CN107619821A - 一种类似嵌合抗原受体修饰的cik及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种类似嵌合抗原受体修饰的CIK及其制备方法与应用。本发明制备类似嵌合抗原受体修饰的CIK细胞制剂的方法包括：向CIK中转入能敲低内源性PD‑1表达，且能表达PD1胞外区‑CD28‑41BB‑CD3融合蛋白的重组载体，培养后收获细胞，从而制得所述CIK细胞制剂；所述重组载体上含有多个串联的靶向PD‑1mRNA的5’‑UTR、3’‑UTR和/或胞内区的miRNA的编码基因。实验证明，该载体可大大降低CIK细胞中内源PD‑1的表达，而表达的PD1胞外区‑CD28‑41BB‑CD3融合蛋白在与肿瘤细胞表面的PD‑L1/L2结合之后激活CIK细胞，从而显著提高CIK细胞的肿瘤杀伤活性。

Description

一种类似嵌合抗原受体修饰的CIK及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于细胞治疗领域，涉及一种类似嵌合抗原受体修饰的CIK及其制备方法与应用，具体涉及一种能敲低内源性PD-1表达，并同时表达PD1胞外区-CD28-41BB-CD3融合蛋白的CIK及其制备方法与应用。

背景技术

CIK(Cytokine-Induced Killer Cells)中文全称为细胞因子诱导的杀伤细胞，是将人外周血单核细胞在体外用多种细胞因子共同培养一段时间后获得的一群异质细胞。其既具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性，又具有NK细胞(自然杀伤细胞)的非MHC(主要组织相容性抗原)限制性肿瘤杀伤能力。CIK细胞具有肿瘤杀伤活性高、杀瘤谱广，对正常组织毒性低，体外可高度扩增等特点，临床上已经有大量的病例证实其肿瘤杀伤活性。

PD-1(程序性死亡受体)是一种表达于T细胞表面的蛋白质分子，当PD-1与其配体PD-L1或PD-L2结合时可抑制下游NF-κB基因的转录，抑制干扰素-γ的分泌，从而抑制T细胞的杀伤活性。PD-L1或PD-L2表达于多种肿瘤细胞，如肺癌、乳腺癌、胃癌、食管癌、肝细胞癌、恶性黑色素瘤、卵巢癌、胰腺癌、肾细胞癌以及尿路上皮癌等肿瘤组织。T细胞表面的PD-1与表达于肿瘤细胞上的PD-L1或PD-L2结合所引起的T细胞细胞毒活性抑制是肿瘤细胞逃避免疫监视和杀伤的重要机制之一。采用PD-1抗体或PD-L1抗体阻断PD-1与PD-L1、PD-L2的结合，可使T细胞的肿瘤杀伤活性不受抑制，从而提高T细胞杀肿瘤的效果。研究证实，采用PD-1单抗静脉输注治疗恶性黑色素瘤、肺鳞癌、霍奇金氏淋巴瘤、结肠癌及肾癌等肿瘤收到良好的治疗效果。然而，静脉输注PD-1抗体所需抗体量大，成本很高；同时血液成分、淋巴组织微环境等成分会影响PD-1抗体与T细胞表面PD-1的结合。

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是真核细胞中存在的一种RNA降解机制。当病原感染真核细胞或者采用人为的方法将双链RNA(double strand RNA,dsRNA)导入到真核细胞后，这些双链RNA被RNase III家族的成员Dicer加工成21-23bp的双链干扰RNA(shortinterfering RNA,siRNA)。每个siRNA随后被整合到RNA诱导的干扰复合体中(RISC)，该蛋白复合体可以将siRNA靶向到与其互补的转录本的响应序列，导致转录本的切割、降解或者转录抑制。小RNA(microRNA,miRNA)是一种可以诱导基因沉默的内源性RNA，它大概22bp长，可以通过RNAi通路来诱导基因沉默。不同于短发夹RNA(shRNA)，miRNA经常以簇的形式被一个转录本编码，该转录本可能有几kb长并含有发夹结构，其表达由RNA聚合酶II启动。柄环结构的pri-miRNA由核RNase III Drosha降解成70bp左右的前体miRNA(pre-miRNA)，该前体miRNA由exportin-5从核内转运到胞浆。随后前体miRNA被Dicer处理成22bp左右的成熟miRNA，然后被整合入含有miRNA的RAN诱导的沉默复合体。成熟的miRNA通过对mRNA切割或者翻译抑制来调控基因的表达。靶基因的切割可以通过人为改变靶基因或者miRNA的序列来完全互补。

大多数嵌合抗原受体由胞外抗原结合区(由来源于单克隆抗体的轻链和重链组成，中间由带韧性的铰链区连接形成单链抗体)、跨膜区域和胞内信号转导区组成。通过将识别肿瘤相关抗原的scFv和胞内信号域“免疫受体酪氨酸活化基序”在体外进行基因重组，生成重组质粒，再在体外通过转染技术转染到患者的T细胞，使患者T细胞表达肿瘤抗原受体，转染后经过纯化和大规模扩增后的T细胞，称之为嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)。CAR-T细胞在体内、外都具有对特定肿瘤抗原高度亲和性及对抗原负载细胞高效杀伤特性。

发明内容

本发明的目的是提供一种类似嵌合抗原受体修饰的CIK及其制备方法与应用，其中所述类似嵌合抗原受体修饰的CIK能敲低内源性PD-1表达，并且能同时表达PD1胞外区-CD28-41BB-CD3融合蛋白。

本发明所提供的制备类似嵌合抗原受体修饰的CIK细胞制剂的方法，具体可包括如下步骤：向CIK中转入重组载体，所述重组载体能敲低内源性PD-1表达，并且能表达PD1胞外区-CD28-41BB-CD3融合蛋白，培养后收获细胞，从而制得所述类似嵌合抗原受体修饰的CIK细胞制剂。

所述重组载体上含有多个串联的靶向PD-1mRNA的5’-UTR、3’-UTR和/或胞内区(注：此处的胞内区指的是直接翻译得到PD-1蛋白胞内区的mRNA，下文同理)的miRNA的编码基因；所述多个为2-30个；

所述PD1胞外区-CD28-41BB-CD3融合蛋白自N端到C端依次由PD-1的胞外区、CD28的跨膜区和胞内区、4-1BB的胞内区和CD3的胞内区组成。

进一步，所述重组载体为慢病毒载体。

在本发明的一个实施例中，所述重组载体上含有5个串联的靶向PD-1mRNA的5’-UTR、3’-UTR和/或胞内区的miRNA的编码基因；所述5个串联的靶向PD-1mRNA的5’-UTR、3’-UTR和/或胞内区的miRNA的编码基因具体分别如下：

