KR20130087878A - 인간 적혈구 형성 자극인자 발현 벡터 및 이를 이용한 인간 적혈구 형성 자극인자의 생산방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간 적혈구 형성 자극인자(human erythropoietin, hEpo)의 대량 생산용 벡터 및 이를 이용한 hEpo의 생산 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로 말토오즈 결합 단백질(Maltose Binding Protein, MBP) 을 암호화하는 DNA, 단백질분해효소 인식부위를 암호화하는 DNA 및 인간 적혈구 형성 자극인자를 암호화하는 DNA를 순서대로 포함하는 인간 적혈구 형성 자극인자 발현용 벡터, 및 이를 이용한 Epo의 생산방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 형질전환된 대장균을 배양하여 가용화된 상태로 MBP-hEpo 융합 단백질을 대량 생산할 수 있으며, 본 발명의 방법에 따라 제조된 재조합 hEpo 단백질은 진핵세포에서 발현된 hEpo 단백질과 동일한 생물학적 활성을 보인다.

Description

인간 적혈구 형성 자극인자 발현 벡터 및 이를 이용한 인간 적혈구 형성 자극인자의 생산방법 {Expression Vector for Human Erythropoietin and Process for Production of Erythropoietin Using Thereof}

본 발명은 인간 적혈구 형성 자극인자(human erythropoietin, hEpo)의 대량 생산용 벡터 및 이를 이용한 hEpo의 생산 방법에 관한 것이다.

인간 적혈구 형성 자극인자(human erythropoietin, hEpo)는 고등생물에서 적혈구 형성을 촉진하는 호르몬으로서 166개의 아미노산과 여러 종류의 당으로 구성된 당단백질이다(Carnot, et al., Compt. Rend., 143, 384, 1906). 또한, Epo는 혈액내 적혈구 형성에 필수불가결한 인자로서 빈혈 등 혈액관련 질병의 진단 및 치료에 이용되고 있다.

천연형 인간 Epo는 단일형(monomer)의 산성 당 단백질(acid glycoprotein)로서 전체 분자량이 약 34 kDa 정도이며, 당을 제외한 단백질 분자량은 약 18 kDa이다. 또한, 아미노산 Asn 24, Asn 38 및 Asn 83의 위치에 3개의 N-결합 당쇄와 Ser 126 위치에 하나의 뮤신형(mucin-type) O-결합 당쇄를 포함하며, hEpo의 당함량이 감소하면 이의 생물학적 반감기가 급격히 감소된다.

사람의 Epo 유전자를 클로닝하여 동물세포(대한민국 특허공고 제89-1011 호 및 제 93-5917 호) 및 효모 또는 곤충세포(대한민국 특허공개 제 95-5988 호)에서 발현시키는 방법들이 개발되었다. 그러나, 효모 또는 곤충세포는 주로 고만노즈형(high mannose type)의 당 단백질을 생성하고 당화능이 낮아서 인간 Epo와 같은 복합형(complex type)의 당 단백질을 생성하지 못하며, 이 같은 형태로 생성된 당쇄구조는 인체 내에서 항원성을 유발시킬 위험이 있으므로 인간 Epo를 발현시키기 위한 숙주세포로는 적절하지 못하다. 또한 동물세포를 이용하여 인간 Epo를 제조하면 천연형과 가장 유사한 Epo를 생산할 수 있으나 발현율이 매우 낮으며, 생산비용이 고가인 단점이 있다.

인간 Epo의 4개의 당쇄구조 중에서 Ser 126 위치의 O-결합 당쇄는 생체내(in vivo)에서와 시험관내(in vitro)에서 아무런 역할을 하지 않았으며, 3개의 N-결합 당쇄를 제거하였을 때 생체 내 활성이 급격하게 감소하였지만 시험관내에서의 활성은 그대로 유지되는 것으로 밝혀졌다(Masato H. et al., J. Biol. Chem., 267, 7703-7709, 1992). 이러한 사실은 인간 Epo의 당쇄가 생체 내에서 수용체와의 결합에 관여하는 것이 아니라 구조적인 안정성에만 기여한다는 것을 나타낸다. 따라서, 당화 기능이 전혀 없는 대장균을 숙주세포로 하여 인간 Epo 를 생산한 후에 적절한 변형을 가해 구조적인 안정성을 높임으로써 hEpo를 대량 생산하기 위한 많은 연구가 있었으나 순수한 hEpo만을 가용화된 상태로 발현시키는데는 실패하였다. 예를 들어, 보이셀 등은 Epo의 아미노 말단에 10개의 히스티딘을 접합시키므로써 대장균에서 Epo를 융합 단백질 형태로 발현시켰으며(Boissel J.P. et al., J. Biol. Chem., 268(21), 15983-93, 1993), 빌 등은 4가지 대장균 발현벡터를 이용하여 Epo의 아미노 말단에 글루타티온-S-전이효소가 결합된 융합 단백질을 발현시킨 바 있다(Bill R.M., et al., Biochem., Biophys. Acta, 1261, 35, 1995). 그러나 상기와 같은 방법으로 얻어진 Epo는 발현율이 매우 낮아서 순수한 hEpo를 얻기 힘들거나, 수용성이 매우 낮아 봉입체 형태로 발현되므로 대량생산에는 많은 어려움이 있다. 따라서 대장균에서 인간 적혈구 형성 자극인자를 가용화된 상태로 발현하고, 이를 용이하게 정제하는 방법에 대한 연구가 요구되고 있다.

