ES2927271T3 - Inhibidor de esterasa C1 humana recombinante y usos del mismo - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona, entre otras cosas, métodos y composiciones para tratar enfermedades mediadas por el complemento. En algunas realizaciones, se proporcionan proteínas inhibidoras de C1 esterasa humana recombinante que tienen una vida media similar o más prolongada que el inhibidor de C1 esterasa humana derivado de plasma nativo, y métodos para prepararlas. En algunas realizaciones, la invención proporciona un método para administrar una cantidad eficaz de una proteína inhibidora de la esterasa C1 humana recombinante a un individuo que sufre o es susceptible a una enfermedad mediada por el complemento de tal manera que al menos un síntoma o característica de dicha enfermedad mediada por el complemento la enfermedad es prevenida y/o reducida en intensidad, severidad o frecuencia. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Inhibidor de esterasa C1 humana recombinante y usos del mismo

ANTECEDENTES

El inhibidor de C1 (C1 -INH), también conocido como inhibidor de la esterasa C1, es el miembro más grande de la superfamilia de proteínas serpina. Es un inhibidor de proteinasa de serina fuertemente glicosilado que tiene la función principal de inhibir la activación espontánea del sistema del complemento. C1-INH regula el sistema de cascada del complemento, desempeña un papel clave en la regulación de la cascada de amplificación por contacto (calicreína-cinina) y participa en la regulación de los sistemas de coagulación y fibrinolítico. Ver Karnaukhova, E., C1 -Esterase Inhibitor: Biological Activities and Therapeutic Applications. J Hematol Thromb Dis, 1: 113 (2013).

La disfunción y/o deficiencia de C1 -INH en sujetos se ha correlacionado con una variedad de enfermedades autoinmunes debido a la incapacidad de C1-INH para inhibir la activación del sistema del complemento. Un ejemplo de tal enfermedad es el angioedema hereditario (HAE), un trastorno raro, pero potencialmente mortal, caracterizado por ataques de inflamación impredecibles y recurrentes. Los síntomas de los ataques de HAE incluyen hinchazón de la cara, la boca y/o las vías respiratorias que se producen espontáneamente o se desencadenan por un traumatismo leve. Tal hinchazón también puede producirse en cualquier parte del cuerpo. En algunos casos, el HAE está asociado con niveles en plasma bajos de inhibidor de C1, mientras que en otros casos la proteína circula en cantidades normales o elevadas, pero es disfuncional. Además de los episodios de inflamación, también puede provocar indicaciones más graves o potencialmente mortales, como enfermedades autoinmunes o lupus eritematoso.

El CINRYZE®, un inhibidor de la esterasa C1 derivado de plasma humano, ha sido aprobado para uso profiláctico y tratamiento de ataques agudos de HAE. El Berinert® (también un C1-INH humano derivado de plasma, CSL Behring) está indicado para el tratamiento del ataque agudo de HAE. El suministro de inhibidor de la esterasa C1 derivado de plasma humano está ligado a la disponibilidad de donaciones de sangre y plasma. el Ruconest® (conestat alfa, Pharming NV), un C1-INH recombinante expresado en conejos manipulados genéticamente, está indicado para administración IV para el tratamiento del ataque agudo de HAE. Aunque el Ruconest® tiene la misma secuencia de aminoácidos que el C1-INH derivado del plasma humano, ya que se fabrica en conejos, su perfil de glicosilación es muy diferente al del C1 -INH derivado del plasma humano. El resultado es que el Ruconest tiene una vida media extremadamente corta de aproximadamente 2,4 a 2,7 horas. consultar la información de prescripción y la etiqueta de la FDA del Ruconest®.

Por lo tanto, sigue habiendo una necesidad en la técnica de un inhibidor de la esterasa C1 humana recombinante mejorado para el tratamiento de varias indicaciones mediadas por la esterasa C1.

La WO 2016/070156 A2 describe inhibidores de esterasa C1 recombinantes de acción prolongada mejorados que pueden usarse para tratar eficazmente varios trastornos mediados por el complemento. La WO 2016/081889 A1 se refiere a un método para la producción de inhibidor de esterasa C1 recombinante.

La EP3042952 A1 se refiere a glicoproteínas recombinantes que tienen glicanos de GalNAc O-enlazados altamente o completamente sialilados (GalNAc O-glicanos).

Silke Wissing et al. (06/03/2015) se refiere a la expresión de en células CAP-Go.

La WO 2013/093027 A1 se refiere a la prevención y/o tratamiento de un edema secundario.

La WO 2014/135694 A1 se refiere a un inhibidor del sistema de activación de contacto, preferiblemente un C1 INH, para su uso en el tratamiento y/o prevención de lesión por isquemia-reperfusión remota.

Ruth Essers et al. (2011) se refiere a la mejora de la productividad volumétrica de una línea celular de CAP humana estable mediante la optimización de bioprocesos.

Elena Karnaukhova (2015) se refiere a las actividades biológicas y las aplicaciones terapéuticas de los inhibidores de la esterasa C1.

Silke Wissing et al. (11/01/2015) se refiere a métodos para la expresión de glicoproteínas.

Cevec se refiere a un sistema de expresión celular CAP Go.

La WO 01/57079 A2 se refiere a mamíferos no humanos transgénicos que expresan el inhibidor de C1 en su leche.

El consorcio Cho "Recombinant Protein Therapeutics from CHO cells - 20 years and counting" se refiere, en general, a la producción de agentes terapéuticos de proteínas recombinantes usando células CHO.

La WO 2011/116291 A1 se refiere a la producción de inhibidor de C1 humano en células humanas.

Bos IGA et al. (2003) se refiere a la expresión de rhC1 -Inh en Pichia pastoris.

Yang H y Zheng S (1997) se refieren a la expresión del inhibidor de C1 humano en células CHO usando un vector de expresión dicistrónico.

La US 5622930 A se refiere a muteínas inhibidoras de C1 y aplicaciones de las muteínas preferiblemente como agentes antiinflamatorios y más preferiblemente para el tratamiento profiláctico o terapéutico de la sepsis. SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente divulgación se refiere a inhibidores mejorados de la esterasa C1 humana recombinante de acción prolongada (rhC1-INH) que pueden usarse para tratar eficazmente varios trastornos mediados por el complemento y que pueden fabricarse de manera rentable. La invención se define en las reivindicaciones.

En particular, la presente invención se refiere a proteínas inhibidoras de la esterasa C1 recombinantes que muestran una vida media más prolongada que el Ruconest® (conestat alfa). Las proteínas de rhC1-INH de la invención muestran una vida media comparable o más larga que la de C1 -INH derivado de plasma. Por ejemplo, los presentes inventores han demostrado que ciertas proteínas rhC1-INH ejemplares tienen una vida media en suero extendida de por lo menos 4 días. Se contempla que la larga vida media en suero de una rhC1-INH lleve a una eficacia in vivo superior y permita un régimen de dosificación y vía de administración preferibles. En ciertas realizaciones, las proteínas rhC1-INH pueden administrarse por vía subcutánea con una frecuencia similar o reducida en comparación con los inhibidores de la esterasa C1 administrados por vía intravenosa aprobados, a la vez que se logra la eficacia deseada (por ejemplo, profilaxis). Además, las proteínas rhC1-INH pueden producirse recombinantemente en células huésped de tal manera que las proteínas rhC1-INH divulgadas no dependen del suministro de sangre, no presentan un riesgo de transmisión de agentes infecciosos y son menos costosas de fabricar. El Ruconest también conlleva el riesgo de hipersensibilidad y/o reacciones de anafilaxia debido a la presencia de impurezas relacionadas con el huésped del conejo. El Ruconest no puede administrarse a ningún paciente que tenga sensibilidad o alergia conocidas a los conejos o productos derivados del conejo.

Como la presente invención se refiere a proteínas inhibidoras de esterasa C1 recombinantes que se producen recombinantemente en células huésped, ofrecen más consistencia en la producción y el producto final que los productos purificados a partir de sangre humana, componentes sanguíneos humanos (por ejemplo, plasma) o leche animal. Además, las proteínas rhC1-INH descritas en la presente, a diferencia del Ruconest, no dependen de las consideraciones de cría de animales, incluyendo la edad y/o madurez del animal, la producción de leche, la enfermedad del animal, etc., todas las cuales pueden afectar tanto a la cantidad como a la calidad (por ejemplo, perfil de glicosilación, heterogeneidad de la proteína expresada, impurezas relacionadas con el huésped, etc.) del C1-INH expresado en conejo.

En un aspecto, la invención proporciona una composición que comprende un inhibidor de la esterasa C1 humana recombinante (rhC1-INH) truncado purificado que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a la SEQ ID NO: 4 que tiene una mutación E165Q, en donde:

(i) el rhC1-INH truncado purificado tiene una vida media de por lo menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 o 70 horas;

(ii) el rhC1-INH truncado purificado comprende, de media, por lo menos 10, 11, 12, 13 o 14 residuos de glicano sialilado por molécula y tiene una vida media similar o más larga que el inhibidor de esterasa C1 derivado de plasma humano; o

(iii) el rhC1-INH truncado purificado comprende, de media, por lo menos un 80% de glicanos cargados por molécula y tiene una vida media similar o más prolongada que el inhibidor de esterasa C1 derivado de plasma humano.

En un segundo aspecto, la invención proporciona un ácido nucleico que codifica un rhC1-INH truncado que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a la SEQ ID NO: 4 que tiene una mutación E165Q o una célula que comprende dicho ácido nucleico.