(1)miRNA-PD1-716：核苷酸序列如序列表中序列1的第6396-6454位或序列2的第5641-5699所示；

(2)miRNA-PD1-801：核苷酸序列如序列表中序列1的第6534-6592位或序列2的第5779-5837所示；

(3)miRNA-PD1-808：核苷酸序列如序列表中序列1的第6672-6730位或序列2的第5917-5975所示；

(4)miRNA-PD1-904：核苷酸序列如序列表中序列1的第6810-6868位或序列2的第6055-6113所示；

(5)miRNA-PD1-988：核苷酸序列如序列表中序列1的第6948-7006位或序列2的第6193-6251所示。

所述PD1胞外区-CD28-41BB-CD3融合蛋白中，所述PD-1的胞外区的氨基酸序列具体可如序列表中序列3的第1-165位所示；所述CD28的跨膜区和胞内区的氨基酸序列具体可如序列表中序列3的第169-275位所示；所述4-1BB的胞内区的氨基酸序列具体可如序列表中序列3的第276-322位所示；所述CD3的胞内区的氨基酸序列具体可如序列表中序列3的第323-435位所示。

进一步，所述PD1胞外区-CD28-41BB-CD3融合蛋白的氨基酸序列具体可如序列表中序列3所示。

所述重组载体中用于表达所述PD1胞外区-CD28-41BB-CD3融合蛋白的编码基因具体为序列表中序列1的第3348-4655位或者序列2的第3348-4655位。

更加具体的，在本发明中，所述重组载体的序列具体为序列表中序列1或序列2所示。

在所述方法中，所述CIK细胞具体可利用细胞因子体外诱导PBMC分化而来。具体的，所述细胞因子可为CD3mAb、CD28mAb、IFN-γ和IL-2。更加具体的，是利用CD3mAb/CD28mAb磁珠、IFN-γ和IL-2诱导PBMC分化为CIK。所述CD3mAb/CD28mAb磁珠的用量为1-2个磁珠/个PBMC；所述IFN-γ的用量为400-1200IU/ml体系；所述IL-2的用量为250-900IU/ml体系。

在所述方法中，所述培养的时间为自转入所述重组载体后培养12天。

在本发明中，所述方法具体可包括如下步骤：

(1)将PBMC用淋巴细胞培养基调整浓度至3×10⁵-9×10⁵/ml，制成PBMC细胞悬液；所述淋巴细胞培养基中含有终浓度为300IU/ml的IL-2，以及终浓度为1000IU/ml的IFN-γ。

(2)将步骤(1)的PBMC细胞悬液转移至含有CD3mAb/CD28mAb磁珠的T-175培养瓶中，总体积50ml，并添加IFN-γ、IL-2。

进一步，所述CD3mAb/CD28mAb磁珠的用量为1-2个磁珠/个PBMC。所述CD3mAb/CD28mAb磁珠为invitrogen公司产品，货号为402.03D。

进一步，添加后，所述IFN-γ的终浓度为1000IU/ml；所述IL-2的终浓度为300IU/ml。

(3)培养第3天，将所述重组载体(全载体序列如序列表中序列1或序列2所示)电转入细胞；电转之后，添加含有IFN-γ和IL-2的无血清培养基继续培养。

其中，进行电转时，细胞浓度为10⁷-10⁹/ml，所用载体量为1-10μg/100μl细胞。所述含有IFN-γ和IL-2的无血清培养基中IFN-γ的终浓度为1000IU/ml，IL-2的终浓度为300IU/ml。

(4)培养第7天，补加200ml所述淋巴细胞培养基，并加入与细胞数量相同的所述CD3mAb/CD28mAb磁珠。

(5)每隔两天进行细胞计数，并补加相应体积的所述淋巴细胞培养液，使得细胞密度基本不变。

(6)培养第15天，离心收获细胞，即为所述类似嵌合抗原受体修饰的CIK细胞制剂。

利用所述方法制备得到的类似嵌合抗原受体修饰的CIK细胞制剂也属于本发明的保护范围。

所述CIK细胞制剂在如下任一中的应用也属于本发明的保护范围：

(1)制备治疗肿瘤的产品；

(2)制备用于杀伤肿瘤细胞的产品。

其中，所述肿瘤最好为PD-L1或PD-L2阳性的肿瘤；所述肿瘤细胞最好为PD-L1或PD-L2阳性的肿瘤细胞。

本发明还保护一种重组载体。

本发明所保护的重组载体能敲低内源性PD-1表达，并且能表达PD1胞外区-CD28-41BB-CD3融合蛋白；

所述重组载体上含有多个串联的靶向PD-1mRNA的5’-UTR、3’-UTR和/或胞内区的miRNA的编码基因；所述多个为2-30个；

所述PD1胞外区-CD28-41BB-CD3融合蛋白自N端到C端依次由PD-1的胞外区、CD28的跨膜区和胞内区、4-1BB的胞内区和CD3的胞内区组成。

进一步，所述重组载体为慢病毒载体。

在本发明的一个实施例中，所述重组载体上含有5个串联的靶向PD-1mRNA的5’-UTR、3’-UTR和/或胞内区的miRNA的编码基因；所述5个串联的靶向PD-1mRNA的5’-UTR、3’-UTR和/或胞内区的miRNA的编码基因具体分别如下：

(1)miRNA-PD1-716：核苷酸序列如序列表中序列1的第6396-6454位或序列2的第5641-5699所示；

(2)miRNA-PD1-801：核苷酸序列如序列表中序列1的第6534-6592位或序列2的第5779-5837所示；

(3)miRNA-PD1-808：核苷酸序列如序列表中序列1的第6672-6730位或序列2的第5917-5975所示；

(4)miRNA-PD1-904：核苷酸序列如序列表中序列1的第6810-6868位或序列2的第6055-6113所示；

(5)miRNA-PD1-988：核苷酸序列如序列表中序列1的第6948-7006位或序列2的第6193-6251所示。

所述PD1胞外区-CD28-41BB-CD3融合蛋白中，所述PD-1的胞外区的氨基酸序列具体可如序列表中序列3的第1-165位所示；所述CD28的跨膜区和胞内区的氨基酸序列具体可如序列表中序列3的第169-275位所示；所述4-1BB的胞内区的氨基酸序列具体可如序列表中序列3的第276-322位所示；所述CD3的胞内区的氨基酸序列具体可如序列表中序列3的第323-435位所示。