따라서 본 발명은 대장균에서 인간 적혈구 형성 자극인자를 가용화된 상태로 발현하기 위한 발현용 벡터 및 이를 통해 인간 적혈구 형성 자극인자를 용이하게 생산, 정제하는 방법을 제공하고자 한다.

상기 과제의 해결을 위하여, 본 발명은 말토오즈 결합 단백질(Maltose Binding Protein, MBP) 을 암호화하는 DNA, 단백질분해효소 인식부위를 암호화하는 DNA 및 인간 적혈구 형성 자극인자를 암호화하는 DNA를 순서대로 포함하는 인간 적혈구 형성 자극인자 발현용 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 대장균을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 형질전환된 대장균을 인간 적혈구 형성 자극인자의 발현에 적합한 조건에서 배양하는 단계; 및 배양된 대장균의 세포파쇄액으로부터 융합단백질을 정제하는 단계를 포함하는 인간 적혈구 형성 자극인자의 생산방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 형질전환된 대장균을 배양하여 가용화된 상태로 MBP-rhEpo 융합 단백질을 대량 생산할 수 있으며, 본 발명의 방법에 따라 제조된 재조합(recombination) hEpo 단백질은 진핵세포에서 발현된 hEpo 단백질과 동일한 생물학적 활성을 보인다.

도 1은 본 발명의 발현 벡터 제조 모식도 (A) 및 이를 통해 제조되는 단백질의 구조 모식도(B)이다.
도 2는 본 발명의 발현벡터 개열지도이다.
도 3의 A는 다양한 태그단백질이 결합된 rhEpo의 발현에 대한 SDS-PAGE 결과이다(C: 대조군, T: 총 세포 용해물, S: 상청액).
도 3의 B는 세포 생장 곡선 및 SDS-PAGE 결과이다(왼쪽 패널 C: 대조군, I: 도입 후 총 세포 용해물, 1, 2, 3, 4 :도입 후 시간/ 오른쪽 패널: 배양 3시간 후 결과, T: 총 세포 용해물, P: 펠렛, S:상청액)
도 4의 A는 각 분리 단계에 따른 SDS-PAGE 결과이다(1: 총 세포 용해물, 2: 상청액, 3: MBP 친화컬럼의 flow through region, 4: 용출된 MBP-결합된 rhEpo, 5: TEV 프로테아제 처리 후 샘플, 6: GPC 후 용출산물)
도 4의 B는 각 분리 단계에 따른 웨스턴 블랏 결과 사진이다(1: 총 세포 용해물, 2: 상청액, 3: MBP 친화컬럼의 flow through region, 4: 용출된 MBP-결합된 rhEpo, 5: TEV 프로테아제 처리 후 샘플, 6: GPC 후 용출산물)
도 5의 A는 rhEpo의 트립신 분해 펩티드 맵, B및 C는 MALDI-TOF MS 분석 결과 그래프이다.
도 6은 in vitro 세포 증식 분석 결과 그래프이다(○: CHO세포로부터 정제된 Epo, ●: 대장균에서 정제된 Epo)

본 발명은 말토오즈 결합 단백질(Maltose Binding Protein, MBP) 을 암호화하는 DNA, 단백질분해효소 인식부위를 암호화하는 DNA 및 인간 적혈구 형성 자극인자를 암호화하는 DNA를 순서대로 포함하는 인간 적혈구 형성 자극인자 발현용 벡터를 제공한다.

본 발명의 발명자들은 대장균에서 hEpo를 가용화된 상태로 발현하기 위한 방법에 대해 연구하던 중, 말토오즈 결합 단백질과 융합된 hEpo의 발현 시 융합단백질의 가용성이 매우 우수하고, 이를 통한 정제 또한 용이하며, 발현된 hEpo는 인간 Epo와 동일한 위치에 이황화결합이 형성되어 생물학적 활성이 우수하다는 점을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 말토오즈 결합 단백질(MBP)을 암호화하는 DNA는 말토오즈 결합 단백질을 암호화하는 DNA의 전체 또는 일부분일 수 있다.

본 발명의 일실시예에서, 상기 말토오즈 결합 단백질(MBP)의 아미노산 서열은 서열번호 4로 표시될 수 있다.

또한 본 발명의 일실시예에서, 상기 말토오즈 결합 단백질을 암호화하는 DNA는 서열번호 2의 핵산서열을 갖는 유전자일수 있다.

