polypeptid av interesse kan derfor især være isoton med hensyn til vevet i pattedyr, f.eks. kan den især ha en osmolalitet i området 200-400 mOsm/kg, slik som i området 250-350 mOsm/kg eller i området 275-325 mOsm/kg eller i området 295-305 mOsm/kg, slik som 295 mOsm/kg eller 300 mOsm/kg eller 305 mOsm/kg.

Fremgangsmåte for konsentrering av et polypeptid av interesse

Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter trinnene med a) sentrifugering og/eller filtrering av en sammensetning omfattende et polypeptid av interesse og b) konsentrering av sammensetningen fra trinn a). Oppfinnerne av foreliggende oppfinnelse har funnet at ved sentrifugering og/eller filtrering av en sammensetning omfattende et polypeptid av interesse før konsentrering av nevnte sammensetning er det mulig å oppnå en sammensetning som omfatter et høyt konsentrert polypeptid av interesse uten noen eller med i det minste kun noen få aggregater av polypeptidet av interesse. Videre er det generelt en fordel for terapeutiske anvendelser av et polypeptid at mengden polypeptidaggregater reduseres, f.eks. siden de kan øke risikoen for å fremkalle en immunrespons mot polypeptidet.

For subkutan administrasjon av et polypeptid er det en fordel at polypeptidsammensetningen har en høy aktivitet i et lite volum siden kun små volum kan injiseres subkutant.

Proteiner eller polypeptider kan generelt danne aggregater når de er konsentrert. Det er følgelig en fordel at når fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse anvendes for å konsentrere et polypeptid av interesse ikke forårsaker en høy grad av polypeptidaggregatdannelse. Som vist i eksemplene er mengden PBGD-aggregater i sammensetningen som oppnås ved konsentreringsfremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse lignende den for en ikke-konsentrert PBGD-sammensetning.

I en spesiell utførelsesform utføres trinn a) i fremgangsmåten før trinn b).

Trinn a) sentrifugering og/eller filtrering

Oppfinnerne av foreliggende oppfinnelse har funnet at før konsentrering av en sammensetning omfattende et polypeptid av interesse er det en fordel å forbehandle sammensetningen ved sentrifugering og/eller filtrering av sammensetningen siden mange eller de fleste polypeptidaggregatene fjernes ved denne forbehandlingen.

Når konsentrasjonen av sammensetningen i trinn b) utføres ved en fremgangsmåte som avhenger av bruken av et filter eller en membran, slik som ultrafiltrering, kan nærvær av aggregater blokkere filteret eller membranen slik at små molekyler og væske ikke er i stand til å passere filteret eller membranen. Dette kan minske hastigheten med hvilken sammensetningen konsentreres og/eller fullstendig blokkere videre konsentrasjon.

For denne typen konsentrasjon er dermed forbehandlingen ifølge trinn a) en fordel siden fjerning av aggregatene gjør det mulig å oppnå sammensetninger av et polypeptid av interesse som er mer konsentrert enn om nevnte sammensetning ikke ble forbehandlet.

Når konsentrasjonen av sammensetningen i trinn b) utføres ved en fremgangsmåte som er basert på fjerning av vann, slik som frysetørking eller inndamping, har forbehandlingen i trinn a) fordelen at den reduserer mengden aggregater til stede i den konsentrerte sammensetningen.

Trinn a) kan utføres ved en av følgende tre alternativer:

● sentrifugering,

● filtrering, eller

● sentrifugering og filtrering.

Dersom trinn a) omfatter både sentrifugering og filtrering er det en fordel å utføre sentrifugeringen før filtreringen siden oppfinnerne av foreliggende oppfinnelse har funnet at sentrifugeringen fjerner det meste av store aggregater og etterfølgende filtrering fjerner de gjenværende mindre aggregatene.

Sentrifugering

For å kunne fjerne aggregatene kan sammensetningen omfattende et polypeptid av interesse sentrifugeres ved en kraft i området 1500–3000 g, slik som i området 1800-2500 g, eller i området 2000-2300 g.

Typisk kan sammensetningen sentrifugeres i 10-60 minutter, slik som i 15-50 minutter eller i 20-40 minutter.

Siden temperaturen kan påvirke stabiliteten til polypeptidet av interesse kan sentrifugeringen utføres ved en temperatur i området 2-20 °C, slik som fra 3-15 °C eller i området 3-10 °C, eller i området 3-8 °C, slik som ved 4 °C eller 5 °C eller 6 °C.

Sentrifugeringen fører til at aggregatene av polypeptidet av interesse sedimenterer, dvs. de danner en pellet, mens de enkelte molekylene av polypeptidet av interesse forblir i løsningen. Således er det supernatanten av den sentrifugerte sammensetningen som deretter anvendes i fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse.

Filtrering

Sammensetningen omfattende et polypeptid av interesse kan filtreres gjennom et filter med en porestørrelse i området 0,20-5 �m, slik som i området 0,2-2,5 �m.

I tillegg til filterets porestørrelse kan også materialet filteret er laget av påvirke filtrering av polypeptidet av interesse. Eksempler på egnede membranfiltre inkluderer, men er ikke begrenset til polyetersulfon (PES), celluloseacetat, regenerert cellulose og polyviylidenflourid (PVDF).

Når molekyler slik som proteiner filtreres, er det vanligvis de små molekylene som fjernes således kan polypeptidet av interesse generelt være til stede i retentatet etter filtreringen. Det er derfor generelt retentatet fra filtreringen som anvendes i etterfølgende trinn av foreliggende oppfinnelse.

Trinn b) konsentrering

I prinsippet kan enhver fremgangsmåte for konsentrering av sammensetningen med polypeptidet av interesse anvendes i trinn b) av foreliggende oppfinnelse.

Eksempler på slike egnede fremgangsmåter inkluderer, men er ikke begrenset til ultrafiltrering og konsentrasjon ved fjerning av vann.

Ultrafiltrering

Ultrafiltrering er en separasjonsmetode der hydraulisk trykk anvendes for å tvinge molekyler og løsningsmiddel gjennom en membran omfattende porer med en spesiell størrelse, også kjent som cut-off-størrelsesverdien. Kun molekyler som har en molekylvekt mindre enn cut-off-verdien til membranen er i stand til å passere membranen mens de med en større molekylvekt ikke passerer membranen og danner det såkalte retentatet. Molekylene til stede i retentatet konsentreres dermed siden løsningsmidlet strømmer gjennom membranen.

I en spesiell utførelsesform kan konsentrasjonen av løsningen eller sammensetningen omfattende et polypeptid av interesse utføres ved tangential strømningsfiltrering (TFF). Denne metoden er spesielt nyttig for konsentrasjon i stor skala, dvs. for konsentrasjon av løsninger med et volum fra en liter til flere hundre liter. Denne fremgangsmåten er derfor spesielt nyttig for produksjon av konsentrerte løsninger av et polypeptid av interesse i industriell skala.

TFF-teknikken er basert på bruken av et spesielt apparat som sørger for at løsningen som skal filtreres strømmer gjennom en semipermeabel membran, der kun molekyler som er mindre enn membranporene vil passere gjennom membranen og danne filtratet, etterlatende større materiale for å bli samlet (retentat). Med TFF-fremgangsmåten anvendes to forskjellige trykk, ett for å pumpe løsningen inn i systemet og sirkulere den i systemet (innløpstrykk), og et annet trykk anvendes over membranen (membrantrykk) for å presse de små molekylene og løsningsmidlet gjennom membranen. Innløpstrykket kan typisk være i området 1-3 bar, slik som mellom 1,5 og 2 bar. Membrantrykket kan typisk være større enn 1 bar.