进一步，所述PD1胞外区-CD28-41BB-CD3融合蛋白的氨基酸序列具体可如序列表中序列3所示。

所述重组载体中用于表达所述PD1胞外区-CD28-41BB-CD3融合蛋白的编码基因具体为序列表中序列1的第3348-4655位或者序列2的第3348-4655位。

更加具体的，在本发明中，所述重组载体的序列具体为序列表中序列1或序列2所示。

所述载体在制备所述CIK细胞制剂中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明采用pLV-PD1ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-PD1-GFP及pLV-PD1ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-PD1质粒表达人工设计的5个串联的靶向PD-1mRNA的5’-UTR、3’-UTR和/或胞内区的miRNA(同时该质粒能够表达所述PD1胞外区-CD28-41BB-CD3融合蛋白)，并将该质粒导入CIK细胞。实验结果表明，该质粒可以大大降低CIK细胞中内源PD-1的表达水平，并高表达PD1胞外区-CD28-41BB-CD3融合蛋白，从而显著的提高了CIK细胞的肿瘤杀伤活性。

附图说明

图1为pLV-PD1ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-PD1-GFP及pLV-PD1ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-PD1载体在CIK细胞中对内源PD1的干扰作用，及PD1胞外区-CD28-41BB-CD3融合蛋白的表达。1：CIK；2：CIK-pLV-PD1ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-PD1-GFP；3：CIK-pLV-PD1ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-PD1。

图2为流式检测pLV-PD1ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-PD1-GFP载体转染CIK细胞之后GFP表达情况。GFP表达方便用于流式细胞仪检测质粒是否转染进入CIK，GFP表达意味着融合蛋白和干扰miRNA也都表达。

图3为流式验证转染了pLV-PD1ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-PD1-GFP质粒的CIK细胞的分子标记表达，证实获得了合格的CIK细胞(转染pLV-PD1ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-PD1质粒的CIK细胞的结果与此类似，因此没有给出)。

图4为CIK-pLV-PD1ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-PD1-GFP及CIK-pLV-PD1ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-PD1细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。图中的“PD1ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-PD1-GFP”即表示CIK-pLV-PD1ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-PD1-GFP；“PD1ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-PD1”即表示CIK-pLV-PD1ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-PD1。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、类似嵌合抗原受体修饰的CIK细胞的制备与鉴定

本实施例所制备的类似嵌合抗原受体修饰的CIK细胞能敲低内源性PD-1表达，并且能同时表达PD1胞外区-CD28-41BB-CD3融合蛋白。

一、类似嵌合抗原受体修饰的CIK细胞的制备

1、淋巴细胞培养基的配制：含有终浓度为300IU/ml的IL-2、终浓度为1000IU/ml的IFN-γ的无血清培养基。其中，所述无血清培养基为Lonza公司产品，货号为04-418Q；所述IL-2为peprotech公司产品，货号为200-02；所述IFN-γ为peprotech公司产品，货号为300-02。

2、采集健康人外周血(当然如果采用绝大多数肿瘤患者的外周血也可以)，经检测无污染后，等体积生理盐水稀释，利用Ficoll淋巴细胞分离液(所述Ficoll淋巴细胞分离液的密度为1.077g/ml)将稀释的外周血进行单核细胞分离；分离得到的PBMC用淋巴细胞培养基调整浓度至3×10⁵-9×10⁵/ml，制成PBMC细胞悬液。

3、将步骤2的PBMC细胞悬液转移至含有CD3mAb/CD28mAb磁珠的T-175培养瓶中，总体积50ml，CD3mAb/CD28mAb磁珠的用量为1-2个磁珠/个PBMC，并向培养瓶中添加IFN-γ至其终浓度为1000IU/ml，添加IL-2至其终浓度为300IU/ml。其中，所述CD3mAb/CD28mAb磁珠为invitrogen公司产品，货号为402.03D。

4、培养第3天，采用Celetrix公司的电转仪将质粒(pLV-PD1ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-PD1-GFP或者pLV-PD1ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-PD1)电转入细胞，电转操作按照公司推荐的实验步骤进行(进行电转时，细胞浓度为10⁷-10⁹/ml，所用载体量为1-10μg/100μl细胞)。电转之后，添加含有终浓度为1000IU/ml的IFN-γ和终浓度为300IU/ml的IL-2的无血清培养基继续培养。

其中，两个PD-1干扰质粒，pLV-PD1ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-PD1-GFP和pLV-PD1ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-PD1均含有5个靶向PD-1mRNA的5’-UTR、3’-UTR和/或胞内区的串联miRNA的编码基因，并且能够同时表达PD1胞外区-CD28-41BB-CD3融合蛋白。所述PD1胞外区-CD28-41BB-CD3融合蛋白的氨基酸序列具体如序列表中序列3所示。序列3的第1-165位为PD-1的胞外区的氨基酸序列；第169-275位为CD28的跨膜区和胞内区的氨基酸序列；第276-322位所示为4-1BB的胞内区的氨基酸序列；第323-435位为CD3的胞内区的氨基酸序列。

pLV-PD1ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-PD1-GFP载体的全序列如序列表中序列1所示。序列1的第236-416位为5’LTR；第463-588位为HIV-1Ψ；第2131-3312位为EF-1αpromoter；第3348-4655位为PD1胞外区-CD28-41BB-CD3融合蛋白的编码基因；第3348-3842位为PD1ECD(PD-1胞外区)的编码基因；第3852-4172位为CD28跨膜区+胞内区的编码基因；第4173-4313位为4-1BB胞内区的编码基因；第4314-4655位为CD3胞内区的编码基因；第4858-5434位为IRES(internal ribozyme entry site)；第5589-6308位为EmGFP；第6396-6454位为miRNA-PD1-716；第6534-6592位为miRNA-PD1-801；第6672-6730位为miRNA-PD1-808；第6810-6868位为miRNA-PD1-904；第6948-7006位为miRNA-PD1-988；第7139-7727位为WPRE；第7814-8047位为3’LTR；第9208-10068位为AmpR。

pLV-PD1ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-PD1载体的全序列如序列表中序列2所示。序列2的第236-416位为5’LTR；第463-588位为HIV-1Ψ；第2131-3312位为EF-1αpromoter；第3348-4655位为PD1胞外区-CD28-41BB-CD3融合蛋白；第3348-3842位为PD1ECD(PD-1胞外区)的编码基因；第3852-4172位为CD28跨膜区+胞内区的编码基因；第4173-4313位为4-1BB胞内区的编码基因；第4314-4655位为CD3胞内区的编码基因；第4858-5434位为IRES(internal ribozyme entry site)；第5641-5699位为miRNA-PD1-716；第5779-5837位为miRNA-PD1-801；第5917-5975位为miRNA-PD1-808；第6055-6113位为miRNA-PD1-904；第6193-6251位为miRNA-PD1-988；第6384-6972位为WPRE；第7059-7292位为3’LTR；第8453-9313位为AmpR。