서열번호 2의 핵산서열을 갖는 유전자 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 외에도, 상기 서열들의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 본다. 변이체는 핵산서열 또는 아미노산 서열은 변화 및 추가되지만, 서열번호 2의 핵산서열 또는 서열번호 4의 아미노산 서열과 유사한 기능적 특성을 갖는 염기서열로 이루어진 유전자 또는 폴리펩티드이다. 구체적으로, 본 발명에 따른 말토오즈 결합 단백질을 암호화하는 DNA는 서열번호 2의 핵산서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, 인간 적혈구 형성 자극인자(Epo)를 암호화하는 DNA는 천연형 또는 변이형 Epo를 암호화하는 DNA의 어느 것이나 사용할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서, 상기 인간 적혈구 형성 자극인자(Epo)의 아미노산 서열은 서열번호 5로 표시될 수 있다.

또한 본 발명의 일실시예에서, 상기 인간 적혈구 형성 자극인자(Epo)를 암호화하는 DNA는 서열번호 3으로 표시될 수 있다.

서열번호 3의 핵산서열을 갖는 유전자 또는 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 외에도, 상기 서열들의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 본다. 변이체는 핵산서열 또는 아미노산 서열은 변화 및 추가되지만, 서열번호 3의 핵산서열 또는 서열번호 5의 아미노산 서열과 유사한 기능적 특성을 갖는 염기서열로 이루어진 유전자 또는 폴리펩티드이다. 구체적으로, 본 발명에 따른 인간 적혈구 형성 자극인자(Epo)를 암호화하는 DNA는 서열번호 3의 핵산서열과 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 단백질분해효소 인식 부위는 발현된 MBP-rhEpo 융합 단백질로부터 hEpo를 용이하게 분리해 내기 위해 포함되는 것으로서, 당 분야의 공지된 인자 Xa 프로테아제, 트롬빈, 엔테로키나아제 또는 TEV(Tavacco Etch Virus) 프로테아제의 인식부위를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 TEV(Tavacco Etch Virus) 프로테아제의 인식부위를 사용할 수 있다. TEV 프로테아제는 ENLYFQˇG(Glu - Asn - Leu - Tyr - Phe - Gln ↓ Gly) 서열을 인식하여 상기 표지부위를 절단하므로, 백터내에 상기 서열을 암호화하는 DNA를 삽입하면 발현된 융합 단백질로부터 rhEpo를 용이하게 회수할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서, 상기 단백질분해효소는 TEV 프로테아제일 수 있으며, 벡터는 pET022b일 수 있다. 이의 개열지도는 도 2에 기재되어 있으며, 보다 구체적으로, 본 발명에 따른 벡터의 핵산서열은 서열번호 1과 같다. 그러나 본 발명의 벡터는 도 2에 기재된 벡터에 한정되지 않고, 대장균의 형질전환에 유용한 임의의 벡터를 이용할 수 있다.

본 발명에 있어서 “벡터(vector)”는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 DNA 서열을 보유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질 전환되면 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 “발현 벡터”는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질 전환된 세포를 비 형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 암피실린(ampicilin), 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에 의해 적절히 선택 가능하다.

본 발명의 일실시예에 따른 대장균 발현 벡터에서, 프로모터는 이종 단백질의 발현에 통상적으로 사용하는 임의의 프로모터도 사용할 수 있으며, T7 프로모터, Tac 프로모터, 아라비노즈 프로모터 등을 예로 들 수 있다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다.

본 발명에 따른 벡터는 대장균 내에 도입되어 형질 전환된 대장균을 형성할 수 있다. 따라서 본 발명은 상기 벡터로 형질 전환된 대장균을 제공하며, 상기 대장균은 BL21(DE3)일 수 있다.

본 발명은 또한 상기 형질 전환된 대장균을 인간 적혈구 형성 자극인자의 발현에 적합한 조건에서 배양하는 단계; 및 배양된 대장균의 세포파쇄액으로부터 융합단백질을 정제하는 단계를 포함하는 인간 적혈구 형성 자극인자의 생산방법을 제공한다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 정제하는 단계는 친화 크로마토그래피로 1차 정제하는 단계; 단백질 분해효소로 절단하는 단계; 및 겔 투과 크로마토그래피로 2차 정제하는 단계;를 포함할 수 있다.