Den konsentrerte sammensetningen med et polypeptid av interesse kan samles som retentatet når TFF anvendes for å konsentrere sammensetningen.

Nyttige membraner for TFF kan typisk være laget av regenerert cellulose eller polyetersolufon (PES).

Membranens porestørrelse kan typisk ha en molekylvekt-cut-off som er mindre enn 10.000 Mw, slik som i området 10-10.000 Mw.

I en annen utførelsesform kan konsentrasjonen av sammensetningen omfattende et polypeptid av interesse utføres ved anvendelse av en sentrifugalanordning. Prinsippet for denne metoden er at løsningen filtreres over en membran ved å bruke en sentrifugal kraft over membranen. Slike membraner karakteriseres ofte ved en molekylvekt (Mw)-cut-off, dvs. at dette er den maksimale molekylstørrelse for forbindelser som er i stand til å krysse membranen, og en forbindelse med en molekylstørrelse større enn dette vil ikke passere membranen. Mw-cut-off for membranene brukt i foreliggende oppfinnelse kan især være mindre enn 30.000 Mw, slik som mellom 10-30.000 Mw.

Membranen kan især være laget av polyetersulfon (PES) eller regenerert cellulose.

Eksempler på slike egnede kommersielle filteranordninger kan være Centricon Plus-80 eller Centricon Plus-15.

Konsentrasjonen kan typisk utføres ved sentrifugering ved 2000-4500 g, slik som mellom 2500-4000 g, eller mellom 2750-3500 g, eller mellom 3000-3500 g, slik som ved 3000 g eller 3100 g eller 3200 g eller 3300 g eller 3400 g eller 3500 g.

Typisk kan sentrifugeringen utføres i flere timer, f.eks. i mer enn en time, slik som i 1-10 timer.

For å minimere eventuelle negative effekter på stabiliteten til polypeptidet av interesse kan sentrifugeringen især utføres ved en temperatur i området 2-20 °C, slik som i området 3-15 °C eller i området 3-10 °C eller i området 3-6 °C.

Konsentrering ved fjerning av vann

Prinsippet for konsentrasjon ved fjerning av vann er vanligvis at alt eller det meste av vannet fjernes for å oppnå et fast stoff og deretter etterfølgende fortynning eller oppløsning av dette faste stoffet i et vannvolum som er mindre enn det var fortynnet eller løst i tidligere. Det kan imidlertid i prinsippet utføres ved bare å fjerne den nødvendige mengde vann for å oppnå den ønskede konsentrasjonen uten deretter å fortynne eller løse forbindelsen på nytt.

Eksempler på egnede fremgangsmåter for konsentrering ved fjerning av vann inkluderer frysetørring og inndamping.

Både for frysetørring og inndamping er de tre mest relevante parameterne temperatur, trykk og tid.

Fremgangsmåten for frysetørring kan omfatte følgende tre eller fire trinn; en frysefase, en primær tørkefase og en sekundær tørkefase og eventuelt et trinn for temperering etter frysefasen. Frysetørking kan især utføres som beskrevet med hensyn til frysetørking inkludert som et ytterligere trinn i fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse.

Ytterligere trinn

Polypeptidet av interesse kan avledes fra en naturlig kilde, dvs. fra celler som naturlig uttrykker polypeptidet av interesse, eller det kan især uttrykkes rekombinant.

Uavhengig av hvor polypeptidet av interesse avledes fra kan det ha blitt renset før det gjennomgår en fremgangsmåte ifølge foreliggende oppfinnelse.

Slik “rensing” kan især inkludere, men er ikke begrenset til fjerning av cellerester, fjerning av andre proteiner enn polypeptidet av interesse og fjerning av andre komponenter som kan være til stede i kilden som polypeptidet av interesse er avledet fra. I en spesiell utførelsesform av foreliggende oppfinnelse omfatter følgelig sammensetningen omfattende et polypeptid av interesse mindre enn 5 vekt/vekt-%, eller mindre enn 1 vekt/vekt-% eller mindre enn 0,5 vekt/vekt-% eller mindre enn 0,1 vekt/vekt-% eller mindre enn 0,05 vekt/vekt-% eller mindre enn 0,01 vekt/vekt-% av andre proteiner enn polypeptidet av interesse.

Følgelig kan andre proteiner som uttrykkes av f.eks. en vertscelle fjernes fra sammensetningen omfattende et polypeptid av interesse før det anvendes i en fremgangsmåte ifølge foreliggende oppfinnelse.

Følgelig kan fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse i en spesiell utførelsesform omfatte ett eller flere av følgende trinn før trinn a):

i) rekombinant ekspresjon av et polypeptid av interesse

ii) rensing av en sammensetning med et polypeptid av interesse ved ett eller flere kromatografitrinn

iii) bytte av formuleringsbufferen

Rekombinant ekspresjon av et polypeptid av interesse kan især utføres som beskrevet tidligere med hensyn til polypeptidet av interesse.

Dersom polypeptidet av interesse er PBGD, inkluderer eksempler på egnede typer kromatografi, men ikke være begrenset til affinitetskromatografi, ionebyttekromatografi (IEC) og kromatografi på en hydroksyapatittkolonne. I prinsippet kan en hvilken som helst kombinasjon av disse kromatografimetodene brukes. Oppfinnerne av foreliggende oppfinnelse har tidligere funnet at det for PBGD er en fordel å utføre minst trinnet med affinitetskromatografi, og hvis dette kombineres med en hvilken som helst av de andre kromatografimetodene, er det en fordel å utføre trinnet med affinitetskromatografi før de andre kromatografitrinnene (se f.eks. WO 03/002731).

For utførelsesformen der polypeptidet av interesse er PBGD inkluderer eksempler på kommersielt tilgjengelige kromatografikolonner affinitetskobling, gruppespesifikk affinitet og metallchelat-affinitetskolonner.

Produktkatalogen 2001 fra firmaet Amersham Pharmacia Biotech gir eksempler på affinitetskoblingskolonner slik som kolonner omfattende immobiliseringsligander som inneholder -NH2 og kolonner omfattende ligander som inneholder primære aminogrupper.

Metallchelat-affinitetskolonner er spesielt foretrukket for rensing av proteiner via metallionkompleksdannelse med ubeskyttede histidingrupper. Eksempel 3 i WO01/07065 beskriver konstruksjon av en rekombinant human porfobilinogendeamiase med en "His-Tag" (rhPBGD-His). For å rense rhPBGD-His er det foretrukket å bruke en metallchelat-affinitetskolonne, slik som en kolonne som har et koboltmetallaffinitetsresin.

Eksempler på andre egnede metoder for affinitetskromatografi inkluderer, men er ikke begrenset til kolonner som har svineheparin som ligand eller kolonner som har 1-amino-4-[[4-[[4-klor-6-[[3 (eller 4)-sulfofenyl]amino]-1,3,5-triazi-2-yl]amino]-3-sulfofenyl]amio]-9,10-dihydro-9,10-diokso-2-antrasensulfonsyre, også kjent som Cibracon Blue 3G, som ligand og bruk av Triazin-kobling som ligandkoblingsmetoden. Et kommersielt tilgjengelig eksempel på det siste er Blue Sepharose 6 Fast Flow (FF) fra Amersham Pharmacia Biotech. Følgelig vedrører en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen prosessen, som beskrevet heri, hvori affinitetskromatografikolonnen i trinn (i) er en kolonne som bruker en triazinkobling som ligandkoblingsmetode og mer foretrukket hvori liganden er Cibacron Blue 3G.