En un tercer aspecto, la invención proporciona una célula huésped que comprende un vector de expresión que codifica un rhC1-INH truncado que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a la SEQ ID NO: 4 que tiene una mutación E165Q, en donde:

(i) dicha célula huésped, una vez cultivada en condiciones de cultivo celular, es capaz de expresar el rhC1-INH truncado a un título entre 0,1 g/l y 10,0 g/l o a una tasa de productividad específica de más de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 picogramos/célula/día; opcionalmente en donde

(a) dicha célula huésped, una vez cultivada en condiciones de cultivo celular, es capaz de expresar el rhC1-INH truncado a una tasa de productividad específica de más de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 picogramos/célula/día;

(b) la célula huésped es una célula de mamífero, opcionalmente una célula CHO o una célula humana, en donde la célula humana es opcionalmente una célula HT1080 o HEK; y/o

(c) la célula huésped se manipula para aumentar la sialilación del rhC1 -INH truncado expresado; o

(ii) el rhC1-INH truncado se manipula para aumentar la sialilación;

opcionalmente en donde la célula huésped se manipula para expresar una enzima heteróloga para aumentar la sialilación, se manipula para expresar una enzima heteróloga mutante para aumentar la sialilación, se manipula para sobreexpresar una enzima endógena para aumentar la sialilación, se manipula para expresar una enzima endógena mutada para aumentar la sialilación, y/o se manipula para reducir o prevenir la expresión de enzimas endógenas que reducen, inhiben o degradan la sialilación.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para producir un rhC1-INH truncado que comprende (i) cultivar la célula huésped de la invención; o

(ii) que comprende los pasos de:

proporcionar una célula huésped manipulada para expresar rhC1-INH truncado que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a la SEQ ID NO: 4 que tiene una mutación E165Q; y

cultivar la célula huésped en condiciones adecuadas para que la célula produzca rhC1-INH truncado, en donde las condiciones comprenden alimentar las células con un medio de cultivo que comprende un modulador de glicosilación durante por lo menos un período de tiempo;

opcionalmente, en donde las células se cultivan entre 30° C y 34° C durante por lo menos un período de tiempo.

En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende:

(i) un rhC1-INH truncado purificado de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable; y/o

(ii) que comprende el rhC1-INH truncado de la invención en un tampón de formulación que comprende Tris 50 mM, sorbitol 50 mM y glicina 150 mM, en donde la composición tiene un pH de 7,2.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un kit que comprende una composición farmacéutica de la invención, en donde

(i) el kit comprende opcionalmente además una jeringuilla, en donde la jeringuilla está precargada con la composición farmacéutica líquida de la invención; o

(ii) la composición farmacéutica está liofilizada y el kit comprende además un tampón para la reconstitución, en donde el mezclado de la composición liofilizada y el tampón para la reconstitución produce una composición líquida de la invención, y en donde el kit comprende además opcionalmente una jeringuilla.

En un aspecto adicional, la invención proporciona una composición farmacéutica de acuerdo con la invención para su uso en el tratamiento de un trastorno mediado por el complemento, en donde el trastorno mediado por el complemento se selecciona opcionalmente de angioedema hereditario, rechazo mediado por anticuerpos, trastornos del espectro de la neuromielitis óptica, trastornos cerebrales traumáticos. lesión de la médula espinal, lesión cerebral isquémica, lesión por quemadura, necrólisis epidérmica tóxica, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), enfermedad de Parkinson, ataque cerebral, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP), miastenia grave, neuropatía motora multifocal.

En una realización, el rhC1-INH recombinante purificado tiene un perfil de glicosilación que comprende no más del 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% o 5% de especies de glicanos neutras. En otra realización, la proteína rhC1-INH recombinante es una proteína de fusión. En otra realización, la proteína rhC1-INH recombinante comprende un dominio Fc fusionado directa o indirectamente con un dominio de C1-INH. En otra realización, la proteína rhC1-INH recombinante comprende un dominio de albúmina fusionado directa o indirectamente con un dominio de C1-INH. En otra realización, el rhC1-INH recombinante purificado tiene un perfil de glicosilación que comprende entre aproximadamente el 5% y aproximadamente el 25% de especies de glicanos neutras. En otra realización, el rhC1-INH recombinante purificado contiene menos del 20%, 15%, 10%, 5% o 0% de una o más glicosilaciones de tipo manosa, a-galactosa, NGNA y/u oligomanosa. En otra realización, el rhC1-INH recombinante purificado tiene un perfil de glicosilación que comprende no más del 30% de especies de glicanos neutras y suficientes especies de glicanos sialiladas de tal manera que el rhC1-INH purificado tiene una vida media similar o más prolongada que la del C1-INH derivado del plasma. En otra realización, el rhC1-INH recombinante purificado tiene un perfil de glicosilación que comprende por lo menos uno de los siguientes: entre el 5% y el 30% de especies de glicanos neutras; entre el 10% y el 30% de especies de glicanos monosialiladas; entre el 30% y el 50% de especies de glicanos disialiladas; entre el 15% y el 35% de especies de glicanos trisialiladas; o entre el 5% y el 15% de especies de glicanos tetrasialiladas.

En otra realización, el rhC1-INH recombinante purificado tiene un perfil de glicosilación que incluye lo siguiente: no más del 30% de especies de glicanos neutras; entre el 20% y el 30% de especies de glicanos monosialiladas; entre el 30% y el 40% de especies de glicanos disialiladas; entre el 10% y el 20% de especies de glicanos trisialiladas; y entre el 5% y el 10% de especies de glicanos tetrasialiladas.

En una realización, el rhC1-INH recombinante purificado incluye, de media, por lo menos 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 o 29 residuos de glicano sialilado. por molécula. En otra realización, el rhC1-INH recombinante purificado incluye, de media, por lo menos 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 residuos de glicano sialilado por molécula.

En una realización, el rhC1 -INH recombinante purificado incluye, de media, por lo menos 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 moles de ácido siálico por mol de proteína. En otra realización, el rhC1-INH recombinante purificado tiene una vida media en el intervalo del 50%-150% de la vida media del inhibidor de esterasa C1 humano derivado de plasma. En otra realización, el rhC1-INH recombinante purificado tiene una vida media en el intervalo del 80%-120% de la vida media del inhibidor de esterasa C1 humano derivado de plasma. El rhC1-INH recombinante purificado tiene una vida media similar o más larga que la vida media del inhibidor de la esterasa C1 humano derivado del plasma. En otra realización, la proteína rhC1-INH recombinante purificado es estable como un producto líquido a concentraciones superiores a 20 mg/ml. En otra realización, la proteína rhC1-INH recombinante purificado es estable como producto líquido en concentraciones superiores a 60 mg/ml. En otra realización, la proteína rhC1-INH recombinante purificado es estable como producto líquido a concentraciones de 70 mg/ml o más. En otra realización, la proteína rhC1-INH recombinante purificado es estable como producto líquido a concentraciones de 100 mg/ml o más. En otra realización, la proteína rhC1-INH recombinante purificado es estable como un producto líquido a concentraciones superiores a 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700 o 750 U/ml.

En una realización, la célula huésped, una vez cultivada en condiciones de cultivo celular, es capaz de expresar el rhC1 -INH recombinante a una tasa de productividad específica de más de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 picogramos/célula/día. En otra realización, la célula huésped es una célula de mamífero. En otra realización, la célula de mamífero es una célula CHO. En otra realización, la célula de mamífero es una célula humana. En otra realización, la célula humana es una célula HT1080 o HEK. En otra realización, la célula huésped se manipula para aumentar la sialilación del rhC1 -INH recombinante expresado.

En una realización, la célula huésped se manipula para expresar una enzima heteróloga para aumentar la sialilación, se manipula para expresar una enzima heteróloga mutante para aumentar la sialilación, se manipula para sobreexpresar una enzima endógena para aumentar la sialilación, se manipula para expresar una enzima endógena mutada para aumentar la sialilación, y/o se manipula para reducir o prevenir la expresión de enzimas endógenas que reducen, inhiben o degradan la sialilación. En un aspecto, la presente invención proporciona un método para producir un inhibidor de la esterasa C1 humana recombinante (rhC1 -INH) que incluye cultivar la célula huésped, como se define en las reivindicaciones.

En una realización, la presente invención proporciona un método para la producción a gran escala de la proteína del inhibidor de la esterasa C1 humana recombinante (rhC1-INH) en células de mamífero, incluyendo el cultivo de células de mamífero que expresan una proteína rhC1-INH recombinante en suspensión en un recipiente de cultivo a gran escala, en donde el inhibidor de C1 esterasa humano recombinante tiene una vida media similar o más prolongada que el inhibidor de C1 esterasa derivado de plasma humano, como se define en las reivindicaciones.

En una realización, las células coexpresan un constructo que modifica glicanos. En otra realización, el constructo que modifica glicanos aumenta la sialilación. En otra realización, las células de mamífero se cultivan en un medio de cultivo celular que carece de suero. En otra realización, el recipiente de cultivo a gran escala es un biorreactor. En otra realización, el biorreactor está a una escala de o mayor que aproximadamente 5 l, 10 l, 200 l, 500 l, 1.000 l, 1.500 l, 2.000 l, 5.000 l, 10.000 l, 15.000 l o 20.000 l. En otra realización, el paso de cultivo comprende un proceso de perfusión. En otra realización, el paso de cultivo comprende un proceso de alimentación por lotes. En otra realización, las células se cultivan en un proceso de alimentación por lotes a 30-34° C durante por lo menos un período de tiempo. En otra realización, las células, de media, producir la proteína rhC1-INH recombinante a una tasa de productividad específica superior a aproximadamente 5 picogramos/célula/día. En otra realización, las células, de media, producen la proteína rhC1-INH recombinante a una tasa de productividad específica superior a aproximadamente 10 picogramos/célula/día. En otra realización, las células producen la proteína rhC1-INH recombinante a un título de recogida medio de por lo menos 5, 6, 8, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290 o 300 mg por litro por día. En otra realización, las células de mamífero son células humanas. En otra realización, las células de mamífero son células CHO.