친화 크로마토그래피는 MBP 친화 컬럼을 사용하여 수행될 수 있으며 이를 통해 정제된 MBP-rhEpo 융합 단백질은 벡터 내에 존재하는 인식부위를 인식하는 적합한 단백질 분해효소, 바람직하게는 인자 Xa 프로테아제, 트롬빈, 엔테로키나아제 또는 TEV(Tavacco Etch Virus) 프로테아제를 사용하여 절단하여 rhEpo 단백질을 생산할 수 있다. 이후 2차로 겔 투과 크로마토그래피(GPC)를 실시하여 고순도로 정제된 rhEpo 단백질을 분리할 수 있는데, 이때 겔 투과 크로마토그래피는 0.1 내지 1M의 NaCl 및 0.005 내지 0.01%의 계면활성제를 포함하는 완충액을 사용하여 수행될 수 있다. rhEpo의 정제에 있어서, 이온성 상호작용이 이황화결합 또는 소수성 상호작용보다 중요한 것으로 나타났는 바, 상기와 같이 상대적으로 높은 염 농도 및 상대적으로 낮은 농도의 계면활성제를 포함하는 완충액을 사용할 수 있으며, 보다 구체적으로 계면활성제로는 Triton X-100을 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 방법으로 분리, 정제된 재조합 hEpo는 이황화결합이 형성되어 있어 진핵세포에서 생산된 hEpo와 동일한 생물학적 활성을 갖는 것으로 확인되었다. 이는 MBP가 rhEpo의 적합한 폴딩을 위한 분자 샤페론 역할을 수행하며, 표면에 존재하는 소수성 잔기의 클러스터가 결합 부위의 역할을 수행함을 시사한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당 업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실험예 >

하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.

1. SDS - PAGE

SDS-PAGE가 통상의 방법으로 수행되었다. 미리 염색된 분자량 스탠다드 (Elpis biotech, Daejeon, Korea)가 단백질 사이즈 마커로 사용되었다. 샘플은 10% SDS-PAGE 겔에 로드되었다. 단백질 밴드는 쿠마시 블루로 염색되었고, 발현, 용해도 및 순도는 ImageJ 프로그램(http://imagej.nih.gov/ij)으로 정량화되었다.

2. 웨스턴 블랏

웨스턴 블랏을 위하여, 샘플은 10% SDS-PAGE 겔에 로드되었다. 용해된 단백질은 니트로셀룰로오스 막에 처리되었고, 상기 막은 상온, TBST (10 mM Tris-HCl, pH 7.4; 150 mM NaCl, 0.05% Tween)에서 5% skim milk로 30분간 블락되었다. 그 후 막은 TBST (1 : 2000)에서 Epo에 대한 Ms mAb (Abcam, Cambridge, UK) 와 4°C 에서 하룻밤 동안 배양된 후 TBST로 10분간 5회 세척되었다. 세척된 막은 상온, TBST (1 : 5000)에서 퍼옥시다아제-표지된 항-마우스 IgG (Vector, MA, USA)와 1시간 동안 배양된 후 TBST로 다섯번 세척되었다. 세척 후, 상기 막은 picoEPD (Elpis biotech, Daejeon, Korea)를 사용하여 처리되었다.

< 실시예 1> rhEpo 의 구조 제작: His , GST , TRX , NusA 및 MBP 벡터

다양한 태그 단백질이 N-말단 부위에 부착된 pET22b-기초한 데스티네이션 벡터(Destination Vector)가 발현벡터로 사용되었다. hEpo 유전자의 증폭을 위해, 두 프라이머(정방향 5′- GCGCTGGGCGCGCAGAAAGAAGCTATCAGTC-3′ 및 역방향 5′- GACTGATAGCTTCTTTCTGCGCGCCCAGCGC-3′)가 사용되었다. 전체 벡터의 구조 제작을 위해, 성숙 인간 Epo(NP_000790.2)의 166개의 아미노산을 암호화하는 DNA 서열이 합성되었고, 유전자 합성 서비스(Epoch life science Inc., TX, USA)를 사용하여 E. coli 발현을 위한 코돈으로 최적화되었다. 상기 서열은 BP 재조합 클로닝 시스템 (Invitrogen, CA, USA)을 사용하여 pDONR 207 벡터로 도입되었다. TEV 프로테아제 결합부위(ENLYFQˇG)가 재조합된 인간 Epo(rhEpo)의 아미노산 서열 앞에 삽입되었다. 발현 벡터의 획득을 위해, rhEpo 유전자는 LR recombination cloning (Invitrogen, CA, USA)를 통해 pHGWA (His6), pHGGWA (GST), pHXGWA (TRX), pHNGWA (NusA), 및 pHMGWA (MBP) 벡터로 클로닝되었다. 최종 플라스미드는 E. coli BL21 (DE3)로 rhEpo의 과 발현을 위해 도입되었다. 도 1은 발현 벡터 제조 모식도(A) 및 이를 통해 제조되는 단백질의 구조 모식도(B)이며, 도 2는 제조된 발현벡터의 개열지도이다.