Begrepet "ionebyttekromatografi (IEC)" skal heri forstås i henhold til faget, som en kolonne som separerer molekyler slik som proteiner på grunnlag av deres nettoladning ved en viss pH ved elektrostatisk binding til en ladet gruppe på kolonnen. Ionebytte betegner absorpsjonen av ioner av en type på en kolonne i bytte med andre som tapes i løsning.

Eksempler på egnede IEC-kolonner er kolonner slik som en Q Sepharosekolonnne, en Q SP Sepharose-kolonne eller en CM Sepharose-kolonne, det kan især være en DEAE Sepharose-kolonne.

Et eksempel på en egnet hydroksyapatittkolonne er en keramisk hydroksyapatittkolonne. Hydroksyapatitt (Ca5(PO4)3OH)2 er en form for kalsiumfosfat som kan anvendes til separasjon og rensing av proteiner, enzymer, nukleinsyrer, virus og andre makromolekyler. Keramisk hydroksyapatitt er en sfærisk, makroporøs form av hydroksyapatitt. CHT Type I (Bio-Rad) er et eksempel på en egnet kommersielt tilgjengelig keramisk hydroksyapatittkromatografikolonne.

Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan i en utførelsesform omfatte følgende trinn før trinn a):

i) rekombinant ekspresjon av PBGD

ii) la PBGD-sammensetningen fra trinn i) gjennomgå affinitetskromatografi

iii) la PBGD-sammensetningen fra trinn ii) gjennomgå ionebyttekromatografi

Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan i en ytterligere utførelsesform omfatte følgende trinn før trinn a):

i) rekombinant ekspresjon av PBGD

ii) la PBGD-sammensetningen fra trinn i) gjennomgå affinitetskromatografi

iii) la PBGD-sammensetningen fra trinn ii) gjennomgå ionebyttekromatografi

iv) la PBGD-sammensetningen fra trinn iii) gjennomgå en hydroksyapatittkolonne

Begge disse fremgangsmåtene kan eventuelt inkludere et videre trinn med fortynning av diafiltrering av PBGD-sammensetningen oppnådd fra trinn ii).

Følgelig bør nevnte trinn komme etter trinn ii) og før iii), dvs. et trinn iia). Trinn iia) har som formål å redusere konsentrasjonen av salter til egnet ledningsevne, f.eks. < 10 mS/cm. Dette kan især være relevant dersom DEAE Sepharose anvendes som resin i ionebyttekromatografitrinnet, dvs. trinn iii), siden dette kan fremme binding av det fangede PBGD til DEAE Sepharose-resinet. Fortynning kan oppnås ved tilsetting av renset vann direkte eller ved ultrafiltrering mot renset vann.

Den rekombinante ekspresjonen av PBGD, trinn i) kan utføres ved enhver av fremgangsmåtene beskrevet over.

Eksempler på egnede affinitetskromatografikolonner i trinn ii) kan være enhver av de ovennevnte.

Eksempler på egnede fremgangsmåter for å utføre ionebyttekromatografi i trinn iii) kan være enhver av de ovennevnte.

Eksempler på egnede hydroksyapatitkromatografikolonner i trinn iv) kan være enhver av de ovennevnte.

I en spesiell utførelsesform kan affinitetskromatografikolonnen være en kolonne som bruker en triazinkobling som ligandkoblingsmetode og især en slik metode hvori liganden er Cibracon Blue 3G. Dette kan især være en Blue Sepharose 6 Fast Flow-kolonne og ionebyttekromatografikolonnen kan være DEAE Sepharosekolonne, og i utførelsesformen hvori fremgangsmåten også omfatter et trinn iv) kan denne kolonnen især være en keramisk hydroksyapatittkolonne.

Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan også omfatte ytterligere trinn etter trinn b) i fremgangsmåten. Slike trinn inkluderer, men er ikke begrenset til ett eller flere av følgende:

● frysetørking av sammensetningen omfattende et konsentrert polypeptid av interesse,

● endring av bufferen i sammensetningen omfattende et konsentrert polypeptid av interesse,

● sterilfiltrering av sammensetningen omfattende et konsentrert polypeptid av interesse,

● inndamping

Forskjellige frysetørkere, volum av løsninger som skal frysetørkes og andre parametere kan anvendes i fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse. Et eksempel på en egnet frysetørker inkluderer, men er ikke begrenset til en Lyostar-frysetørker (FTM-systems) som er brukt i eksemplene ifølge foreliggende oppfinnelse, hvori løsningene omfattende et konsentrert polypeptid av interesse, dvs. i dette tilfellet PBGD, ble fylt i 2 og 6 ml injeksjonsglassflasker (type 1) og lukket med gummikorker (klorbutyl). Frysetørkingen kan utføres ved følgende tre trinn;

i) frysing,

ii) Primær tørking og

iii) Sekundær tørking.

Trinn i) frysing kan især utføres ved å først laste en prøve i omgivelsestemperatur og avkjøle den til 0 °C og holde den ved 0 °C i 30 minutter før temperaturen senkes med 1 °C per minutt til -40 °C og holde den ved -40 °C i 30 minutter.

Trinn ii) primær tørking kan især utføres ved å senke vakuumtrykket til 126 mTorr, øke temperaturen med 1 °C per minutt til 0 °C og holde prøven ved 0 °C i 360 minutter.

Trinn iii) sekundær tørking kan især utføres ved å senke trykket til fullt vakuum samtidig som temperaturen økes med 0,5 °C per minutt til 30 °C, og holde prøven ved 30°C i 360 minutter.

Etter den sekundære tørkingen kan prøven ytterligere lukkes under vakuum eller lukkes etter fylling med nitrogen.

Et eksempel på en egnet frysetørkingsfremgangsmåte inkluderer den som er beskrevet i eksemplene ifølge foreliggende oppfinnelse.

Frysetørkingen kan i en ytterligere utførelsesform omfatte et tempereringstrinn før den primære tørkefasen. Oppfinnerne av foreliggende oppfinnelse har funnet at inkludering av et tempereringstrinn i frysetørkingsfremgangsmåten forbedrer det visuelle utseendet i form av færre sprekker og/eller fører til en kortere rekonstitueringstid for det frysetørkede produktet sammenlignet med når samme fremgangsmåte for frysetørking brukes, men uten tempereringstrinnet. Det er en fordel at tiden for å rekonstituere et frysetørket produkt reduseres og spesielt dersom det skal anvendes som et farmasøytisk middel som administreres som en løsning. Et forbedret visuelt utseende ansees vanligvis som en fordel for de fleste produkter.

Derfor kan frysetørkingen omfatte følgende trinn:

i) frysing

ii) temperering

iii) primær tørking

iv) sekundær tørking.

Trinnene med frysing, primær tørking og sekundær tørking kan især utføres som beskrevet over. Tempereringstrinnet, dvs. trinn ii) kan især utføres etter 30 minutters frysing, ved å heve temperaturen med f.eks. en hastighet på 2 °C per minutt til -10 °C eller -20 °C og holde denne temperaturen i 120 eller 420 minutter og deretter senke temperaturen for eksempel med en hastighet på 2 °C per minutt til -40 °C ved hvilken temperatur prøven kan holdes i 60-90 minutter før start på trinnet med primær tørring.