5、培养第7天，补加200ml所述淋巴细胞培养基(配方同上)，并加入与细胞数量相同的所述CD3mAb/CD28mAb磁珠。

6、每隔两天进行细胞计数，并补加相应体积的所述淋巴细胞培养基(配方同上)，使得细胞密度基本不变。

7、培养第15天，离心收获CIK细胞。CIK转染了pLV-PD1ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-PD1-GFP或者pLV-PD1ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-PD1质粒之后，分别记为CIK-pLV-PD1ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-PD1-GFP和CIK-pLV-PD1ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-PD1。

二、类似嵌合抗原受体修饰的CIK细胞的鉴定

1、验证步骤一最终所得细胞能敲低内源性PD-1表达并且能表达PD1胞外区-CD28-41BB-CD3融合蛋白

Western blot检测步骤一所获得的CIK细胞内源PD-1表达情况以及PD1胞外区-CD28-41BB-CD3融合蛋白的表达情况。1500rpm离心收集未转染任何质粒的CIK细胞、分别转染pLV-PD1ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-PD1-GFP和pLV-PD1ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-PD1质粒的CIK细胞(即CIK-pLV-PD1ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-PD1-GFP和CIK-pLV-PD1ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-PD1)上清，细胞沉淀按照每10⁵个细胞加入100μl RIPA裂解液(配方：50mM Tris，150mM NaCl，1％(v/v)Triton X-100，1％(w/v)sodium deoxycholate，0.1％(w/v)SDS)并吹打均匀，室温裂解15分钟，然后12000g离心5分钟，取上清并加入SDS-PAGE上样缓冲液，然后进行SDS-PAGE电泳及Western blot分析。针对内源PD-1及PD1胞外区-CD28-41BB-CD3融合蛋白的表达的检测，采用一抗为小鼠抗PD-1抗体(Abcam公司，货号ab140950)，二抗为HRP标记兔抗小鼠IgG(Santa Cruz Biotechnology公司，货号SC-358914)。

结果如图1所示，由图可见：CIK转染了pLV-PD1ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-PD1-GFP或者pLV-PD1ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-PD1质粒之后，与CIK对照相比，内源性PD-1蛋白表达水平至少下降了95％以上，且PD1胞外区-CD28-41BB-CD3融合蛋白获得了高表达。

2、流式检测pLV-PD1ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-PD1-GFP载体转染CIK细胞之后GFP表达情况

取上述步骤一收获的CIK-pLV-PD1ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-PD1-GFP300μl放入1.5ml EP管中，300g离心5分钟，弃上清，加入500μl含有0.5％多聚甲醛的PBS悬浮细胞并室温保持10分钟。然后300g离心5分钟，弃上清，加入300μl PBS，用移液器吹打并悬浮细胞，用流式细胞仪进行检测。

结果如图2所示，GFP表达方便用于流式细胞仪检测质粒是否转染进入CIK，GFP表达意味着融合蛋白和干扰miRNA也都表达。该结果表明目的质粒成功转染进入CIK细胞，结合图1结果，说明靶向PD1的miRNA及PD1胞外区-CD28-41BB-CD3融合蛋白都获得了高表达。

3、验证步骤一最终所得细胞为CIK细胞

处理细胞步骤同上述步骤2中所述，所用荧光抗体PE-anti-CD8antibody、FITC-anti CD4antibody、APC-anti-CD56antibody及PerCP-anti-CD3antibody为Biolegend公司产品，货号分别为300907、357405、362503、300325。

结果如图3所示，CIK、CIK-pLV-PD1ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-PD1-GFP、CIK-pLV-PD1ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-PD1三组细胞培养都获得了成功，CD8⁺细胞超过80％，CD4⁺细胞不超过20％，CD56⁺细胞超过50％。三组细胞的分子表型类似，因此只给出了CIK-pLV-PD1ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-PD1-GFP的结果。

实施例2、实施例1制备的类似嵌合抗原受体修饰的CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤效果检测

首先将人肿瘤细胞系SKOV3接种到艾森活细胞检测站的细胞培养板上，12小时之后，待细胞贴壁生长，加入一定数量的CIK(未转染任何质粒)、CIK-pLV-PD1ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-PD1-GFP、CIK-pLV-PD1ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-PD1细胞，形成不同的效靶比。继续培养48小时，检测各种CIK细胞对肿瘤细胞的杀伤效果。

结果如图4所示，由图可见：转染了pLV-PD1ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-PD1-GFP或者pLV-PD1ECD-CD28-41BB-CD3-IRES-miRNA-PD1质粒的CIK细胞对肿瘤的杀伤活性显著提高。