< 실시예 2> 다양한 태그 단백질과 결합된 rhEpo의 발현

다양한 태그 단백질과 함께 발현되는 rhEpo의 발현수준 분석을 위해, 발현 클론은 50 μg/ml 암피실린이 부가된 3 ml LB 배양액에서 37℃로 하룻밤 동안 미리 배양되었다. 미리 배양된 샘플은 적절한 항생제를 포함하는 새 LB 배양액 1L 에 접종되었고, mid-log phase(OD₆₀₀ 0.4~0.5)까지 배양된 후 이소프로필-β-D-싸이오갈락토시드(IPTG)를 가하여 최종 농도가 1 mM이 되게 하였다. Soluble 발현 수준을 증가시키기 위해, 배양 시 온도를 30℃로 변경하였다. 3시간 배양된 후 세포는 30분간 3,500 rpm의 원심분리를 통해 획득되었다. 세포 펠렛은 10 ml/g 세포 버퍼 A(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.5 mM EDTA, 5% 글리세롤) 로 재 부유되었고 초음파 분쇄되었다. 30분간 12,000 rpm으로의 원심분리 후 가용성 및 비 가용성 분획이 수득되었다. 다양한 태그단백질이 부착된 rhEpo의 발현 수준은 SDS-PAGE 분석으로 측정되었고, ImageJ 프로그램으로 계산되었다. 결과를 도 3 및 표 1에 나타내었다.

Tagging protein	Expression size ( kDa )	Expression level (%)	Solubility (%)
His6	22.4	47	17
TRX	34.2	48	34
GST	48	7	-
MBP	62.7	36	92
NusA	77.25	60	85

도 3의 A및 표 1을 참조하면, GST 태그된 단백질을 제외하고는 모든 태그된 rhEpo 단백질이 과량 발현됨을 알 수 있었다. 또한, MBP 및 NusA 태그된 rhEpo 단백질이 다른 단백질에 비해 보다 가용성임을 알 수 있었다. 상기 결과로부터, MBP 및 NusA가 E. coli에서 가용성 rhEpo 단백질의 발현을 위해 유용하게 사용될 수 있을 것으로 추정되었다. 효과적인 정제를 위하여, 가용성이 우수한 MBP 태그된 rhEpo가 추후 정제과정에 선택되었다.

도 3의 B의 세포 생장 곡선을 참조하면, MBP 태그된 rhEpo의 발현은 E. coli 에의 도입 3시간 후에 현저하게 증가하는 것을 알 수 있었다. 상기 결과에 기초하여, 1 L 당 3g의 wet 세포가 동일 조건에서 얻어졌고, 초음파 처리 및 원심분리 후 상청액에서 MBP 태그된 rhEpo를 얻을 수 있었으며, 최종 농도는 118 mg/L이었다(표 2 참조). 또한 SDS-PAGE 결과를 참조하면, 세포 배양 시간에 다른 발현된 단백질의 존재 여부 및 배양 3시간째에 회수된 샘플에서의 MBP 태그된 rhEpo 발현을 알 수 있다.

Purification step	Volume ( ml )	Pellet weight (g)	Total protein ( mg /L)	Purity (%)	Specific activity (U/ mg )
Bacterial culture	1,000	3.92	-	-	-
Cell lysate	100	0.92	124	58	-
Supernatant	100	-	118	67	-
MBP eluate	50	-	24.1	70	-
TEV treatment	50	-	29.4	27	-
GPC eluate	20	-	1.17	98	3.7 x 105

3. rhEpo 의 효율적인 정제

3.1. MBP 친화 컬럼을 통한 rhEpo의 정제

획득된 상청액은 MBP Trap HP (GE life science, NJ, USA)로 로드되었고, AKTA Prime Plus (GE life science, NJ, USA)를 사용하여 버퍼 A로 평형이 유지되었다. 그 후 컬럼은 UV 값이 베이스라인에 도달할 때까지 버퍼 A로 세척되었다. 결합 단백질은 그 후 버퍼 B (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.5 mM EDTA, 5% 글리세롤, 20 mM 말토오즈 모노하이드레이트 (Junsei chemical Co., Tokyo, Japan)로 용출되었다. 용출된 MBP-결합된 rhEpo는 주요 단백질 피크에 존재하였고, 10% tris-glycine SDS-PAGE 분석으로 확인되었다. 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4A에서 확인할 수 있는 바와 같이, 컬럼을 통한 불순물 및 MBP-태그된 rhEpo 의 용출 분획에서의 존재를 2 내지 4 레인에서 확인할 수 있었다. 발현된 전체 MBP-결합된 rhEpo의 아미노산 서열은 서열번호 6과 같다.

3.2. TEV 프로테아제를 사용한 MBP-rhEpo 의 절단

MBP 친화 컬럼으로부터 용출된 rhEpo에 결합된 MBP는 TEV 프로테아제(1 U는 30 μg 단백질을 절단하는 1 μg TEV 프로테아제를 의미함)로 TEV 스탠다드 버퍼(50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.5 mM EDTA, 5 mM Dithiothreitol (DTT), 5% 글리세롤 (v/v))에서 처리되었다. 5 mM DTT를 반응 샘플에 가한 후, TEV 처리된 샘플은 상온에서 하룻밤 동안 배양되었다. 절단된 rhEpo의 분리는 10% tris-glycine SDS-PAGE 분석으로 확인되었다. 도 4A의 5번 레인을 참조하면, TEV 프로테아제가 90%이상의 MBP-태그된 rhEpo를 절단하는 것을 알 수 있다.