Endring av bufferen i sammensetningen omfattende et konsentrert polypeptid av interesse kan især utføres ved å a) fortynne, f.eks. 5-15 ganger sammensetningen omfattende et konsentrert polypeptid av interesse i en buffer eller formulering, b) å konsentrere den fortynnede sammensetning igjen og utføre trinnene a) og b) et tilstrekkelig antall ganger slik at mengden av eksipiensene i bufferen eller formuleringen til stede i sammensetningen før disse trinnene utgjør mindre enn f.eks. 5 volum/volum-% eller mindre enn 1 volum/volum-% av eksipiensene i bufferen eller formuleringen som er til stede i nevnte sammensetning etter at nevnte trinn ble utført.

Især kan sammensetningen omfattende et polypeptid av interesse oppnådd fra trinn b) av foreliggende oppfinnelse spesielt videre omfatte et trinn med sterilfiltrering av nevnte sammensetning og/eller et trinn med frysetørking av sammensetningen.

Sterilfiltrering utføres generelt ved filtrering av sammensetningen gjennom et filter med en porestørrelse på 0,22 µm eller 0,20 µm. Frysetørking kan især utføres som beskrevet over.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også en frysetørket sammensetning oppnådd ved en fremgangsmåte ifølge foreliggende oppfinnelse.

Subkutan injeksjon

Foreliggende oppfinnelse vedrører også anvendelsen av en sammensetning omfattende i området 50-300 mg/ml polypeptid av interesse for fremstillingen av et medikament for subkutan injeksjon i et pattedyr.

Polypeptidet av interesse kan være et hvilket som helst polypeptid av interesse ifølge foreliggende oppfinnelse, inkludert, men ikke begrenset til PBGD, arylsulfatase A, lysosomal alfamannosidase og galaktocerebrosidase.

Begrepet subkutan forkortes ofte til s.c. og de to begrepene kan anvendes omvekslende i konteksten av foreliggende oppfinnelse.

Når injeksjon utføres subkutant, er det vanligvis ikke mulig å injisere mer enn 1,5 ml grunnet fysiologiske begrensinger.

Siden pasienten vanligvis trenger en viss mengde av det spesielle polypeptidet av interesse, er det en korrelasjon mellom volumet av sammensetningen omfattende et polypeptid av interesse som trenger å bli administrert til pasienten og konsentrasjonen av polypeptid av interesse i nevnte sammensetning.

Det er derfor en fordel ved foreliggende oppfinnelse at sammensetningen omfattende et polypeptid av interesse omfatter en høy konsentrasjon av polypeptidet av interesse og at denne høye konsentrasjonen av polypeptidet av interesse kan oppnås uten dannelse av store mengder polypeptidaggregater. Bruken av slike konsentrerte sammensetninger med polypeptider av interesse gjør det mulig å injisere et mindre volum av nevnte sammensetning og samtidig sikre at pasienten mottar en tilstrekkelig mengde av polypeptidet av interesse og dermed gjøre det lettere å administrere polypeptidet av interesse subkutant.

Den ovennevnte sammensetningen omfattende et polypeptid av interesse kan især omfatte mellom 75-250 mg/ml, slik som mellom 75-200 mg/ml eller mellom 75-150 mg/ml eller mellom 100-150 mg/ml eller mellom 100-125 mg/ml eller mellom 125-150 mg/ml av polypeptidet av interesse.

Som beskrevet over korrelerer volumet det er nødvendig å injisere av sammensetningen omfattende et polypeptid av interesse inn i pasienten for å sikre at pasienten mottar en tilstrekkelig mengde av polypeptidet av interesse med konsentrasjonen av polypeptidet av interesse i nevnte sammensetning.

Dermed vil volumet i en slik sammensetning generelt justeres ifølge konsentrasjonen av polypeptidet av interesse i sammensetningen. Volumet kan imidlertid generelt være i området 0,1-1,5 ml, slik som i området 0,1-1,5 ml eller i området 0,5-1,5 ml eller i området 0,5-1,5 ml eller i området 0,75-1,5 ml eller i området 0,75-1,5 ml eller i området 1-1,5 ml eller i området 1-1,5 ml.

Mengden av polypeptid av interesse som det er relevant å administrere til en pasient avhenger generelt av individets vekt og det spesielle polypeptidet av interesse.

I en utførelsesform vedrører foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for å behandle et pattedyr for akutt intermitterende porfyri, omfattende subkutan injeksjon av en sammensetning med 50-300 mg/ml PBGD.

Administrasjon av PBGD kan især være nyttig ved behandlingen av akutt intermitterende porfyri. Det er imidlertid vurdert at administrasjon av PBGD også kan være nyttig for behandlingen av andre porfyrier, slik som hereditær koproporfyri eller variegatær porfyri. Porfyri er et samlebegrep for å beskrive flere sykdommer som skyldes forskjellige mangler i hemets biosyntetiske vei. Det er følgelig vurdert at administrasjon av PBGD, f.eks. i kombinasjon med andre terapeutiske midler til en pasient som lider av en hvilken som helst type porfyri, kan bidra til å øke den totale omsetningen av de forskjellige intermediatene i veien. F. eks. Meissner PN et al., 1986, European Journal of Cliical Ivestigation, vol. 16, 257-261; Hift RJ et al., 1997, S. Afr. Med. J., vol. 87, 718-27 og Meissner P et al., 1993, J. Cli. Ivest., vol. 91, 1436-44 beskriver akkumulasjon av ALA og PBG i hereditær koproporfyri og variegatær porfyri. I disse sykdommene skyldes akkumulasjonen av ALA og PBG enzymatiske defekter som er lokalisert fire eller fem trinn nedstrøms fra omdanningen av henholdsvis ALA til PBG. I de to nyeste artiklene er det beskrevet hvordan porfyrinogenet som akkumulerer i pasienter med variegatær porfyri er i stand til å inhibere PBG-deaminase.

I en ytterligere utførelsesform vedrører foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for behandling av et pattedyr for metakromatisk levkodystrofi, omfattende subkutan injeksjon av en sammensetning med 50-300 mg/ml arylsulfatase A.

Metakromatisk levkodystrofi (MLD) forårsakes av en autosomal resessiv genetisk feil i det lysosomale enzymet arylsulfatase A (ASA) og fører til en progressiv nedbryting av membraner i myelinskjeden (demyelinisering) og akkumulering av galaktosylsulfatid (cerebrosidsulfat) i hvit substans i både det sentrale nervesystemet (CNS) og det perifere nervesystemet. I histologiske preparater danner galaktosylsulfatid sfæriske granulamasser som farger metakromatisk.

Galactosylsulfatid akkumulerer også i nyrene, galleblæren og visse andre indre organer og utskilles i store mengder i urinen.

Galaktosylsulfatid metaboliseres vanligvis ved hydrolysen av 3-O-sulfatkobling og danner galaktocerebrosid gjennom den kombinerte virkningen av det lysosomale enzymet arylsulfatase A (EC 3.1.6.8) (Austi et al. Biochem J. 1964, 93, 15C-17C) og et sfingolipidaktivatorprotein kalt saposin B. En grunnleggende mangel på arylsulfatase A finnes i alle vev fra pasienter med de sene infantile, juvenile og voksne formene av MLD (se nedenfor). I det følgende vil arylsulfatase A-proteinet betegnes "ASA". En grunnleggende mangel på ASA finnes i alle vev fra pasienter med MLD.