<110> 北京瑞健科技有限公司

<120> 一种类似嵌合抗原受体修饰的CIK及其制备方法与应用

<130> GNCLN171778

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 11287

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

aagcttaatg tagtcttatg caatactctt gtagtcttgc aacatggtaa cgatgagtta 60

gcaacatgcc ttacaaggag agaaaaagca ccgtgcatgc cgattggtgg aagtaaggtg 120

gtacgatcgt gccttattag gaaggcaaca gacgggtctg acatggattg gacgaaccac 180

tgaattgccg cattgcagag atattgtatt taagtgccta gctcgataca taaacgggtc 240

tctctggtta gaccagatct gagcctggga gctctctggc taactaggga acccactgct 300

taagcctcaa taaagcttgc cttgagtgct tcaagtagtg tgtgcccgtc tgttgtgtga 360

ctctggtaac tagagatccc tcagaccctt ttagtcagtg tggaaaatct ctagcagtgg 420

cgcccgaaca gggacttgaa agcgaaaggg aaaccagagg agctctctcg acgcaggact 480

cggcttgctg aagcgcgcac ggcaagaggc gaggggcggc gactggtgag tacgccaaaa 540

attttgacta gcggaggcta gaaggagaga gatgggtgcg agagcgtcag tattaagcgg 600

gggagaatta gatcgcgatg ggaaaaaatt cggttaaggc cagggggaaa gaaaaaatat 660

aaattaaaac atatagtatg ggcaagcagg gagctagaac gattcgcagt taatcctggc 720

ctgttagaaa catcagaagg ctgtagacaa atactgggac agctacaacc atcccttcag 780

acaggatcag aagaacttag atcattatat aatacagtag caaccctcta ttgtgtgcat 840

caaaggatag agataaaaga caccaaggaa gctttagaca agatagagga agagcaaaac 900

aaaagtaaga ccaccgcaca gcaagcggcc gctgatcttc agacctggag gaggagatat 960

gagggacaat tggagaagtg aattatataa atataaagta gtaaaaattg aaccattagg 1020

agtagcaccc accaaggcaa agagaagagt ggtgcagaga gaaaaaagag cagtgggaat 1080

aggagctttg ttccttgggt tcttgggagc agcaggaagc actatgggcg cagcgtcaat 1140

gacgctgacg gtacaggcca gacaattatt gtctggtata gtgcagcagc agaacaattt 1200

gctgagggct attgaggcgc aacagcatct gttgcaactc acagtctggg gcatcaagca 1260

gctccaggca agaatcctgg ctgtggaaag atacctaaag gatcaacagc tcctggggat 1320

ttggggttgc tctggaaaac tcatttgcac cactgctgtg ccttggaatg ctagttggag 1380

taataaatct ctggaacaga tttggaatca cacgacctgg atggagtggg acagagaaat 1440

taacaattac acaagcttaa tacactcctt aattgaagaa tcgcaaaacc agcaagaaaa 1500

gaatgaacaa gaattattgg aattagataa atgggcaagt ttgtggaatt ggtttaacat 1560

aacaaattgg ctgtggtata taaaattatt cataatgata gtaggaggct tggtaggttt 1620

aagaatagtt tttgctgtac tttctatagt gaatagagtt aggcagggat attcaccatt 1680

atcgtttcag acccacctcc caaccccgag gggacccgac aggcccgaag gaatagaaga 1740

agaaggtgga gagagagaca gagacagatc cattcgatta gtgaacggat ctcgacggta 1800

tcggttaact tttaaaagaa aaggggggat tggggggtac agtgcagggg aaagaatagt 1860

agacataata gcaacagaca tacaaactaa agaattacaa aaacaaatta caaaattcaa 1920

aattttatcg atgcctcccc gtcaccaccc cccccaaccc gccccgaccg gagctgagag 1980

taattcatac aaaaggactc gcccctgcct tggggaatcc cagggaccgt cgttaaactc 2040

ccactaacgt agaacccaga gatcgctgcg ttcccgcccc ctcacccgcc cgctctcgtc 2100

atcactgagg tggagaagag catgcgtgag gctccggtgc ccgtcagtgg gcagagcgca 2160

catcgcccac agtccccgag aagttggggg gaggggtcgg caattgaacc ggtgcctaga 2220

gaaggtggcg cggggtaaac tgggaaagtg atgtcgtgta ctggctccgc ctttttcccg 2280

agggtggggg agaaccgtat ataagtgcag tagtcgccgt gaacgttctt tttcgcaacg 2340

ggtttgccgc cagaacacag gtaagtgccg tgtgtggttc ccgcgggcct ggcctcttta 2400

cgggttatgg cccttgcgtg ccttgaatta cttccacgcc cctggctgca gtacgtgatt 2460

cttgatcccg agcttcgggt tggaagtggg tgggagagtt cgaggccttg cgcttaagga 2520

gccccttcgc ctcgtgcttg agttgaggcc tggcctgggc gctggggccg ccgcgtgcga 2580

atctggtggc accttcgcgc ctgtctcgct gctttcgata agtctctagc catttaaaat 2640

ttttgatgat atcctgcgac gctttttttc tggcaagata gtcttgtaaa tgcgggccaa 2700

gatctgcaca ctggtatttc ggtttttggg gccgcgggcg gcgacggggc ccgtgcgtcc 2760

cagcgcacat gttcggcgag gcggggcctg cgagcgcggc caccgagaat cggacggggg 2820

tagtctcaag ctggccggcc tgctctggtg cctggcctcg cgccgccgtg tatcgccccg 2880

ccctgggcgg caaggctggc ccggtcggca ccagttgcgt gagcggaaag atggccgctt 2940

cccggccctg ctgcagggag ctcaaaatgg aggacgcggc gctcgggaga gcgggcgggt 3000

gagtcaccca cacaaaggaa aagggccttt ccgtcctcag ccgtcgcttc atgtgactcc 3060

acggagtacc gggcgccgtc caggcacctc gattagttct cgagcttttg gagtacgtcg 3120

tctttaggtt ggggggaggg gttttatgcg atggagtttc cccacactga gtgggtggag 3180

actgaagtta ggccagcttg gcacttgatg taattctcct tggaatttgc cctttttgag 3240

tttggatctt ggttcattct caagcctcag acagtggttc aaagtttttt tcttccattt 3300

caggtgtcgt gaaaactacc cctgagctcc ttaaggttaa ctctagaatg cagatcccac 3360

aggcgccctg gccagtcgtc tgggcggtgc tacaactggg ctggcggcca ggatggttct 3420

tagactcccc agacaggccc tggaaccccc ccaccttctc cccagccctg ctcgtggtga 3480

ccgaagggga caacgccacc ttcacctgca gcttctccaa cacatcggag agcttcgtgc 3540

taaactggta ccgcatgagc cccagcaacc agacggacaa gctggccgcc ttccccgagg 3600

accgcagcca gcccggccag gactgccgct tccgtgtcac acaactgccc aacgggcgtg 3660

acttccacat gagcgtggtc agggcccggc gcaatgacag cggcacctac ctctgtgggg 3720

ccatctccct ggcccccaag gcgcagatca aagagagcct gcgggcagag ctcagggtga 3780

cagagagaag ggcagaagtg cccacagccc accccagccc ctcacccagg ccagccggcc 3840

aggctgctgc cattgaagtt atgtatcctc ctccttacct agacaatgag aagagcaatg 3900

gaaccattat ccatgtgaaa gggaaacacc tttgtccaag tcccctattt cccggacctt 3960

ctaagccctt ttgggtgctg gtggtggttg gtggagtcct ggcttgctat agcttgctag 4020

taacagtggc ctttattatt ttctgggtga ggagtaagag gagcaggctc ctgcacagtg 4080

actacatgaa catgactccc cgccgccccg ggcccacccg caagcattac cagccctatg 4140

ccccaccacg cgacttcgca gcctatcgct cccgtttctc tgttgttaaa cggggcagaa 4200

agaaactcct gtatatattc aaacaaccat ttatgagacc agtacaaact actcaagagg 4260

aagatggctg tagctgccga tttccagaag aagaagaagg aggatgtgaa ctgagagtga 4320

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tgcagaaaga taagatggcg gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc gagcgccgga 4560