En una realización, el medio carece de componentes derivados de animales. En otra realización, el medio es un medio químicamente definido. En otra realización, el medio está libre de proteínas. En otra realización, el medio comprende por lo menos un modulador de glicosilación. En una realización, el medio incluye por lo menos un modulador del crecimiento. En otra realización, el por lo menos un modulador del crecimiento incluye hipoxantina. En una realización, la hipoxantina está a una concentración que varía de aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 10 mM. En una realización, el por lo menos un modulador del crecimiento comprende timidina. En una realización, la timidina está a una concentración que varía de aproximadamente 1 pM a aproximadamente 100 mM. En una realización, el medio tiene un pH que varía entre aproximadamente 6,8-7,5. En una realización, el medio tiene un pH que varía entre aproximadamente 6,9-7,3. En una realización, el paso de cultivo comprende mantener un punto de ajuste de oxígeno disuelto de entre aproximadamente el 20% y aproximadamente el 40% de oxígeno disuelto. En una realización, el paso de cultivo comprende una fase de crecimiento y una fase de producción. En una realización, las células de mamífero se cultivan a una temperatura que varía entre 30-37° C. En una realización, las células de mamífero se cultivan a diferentes temperaturas durante la fase de crecimiento y la fase de producción. En una realización, las células de mamífero se cultivan a 37° C durante la fase de crecimiento y a entre 32° C-34° C durante la fase de producción. En una realización, el medio para la fase de crecimiento y la fase de producción tienen un pH diferente.

En una realización, el método comprende además un paso de recogida de la proteína rhC1-INH recombinante. En una realización, se controlan uno o más del pH, la gasificación y la temperatura del cultivo para permitir una sialización suficiente de la molécula de rhC1-INH para proporcionar una vida media similar o más prolongada que el inhibidor de esterasa C1 derivado de plasma humano.

Un método para purificar el inhibidor de esterasa C1 humano recombinante (rhC1-INH) a partir de una preparación impura puede incluir uno o más pasos de cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio aniónico, cromatografía de intercambio catiónico, cromatografía de modo mixto y cromatografía de interacción hidrofóbica, en donde la proteína rhC1-INH purificada tiene una pureza de por lo menos el 90% y tiene una vida media similar o más prolongada que el inhibidor de la esterasa C1 derivado del plasma humano.

La preparación impura puede comprender medio de cultivo celular. El método puede incluir la realización de cromatografía de intercambio aniónico (AEX) para reducir las impurezas del proceso y las especies de glicanos no deseadas. El método puede incluir la realización de cromatografía de intercambio catiónico (CEX) para reducir las impurezas del proceso y las especies de glicanos no deseadas. El método puede incluir la realización de cromatografía de intercambio aniónico (AEX), cromatografía de intercambio catiónico (CEX) y cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC). El método puede incluir además uno o más pasos de inactivación y/o eliminación viral. Los pasos de inactivación y/o eliminación viral pueden seleccionarse de un paso de filtración, un paso de inactivación viral con solventes y un paso de inactivación con detergente. En una realización, la proteína rhC1-INH recombinante purificado, de media, incluye no más del 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, o 5% de especies de glicanos neutras. En una realización, el rhC1-INH recombinante purificado tiene una vida media en el intervalo de 50%-150% de la vida media del inhibidor de esterasa C1 humano derivado de plasma. En una realización, el rhC1 -INH recombinante purificado tiene una vida media en el intervalo del 80%-120% de la vida media del inhibidor de esterasa C1 humano derivado de plasma. En una realización, la proteína rhC1-INH recombinante purificado es estable como un producto líquido a concentraciones superiores a 20 mg/ml. En una realización, la proteína rhC1-INH recombinante purificado es estable como un producto líquido a concentraciones superiores a 60 mg/ml. En una realización, la proteína rhC1-INH recombinante purificado es estable como producto líquido a concentraciones de 70 mg/ml o más.

En un aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que incluye una proteína del inhibidor de la esterasa C1 humana recombinante purificado y un portador farmacéuticamente aceptable, como se define en las reivindicaciones.

En un aspecto, la composición farmacéutica incluye la proteína del inhibidor de la esterasa C1 humana recombinante en un tampón de formulación que incluye Tris 50 mM, sorbitol 50 mM y glicina 150 mM, en donde la composición tiene un pH de 7,2. En una realización, la composición farmacéutica es líquida. En una realización, la composición farmacéutica se liofiliza. En una realización, la composición farmacéutica se reconstituye con un tampón adecuado para reconstitución. En una realización, el tampón adecuado para la reconstitución se selecciona de agua estéril, una solución salina estéril, una solución tampón estéril o una solución estéril que comprende uno o más portadores farmacéuticamente aceptables. En una realización, la proteína rhC1-INH recombinante purificado es estable como un producto líquido a concentraciones superiores a 20 mg/ml. En una realización, la proteína rhC1-INH recombinante purificado es estable como producto líquido a concentraciones superiores a 60 mg/ml. En una realización, la proteína rhC1-INH recombinante purificado es estable como producto líquido a concentraciones de 70 mg/ml o más. En una realización, la proteína rhC1-INH recombinante purificado es estable como producto líquido a concentraciones de 100 mg/ml o más. En una realización, la proteína rhC1-INH recombinante purificado es estable como producto líquido a concentraciones que superan los 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700 o 750 U/ml.

En un aspecto, se proporciona un kit, como se define en las reivindicaciones. En una realización, el kit incluye además una jeringuilla. En un aspecto, la jeringuilla está precargada con la composición farmacéutica. En una realización, el kit que incluye la composición farmacéutica también incluye un tampón para la reconstitución, eb donde el mezclado de la composición liofilizada y el tampón para la reconstitución produce la composición.

En una realización, la presente invención proporciona una composición farmacéutica para su uso en un método de tratamiento de un trastorno mediado por el complemento que incluye administrar a un sujeto con necesidad de ello una composición farmacéutica, como se define en las reivindicaciones. En una realización, el trastorno mediado por el complemento se selecciona de angioedema hereditario, rechazo mediado por anticuerpos, trastornos del espectro de la neuromielitis óptica, lesión cerebral traumática, lesión de la médula espinal, lesión cerebral isquémica, lesión por quemadura, necrólisis epidérmica tóxica, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), enfermedad de Parkinson, ataque cerebral, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP), miastenia grave, neuropatía motora multifocal.

Por tanto, la presente invención proporciona la fabricación rentable y fiable de inhibidores de rhC1 -INH y un tratamiento más seguro y eficaz del HAE y otros trastornos mediados por el complemento. Otras características, objetos y ventajas de la presente invención son evidentes en la descripción detallada que sigue.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Los dibujos son solo con propósitos ilustrativos, no de limitación.

La Figura 1 es una representación esquemática de C1-INH. De izquierda a derecha, los tres dominios son el péptido señal, el extremo N-terminal, también denominado dominio N-terminal, y el dominio serpina. Los glicanos N-enlazados se muestran como líneas verticales largas con cabezas de diamante y los glicanos O-enlazados se muestran como líneas verticales cortas.

La Figura 2 es una representación esquemática del flujo del proceso en sentido descendente para la purificación de rhC1-INH.

La Figura 3 representa un perfil de elución de Gigacap Q ejemplar junto con la correspondiente separación de especies neutras y sialiladas.

La Figura 4 representa la capacidad del paso de la cromatografía de intercambio aniónico para separar las impurezas del proceso, como las proteínas de la célula huésped (HCP).

La Figura 5 representa un perfil de elución ejemplar de Poros XS que demuestra el enriquecimiento de las especies de glicanos sialiladas deseadas.

La Figura 6 muestra la reducción del contenido de HCP después de la elución de Poros XS

La Figura 7 representa un ejemplo de integración de muestra para NGA-NP/AE de un rhC1-INH

La Figura 8 representa un cromatograma de modo mixto etiquetado, con picos identificados a partir del análisis MALDI-TOF MS de un grupo de glicanos fraccionados por HPLC de un rhC1 -INH

La Figura 9 representa el perfil de glicano para C1 -INH derivado de plasma

La Figura 10 muestra un cromatograma para el análisis HILIC de los N-glicanos de un rhC1-INH ejemplar. Los picos marcados se identificaron mediante LC/MS en línea.

La Figura 11 presenta los perfiles obtenidos para el perfil de N-glicanos (PNGasa-F) y el perfil de N+O-glicanos (desglicosilación de ORELA) de un rhC1-INH

La Figura 12 es una serie de gráficos que indican la estabilidad de una formulación de rhC1-INH a 2° C-82 C (panel A) y a 25° C (panel B).

La Figura 13 muestra la vida media de rhC1 -INH en comparación con Cinryze® en conejos.

La Figura 14 representa un esquema de un proceso de purificación de proteína rhC1-INH.

La Figura 15 representa una serie de cromatogramas que muestran el rendimiento y los descriptores asociados de las siguientes series de perfiles: Sartobind Q (panel A), Sartobind STIC (panel B) y Natrix (panel C).

La Figura 16 representa una serie de cromatogramas que muestran series de productos para Sartobind Q (panel A), Sartobind STIC a 30 MV/min (panel B) y Sartobind STIC a 5 MV/min (panel C).