3.3. 겔 투과 크로마토그래피(GPC)를 통한 rhEpo의 이차 정제공정

rhEpo를 정제하기 위해, TEV 프로테아제가 처리된 샘플은 HiLoad 26/100 Superdex-200 HR 에 로딩되었고, 이때 5 mM DTT, 0.01% Triton X-100 및 0.5 M NaCl를 가하며 버퍼 A로 평형을 조절하였다. 이온성 상호작용이 rhEpo의 정제에 있어서 이황화결합 또는 소수성 상호작용보다 중요한 것으로 나타났는 바, 상기와 같이 높은 염 농도 및 낮은 농도의 계면활성제를 사용하였다.

최종 정제된 rhEpo는 10% tris-glycine SDS-PAGE 분석 및 항-Epo 항체(Abcam, Cambridge, UK)를 사용한 웨스턴 블롯팅으로 확인되었다.

도 4A의 SDS-PAGE 분석 결과를 참조하면, 6번 레인에서, GPC 결과 정제된 rhEpo가 검출된 것을 알 수 있었다.

상기 정제 과정의 결과는 상기 표 2에 요약되어 있다. 표 2를 참조하면, 정제된 rhEpo의 최종 수율은 미생물 배양액 1L 당 1.17 mg로 나타났으며, 이의 순도는 98% 이상임을 알 수 있다. rhEpo의 정제 단계는 도 4B의 웨스턴 블랏 분석을 사용하여서도 확인되었다.

< 시험예 1> rhEpo 의 이황화결합 분석을 위한 MALDI-TOF MS 분석

정제된 rhEpo의 이황화결합 유무 및 위치를 확인하기 위해, 환원 조건 및 비 환원 조건에서 분석이 수행되었다. 환원 및 비 환원된 rhEpo는 10% TCA로 침전되었고, 침전된 rhEpo는 IAA 버퍼(25 mM 아이오도아세트아마이드, 0.5 M Tris-HCl, pH 8.0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2% SDS, 5% 글리세롤)에 재 부유되었고, 이후 암실, 상온에서 30분간 배양되었다. 샘플은 10% 비-환원 tris-tricine SDS-PAGE 겔로 분리되었고, 겔 염색 후, rhEpo 밴드를 자르고 트립신 처리 후 MALDI-TOF MS 분석이 수행되었다.

본 발명의 발명자들은 도 5A의 rhEpo의 트립신 분해 펩티드 맵을 참조하여, 전체 15개의 트립신 분해 펩티드로부터 11개의 일치하는 펩타이드를 찾았다. 환원된 rhEpo의 펩타이드 맵은 인간 Epo와 73% 이상 일치하였고, 네 개의 시스테인 잔기는 T2+IAA (763.8 Da), T15+IAA (970.2 Da) 및 T5+2 IAA (2803.7 Da) 와 같이 IAA 로 변화되었다(도 5B 참조). 또한 단량체 형태로 존재하는 정제된 rhEpo의 대부분은 비 환원된 형태로 존재하였다(도 5C 참조). 도 5의 B와 C를 비교하면, 정제된 rhEpo가 Cys13-Cys167 (T2+T15, 1617.9 Da) 및 Cys35-Cys39 (T5, 2689.2 Da) 즉, 내부에 두 개의 이황화결합을 포함하고 있음을 알 수 있다. 상기 결과로부터 E. coli 로부터 MBP를 태그 단백질로 사용하여 정제된 rhEpo 는 두 개의 정확한 이황화결합을 형성함을 확인하였다.

< 시험예 2> in vitro 세포 증식 분석

인간 TF-1 세포주는 적백혈병세포로서, Epo, 인터루킨 3(IL-3) 또는 과립대식세포집락자극인자(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-SCF)를 성장 및 생존에 필요로 한다. 이에 따라 본 발명에 따른 hEpo 단백질이 인간 TF-1 세포주의 생장에 효과가 있는지 여부를 분석하였다.

인간 TF-1 세포주(ATCC, VA, USA)가 2.2 g/L 소듐 바이카보네이트 (Bioshop, Ontario, Canada), 100X 페니실린/스트렙토마이신 항생제 (Gibco, NY, USA), 2 ng/ml 재조합 인간 GM-CSF (Prospec, NJ, USA) 및 10% FBS 가 첨가된 RPMI1640 (Gibco, NY, USA) 배양액에서 37℃, 습한 5% CO₂ 대기 하에서 유지되었다.

그 후 세포는 세척되었고, 1 x 10⁵ cells/ml의 농도로 2.2 g/L 소듐 바이카보네이트 (Bioshop, Ontario, Canada), 100X 페니실린/스트렙토마이신 항생제 (Gibco, NY, USA) 및 10% FBS를 포함하는 RPMI1640 배양액에 재 부유되었다. 96-웰 플레이트의 각각의 웰에는 100 μl의 세포 및 차례로 2-배 희석된 샘플이 위치하였고, 웰에 3회 첨가되었다. 37℃, 5% CO₂ 에서 48시간 배양 후 세포 생장은 WST-1 분석으로 측정되었다.