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catggaagct ttacccttat gacgtacctg actatgctgg cgcctaccct tatgacgtac 4740

ctgactatgc tggataccct tatgacgtac ctgactatgc tggagatatc taactgactg 4800

aaccggtggt accgatccac gcgtctccgg cctagggata acagggtaat ccgctagccc 4860

ctctccctcc ccccccccta acgttactgg ccgaagccgc ttggaataag gccggtgtgc 4920

gtttgtctat atgttatttt ccaccatatt gccgtctttt ggcaatgtga gggcccggaa 4980

acctggccct gtcttcttga cgagcattcc taggggtctt tcccctctcg ccaaaggaat 5040

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aacgtctgta gcgacccttt gcaggcagcg gaacccccca cctggcgaca ggtgcctctg 5160

cggccaaaag ccacgtgtat aagatacacc tgcaaaggcg gcacaacccc agtgccacgt 5220

tgtgagttgg atagttgtgg aaagagtcaa atggctctcc tcaagcgtat tcaacaaggg 5280

gctgaaggat gcccagaagg taccccattg tatgggatct gatctggggc ctcggtacac 5340

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cgtggttttc ctttgaaaaa cacgatgata atatggccac actagagatc caccggtcgc 5460

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tatagggagt cccaagctgg ctagttaagc tatcaacaag tttgtacaaa aaagcaggct 5580

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ccatcttctt caaggacgac ggcaactaca agacccgcgc cgaggtgaag ttcgagggcg 5940

acaccctggt gaaccgcatc gagctgaagg gcatcgactt caaggaggac ggcaacatcc 6000

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agctcgccga ccactaccag cagaacaccc ccatcggcga cggccccgtg ctgctgcccg 6180

acaaccacta cctgagcacc cagtccgccc tgagcaaaga ccccaacgag aagcgcgatc 6240

acatggtcct gctggagttc gtgaccgccg ccgggatcac tctcggcatg gacgagctgt 6300

acaagtaagc taagcacttc gtggccgtcg atcgtttaaa gggaggtagt gagtcgacca 6360

gtggatcctg gaggcttgct gaaggctgta tgctgtagtc cacagagaac acaggcgttt 6420

tggccactga ctgacgcctg tgttctgtgg actacaggac acaaggcctg ttactagcac 6480

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gcatactccg tctggttttg gccactgact gaccagacgg aatgccacca ttcaggacac 6600

aaggcctgtt actagcactc acatggaaca aatggcccag atcctggagg cttgctgaag 6660

gctgtatgct gattccgcta ggaaagacaa tggttttggc cactgactga ccattgtctc 6720

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<211> 10532

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

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gccccttcgc ctcgtgcttg agttgaggcc tggcctgggc gctggggccg ccgcgtgcga 2580

atctggtggc accttcgcgc ctgtctcgct gctttcgata agtctctagc catttaaaat 2640

ttttgatgat atcctgcgac gctttttttc tggcaagata gtcttgtaaa tgcgggccaa 2700

gatctgcaca ctggtatttc ggtttttggg gccgcgggcg gcgacggggc ccgtgcgtcc 2760

cagcgcacat gttcggcgag gcggggcctg cgagcgcggc caccgagaat cggacggggg 2820

tagtctcaag ctggccggcc tgctctggtg cctggcctcg cgccgccgtg tatcgccccg 2880

ccctgggcgg caaggctggc ccggtcggca ccagttgcgt gagcggaaag atggccgctt 2940

cccggccctg ctgcagggag ctcaaaatgg aggacgcggc gctcgggaga gcgggcgggt 3000

gagtcaccca cacaaaggaa aagggccttt ccgtcctcag ccgtcgcttc atgtgactcc 3060

acggagtacc gggcgccgtc caggcacctc gattagttct cgagcttttg gagtacgtcg 3120

tctttaggtt ggggggaggg gttttatgcg atggagtttc cccacactga gtgggtggag 3180

actgaagtta ggccagcttg gcacttgatg taattctcct tggaatttgc cctttttgag 3240

tttggatctt ggttcattct caagcctcag acagtggttc aaagtttttt tcttccattt 3300

caggtgtcgt gaaaactacc cctgagctcc ttaaggttaa ctctagaatg cagatcccac 3360

aggcgccctg gccagtcgtc tgggcggtgc tacaactggg ctggcggcca ggatggttct 3420

tagactcccc agacaggccc tggaaccccc ccaccttctc cccagccctg ctcgtggtga 3480

ccgaagggga caacgccacc ttcacctgca gcttctccaa cacatcggag agcttcgtgc 3540

taaactggta ccgcatgagc cccagcaacc agacggacaa gctggccgcc ttccccgagg 3600

accgcagcca gcccggccag gactgccgct tccgtgtcac acaactgccc aacgggcgtg 3660

acttccacat gagcgtggtc agggcccggc gcaatgacag cggcacctac ctctgtgggg 3720

ccatctccct ggcccccaag gcgcagatca aagagagcct gcgggcagag ctcagggtga 3780

cagagagaag ggcagaagtg cccacagccc accccagccc ctcacccagg ccagccggcc 3840

aggctgctgc cattgaagtt atgtatcctc ctccttacct agacaatgag aagagcaatg 3900

gaaccattat ccatgtgaaa gggaaacacc tttgtccaag tcccctattt cccggacctt 3960

ctaagccctt ttgggtgctg gtggtggttg gtggagtcct ggcttgctat agcttgctag 4020

taacagtggc ctttattatt ttctgggtga ggagtaagag gagcaggctc ctgcacagtg 4080

actacatgaa catgactccc cgccgccccg ggcccacccg caagcattac cagccctatg 4140

ccccaccacg cgacttcgca gcctatcgct cccgtttctc tgttgttaaa cggggcagaa 4200

agaaactcct gtatatattc aaacaaccat ttatgagacc agtacaaact actcaagagg 4260

aagatggctg tagctgccga tttccagaag aagaagaagg aggatgtgaa ctgagagtga 4320

agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag ctctataacg 4380

agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagagacgt ggccgggacc 4440

ctgagatggg gggaaagccg cagagaagga agaaccctca ggaaggcctg tacaatgaac 4500

tgcagaaaga taagatggcg gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc gagcgccgga 4560