La Figura 17 representa un cromatograma que muestra una serie en blanco de picos de ADN con Sartobind Q. La Figura 18 representa una serie de cromatogramas que muestran los resultados de un estudio de adición de ADN seguido de una purificación de rhC1-INH. La Figura 18, panel A, es un cromatograma que muestra los resultados de un estudio de adición con Sartobind Q (carga no diluida); la Figura 18, panel B, es un cromatograma que muestra los resultados de un estudio de adición con Sartobind Q (carga diluida); la Figura 18, panel C, es un cromatograma que muestra los resultados de un estudio de adición con Sartobind STIC.

La Figura 19 es un cromatograma que muestra los resultados de una serie de carga máxima con Sartobind Q. La Figura 20 es un cromatograma que muestra los resultados de un experimento diseñado para evaluar el rendimiento de la membrana Sartobind Q después de GigacapQ.

DEFINICIONES

Para que la presente invención se entienda más fácilmente, a continuación se definen primero ciertos términos. A lo largo de la memoria descriptiva se exponen definiciones adicionales para los siguientes términos y otros términos.

Tal como se usan en la presente, ciertos términos tienen los siguientes significados definidos. Como se usa en la memoria descriptiva y las reivindicaciones, la forma singular "un", "uno" y "el" incluyen referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, el término "una célula" incluye una pluralidad de células, incluyendo mezclas de las mismas.

Animal: Como se usa en la presente, el término "animal" se refiere a cualquier miembro del reino animal. "Animal" puede referirse a humanos, en cualquier etapa de desarrollo. "Animal" puede referirse a animales no humanos, en cualquier etapa de desarrollo. El animal no humano puede ser un mamífero (por ejemplo, un roedor, un ratón, una rata, un conejo, un mono, un perro, un gato, una oveja, ganado, un primate y/o un cerdo). Los animales pueden incluir, entre otros, mamíferos, aves, reptiles, anfibios, peces, insectos y/o gusanos. Un animal puede ser un animal transgénico, un animal manipulado genéticamente y/o un clon.

Aproximadamente o alrededor de: Como se usan en esta solicitud, los términos "alrededor de" y "aproximadamente" se usan como equivalentes. Cualquier numeral usado en esta solicitud con o sin alrededor de/aproximadamente se pretende que cubra cualquier fluctuación normal apreciada por un experto en la técnica relevante. Como se usa en la presente, el término "aproximadamente" o "alrededor de", aplicado a uno o más valores de interés, se refiere a un valor que es similar a un valor de referencia indicado. El término "aproximadamente" o "alrededor de" puede referirse a un intervalo de valores que se encuentran dentro del 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, o menos en cualquier dirección (mayor que o menor que) el valor de referencia indicado a menos que se indique lo contrario o sea evidente por el contexto (excepto cuando dicho número exceda el 100% de un posible valor).

Biodisponibilidad: como se usa en la presente, el término "biodisponibilidad" se refiere de manera general al porcentaje de la dosis administrada que llega al torrente sanguíneo de un sujeto.

Biológicamente activo: Como se usa en la presente, la frase "biológicamente activo" se refiere a una característica de cualquier agente que tenga actividad en un sistema biológico, y particularmente en un organismo. Por ejemplo, un agente que cuando se administra a un organismo, tiene un efecto biológico sobre ese organismo se considera biológicamente activo. Cuando un péptido es biológicamente activo, a una parte de ese péptido que comparte por lo menos una actividad biológica del péptido puede hacerse referencia típicamente como una parte "biológicamente activa".

Portador o diluyente: Como se usa en la presente, los términos "portador" y "diluyente" se refieren a un portador farmacéuticamente aceptable (por ejemplo, seguro y no tóxico para su administración a un humano) o sustancia diluyente útil para la preparación de una formulación farmacéutica. Los diluyentes ejemplares incluyen agua estéril, agua bacteriostática para inyección (BWFI), una solución tamponada de pH (por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato), solución salina estéril, solución de Ringer o solución de dextrosa.

Inhibidor de C1 o inhibidor de C1 esterasa o C1-INH: Como se usa en la presente, los términos "inhibidor de C1" o "inhibidor de C1 esterasa" o "C1-INH" pueden usarse indistintamente y se refieren a cualquier polipéptido de C1-INH de tipo salvaje, nativo o de origen natural o modificado (por ejemplo, proteínas de C1-INH con una o más mutaciones, truncamientos, deleciones, inserciones y/o proteínas de fusión de aminoácidos) que conservan una actividad biológica sustancial de C1-INH a menos que se especifique lo contrario. En algunas realizaciones, una proteína de fusión de C1-INH comprende un polipéptido de C1-INH y un dominio Fc. En algunas realizaciones, una proteína de fusión de C1-INH comprende un polipéptido de C1-INH y un dominio de albúmina. En algunas realizaciones, la proteína de fusión comprende además un conector. C1-INH puede expresarse recombinantemente en células. En ciertas realizaciones, el rhC1-INH se expresa en células de mamífero, preferiblemente células CHO, o células humanas, preferiblemente células HT1080 o HEK.

Derivado o equivalente funcional: Como se usa en la presente, el término "equivalente funcional" o "derivado funcional" denota, en el contexto de un derivado funcional de una secuencia de aminoácidos, una molécula que retiene una actividad biológica (ya sea funcional o estructural) que es sustancialmente similar a la de la secuencia original. Un derivado o equivalente funcional puede ser un derivado natural o prepararse sintéticamente. Los derivados funcionales ejemplares incluyen secuencias de aminoácidos que tienen sustituciones, deleciones o adiciones de uno o más aminoácidos, siempre que se conserve la actividad biológica de la proteína. El aminoácido de sustitución tiene deseablemente propiedades químico-físicas que son similares a las del aminoácido sustituido. Las propiedades químico-físicas similares deseables incluyen similitudes en la carga, volumen, hidrofobicidad, hidrofilicidad y similares.

Proteína de fusión: como se usa en la presente, el término "proteína de fusión" o "proteína quimérica" se refiere a una proteína creada mediante la unión de dos o más proteínas originalmente separadas, o porciones de las mismas. Entre cada proteína puede estar presente un conector o espaciador.

Vida media: Tal como se usa en la presente, el término "vida media" es el tiempo requerido para que una cantidad como la concentración o actividad de proteínas caiga a la mitad de su valor medido al comienzo de un período de tiempo.

Angioedema hereditario o HAE: Como se usa en la presente, el término "angioedema hereditario" o "HAE" se refiere a un trastorno sanguíneo caracterizado por ataques de inflamación impredecibles y recurrentes. El HAE está asociado típicamente con la deficiencia de C1-INH, que puede ser el resultado de niveles bajos de C1-INH o C1-INH con una actividad alterada o disminuida. Los síntomas incluyen, pero no se limitan a, hinchazón que puede producirse en cualquier parte del cuerpo, como la cara, las extremidades, los genitales, el tracto gastrointestinal y las vías respiratorias superiores.

Mejorar, aumentar o reducir: como se usa en la presente, los términos "mejorar", "aumentar" o "reducir", o equivalentes gramaticales, indican valores que son relativos a una medición de referencia, como una medición en el mismo individuo antes del inicio del tratamiento descrito en la presente, o una medición en un sujeto de control (o múltiples sujetos de control) en ausencia del tratamiento descrito en la presente. Un "sujeto de control" es un sujeto afectado por la misma forma de enfermedad que el sujeto que se está tratando, que tiene aproximadamente la misma edad que el sujeto que se está tratando.

In Situ: Como se usa en la presente, el término ”in situ” se refiere a eventos que se producen en un lugar o posición o entorno original, natural y existente.

In vitro: como se usa en la presente, el término ”in vitro” se refiere a eventos que se producen en un entorno artificial, por ejemplo, en un tubo de ensayo o recipiente de reacción, en cultivo celular, etc., en lugar de dentro de un organismo multicelular.

In vivo: como se usa en la presente, el término ”in vivo” se refiere a eventos que se producen dentro de un organismo multicelular, como un ser humano y un animal no humano. En el contexto de los sistemas basados en células, el término puede usarse para referirse a eventos que se producen dentro de una célula viva (a diferencia de, por ejemplo, los sistemas in vitro).

Conector: como se usa en la presente, el término "conector" se refiere, en una proteína de fusión, a una secuencia de aminoácidos distinta de la que aparece en una posición particular en la proteína natural y generalmente está diseñada para ser flexible o para interponer una estructura, como una hélice a, entre dos fracciones de proteína. Un conector también se conoce como espaciador. Un conector o un espaciador típicamente no tiene una función biológica por sí mismo.

Polipéptido: el término "polipéptido" como se usa en la presente se refiere a una cadena secuencial de aminoácidos enlazados entre sí mediante enlaces peptídicos. El término se usa para referirse a una cadena de aminoácidos de cualquier longitud, pero un experto en la técnica entenderá que el término no se limita a cadenas largas y puede referirse a una cadena mínima que comprende dos aminoácidos enlazados entre sí a través de un enlace peptídico. Como saben los expertos en la técnica, los polipéptidos pueden procesarse y/o modificarse. Como se usan en la presente, los términos "polipéptido" y "péptido" se usan indistintamente.

Prevenir: Como se usa en la presente, el término "prevenir" o "prevención", cuando se usa en relación con la aparición de una enfermedad, trastorno y/o afección, se refiere a reducir el riesgo de desarrollar la enfermedad, trastorno y/o afección. Ver la definición de "riesgo".

Proteína: el término "proteína", como se usa en la presente, se refiere a uno o más polipéptidos que funcionan como una unidad discreta. Si un solo polipéptido es la unidad de funcionamiento discreta y no requiere una asociación física permanente o temporal con otros polipéptidos para formar la unidad de funcionamiento discreta, los términos "polipéptido" y "proteína" pueden usarse indistintamente. Si la unidad funcional discreta consiste de más de un polipéptido que se asocian físicamente entre sí, el término "proteína" se refiere a los múltiples polipéptidos que están acoplados físicamente y funcionan juntos como la unidad discreta.