결과를 도 6에 나타내었다. 정제된 rhEpo는 0.2 ng/ml 농도에서 음성 대조군보다 보다 높은 세포 분화 촉진 능을 보였다. 양성 대조군과 비교할 때, 분리 정제된 rhEpo는 in vitro 에서 유사한 생물학적 활성을 보였다. 상기 결과를 참조하면, 정제된 rhEpo의 ED₅₀은 0.37 ng/ml이며, 고유 활성도는 3.7 x 10⁵ U/mg임을 알 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당 업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> University of Ulsan Foundation For Industry Cooperation <120> Expression Vector for Human Erythropoietin and Process for Production of Erythropoietin Using Thereof <130> DP-2011-0841 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 7136 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified pET022b vector <400> 1 ttgtacaaag tggtgatgta cctcgagcac caccaccacc accactgaga tccggctgct 60 aacaaagccc gaaaggaagc tgagttggct gctgccaccg ctgagcaata actagcataa 120 ccccttgggg cctctaaacg ggtcttgagg ggttttttgc tgaaaggagg aactatatcc 180 ggattggcga atgggacgcg ccctgtagcg gcgcattaag cgcggcgggt gtggtggtta 240 cgcgcagcgt gaccgctaca cttgccagcg ccctagcgcc cgctcctttc gctttcttcc 300 cttcctttct cgccacgttc gccggctttc cccgtcaagc tctaaatcgg gggctccctt 360 tagggttccg atttagtgct ttacggcacc tcgaccccaa aaaacttgat tagggtgatg 420 gttcacgtag tgggccatcg ccctgataga cggtttttcg ccctttgacg ttggagtcca 480 cgttctttaa tagtggactc ttgttccaaa ctggaacaac actcaaccct atctcggtct 540 attcttttga tttataaggg attttgccga tttcggccta ttggttaaaa 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1440 gctcggccct tccggctggc tggtttattg ctgataaatc tggagccggt gagcgtgggt 1500 ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag atggtaagcc ctcccgtatc gtagttatct 1560 acacgacggg gagtcaggca actatggatg aacgaaatag acagatcgct gagataggtg 1620 cctcactgat taagcattgg taactgtcag accaagttta ctcatatata ctttagattg 1680 atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa gatccttttt gataatctca 1740 tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga 1800 tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa 1860 aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga 1920 aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg tagccgtagt 1980 taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt 2040 taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat 2100 agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct 2160 tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca 2220 cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag 2280 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ctcaatctgg cctgttggct gaaatcaccc cggacaaagc gttccaggac aagctgtatc 5700 cgtttacctg ggatgccgta cgttacaacg gcaagctgat tgcttacccg atcgctgttg 5760 aagcgttatc gctgatttat aacaaagatc tgctgccgaa cccgccaaaa acctgggaag 5820 agatcccggc gctggataaa gaactgaaag cgaaaggtaa gagcgcgctg atgttcaacc 5880 tgcaagaacc gtacttcacc tggccgctga ttgctgctga cgggggttat gcgttcaagt 5940 atgaaaacgg caagtacgac attaaagacg tgggcgtgga taacgctggc gcgaaagcgg 6000 gtctgacctt cctggttgac ctgattaaaa acaaacacat gaatgcagac accgattact 6060 ccatcgcaga agctgccttt aataaaggcg aaacagcgat gaccatcaac ggcccgtggg 6120 catggtccaa catcgacacc agcaaagtga attatggtgt aacggtactg ccgaccttca 6180 agggtcaacc atccaaaccg ttcgttggcg tgctgagcgc aggtattaac gccgccagtc 6240 cgaacaaaga gctggcaaaa gagttcctcg aaaactatct gctgactgat gaaggtctgg 6300 aagcggttaa taaagacaaa ccgctgggtg ccgtagcgct gaagtcttac gaggaagagt 6360 tggcgaaaga tccacgtatt gccgccacca tggaaaacgc ccagaaaggt gaaatcatgc 6420 cgaacatccc gcagatgtcc gctttctggt atgccgtgcg tactgcggtg atcaacgccg 6480 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Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp Arg 165 <210> 6 <211> 571 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> His-MBP-hEpo recombination protein <400> 6 Met Gly Ser Ser His His His His His His Gly Thr Lys Thr Glu Glu 1 5 10 15 Gly Lys Leu Val Ile Trp Ile Asn Gly Asp Lys Gly Tyr Asn Gly Leu 20 25 30 Ala Glu Val Gly Lys Lys Phe Glu Lys Asp Thr Gly Ile Lys Val Thr 35 40 45 Val Glu His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys Phe Pro Gln Val Ala Ala 50 55 60 Thr Gly Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe Trp Ala His Asp Arg Phe Gly 65 70 75 80 Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Leu Leu Ala Glu Ile Thr Pro Asp Lys Ala 85 90 95 Phe Gln Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp Ala Val Arg Tyr Asn 100 105 110 Gly Lys Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala Val Glu Ala Leu Ser Leu Ile 115 120 125 Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys Thr Trp Glu Glu Ile 130 135 140 Pro Ala Leu Asp Lys Glu Leu Lys Ala Lys Gly Lys Ser Ala Leu Met 145 150 155 160 Phe Asn Leu Gln Glu Pro Tyr Phe Thr Trp Pro Leu Ile Ala Ala Asp 165 170 175 Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu Asn Gly Lys Tyr Asp Ile Lys Asp 180 185 190 Val Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala Gly Leu Thr Phe Leu Val 195 200 205 Asp Leu Ile Lys Asn Lys His Met Asn Ala Asp Thr Asp Tyr Ser Ile 210 215 220 Ala Glu Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala Met Thr Ile Asn Gly 225 230 235 240 Pro Trp Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys Val Asn Tyr Gly Val 245 250 255 Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser Lys Pro Phe Val Gly 260 265 270 Val Leu Ser Ala Gly Ile Asn Ala Ala Ser Pro Asn Lys Glu Leu Ala 275 280 285 Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp Glu Gly Leu Glu Ala 290 295 300 Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu Gly Ala Val Ala Leu Lys Ser Tyr Glu 305 310 315 320 Glu Glu Leu Ala Lys Asp Pro Arg Ile Ala Ala Thr Met Glu Asn Ala 325 330 335 Gln Lys Gly Glu Ile Met Pro Asn Ile Pro Gln Met Ser Ala Phe Trp 340 345 350 Tyr Ala Val Arg Thr Ala Val Ile Asn Ala Ala Ser Gly Arg Gln Thr 355 360 365 Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr Gly Thr Gly Ser Tyr Ile 370 375 380 Thr Ser Leu Tyr Lys Lys Ala Gly Phe Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly 385 390 395 400 Gly Thr Ala Ala Ala Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val 405 410 415 Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr 420 425 430 Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp 435 440 445 Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln 450 455 460 Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu 465 470 475 480 Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu 485 490 495 Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr 500 505 510 Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp 515 520 525 Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg 530 535 540 Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu 545 550 555 560 Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp Arg 565 570