I enda en annen utførelsesform vedrører foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for behandling av et pattedyr for den lysosomale lagringslidelsen alfamannosidose, omfattende subkutan injeksjon av en sammensetning med 50-300 mg/ml lysosomal alfamannosidase.

Alfamannosidose er en resessiv, autosomal sykdom som finnes over hele verden med en hyppighet på mellom 1/1 000 000 og 1/500 000. Mannosidose finnes i alle etniske grupper i Europa, Amerika, Afrika og også i Asia. Den er oppdaget i alle land med en god diagnosetjeneste for lysosomale lagringslidelser, med samme hyppighet. De blir født tilsynelatende friske, men symptomene på sykdommene er progressive. Alfamannosidose viser klinisk heterogenitet og spenner fra svært alvorlige til svært milde former. Typiske kliniske symptomer er: mental retardasjon, skjelettendringer, svekket immunsystem som fører til gjentatte infeksjoner, hørselssvekkelse og ofte er sykdommen forbundet med typiske ansiktstrekk slik som et grovt ansikt, fremstående panne, en flat nesebro, smal nese og bred munn. I de mest alvorlige tilfellene (mannosidose type I) lider barna av hepatosplenomegali, og de dør i løpet av de første leveårene. Muligens forårsakes denne tidlige død av alvorlige infeksjoner grunnet immunsvikt forårsaket av sykdommen. I mildere tilfeller (mannosidose type 2) når vanligvis pasientene voksen alder. Pasientens skjelettsvakheter fører til behov for rullestol ved en alder på 20 til 40. Sykdommen forårsaker en diffus dysfunksjon i hjernen, som ofte fører til svak mental yteevne som utelukker alt annet enn de mest grunnleggende ferdigheter i lesing og skriving. Disse problemene forbundet med hørselsproblemer og andre kliniske tegn hindrer pasienten i et uavhengig liv, og følgen er at de har behov for livslang omsorg.

I enda en annen utførelsesform vedrører foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for behandling av et pattedyr for Krabbes sykdom, omfattende subkutan injieksjon av en sammensetning med 50-300 mg/ml galaktosylcerebrosidase.

Hos mennesker fører en mangel på GALC-enzymet til en autosomal arvelig genetisk lysosomal lagringssykdom kjent som Krabbes sykdom eller globoidcelle levkodystrofi. Enzymet uttrykkes generelt i testiklene nyrene, placenta, lever og hjerne hos mennesker, og en mangel på GALC-enzymet fører generelt til en lidelse i myelinmetabolismen og i det sentrale og perifere nervesystemet (henholdsvis CNS og PNS).

Krabbes sykdom har blitt observert hos mennesker i alle aldre, nasjonaliteter og kjønn.

Man skal legge merke til at utførelsesformene og trekkene beskrevet i konteksten for ett av aspektene ifølge foreliggende oppfinnelse også gjelder for de andre aspektene av oppfinnelsen. Især gjelder alle utførelsesformene beskrevet for sammensetningen omfattende et polypeptid av interesse, slik som nærvær av ytterligere forbindelser, buffere og pH også for sammensetningen omfattende et polypeptid av interesse anvendt i de foreliggende anvendelser.

Når en gjenstand ifølge foreliggende oppfinnelse eller ett av dens trekk eller karakteristika vises til i entall viser dette også til gjenstanden eller dens trekk eller karakteristika i flertall. Når man f.eks. viser til "et polypeptid" skal det forstås som at det viser til ett eller flere polypeptider.

Gjennom den foreliggende beskrivelsen skal ordet "omfatte", eller varianter slik som "omfatter" eller "omfattende" forstås å bety inkluderingen av et oppgitt element, heltall eller trinn, eller grupper av elementer, heltall eller trinn, men ikke utelukkelse av noe annet element, heltall eller trinn, eller gruppe av elementer, heltall eller trinn.

Alle patent- og ikke-patentreferanser sitert i foreliggende søknad innlemmes herved ved referanse i sin helhet.

Oppfinnelsen vil nå bli beskrevet i mer detaljer i de følgende ikke-begrensende eksperimentelle deler.

EKSPERIMENTELL

Materialer

rhPBGD

rhPBGD brukt i de følgende eksperimentene ble oppnådd ifølge prosess 2 i eksempel 1 i WO 03/002731, der prosess 2 er den prosessen som inkluderer trinn IV, dvs. trinnet med keramisk hydroksyapatittkromatografi.

Formuleringsbuffer

Det rekombinante og rensede rhPBGD forelå i følgende vandige formuleringsbuffer:

3,67 mM Na2HPO4

27 mM glysin

250 mM mannitol

og en pH på 7,9

Formuleringsbufferen ble så sterilfiltrert gjennom et 0,22 µm filter.

Fremgangsmåter

Frysetørking

Frysetørkingen av de rensede rhPBGD-løsningene ble utført i en Lyostarfrysetørker (FTM-systemer) ifølge følgende skjema:

Visuell observasjon (klarhet og farge)

Væsken ble visuelt undersøkt med hensyn på farge, klarhet og presipitater ifølge skjemaet under.

Farge: 1: Ingen farge; 2: Svakt gul; 3: Gul

Klarhet: 1: Klar; 2: Svakt turbid; 3: Turbid

Andre bemerkninger: Andre observasjoner fra operatøren ble i noen tilfeller inkludert her (dvs. presipitater, uløst materiale etc.)

pH-måling

pH-meter (Metrohm 691 pH Meter) og elektrode (kombinert LL pH-elektrode) ble kalibrert med 3 standard referanseløsninger (Merck) i området 4,00 til 9,00.

Væsken ble til slutt analysert.

Proteinkonsentrasjon

Proteinkonsentrasjon i ekstrakt, i prosessprøver, bulk legemiddelsubstans og sluttprodukt ble bestemt ved en fremgangsmåte som anvender prinsippene for reduksjon av Cu2+ til Cu+ med protein i et alkalisk medium (Biuret-reaksjon). Cu+-ionene ble så reagert med et reagens som inneholder bicinchoninsyre som fører til en meget sensitiv og selektiv kolorimetrisk deteksjon.

Renhet

Rekombinant human porfobilinogen-deamiase (rhPBGD) og rhPBGD-varianter ble separert i henhold til deres evne til å adsorbere og desorbere til silikabaserte stasjonære media avhengig av prosentandelen med organisk modifiseringsmiddel (acetonitril) i den mobile fasen.

rhPBGD-aktivitet

Porfobilinogen-deamiase (PBGD) katalyserer addisjonen av 4 molekyler med porfobilinogen (PBG) for å danne en lineær tetramer, preuroporfyrinogen, som frigjøres fra enzymet og sirkulariseres in vivo til uroporfyrinogen III ved hjelp av uroporfyrinogen III-syntase. Preuroporfyrinogen kan kjemisk oksideres med benzokinon for å danne uroporfyrin, som absorberer lys ved 405 nm.

Analysene ble utført på en enkelt flaske ved hver testanledning. For bestemmelse av rhPBGD-aktivitet og proteinkonsentrasjon ble testene utført i henholdsvis duplikat og triplikat for hver flaske.

Osmolalitet

En flaske med frysetørket rhPBGD ble resuspendert i 1,00 ml MilliQ-vann. Flasken med frosset vandig løsning av rhPBGD ble tint. Osmometeret (Vapro-osmometer) ble kalibrert med 3 standardløsninger i området 100-1000 mOsm/kg (100, 290, 1000 mOsm/kg). Væsken ble så analysert.