Riesgo: como se entenderá por el contexto, un "riesgo" de una enfermedad, trastorno y/o afección comprende la probabilidad de que un individuo particular desarrolle una enfermedad, trastorno y/o afección (por ejemplo, distrofia muscular). El riesgo puede expresarse como un porcentaje. El riesgo puede ser desde el 0,1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 hasta el 100%. El riesgo puede expresarse como un riesgo relativo a un riesgo asociado con una muestra de referencia o un grupo de muestras de referencia. Una muestra de referencia o un grupo de muestras de referencia pueden tener un riesgo conocido de una enfermedad, trastorno, afección y/o evento (por ejemplo, distrofia muscular). Una muestra de referencia o un grupo de muestras de referencia pueden ser de individuos comparables con un individuo en particular. El riesgo relativo puede serde 0,1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más.

Estabilidad: Como se usa en la presente, el término "estable" se refiere a la capacidad del agente terapéutico (por ejemplo, una proteína recombinante) de mantener su eficacia terapéutica (por ejemplo, toda o la mayoría de su actividad biológica y/o integridad fisicoquímica prevista) durante períodos prolongados de tiempo. La estabilidad de un agente terapéutico y la capacidad de la composición farmacéutica de mantener la estabilidad de dicho agente terapéutico pueden evaluarse durante períodos de tiempo prolongados (por ejemplo, durante por lo menos 1, 3, 6, 12, 18, 24, 30, 36 meses o más). En el contexto de una formulación, una formulación estable es aquella en la que el agente terapéutico conserva esencialmente su integridad física y/o química y su actividad biológica durante el almacenamiento y durante los procesos (como congelación/descongelación, mezclado mecánico y liofilización). Para la estabilidad de las proteínas, puede medirse por la formación de agregados de alto peso molecular (HMW), pérdida de actividad enzimática, generación de fragmentos de péptidos y desplazamiento de perfiles de carga.

Sujeto: como se usa en la presente, el término "sujeto" se refiere a un humano o cualquier animal no humano (por ejemplo, ratón, rata, conejo, perro, gato, ganado, cerdos, ovejas, caballos o primates). Un humano incluye formas prenatales y posnatales. Un sujeto puede ser un ser humano. Un sujeto puede ser un paciente, que se refiere a un humano que se presenta a un proveedor médico para el diagnóstico o tratamiento de una enfermedad. El término "sujeto" se usa en la presente de manera intercambiable con "individuo" o "paciente". Un sujeto puede padecer o ser susceptible a una enfermedad o trastorno, pero puede presentar los síntomas de la enfermedad o trastorno o no.

Sustancialmente: como se usa en la presente, el término "sustancialmente" se refiere a la condición cualitativa de mostrar una extensión o grado total o casi total de una característica o propiedad de interés. Un experto en las técnicas biológicas comprenderá que los fenómenos biológicos y químicos rara vez, si es que alguna vez lo hacen, se completan y/o proceden a completarse o logran o evitan un resultado absoluto. Por lo tanto, el término "sustancialmente" se usa en la presente para capturar la posible falta de integridad inherente en muchos fenómenos biológicos y químicos.

Homología sustancial: La frase "homología sustancial" se usa en la presente para referirse a una comparación entre secuencias de aminoácidos o de ácidos nucleicos. Como apreciarán los expertos en la técnica, generalmente se considera que dos secuencias son "sustancialmente homólogas" si contienen residuos homólogos en las posiciones correspondientes. Los residuos homólogos pueden ser residuos idénticos. Alternativamente, los residuos homólogos pueden ser residuos no idénticos con características estructurales y/o funcionales apropiadamente similares. Por ejemplo, como es bien sabido por los expertos en la técnica, ciertos aminoácidos se clasifican típicamente como aminoácidos "hidrófobos" o "hidrófilos" y/o como que tienen cadenas laterales "polares" o "no polares". La sustitución de un aminoácido por otro del mismo tipo puede considerarse a menudo una sustitución "homóloga".

Como es bien sabido en esta técnica, las secuencias de aminoácidos o de ácidos nucleicos pueden compararse usando cualquiera de una variedad de algoritmos, incluyendo los disponibles en programas informáticos comerciales como BLASTN para secuencias de nucleótidos y BLASTP, gapped BLAST y PSI-BLAST para secuencias de aminoácidos. Tales programas ejemplares se describen en Altschul, et al., Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410, 1990; Altschul, et al., Methods in Enzymology; Altschul, et al., "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Baxevanis, et al., Bioinformatics : A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; y Misener, et al., (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999. Además de identificar secuencias homólogas, los programas mencionados anteriormente típicamente proporcionan una indicación del grado de homología. Puede considerarse que dos secuencias son sustancialmente homólogas si por lo menos el 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, el 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de sus residuos correspondientes son homólogos en un tramo relevante de residuos. El tramo relevante puede ser una secuencia completa. El tramo relevante puede tener por lo menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 o más residuos. Las sustituciones conservadoras de aminoácidos pueden incluir sustituciones realizadas entre aminoácidos dentro de los siguientes grupos: (a) M, I, L, V; (b) F, Y, W; (c) K, R, H; (d) A, G; (e) S, T; (f) Q, N; y (g) E, D. A. Una "sustitución de aminoácidos conservadora" puede referirse a una sustitución de aminoácidos que no altera la carga relativa o las características de tamaño de la proteína en la que se realiza la sustitución de aminoácidos.

Identidad sustancial: la frase "identidad sustancial" se usa en la presente para referirse a una comparación entre secuencias de aminoácidos o de ácidos nucleicos. Como apreciarán los expertos en la técnica, dos secuencias generalmente se consideran "sustancialmente idénticas" si contienen residuos idénticos en las posiciones correspondientes. Como es bien sabido en esta técnica, las secuencias de aminoácidos o de ácidos nucleicos pueden compararse usando cualquiera de una variedad de algoritmos, incluyendo los disponibles en programas informáticos comerciales como BLASTN para secuencias de nucleótidos y BLASTP, gapped BLAST y PSI-BLAST para secuencias de aminoácidos. Tales programas ejemplares se describen en Altschul, et al., Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410, 1990; Altschul, et al., Methods in Enzymology; Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Baxevanis et al., Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; y Misener, et al., (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999. Además de identificar secuencias idénticas, los programas mencionados anteriormente típicamente proporcionan una indicación del grado de identidad. Puede considerarse que dos secuencias son sustancialmente idénticas si por lo menos el 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de sus residuos correspondientes son idénticos en un tramo relevante de residuos. El tramo relevante puede ser una secuencia completa. El tramo relevante puede tener por lo menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 o más residuos.

Como se usa en la presente, "porcentaje (%) de identidad de la secuencia de aminoácidos" con respecto a una secuencia de proteínas de referencia (por ejemplo, una secuencia de proteínas de C1-INH de referencia) identificada en la presente se define como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácidos en la secuencia de referencia, después de alinear las secuencias e introducir espacios, si es necesario, para lograr el porcentaje de identidad de secuencia máximo, y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identidad de secuencia. La alineación con el propósito de determinar el porcentaje de identidad de secuencias de aminoácidos puede lograrse de varias maneras que están dentro de la capacidad de la técnica, por ejemplo, usando software informático disponible públicamente como el software BLAST, ALIGN o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la técnica pueden determinar los parámetros apropiados para medir la alineación, incluyendo los algoritmos necesarios para lograr la alineación máxima en toda la longitud de las secuencias que se están comparando. Preferiblemente, para determinar la identidad de la secuencia de aminoácidos se usa el software WU-BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266, 460-480 (1996); http://blast.wustl/edu/blast/README.html). El WU-BLAST-2 usa varios parámetros de búsqueda, la mayoría de los cuales se establecen en los valores predeterminados. Los parámetros ajustables se establecen con los siguientes valores: alcance de superposición=1, fracción de superposición=0.125, umbral mundial (T)=1 1. La puntuación HSP (S) y los parámetros HSP S2 son valores dinámicos y son establecidos por el propio programa, sin embargo, dependiendo de la composición de la secuencia particular, los valores mínimos pueden ajustarse y se establecen como se ha indicado anteriormente.

Padece de: Un individuo que "padece" una enfermedad, trastorno y/o afección se le ha diagnosticado o muestra uno o más síntomas de la enfermedad, trastorno y/o afección.

Susceptible a: Un individuo que es "susceptible a" una enfermedad, trastorno y/o afección no ha sido diagnosticado con la enfermedad, trastorno y/o afección. Un individuo que es susceptible a una enfermedad, trastorno y/o afección puede no mostrar síntomas de la enfermedad, trastorno y/o afección. Un individuo que es susceptible a una enfermedad, trastorno, afección o evento (por ejemplo, DMD) puede caracterizarse por uno o más de los siguientes: (1) una mutación genética asociada con el desarrollo de la enfermedad, trastorno y/o afección; (2) un polimorfismo genético asociado con el desarrollo de la enfermedad, trastorno y/o afección; (3) expresión y/o actividad aumentadas y/o disminuidas de una proteína asociada con la enfermedad, trastorno y/o afección; (4) hábitos y/o estilos de vida asociados con el desarrollo de la enfermedad, trastorno, afección y/o evento (5) que se haya sometido, planee someterse o requiera un trasplante. Un individuo que es susceptible a una enfermedad, trastorno y/o afección puede desarrollar la enfermedad, trastorno y/o afección. Un individuo que es susceptible a una enfermedad, trastorno y/o afección puede no desarrollar la enfermedad, trastorno y/o afección.