Claims (11)

1. 말토오즈 결합 단백질(Maltose Binding Protein, MBP) 을 암호화하는 DNA, 단백질분해효소 인식부위를 암호화하는 DNA 및 인간 적혈구 형성 자극인자를 암호화하는 DNA를 순서대로 포함하는 인간 적혈구 형성 자극인자 발현용 벡터.
2. 제1항에 있어서,
   상기 말토오즈 결합 단백질을 암호화하는 DNA는 서열번호 2의 핵산서열을 갖는 유전자인 것인 인간 적혈구 형성 자극인자 발현용 벡터.
3. 제1항에 있어서,
   상기 인간 적혈구 형성 자극인자를 암호화하는 DNA는 서열번호 3의 핵산서열을 갖는 유전자인 것인 인간 적혈구 형성 자극인자 발현용 벡터.
4. 제1항에 있어서,
   상기 단백질분해효소는 인자 Xa 프로테아제, 트롬빈, 엔테로키나아제 또는 TEV(Tavacco Etch Virus) 프로테아제인 것인 인간 적혈구 형성 자극인자 발현용 벡터.
5. 제1항에 있어서,
   상기 벡터는 pET022b를 기반으로 한 것인 인간 적혈구 형성 자극인자 발현용 벡터.
6. 제1항에 있어서,
   상기 벡터는 도 2에 기재된 개열지도를 갖는 것인 인간 적혈구 형성 자극인자 발현용 벡터.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 벡터로 형질전환된 대장균.
8. 제7항에 있어서,
   상기 대장균은 BL21(DE3)인 것인 형질전환된 대장균.
9. 제7항의 형질전환된 대장균을 인간 적혈구 형성 자극인자의 발현에 적합한 조건에서 배양하는 단계; 및
   배양된 대장균의 세포파쇄액으로부터 융합단백질을 정제하는 단계를 포함하는 인간 적혈구 형성 자극인자의 생산방법.
10. 제9항에 있어서,
    상기 정제하는 단계는
    친화 크로마토그래피로 1차 정제하는 단계;
    단백질 분해효소로 절단하는 단계; 및
    겔 투과 크로마토그래피로 2차 정제하는 단계;를 포함하는 것인 인간 적혈구 형성 자극인자의 생산방법.
11. 제10항에 있어서,
    상기 겔 투과 크로마토그래피는 0.1 내지 1M의 NaCl 및 0.005 내지 0.01%의 계면활성제를 포함하는 완충액을 사용하여 수행되는 것인 인간 적혈구 형성 자극인자의 생산방법.
    

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