Eksempel 1

Konsentrering med sentrifugalfilteranordninger

Frosset PBGD-bulk-løsning (7 mg/ml rhPBGD, 3,67 mM Na2HPO4, 27 mM glysin, 250 mM Mannitol, pH 7,9) ble tint i et vannbad ved 20 °C, sentrifugert ved 3200 g i 10 min og deretter sterilfiltrert med 0,20 �m-PES-filtre (Nalgene polyetersulfonfiltre). PBGD-bulk-løsningen ble konsentrert til 100 mg/ml ved å kjøre Centrifugal Filter Devices Centricon Plus-80 (Mw-cut-off 30000) og Centricon Plus-15 (Mwcut-off 30000) ved 3200 g i flere timer. Den konsentrerte løsningen, dvs. retentatet, ble sterilfiltrert med 0,22 �m-filtre (Millex GV) og til slutt ble en del av denne løsningen fortynnet med steril formuleringsbuffer for å gi 50 mg/ml. 5 mg/ml-løsningen ble fremstilt ved direkte fortynning av det rekombinante og rensede hPBGD med steril formuleringsbuffer.

5 mg/ml, 50 mg/ml og 100 mg/ml rhPBGD ble så frysetørket som beskrevet over. Flere flasker av hver av de ovennevnte frysetørkede rhPBGD-løsningene med 5, 50 og 100 mg/ml rhPBGD og av den vandige 5 mg/ml rhPBGD-løsningen ble lagret ved 40 �C� 2�C, 75 %� 5 % relativ fuktighet (RH). Flaskene ble lagret beskyttet mot lys i en godt lukket sekundær pakning (pappeske).

På de angitte tidspunktene (dvs. lagringstid) ble en flaske av hver frysetørket prøve resuspendert i 1,00 ml Millipore-vann.

Hver av de resuspenderte flaskene og den vandige flasken med rhPBGd ble så visuelt observert med hensyn på farge, klarhet og presipitater, og pH, proteinkonsentrasjon, renhet og rhPBGD-aktivitet ble målt som beskrevet over.

Resultatene er vist i følgende tabeller 1-4:

Tabell 1: Frysetørket produkt, 5 mg/ml

Tabell 2; frysetørket produkt; 50 mg/ml

Tabell 3: Frysetørket produkt; 100 mg/ml

Tabell 4: Vandig produkt; 5 mg/ml

Eksempel 2

Konsentrering av en rhPBGD-sammensetning med sentrifugalfilteranordninger

Frosset PBGD-bulk-løsning (7 mg/ml rhPBGD, 3,67 mM Na2HPO4, 27 mM glysin, 250 mM Mannitol, pH 7,9) ble tint i et vannbad ved 20 °C, sentrifugert ved 3200 g i 10 min og deretter sterilfiltrert med 0,20 �m-PES-filtre (Nalgene polyetersulfonfiltre). PBGD-bulk-løsningen ble konsentrert til 100 mg/ml ved å kjøre Centrifugal Filter Devices Centricon Plus-80 (Mw cut-off 30000) og Centricon Plus-15 (Mw cutoff 30000) ved 3200 g i flere timer. Den konsentrerte løsningen, dvs. retentatet, ble sterilfiltrert med 0,22 �m-filtre (Millex GV) og fortynnet med sterilfiltrert formuleringsbuffer (se over) for å få løsninger med lavere konsentrasjoner. En fraksjon i volum av hver konsentrasjon ble frysetørket som beskrevet over.

De forskjellige konsentrasjonene med frysetørket rhPBGD og vandig løsning av rhPBGD ble lagret ved 5 °C ± 3 °C eller ved -20 °C ± 5 °C (omgivende relativ fuktighet (RH)). Alle flasker ble lagret beskyttet mot lys i en godt lukket sekundær pakning (pappeske).

På de angitte tidspunktene (dvs. lagringstid) ble en flaske av hver frysetørkede prøve resuspendert i 1,00 ml Millipore-vann og så testet sammen med den vandige løsningen av rhPBGD ved visuelt å observere farge, klarhet og presipitater, og ved å måle pH, proteinkonsentrasjon, renhet, osmolalitet og rhPBGD-aktivitet.

Resultatene er vist i følgende tabeller 5-19:

Tabell 5: Vandig produkt; 11 mg/ml; Lagringstemp.:+5 °C

Tabell 6: Vandig produkt: 11 mg/ml; Lagringstemp: -20 °C

Tabell 7: Frysetørket produkt; 11 mg/ml; Lagringstemp.:+5 °C

Tabell 8: Vandig produkt, 17 mg/ml; Lagringstemp.:+5 °C

Tabell 9: Vandig produkt, 17 mg/ml; Lagringstemp.: -20 °C

Tabell 10: Frysetørket produkt; 17 mg/ml; Lagringstemp.: 5 °C

Tabell 11: Vandig produkt; 36 mg/ml; Lagringstemp.:+5 °C

Tabell 12: Vandig produkt, 36 mg/ml; Lagringstemp.: -20 °C

Tabell 13: Frysetørret produkt; 36 mg/ml; Lagringstemp.: 5 �C

Tabell 14: Vandig produkt; 50 mg/ml; Lagringstemp.: 5 �C

Tabell 15: Vandig produkt; 50 mg/ml; Lagringstemp.: -20 �C

Tabell 16: Frysetørket produkt; 50 mg/ml; Lagringstemp.: 5 �C

Tabell 17: Vandig produkt; 100 mg/ml; Lagringstemp.: 5 �C

Tabell 18: Vandig produkt; 100 mg/ml; Lagringstemp.: -20 �C

Tabell 19: Frysetørket produkt; 100 mg/ml; Lagringstemp.: 5 �C

Eksempel 3

Konsentrering av en rhPBGD-sammensetning med tangentiell strømningsfiltrering (TFF)

Bulkløsningen med rhPBGD ble så tint i minimum tre dager ved 5 ºC og i mørke.

Den tinte løsningen ble så sentrifugert med 200 ml koniske sentrifugerør i ca. 10 minutter ved 2200 g.

Løsningen ble så filtrert gjennom en serie filter med følgende porestørrelser: 5,0 μm; 0,65 μm; 0,45 μm og 0,20 μm før den ble konsentrert ved tangentiell strømningsfiltrering (TFF).

Konsentrasjonen ved TFF ble utført med et Millipore Labscale TFF-system og Millipore Pellicon ® XL-filter med et pumpeinnløpstrykk på ca. 20-25 psi og et trykk over Pellicon ® XL-filteret på ca. 4-6 psi. rhPBGD ble beskyttet mot lys under prosedyren ved å dekke prøvebeholderen i TFF-systemet med ark av aluminiumsfolie.

Den konsentrerte rhPBGD-løsningen oppnådd fra TFF-prosedyren ble så bufferbyttet mot en formuleringsbuffer inneholdende 3,67 mM Na2HPO4 x 2H2O, 27 mM glysin og 220 mM Mannitol fremstilt i sterilt vann. Dette ble utført ved kontinuerlig å tilsette buffer i TFF-systemet og presse den gjennom membranen inntil nevnte buffer har erstattet den forrige bufferen.

Den konsentrerte og bufferbyttede rhPBGD-løsningen ble så sterilfiltrert ved å passere den gjennom et filter med en porestørrelse på 0,22 μm. Denne sterilfiltreringen ble utført to ganger med et nytt filter hver gang.

Den sterile, konsentrerte rhPBGD-løsningen ble så plassert i flasker før den ble frysetørket som beskrevet fremgangsmåtedelen.