Cantidad terapéuticamente eficaz: como se usa en la presente, el término "cantidad terapéuticamente eficaz" de un agente terapéutico significa una cantidad que es suficiente, cuando se administra a un sujeto que padece o es susceptible de padecer una enfermedad, trastorno y/o afección, para tratar, diagnosticar, prevenir y/o retrasar la aparición de los síntomas de la enfermedad, trastorno y/o afección. Los expertos en la técnica apreciarán que una cantidad terapéuticamente eficaz se administra típicamente a través de un régimen de dosificación que comprende por lo menos una dosis unitaria.

Tratar: como se usa en la presente, el término "tratar", "tratamiento" o "que trata" se refiere a cualquier método usado para aliviar, mejorar, mitigar, inhibir, prevenir, retrasar el inicio, reducir la gravedad y/o reducir la incidencia parcial o completamente de uno o más síntomas o características de una enfermedad, trastorno y/o afección en particular. El tratamiento puede administrarse a un sujeto que no muestra signos de una enfermedad y/o que muestra solo signos tempranos de la enfermedad con el propósito de disminuir el riesgo de desarrollar patología asociada con la enfermedad.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE CIERTAS REALIZACIONES

La presente invención proporciona, entre otras cosas, métodos y composiciones para tratar trastornos mediados por el complemento, incluyendo el angioedema hereditario (HAE), usando rhC1-INH como proteína terapéutica.

En las siguientes secciones se describen en detalle varios aspectos de la invención. El uso de secciones no pretende limitar la invención. Cada sección puede aplicarse a cualquier aspecto de la invención. En esta solicitud, el uso de "o" significa "y/o" a menos que se indique lo contrario.

C1-INH

El C1-INH humano es una proteína plasmática antiinflamatoria importante con una amplia variedad de actividades biológicas inhibidoras y no inhibidoras. Por homología de secuencia, estructura de su dominio C-terminal y mecanismo de inhibición de la proteasa, pertenece a la superfamilia de las serpinas, la clase más grande de inhibidores de la proteasa plasmática, que también incluye antitrombina, inhibidor de la proteinasa a1, inhibidor del activador del plasminógeno y muchas otras proteínas estructuralmente similares que regulan diversos sistemas fisiológicos. El C1-INH es un inhibidor de proteasas en el sistema del complemento, el sistema de contacto de generación de cininas y la vía de coagulación intrínseca. Cai, S. & Davis, A.E., El inhibidor de la proteína C1 reguladora del complemento se une a las selectinas e interfiere con la adhesión de los endotelial-leucocito, J Immunol, 171:4786-4791 (2003). Específicamente, se ha demostrado que C1 -INH inhibe C1r y C1s del sistema del complemento. El C1-INH también es un importante regulador de los factores de coagulación XI y XII, así como de la calicreína y otras serina proteasas de los sistemas de coagulación y fibrinolíticos, incluyendo el activador del plasminógeno de tipo tisular y la plasmina.

El bajo contenido en plasma de C1-INH o su disfunción da como resultado la activación de las cascadas del complemento y del plasma de contacto, y también puede afectar a otros sistemas. Se ha demostrado que una disminución en el contenido en plasma de C1-INH a niveles inferiores a 55 gg/ml (~25% de lo normal) induce la activación espontánea de C1.

En la Figura 1 se proporciona un esquema que representa la estructura de C1-INH. Se muestran el péptido señal, el dominio N-terminal y el dominio serpina. El péptido señal de 22 aminoácidos es necesario para la secreción y se escinde del resto de la proteína C1-INH. C1-INH tiene dos dominios: un dominio C-terminal que tiene 365 aminoácidos, que es un dominio de serpina típico, y un dominio N-terminal que tiene 113 aminoácidos. La proteína está estabilizada por dos puentes disulfuro que conectan los dominios. Estos puentes disulfuro están formados por Cys101 del dominio N-terminal que forma un enlace disulfuro con Cys406 del dominio C-terminal (serpina) y Cys108 del dominio N-terminal que forma un enlace disulfuro con Cys183 del dominio C-terminal. El dominio serpina es responsable de la actividad proteasa de C1 -INH. P1 -P1' indica el enlace escindible Arg444-Thr445.

Más del 26% del peso de la proteína glicosilada es carbohidrato. Los glicanos se distribuyen de manera desigual sobre el C1-INH humano. El extremo N terminal está muy glicosilado y tiene tres grupos de hidratos de carbono N-enlazados (que se muestran como líneas verticales largas con cabezas de diamante) y por lo menos siete O-enlazados (que se muestran como líneas verticales cortas). Tres glicanos N-enlazados se unen a los residuos de asparagina Asn216, Asn231 y Asn330 en el dominio de serpina (que se muestran como líneas verticales largas con cabezas de diamante). Aunque el papel funcional del dominio N-terminal excepcionalmente largo y fuertemente glicosilado todavía no está claro, puede ser esencial para la estabilidad conformacional, el reconocimiento, la afinidad a las endotoxinas y selectinas y la depuración de la proteína. La heterogeneidad intrínseca de la fracción carbohidrato contribuye en gran medida a la heterogeneidad del C1-INH completo, una de las razones por las que la producción de un rhC1 -INH que imite las propiedades de C1 -INH derivado de plasma es difícil.

Como se usa en la presente, las proteínas de rhC1-INH comprenden cualquier polipéptido de C1-INH humano de tipo salvaje y modificado (por ejemplo, proteínas de C1-INH con mutaciones, deleciones, truncamientos y/o inserciones de aminoácidos) que conservan una actividad biológica sustancial de C1-INH. Típicamente, la proteína rhC1-INH se produce usando tecnología recombinante.

Típicamente, una proteína rhC1-INH adecuada tiene una vida media in vivo de aproximadamente 12 horas, 18 horas, 24 horas, 36 horas, 2 días, 2,5 días, 3 días, 3,5 días, 4 días, 4,5 días, 5 días, 5,5 días, 6 días, 6,5 días, 7 días, 7,5 días, 8 días, 8,5 días, 9 días, 9,5 días o 10 días. En algunas realizaciones, una proteína rhC1-INH tiene una vida media in vivo de entre 0,5 y 10 días, entre 1 día y 10 días, entre 1 día y 9 días, entre 1 día y 8 días, entre 1 día y 7 días, entre 1 día y 6 días, entre 1 día y 5 días, entre 1 día y 4 días, entre 1 día y 3 días, entre 2 días y 10 días, entre 2 días y 9 días, entre 2 días y 8 días, entre 2 días y 7 días, entre 2 días y 6 días, entre 2 días y 5 días, entre 2 días y 4 días, entre 2 días y 3 días, entre 2,5 días y 10 días, entre 2,5 días y 9 días, entre 2,5 días y 8 días, entre 2,5 días y 7 días, entre 2,5 días y 6 días, entre 2,5 días y 5 días, entre 2,5 días y 4 días, entre 3 días y 10 días, entre 3 días y 9 días, entre 3 días y 8 días, entre 3 días y 7 días, entre 3 días y 6 días, entre 3 días y 5 días, entre 3 días y 4 días, entre 3,5 días y 10 días, entre 3,5 días y 9 días, entre 3,5 días y 8 días, entre 3,5 días y 7 días, entre 3,5 días y 6 días, entre 3,5 días y 5 días, entre 3,5 días y 4 días, entre 4 días y 10 días, entre 4 días y 9 días, entre 4 días y 8 días, entre 4 días y 7 días, entre 4 días y 6 días, entre 4 días y 5 días, entre 4,5 días y 10 días, entre 4,5 días y 9 días, entre 4,5 días y 8 días, entre 4,5 días y 7 días, entre 4,5 días y 6 días, entre 4,5 días y 5 días, entre 5 días y 10 días, entre 5 días y 9 días, entre 5 días y 8 días, entre 5 días y 7 días, entre 5 días y 6 días, entre 5,5 días y 10 días, entre 5,5 días y 9 días, entre 5,5 días y 8 días, entre 5,5 días y 7 días, entre 5,5 días y 6 días, entre 6 días y 10 días, entre 7 días y 10 días, entre 8 días y 10 días, entre 9 días y 10 días.

En algunas realizaciones, el rhC1-INH recombinante purificado tiene una vida media similar o más larga que la vida media del inhibidor de esterasa C1 humano derivado de plasma, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, el rhC1-INH recombinante purificado tiene una vida media comparable o más larga que la vida media del inhibidor de esterasa C1 humano derivado de plasma. En algunas realizaciones, el rhC1-INH recombinante purificado tiene una vida media equivalente o más larga que la vida media del inhibidor de esterasa C1 humano derivado de plasma. En algunas realizaciones, el rhC1-INH recombinante purificado tiene una vida media bioequivalente o más larga que la vida media del inhibidor de esterasa C1 humano derivado de plasma. En algunas realizaciones, el rhC1-INH recombinante purificado tiene una vida media igual a la vida media del inhibidor de esterasa C1 humano derivado de plasma. En algunas realizaciones, el rhC1-INH recombinante purificado tiene una vida media en el intervalo del 50%-150% de la vida media del inhibidor de esterasa C1 humano derivado de plasma. En algunas realizaciones, el rhC1-INH recombinante purificado tiene una vida media en el intervalo del 60%-130% de la vida media del inhibidor de esterasa C1 humano derivado de plasma. En algunas realizaciones, el rhC1-INH recombinante purificado tiene una vida media en el intervalo del 70%-130% de la vida media del inhibidor de esterasa C1 humano derivado de plasma. En algunas realizaciones, el rhC1-INH recombinante purificado tiene una vida media en el intervalo del 80%-120% de la vida media del inhibidor de esterasa C1 humano derivado de plasma. En algunas realizaciones, el rhC1-INH recombinante purificado tiene una vida media en el intervalo del 80%-130% de la vida media del inhibidor de esterasa C1 humano derivado de plasma. En algunas realizaciones, el rhC1-INH recombinante purificado tiene una vida media en el intervalo del 80%-140% de la vida media del inhibidor de esterasa C1 humano derivado de plasma. En algunas realizaciones, el rhC1-INH recombinante purificado tiene una vida media en el intervalo del 80%-150% de la vida media del inhibidor de esterasa C1 humano derivado de plasma.