ggggcaaggg gcacgatggc ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag gacacctacg 4620

acgcccttca catgcaggcc ctgccccctc gctaaggatc caatattccc gggctcgagc 4680

catggaagct ttacccttat gacgtacctg actatgctgg cgcctaccct tatgacgtac 4740

ctgactatgc tggataccct tatgacgtac ctgactatgc tggagatatc taactgactg 4800

aaccggtggt accgatccac gcgtctccgg cctagggata acagggtaat ccgctagccc 4860

ctctccctcc ccccccccta acgttactgg ccgaagccgc ttggaataag gccggtgtgc 4920

gtttgtctat atgttatttt ccaccatatt gccgtctttt ggcaatgtga gggcccggaa 4980

acctggccct gtcttcttga cgagcattcc taggggtctt tcccctctcg ccaaaggaat 5040

gcaaggtctg ttgaatgtcg tgaaggaagc agttcctctg gaagcttctt gaagacaaac 5100

aacgtctgta gcgacccttt gcaggcagcg gaacccccca cctggcgaca ggtgcctctg 5160

cggccaaaag ccacgtgtat aagatacacc tgcaaaggcg gcacaacccc agtgccacgt 5220

tgtgagttgg atagttgtgg aaagagtcaa atggctctcc tcaagcgtat tcaacaaggg 5280

gctgaaggat gcccagaagg taccccattg tatgggatct gatctggggc ctcggtacac 5340

atgctttaca tgtgtttagt cgaggttaaa aaaacgtcta ggccccccga accacgggga 5400

cgtggttttc ctttgaaaaa cacgatgata atatggccac actagagatc caccggtcgc 5460

cacctctggc taactagaga acccactgct tactggctta tcgaaattaa tacgactcac 5520

tatagggagt cccaagctgg ctagttaagc tatcaacaag tttgtacaaa aaagcaggct 5580

ttaaagggag gtagtgagtc gaccagtgga tcctggaggc ttgctgaagg ctgtatgctg 5640

tagtccacag agaacacagg cgttttggcc actgactgac gcctgtgttc tgtggactac 5700

aggacacaag gcctgttact agcactcaca tggaacaaat ggcccagatc ctggaggctt 5760

gctgaaggct gtatgctgaa tggtggcata ctccgtctgg ttttggccac tgactgacca 5820

gacggaatgc caccattcag gacacaaggc ctgttactag cactcacatg gaacaaatgg 5880

cccagatcct ggaggcttgc tgaaggctgt atgctgattc cgctaggaaa gacaatggtt 5940

ttggccactg actgaccatt gtctcctagc ggaatcagga cacaaggcct gttactagca 6000

ctcacatgga acaaatggcc cagatcctgg aggcttgctg aaggctgtat gctgaagagc 6060

agtgtccatc ctcaggtttt ggccactgac tgacctgagg atacactgct cttcaggaca 6120

caaggcctgt tactagcact cacatggaac aaatggccca gatcctggag gcttgctgaa 6180

ggctgtatgc tgttctcctg aggaaatgcg ctggttttgg ccactgactg accagcgcat 6240

cctcaggaga acaggacaca aggcctgtta ctagcactca catggaacaa atggcccaga 6300

tctggccgca ctcgagatat ctagacccag ctttcttgta caaagtggtt gatctagagg 6360

gcccgcggtt cgctgatgtc gacaatcaac ctctggatta caaaatttgt gaaagattga 6420

ctggtattct taactatgtt gctcctttta cgctatgtgg atacgctgct ttaatgcctt 6480

tgtatcatgc tattgcttcc cgtatggctt tcattttctc ctccttgtat aaatcctggt 6540

tgctgtctct ttatgaggag ttgtggcccg ttgtcaggca acgtggcgtg gtgtgcactg 6600

tgtttgctga cgcaaccccc actggttggg gcattgccac cacctgtcag ctcctttccg 6660

ggactttcgc tttccccctc cctattgcca cggcggaact catcgccgcc tgccttgccc 6720

gctgctggac aggggctcgg ctgttgggca ctgacaattc cgtggtgttg tcggggaagc 6780

tgacgtcctt tccatggctg ctcgcctgtg ttgccacctg gattctgcgc gggacgtcct 6840

tctgctacgt cccttcggcc ctcaatccag cggaccttcc ttcccgcggc ctgctgccgg 6900

ctctgcggcc tcttccgcgt cttcgccttc gccctcagac gagtcggatc tccctttggg 6960

ccgcctcccc gcctggaatt cgagctcggt acctttaaga ccaatgactt acaaggcagc 7020

tgtagatctt agccactttt taaaagaaaa ggggggactg gaagggctaa ttcactccca 7080

acgaagacaa gatctgcttt ttgcttgtac tgggtctctc tggttagacc agatctgagc 7140

ctgggagctc tctggctaac tagggaaccc actgcttaag cctcaataaa gcttgccttg 7200

agtgcttcaa gtagtgtgtg cccgtctgtt gtgtgactct ggtaactaga gatccctcag 7260

acccttttag tcagtgtgga aaatctctag cagtagtagt tcatgtcatc ttattattca 7320

gtatttataa cttgcaaaga aatgaatatc agagagtgag aggaacttgt ttattgcagc 7380

ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag catttttttc 7440

actgcattct agttgtggtt tgtccaaact catcaatgta tcttatcatg tctggctcta 7500

gctatcccgc ccctaactcc gcccatcccg cccctaactc cgcccagttc cgcccattct 7560

ccgccccatg gctgactaat tttttttatt tatgcagagg ccgaggccgc ctcggcctct 7620

gagctattcc agaagtagtg aggaggcttt tttggaggcc tagggacgta cccaattcgc 7680

cctatagtga gtcgtattac gcgcgctcac tggccgtcgt tttacaacgt cgtgactggg 7740

aaaaccctgg cgttacccaa cttaatcgcc ttgcagcaca tccccctttc gccagctggc 7800

gtaatagcga agaggcccgc accgatcgcc cttcccaaca gttgcgcagc ctgaatggcg 7860

aatgggacgc gccctgtagc ggcgcattaa gcgcggcggg tgtggtggtt acgcgcagcg 7920

tgaccgctac acttgccagc gccctagcgc ccgctccttt cgctttcttc ccttcctttc 7980

tcgccacgtt cgccggcttt ccccgtcaag ctctaaatcg ggggctccct ttagggttcc 8040

gatttagtgc tttacggcac ctcgacccca aaaaacttga ttagggtgat ggttcacgta 8100

gtgggccatc gccctgatag acggtttttc gccctttgac gttggagtcc acgttcttta 8160

atagtggact cttgttccaa actggaacaa cactcaaccc tatctcggtc tattcttttg 8220

atttataagg gattttgccg atttcggcct attggttaaa aaatgagctg atttaacaaa 8280

aatttaacgc gaattttaac aaaatattaa cgcttacaat ttaggtggca cttttcgggg 8340

aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct 8400

catgagacaa taaccctgat aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat 8460