Eksempel 4

Effekten av forskjellige former for frysetørking og/eller mengden av eksipienser på rekonstitueringstiden

PBGD ble konsentrert som beskrevet i eksempel 3 og etter byttet av bufferen ble konsentrasjonen av PBGD bestemt.

Den konsentrerte PBGD-løsningen ble så frysetørket i en Lyostar-frysetørker (FTM-systems). Løsningene ble fylt på 2 og 6 ml injeksjonsglassflasker (type 1) og lukket med gummikorker (klorbutyl).

Opprinnelig frysetørkingssyklus:

Prøvene ble fylt ved romtemperatur og hyllene ble kjølt ned til 0 °C i 30 minutter. Temperaturen ble senket til -40 °C (1 °C per minutt) og holdt der i 30 minutter og deretter ble vakuumtrykket senket til 126 mTorr og den primære tørkingen begynte ved å heve temperaturen til 0 °C (1 °C per minutt). Etter 360 minutter med primær tørking ble temperaturen hevet til 30 °C (0,5 °C per minutt) og fullt vakuum ble samtidig trukket (start på sekundær tørking). Temperaturen ble holdt ved 30 °C i 360 minutter og flaskene ble så lukket under vakuum.

Frysetørking med inklusjon av et tempereringstrinn:

Etter 30 minutter ved -40 °C ble temperaturen hevet med en hastighet på 2 °C per minutt til -10 °C eller -20 °C ved hvilken temperatur de ble holdt i 120 eller 420 minutter før temperaturen på nytt ble senket med 2 °C per minutt til -40 °C der prøvene ble holdt i 60-90 minutter før den primære tørkingen startet.

Resultatene vises i tabell 20 der kortnavnene som anvendes med hensyn til eksipiensene og frysetørkingssyklusen betyr følgende:

1x mengde av eksipienser viser til at PBGD-løsningen omfatter 3,67 mM Na2HPO4 x 2H2O, 27 mM glysin og 220 mM mannitol fremstilt i sterilt vann.

1,5x mengde eksipienser viser til at PBGD-løsningen omfatter 5,51 mM Na2HPO4 x 2H2O, 40,5 mM glysin og 375 mM mannitol fremstilt i sterilt vann, dvs. 1,5x av hver av komponentene til stede i 1x buffer.

2x eksipienser viser til at PBGD-løsningen omfatter 7,34 mM Na2HPO4 x 2H2O, 54 mM glysin og 500 mM mannitol fremstilt i sterilt vann, dvs. 2x av hver av komponentene til stede i 1x buffer.

Den opprinnelige frysetørkingssyklusen er beskrevet over.

Tempereringsfrysetørkingssyklusen er som beskrevet over der tempereringstrinnet omfatter å heve temperaturen til -10 °C og holde prøven ved denne temperaturen i 120 minutter før den senkes til -40 °C igjen.

Den forlengede tempereringsfrysetørkingssyklusen er som beskrevet over, der tempereringstrinnet omfatter å heve temperaturen til -20 °C og holde prøven ved denne temperaturen i 420 minutter før den senkes til -40 °C igjen.

Tabell 20:

Eksempel 5

Effekten av forskjellige former for frysetørking og/eller mengden av eksipienser på utseendet til det frysetørkede produktet

Konsentrerte og frysetørkede løsninger av PBGD ble fremstilt som beskrevet i eksempel 4 og referanser til mengden eksipienser og typen frysetørkingssyklus har samme betydning som i eksempel 4.

Følgende resultater ble oppnådd ved visuell inspeksjon av de frysetørkede produktene:

A: Sammenligning av tre produkter fremstilt fra løsninger omfattende henholdsvis 4,6 mg/ml, 66,6 mg/ml og 109,4 mg/ml rhPBGD viste at antallet av sprekker i det frysetørkede produktet økte ettersom konsentrasjonen av rhPBGD økte.

B: Sammenligning av to produkter fremstilt fra en løsning omfattende 150 mg/ml rhPBGD og omfattende 1x og 1,5x mengden eksipienser viste at antallet sprekker i det frysetørkede produktet var lavere for produktet som omfattet 1,5x mengden av eksipienser enn produktet omfattende 1x mengden av eksipienser.

C: Sammenligning av to frysetørkede produkter fremstilt fra en 150 mg/ml rhPBGD-løsning og omfattende 1x og 2x mengden av eksipienser viste at antallet sprekker i det frysetørkede produktet med 2x mengden av eksipienser var lavere enn produktet omfattende 1x mengden av eksipienser.

D: Sammenligning av tre frysetørkede produkter fremstilt fra en 150 mg/ml rhPBGD-løsning ved å bruke den opprinnelige frysetørkingssyklusen, tempererings- og den forlengede tempereringsfrysetørkingssyklusen viste at antallet sprekker i det frysetørkede produktet var lavere i produktet som ble fremstilt ifølge tempereringsfrysetørkingssyklusen enn i produktet fremstilt ifølge den opprinnelige frysetørkingssyklusen. Videre var antallet sprekker i produktet fremstilt ifølge den forlengede tempereringsfrysetørkingssyklusen lavere enn i produktet fremstilt ifølge tempereringsfrysetørkingssyklusen.

E: Tre frysetørkede produkter ble fremstilt fra henholdsvis en 150, 175 og 200 mg/ml rhPBGD-løsning. De frysetørkede produktene omfattet alle 1,5x mengden av eksipienser og de ble frysetørket med tempereringssyklusen. Ingen av de frysetørkede produktene omfattet sprekker.

F: To frysetørkede rhPBGD-produkter ble fremstilt fra en 150 mg/ml rhPBGD-løsning. Ett av dem omfattet 1x mengden av eksipienser og ble fremstilt ifølge den opprinnelige frysetørkingssyklusen mens det andre omfattet 1,5x mengden av eksipienser og ble fremstilt ifølge den forlengede tempereringsfrysetørkingssyklusen. Produktet omfattende 1,5x mengden av eksipienser og fremstilt ifølge den forlengede tempereringsfrysetørkingssyklusen omfattet færre sprekker enn produktet omfattende 1x mengden av eksipienser og fremstilt ifølge den opprinnelige frysetørkingssyklusen.

G: To frysetørkede rhPBGD-produkter ble fremstilt fra en 150 mg/ml rhPBGD-løsning. Ett av dem omfattet 1x mengden av eksipienser og ble fremstilt ifølge den opprinnelige frysetørkingssyklusen mens det andre omfattet 0,1 % Tween 80 i kombinasjon med 1x mengden av eksipienser og ble fremstilt ifølge den forlengede tempereringsfrysetørkingssyklusen. Produktet omfattende 0,1 % Tween 80 i kombinasjon med 1x mengden av eksipienser og som ble fremstilt ifølge den forlengede tempereringsfrysetørkingssyklusen omfattet færre sprekker enn produktet som omfattet 1x mengden av eksipienser og som ble fremstilt ifølge den opprinnelige frysetørkingssyklusen.

Eksempel 6

Effekten av gjenvinningsvolum, mengden av eksipienser og formen for frysetørking på stabiliteten av frysetørket rhPBGD

Konsentrerte rhPBGD-løsninger frysetørkede prøver ble fremstilt som beskrevet i eksempel 4.

“Bulk-løsningen” er en konsentrert løsning av PBGD før frysetørking.