Un polipéptido de rhC1-INH puede incluir una secuencia de aminoácidos un 50% 55%, 60%, 65%, 70%, 75% u 80%, idéntica a la proteína C1-INH humana de tipo salvaje (aminoácidos 1-478) (los aminoácidos 1-97 están subrayados):

NPNAT S S S SODPESLODRGEGK VATT VISKMLF VEPILE V S SLPTTNSTTN S ATKIT AN TTDEPTT OPTTEPTTOPTIOPTOPTT OLPTD SPTOPTTGSF CPGP VTLC SDLESHSTEAV LGDALVDF SLKLYHAF SAMKKVETNMAF SPF SIASLLTQVLLGAGENTKTNLESILS Y PKDFTCVHQALKGFTTKGVTSVSQIFHSPDLAIRDTFVNASRTLYSSSPRVLSNNSDA NLELINTWVAKNTNNKISRLLDSLPSDTRLVLLNAIYLSAKWKTTFDPKKTRMEPFHF KNSYDCVPMMNSKKYPVAHFIDQTLKAKYGQLQLSHNLSLVILVPQNLKHRLEDME Q AL SP S VFK AIMEKLEMSKF QPTLLTLPRIK VTT SQDMLSIMEKLEFFDF S YDLNLCG LTEDPDLQVSAMQHQTVLELTETGVEAAAASAISVARTLLVFEVQQPFLFVLWDQQ FIKFPVFMGRVYDPRA (SEQ ID NO: 1).

Un polipéptido de rhC1-INH puede incluir una secuencia de aminoácidos un 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% u 80%, idéntica a una proteína C1-INH humana (aminoácidos 1-478) que tiene una mutación E165Q (aminoácido mutado en negrita y subrayado):

NPNATSS S SQDPESLQDRGEGKVATTVISKMLF VEPILE V S SLPTTNSTTN S ATKIT AN

TTDEPTT QPTTEPTTQPTIQPTQPTTQLPTD SPTQPTT GSF CPGPVTLC SDLESHSTE AV

LGDALVDF SLKLYHAF S AMKK VETNMAF SPF SIASLLT Q VLLGAGENTKTNLE SIL S

YPKDF T C VHQALKGF TTKGVT S V S QIFHSPDL AIRDTF VN A SRTL Y S S SPRVL SNN SD

ANLELINTWVAKNTNNKISRLLDSLPSDTRLVLLNAIYLSAKWKTTFDPKKTRMEPF

HFKNSVIKVPMMNSKKYPVAHFIDQTLKAKVGQLQLSHNLSLVILVPQNLKHRLED

MEQ AL SP S VFK AIMEKLEMSKF QPTLLTLPRIK VTT SQDML SIMEKLEFFDF S YDLNL

CGLTEDPDLQVSAMQHQTVLELTETGVEAAAASAISVARTLLVFEVQQPFLFVLWD

QQHKFPVFMGRVYDPRA (SEQ ID NO:2).

Un polipéptido de rhC1-INH puede incluir una secuencia de aminoácidos por lo menos un 99% o 100% idéntica a la proteína C1-INH humana truncada de tipo salvaje (aminoácidos 98-478):

GSFCPGP VTLC SDLESHSTE AVLGD ALVDF SLKLYHAF S AMKK VETNMAF SPFSIASL LTQVLLGAGENTKTNLESILSYPKDFTCVHQALKGFTTKGVTSVSQIFHSPDLAIRDTF VNASRTLYSSSPRVLSNNSDANLELINTWVAKNTNNKISRLLDSLPSDTRLVLLNAIY LSAKWKTTFDPKKTRMEPFFEFKNSVIKVPMMNSKKYPVAHFIDQTLKAKVGQLQLS HNLSLVILVPQNLKHRLEDMEQALSPSVFKAIMEKLEMSKFQPTLLTLPRIKVTTSQD MLSIMEKLEFFDFSYDLNLCGLTEDPDLQVSAMQHQTVLELTETGVEAAAASAISVA RTLLVFEVQQPFLFVLWDQQHKFPVFMGRVYDPRA (SEQ ID NO:3).

El polipéptido de rhC1-INH de la presente invención tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a la proteína C1-INH humana de tipo salvaje truncada (aminoácidos 98-478) que tiene una mutación E165Q (aminoácido mutado en negrita y subrayado):

GSFCPGP VTLC SDLESHSTE AVLGD AL VDF SLKLYHAF S AMKK VETNMAF SPFSIASL LTQVLLGAGENTKTNLESILSYPKDFTCVHQALKGFTTKGVTSVSQIFHSPDLAIRDT FVNASRTLYSSSPRVLSNNSDANLELTNTWVAKNTNNKTSRLLDSLPSDTRLVLLNAT YLSAKWKTTFDPKKTRMEPFHFKNSVIKVPMMNSKKYPVAHFIDQTLKAKVGQLQL SHNL SL VILVPQNLKHRLEDMEQ ALSP S VFKAIMEKLEMSKF QPTLLTLPRIK VTT SQ DMLSIMEKLEFFDFSYDLNLCGLTEDPDLQVSAMQHQTVLELTETGVEAAAASAISV ARTLLVFEVQQPFLFVLWDQQHKFPVFMGRVYDPRA (SEQ ID NO:4).

Como se divulga en la presente, la SEQ ID NO: 1 representa la secuencia canónica de aminoácidos para la proteína C1-INH humana. El polipéptido de C1-INH de la invención es un C1-INH truncado que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a la SEQ ID NO:4. que tiene una mutación E165Q, como se define en las reivindicaciones. Un polipéptido de rhC1 -INH puede ser un homólogo o un análogo de una proteína de origen natural o de tipo salvaje.

Los homólogos o análogos de las proteínas de C1-INH humanas pueden prepararse de acuerdo con métodos para alterar la secuencia polipeptídica conocidos por los expertos en la técnica, como los que se encuentran en las referencias que compilan tales métodos. En algunas realizaciones, las sustituciones conservadoras de aminoácidos incluyen sustituciones realizadas entre aminoácidos dentro de los siguientes grupos: (a) M, I, L, V; (b) F, Y, W; (c) K, R, H; (d) A, G; (e) S, T; (f) Q, N; y (g) E, D. Una "sustitución de aminoácidos conservadora" se refiere a una sustitución de aminoácidos que no altera la carga relativa o las características de tamaño de la proteína en la que se realiza la sustitución de aminoácidos.

El polipéptido de rhC1-INH de la invención está truncado y tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a la SEQ ID NO: 4 que tiene una mutación E165Q, como se define en las reivindicaciones.

El polipéptido de C1-INH es un C1-INH truncado que conserva una actividad sustancial de la proteína C1-INH. Un polipéptido de rhC1-INH puede ser sustancialmente homólogo a la SEQ ID NO:3. Un polipéptido de rhC1-INH puede tener una secuencia de aminoácidos por lo menos un 99% o más homóloga a la SEQ ID NO:3. El polipéptido de rhC1-INH de la presente invención tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a la SEQ ID NO:4 que tiene una mutación E165Q, como se define en las reivindicaciones.

Una proteína rhC1-INH adecuada para la presente invención muestra el efecto terapéutico de C1-INH, por ejemplo, mejorando o aumentando la vida media, la estabilidad, la potencia y/o el suministro de la proteína rhC1-ⁱN^h , o reduciendo o eliminando la inmunogenicidad, depuración o toxicidad. En algunas realizaciones, la proteína rhC1-INH tiene una vida media similar o más larga que la C1-INH derivado de plasma, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, la proteína rhC1 -INH tiene una actividad similar o mayor que la de la C1 -INH derivado de plasma.

Proteínas C1-INH recombinantes ejemplares

Una proteína rhC1-INH adecuada de la invención comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a un polipéptido de C1-INH truncado de la SEQ ID NO: 4 que tiene una mutación E165Q, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, una proteína rhC1-INH adecuada tiene una vida media in vivo que varía entre aproximadamente 0,5 y 10 días (por ejemplo, aproximadamente entre 0,5 y 5,5 días, aproximadamente entre 0,5 y 5 días, aproximadamente entre 1 y 5 días, aproximadamente entre 1,5 y 5 días, aproximadamente entre 1,5 y 4,5 días, aproximadamente entre 1,5 y 4,0 días, aproximadamente entre 1,5 y 3,5 días, aproximadamente entre 1,5 y 3 días, aproximadamente entre 1,5 y 2,5 días, aproximadamente entre 2 y 6 días, aproximadamente entre 2 y 5,5 días, aproximadamente entre 2 y 5 días, aproximadamente entre 2 y 4,5 días, aproximadamente entre 2 y 4 días, aproximadamente entre 2 y 3,5 días, aproximadamente entre 2 y 3 días). En algunas realizaciones, una proteína rhC1 -INH adecuada tiene una vida media in vivo que varía de aproximadamente 2 a 10 días (por ejemplo, que varía de aproximadamente 2,5 a 10 días, de aproximadamente 3 a 10 días, de aproximadamente 3,5 a 10 días, de aproximadamente 4 a 10 días, de aproximadamente 4,5 a 10 días, de aproximadamente 5 a 10 días, de aproximadamente 3 a 8 días, de aproximadamente 3,5 a 8 días, de aproximadamente 4 a 8 días, de aproximadamente 4,5 a 8 días, de aproximadamente 5 a 8 días, de aproximadamente 3 a 6 días, de aproximadamente 3,5 a 6 días, de aproximadamente 4 a 6 días, de aproximadamente 4,5 a 6 días, de aproximadamente 5 a 6 días).