tcaacatttc cgtgtcgccc ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc 8520

tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg 8580

ttacatcgaa ctggatctca acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg 8640

ttttccaatg atgagcactt ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat cccgtattga 8700

cgccgggcaa gagcaactcg gtcgccgcat acactattct cagaatgact tggttgagta 8760

ctcaccagtc acagaaaagc atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc 8820

tgccataacc atgagtgata acactgcggc caacttactt ctgacaacga tcggaggacc 8880

gaaggagcta accgcttttt tgcacaacat gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg 8940

ggaaccggag ctgaatgaag ccataccaaa cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc 9000

aatggcaaca acgttgcgca aactattaac tggcgaacta cttactctag cttcccggca 9060

acaattaata gactggatgg aggcggataa agttgcagga ccacttctgc gctcggccct 9120

tccggctggc tggtttattg ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat 9180

cattgcagca ctggggccag atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg 9240

gagtcaggca actatggatg aacgaaatag acagatcgct gagataggtg cctcactgat 9300

taagcattgg taactgtcag accaagttta ctcatatata ctttagattg atttaaaact 9360

tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt gataatctca tgaccaaaat 9420

cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc 9480

ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct 9540

accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg 9600

cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt tcttctagtg tagccgtagt taggccacca 9660

cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc 9720

tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga 9780

taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac 9840

gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga 9900

agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag 9960

ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg 10020

acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag 10080

caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc 10140

tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag ctgataccgc 10200

tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg aagagcgccc 10260

aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg gccgattcat taatgcagct ggcacgacag 10320

gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt aatgtgagtt agctcactca 10380

ttaggcaccc caggctttac actttatgct tccggctcgt atgttgtgtg gaattgtgag 10440

cggataacaa tttcacacag gaaacagcta tgaccatgat tacgccaagc gcgcaattaa 10500

ccctcactaa agggaacaaa agctggagct gc 10532

<210> 3

<211> 435

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln

1 5 10 15

Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp

20 25 30

Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp

35 40 45

Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val

50 55 60

Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala

65 70 75 80

Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg

85 90 95

Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg

100 105 110

Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu

115 120 125

Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val

130 135 140

Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro

145 150 155 160

Arg Pro Ala Gly Gln Ala Ala Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro

165 170 175

Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly

180 185 190

Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe

195 200 205

Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu

210 215 220

Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg

225 230 235 240

Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro

245 250 255

Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala

260 265 270

Tyr Arg Ser Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu

275 280 285

Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu

290 295 300

Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys

305 310 315 320

Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln

325 330 335

Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu

340 345 350

Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly

355 360 365

Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu

370 375 380

Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys

385 390 395 400

Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu

405 410 415

Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu

420 425 430

Pro Pro Arg

435

Claims (10)

1.一种制备类似嵌合抗原受体修饰的CIK细胞制剂的方法，包括如下步骤：向CIK中转入重组载体，所述重组载体能敲低内源性PD-1表达，并且能表达PD1胞外区-CD28-41BB-CD3融合蛋白，培养后收获细胞，从而制得所述类似嵌合抗原受体修饰的CIK细胞制剂；

所述重组载体上含有多个串联的靶向PD-1mRNA的5’-UTR、3’-UTR和/或胞内区的miRNA的编码基因；所述多个为2-30个；

所述PD1胞外区-CD28-41BB-CD3融合蛋白自N端到C端依次由PD-1的胞外区、CD28的跨膜区和胞内区、4-1BB的胞内区和CD3的胞内区组成。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述重组载体为慢病毒载体。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述重组载体上含有5个串联的靶向PD-1mRNA的5’-UTR、3’-UTR和/或胞内区的miRNA的编码基因；所述5个串联的靶向PD-1mRNA的5’-UTR、3’-UTR和/或胞内区的miRNA的编码基因分别如下：

(1)miRNA-PD1-716：核苷酸序列如序列表中序列1的第6396-6454位或序列2的第5641-5699所示；

(2)miRNA-PD1-801：核苷酸序列如序列表中序列1的第6534-6592位或序列2的第5779-5837所示；

(3)miRNA-PD1-808：核苷酸序列如序列表中序列1的第6672-6730位或序列2的第5917-5975所示；

(4)miRNA-PD1-904：核苷酸序列如序列表中序列1的第6810-6868位或序列2的第6055-6113所示；

(5)miRNA-PD1-988：核苷酸序列如序列表中序列1的第6948-7006位或序列2的第6193-6251所示。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述PD1胞外区-CD28-41BB-CD3融合蛋白中，所述PD-1的胞外区的氨基酸序列如序列表中序列3的第1-165位所示；所述CD28的跨膜区和胞内区的氨基酸序列如序列表中序列3的第169-275位所示；所述4-1BB的胞内区的氨基酸序列如序列表中序列3的第276-322位所示；所述CD3的胞内区的氨基酸序列如序列表中序列3的第323-435位所示；

具体的，所述PD1胞外区-CD28-41BB-CD3融合蛋白的氨基酸序列如序列表中序列3所示。

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述重组载体的序列为序列表中序列1或序列2所示。

6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述CIK细胞是利用细胞因子体外诱导PBMC分化而来的；

具体的，所述细胞因子为CD3mAb、CD28mAb、IFN-γ和IL-2；和/或

所述培养的时间为自转入所述重组载体后培养12天。

7.利用权利要求1-6中任一所述方法制备得到的类似嵌合抗原受体修饰的CIK细胞制剂。

8.权利要求7所述CIK细胞制剂在如下任一中的应用：

(1)制备治疗肿瘤的产品；

(2)制备用于杀伤肿瘤细胞的产品。

9.重组载体，为权利要求1-5任一中所述的重组载体。

10.权利要求9所述的载体在制备权利要求7所述CIK细胞制剂中的应用。