Tabell 21 viser resultatet for rhPBGD-løsninger som har følgende karakteristika med hensyn til konsentrasjonen av rhPBGD, mengden av eksipienser (der de samme definisjonene som i eksempel 4 brukes), frysetørkingsformen (der de samme definisjonene som i eksempel 4 brukes) og forholdet av fyllvolumet (fyllvolumet som er volumet for sammensetningen før det frysetørkes) mot gjenvinningsvolumet (gjenvinningsvolum som er volumet som det frysetørkede produktet resuspenderes i):

Løsning 1:

● ca. 5 mg/ml rhPBGD

● 1x mengden av eksipiens

● opprinnelig frysetørkingssyklus

● fyllvolum = gjenvinningsvolum

Løsning 2:

● ca. 70 mg/ml rhPBGD

● 1x mengden av eksipiens

● opprinnelig frysetørkingssyklus

● fyllvolum = 2x gjenvinningsvolum

Løsning 3:

● ca. 110 mg/ml rhPBGD

● 1x mengden av eksipiens

● opprinnelig frysetørkingssyklus

● fyllvolum = gjenvinningsvolum

Løsning 4:

● Ca. 70 mg/ml rhPBGD

● 1x mengden av eksipiens

● opprinnelig frysetørkingssyklus

● fyllvolum = 1,5x gjenvinningsvolum

Løsning 5:

● ca. 90 mg/ml rhPBGD

● 2/3x mengden av eksipiens

● opprinnelig frysetørkingssyklus

● fyllvolum = 1,5x gjenvinningsvolum

Løsning 6:

● ca. 60 mg/ml rhPBGD

● 1/2x mengden av eksipiens

● opprinnelig frysetørkingssyklus

● fyllvolum = 2x gjennvinningsvolum

Løsning 7:

● ca. 110 mg/ml rhPBGD

● 1x mengden av eksipiens

● tempereringsfrysetørkingssyklus

● fyllvolum = gjenvinningsvolum

Løsning 8:

● ca. 60 mg/ml rhPBGD

● 1x mengden av eksipiens

● tempereringsfrysetørkingssyklus

● fyllvolum = 2x gjenvinningsvolum

Løsning 9:

● ca. 150 mg/ml rhPBGD

● 1x mengden av eksipiens

● tempereringsfrysetørkingssyklus

● fyllvolum = gjenvinningsvolum

Løsning 10:

● ca. 150 mg/ml rhPBGD

● 1x mengden av eksipiens

● opprinnelig frysetørkingssyklus

● fyllvolum = gjenvinningsvolum

Selv om det ikke er vist i tabell 21 ble også renheten testet for hvert tidspunkt som ble funnet til 100 % i alle tilfeller.

For løsning 2 ved tidspunktene i ukene 4 og 9 og for løsning 4 ved tidspunktet i uke 9 ble et galt gjenvinningsvolum brukt.

<T 3 a 9 b 8 e >4 ll 0 2 N 1 O : 03 63

<8>4

0 N

O

03

64

0 N

O

03

65

Eksempel 7

Effekt av forskjellige eksipienser på stabiliteten av rhPBGD

rhPBGD ble konsentrert som beskrevet i eksempel 4 og så ble bufferen byttet til en av de fire bufferene beskrevet nedenfor. Produktene ble så frysetørket som beskrevet i eksempel 4 med et opprinnelig tempereringstrinn inkludert og stabiliteten til prøvene ble testet som beskrevet i eksempel 6.

Effekten av følgende fire formuleringer på stabiliteten av rhPBGD ble testet:

Formulering A (tilsvarer løsning 9 i eksempel 6): 250 mM mannitol, 27 mM glysin og 3,67 mM Na2HPO4.

Formulering B: 250 mM mannitol, 27 mM glysin og 10 mM TRIS-HCl.

Formulering C: 250 mM mannitol, 27 mM glysin, 3,67 mM Na2HPO4 og 0,1 % Tween 80.

Formulering D: 221 mM mannitol, 29 mM sukrose, 27 mM glysin, 3,67 mM Na2HPO4 og 0,1 % Tween 80.

Resultatene er vist i tabell 22.

<3>

<9 8>4 0 N

O

03

67

Claims

PATENTKRAV

1. Sammensetning som omfatter minst 25 mg/ml arylsulfatase A (ASA), der mengden arylsulfatase A som er til stede i form av aggregater, utgjør mindre enn 5 % (vekt-%) av den totale mengden arylsulfatase A i sammensetningen.

2. Sammensetning ifølge krav 1, der arylsulfatase A omfatter en aminosyresekvens valgt fra gruppen som består av:

i) en aminosyresekvens ifølge en av SEKV ID NR: 18, 19 og 20;

ii) en funksjonelt ekvivalent del av en aminosyresekvens ifølge i); og

iii) en funksjonelt ekvivalent analog av en aminosyresekvens ifølge i) eller ii), der analogens aminosyresekvens er minst 75 % identisk med en aminosyresekvens ifølge i) eller ii), der den funksjonelt ekvivalente delen eller analogen av denne utøver vesentlig samme enzymaktivitet som enzymet i full lengde.

3. Sammensetning ifølge krav 1 eller 2, som omfatter en vandig løsning som er isoton når det gjelder vevet hos et pattedyr.

4. Sammensetning ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene, der sammensetningen omfatter mindre enn 1 % (vekt-%) andre proteiner enn arylsulfatase A, fortrinnsvis der mengden arylsulfatase A som er til stede i form av aggregater, utgjør mindre enn 1 % (vekt-%) av den totale mengden arylsulfatase A i sammensetningen.

5. Sammensetning ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene, der pH-en i sammensetningen er fra 7,5 til 8,5.

6. Sammensetning ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene, som videre omfatter én eller flere av bufferne valgt fra gruppen som består av: TRIS-HCL, Na-sitrat og Na2HPO4, og/eller ytterligere omfatter én eller flere av komponentene valgt fra gruppen som består av: glysin, L-serin, sukrose, mannitol og Tween 80.

7. Sammensetning ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene, der sammensetningens osmolalitet er fra 200 til 400 mOsm/kg.

8. Sammensetning ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene, der den spesifikke aktiviteten av arylsulfatase A er minst 20 U/mg, fortrinnsvis der den spesifikke aktiviteten av arylsulfatase A er minst 50 U/mg.

9. Sammensetning ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene, der arylsulfatase A er en rekombinant human arylsulfatase A (rhASA), fortrinnsvis der arylsulfatase A er rekombinant uttrykt i prokaryote celler eller i vertebrate celler i kultur.

10. Sammensetning ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene, der rester av en lineær 20-aminosyre som omgir Cys-51 i arylsulfatase A-sekvensen er minst 90 % identisk med den korresponderende sekvensen i SEKV ID NR: 19.

11. Sammensetning ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene, der arylsulfatase A er kodet av en nukleinsyresekvens som omfatter en sekvens valgt fra gruppen som består av:

i) en nukleinsyresekvens ifølge en av SEKV ID NR: 16 og 17; og ii) en nukleinsyresekvens som er minst 75 % identisk med en nukleinsyresekvens ifølge i).

12. Sammensetning ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene, der sammensetningen kan oppnås ved en prosess som omfatter trinnene a) å sentrifugere og/eller filtrere en sammensetning som omfatter ASA, og b) å konsentrere sammensetningen fra trinn a).

13. Bruk av sammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 1–12 for å framstille et legemiddel for behandling av metakromatisk leukodystrofi, der legemiddelet er til terapeutisk bruk.

14. Sammensetning ifølge et hvilket som helst av kravene 1–12 til bruk i behandling av metakromatisk leukodystrofi.