La proteína rhC1-INH de la invención tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a la SEQ ID NO: 4 que tiene una mutación E165Q, como se define en las reivindicaciones.

Una proteína rhC1-INH adecuada para la presente invención es estable durante periodos de tiempo prolongados a varias concentraciones. En algunas realizaciones, la proteína rhC1-INH recombinante purificada es estable como un producto líquido a concentraciones superiores a 20 mg/ml, 30 mg/ml, 40 mg/ml, 50 mg/ml, 60 mg/ml. 70 mg/ml, 80 mg/ml, 90 mg/ml, 100 mg/ml o más.

Glicosilación/Mapeo de glicanos (Perfil)

La proteína o polipéptido de rhC1-INH producido de acuerdo con la presente invención tiene características distintas como el contenido de ácido siálico y el mapa de glicanos. En algunas realizaciones, la proteína o el polipéptido de C1-INH expresado recombinantemente tiene un perfil de glicosilación similar al del C1-INH derivado de plasma. En algunas realizaciones, la proteína o el polipéptido de C1-INH expresado recombinantemente tiene un perfil de glicosilación tal que la proteína C1-INH expresada recombinantemente muestra una vida media similar a la de C1-INH derivado de plasma, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, la proteína o el polipéptido de C1-INH expresado recombinantemente tiene un perfil de glicosilación tal que la proteína C1-INH expresada recombinantemente muestra una vida media mayor que la de C1-INH derivado de plasma, como se define en las reivindicaciones.

En algunas realizaciones, una proteína rhC1-INH purificada puede caracterizarse por su composición de proteoglicanos, típicamente denominada mapeo de glicanos. Sin desear estar limitados por ninguna teoría, se cree que el enlace de glicano junto con la forma y la complejidad de la estructura de la ramificación pueden afectar a la depuración, la biodisponibilidad y/o la eficacia in vivo.

Típicamente, un mapa de glicanos puede determinarse mediante digestión enzimática y análisis cromatográfico posterior. Pueden usarse varias enzimas para la digestión enzimática que incluyen, pero no se limitan a, glicosilasas, peptidasas (por ejemplo, endopeptidasas, exopeptidasas), proteasas y fosfatasas adecuadas. En algunas realizaciones, una enzima adecuada es la fosfatasa alcalina. En algunas realizaciones, una enzima adecuada es la neuraminidasa. Los glicanos pueden detectarse mediante análisis cromatográfico. Por ejemplo, los glicanos pueden detectarse mediante cromatografía de intercambio aniónico de alto rendimiento con detección amperométrica pulsada (HPAE-PAD) o cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) de exclusión por tamaño. La cantidad de glicano representada por cada pico en un mapa de glicano puede calcularse usando una curva estándar de glicano de acuerdo con métodos conocidos en la técnica y divulgados en la presente.

En algunas realizaciones, un C1-INH purificado de acuerdo con la presente invención se caracteriza con un mapa de glicanos. La cantidad relativa de glicano correspondiente a cada grupo de picos puede determinarse en base al área del grupo de picos con respecto al área del grupo de picos correspondiente en un estándar de referencia predeterminado. En la técnica se conocen varios estándares de referencia para el mapeo de glicanos y pueden usarse para poner en práctica la presente invención. En algunas realizaciones, el rhC1-INH purificado se caracteriza con un mapa de glicanos que comprende cinco o menos grupos de picos seleccionados de los grupos de picos indicativos de proteína rhC1 -INH neutra, monosialilada, disialilada, trisialilada o tetrasialilada.

En algunas realizaciones, el rhC1-INH purificado tiene un perfil de glicosilación que comprende por lo menos uno de los siguientes: especies de glicanos neutras, especies monosialiladas, especies disialiladas, especies trisialiladas y/o especies tetrasialiladas. En algunas realizaciones, el rhC1-INH purificado tiene un perfil de glicosilación que comprende especies de glicanos neutras, especies monosialiladas, especies disialiladas, especies trisialiladas y especies tetrasialiladas. En algunas realizaciones, el rhC1-INH recombinante purificado tiene un perfil de glicosilación que comprende entre aproximadamente el 10% y aproximadamente el 20% de especies de glicanos neutras. En algunas realizaciones, el rhC1-INH recombinante purificado tiene un perfil de glicosilación que comprende no más del 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% o 5% de especies de glicanos neutras. En algunas realizaciones, el rhC1-INH recombinante purificado tiene un perfil de glicosilación que comprende entre un 5% y un 30% de especies de glicanos neutras. En algunas realizaciones, el rhC1-INH recombinante purificado tiene un perfil de glicosilación que comprende entre un 5% y un 25% de especies de glicanos neutras. En algunas realizaciones, el rhC1-INH recombinante purificado tiene un perfil de glicosilación que comprende entre un 10% y un 30% de especies monosialiladas. En algunas realizaciones, el rhC1-INH recombinante purificado tiene un perfil de glicosilación que comprende entre un 30% y un 50% de especies disialiladas. En algunas realizaciones, el rhC1-INH recombinante purificado tiene un perfil de glicosilación que comprende entre un 15% y un 35% de especies trisialiladas. En algunas realizaciones, el rhC1-INH recombinante purificado tiene un perfil de glicosilación que comprende entre un 5% y un 15% de especies tetrasialiladas. En algunas realizaciones, la proteína rhC1-INH comprende, de media, por lo menos un 80% de glicanos cargados por molécula (por ejemplo, más de aproximadamente un 85%, 90%, 95% o 99% de glicanos por molécula). En algunas realizaciones, el rhC1-INH recombinante purificado tiene un perfil de glicosilación que comprende no más de aproximadamente un 30% de especies de glicano neutras y una especie de glicano sialilada, de tal manera que el rhC1-INH purificado tiene una vida media similar o más prolongada que la del C1-INH derivado del plasma. En algunas realizaciones, el rhC1-INH recombinante purificado tiene un perfil de glicosilación que comprende no más del 30% de especies de glicanos neutras, entre aproximadamente el 20% y aproximadamente el 30% de especies de glicanos monosialiladas, entre aproximadamente el 30% y aproximadamente el 40% de especies de glicanos disialiladas, entre aproximadamente el 10% y aproximadamente el 20% de especies de glicanos trisialiladas, y entre aproximadamente el 5% y aproximadamente el 10% de especies de glicanos tetrasialiladas.

En algunas realizaciones, el rhC1-INH recombinante purificado contiene menos del 20%, 15%, 10%, 5% o 0% de uno o más de glicosilación tipo manosa, a-galactosa, ácido N-glicolilneuramínico (NGNA) y/o oligomanosa. En algunas realizaciones, el rhC1-INH recombinante purificado no contiene más del 20%, 15%, 10%, 5% o 0% de uno o más de glicosilación tipo manosa, a-galactosa, ácido N-glicolilneuramínico (NGNA) y/ o oligomanosa. En algunas realizaciones, el rhC1-INH recombinante purificado tiene un perfil de glicosilación que no es inmunogénico. En algunas realizaciones, el rhC1 -INH recombinante purificado tiene un perfil de glicosilación que no aumenta la tasa de depuración en suero en comparación con el C1-INH humano derivado de plasma. En algunas realizaciones, el rhC1-INH recombinante purificado tiene un perfil de glicosilación que disminuye la tasa de depuración en suero en comparación con el C1-INH humano derivado de plasma. En algunas realizaciones, el rhC1-INH recombinante purificado tiene un perfil de glicosilación que disminuye la tasa de depuración en suero en comparación con conestat alfa.

En algunas realizaciones, las células manipuladas para expresar rhC1-INH también pueden manipularse para aumentar la sialilación del rhC1-INH expresado. En algunas realizaciones, las células se manipulan para expresar una enzima heteróloga para aumentar la sialilación. En algunas realizaciones, las células se manipulan para expresar una enzima heteróloga mutante para aumentar la sialilación. En algunas realizaciones, las células se manipulan para sobreexpresar una enzima endógena para aumentar la sialilación. En algunas realizaciones, las células se manipulan para expresar una enzima endógena mutada para aumentar la sialilación. En algunas realizaciones, las células se manipulan para reducir o prevenir la expresión de enzimas endógenas que reducen, inhiben o degradan la sialilación (por ejemplo, con un constructo antisentido).

En la técnica se conocen varios métodos para manipular el perfil de glicosilación de proteínas. Los métodos para manipular el perfil de glicosilación de las proteínas y polipéptidos de C1-INH de la invención incluyen métodos in vitro, in situ e in vivo. En algunas realizaciones, el perfil de glicosilación de proteínas o polipéptidos expresados se altera mediante la modificación química posterior a la expresión de la proteína o polipéptido expresado. En algunas realizaciones, las condiciones del cultivo celular se manipulan para lograr la expresión de proteínas que tienen un perfil de glicosilación deseado. Estas condiciones de cultivo celular incluyen el control de la producción y el proceso de cultivo, incluyendo la duración del cultivo, los aditivos del medio de cultivo y/o la coexpresión de genes para potenciar la glicosilación. También puede usarse la selección de células huésped y clones específicos de células huésped transfectadas para potenciar la glicosilación. Algunos métodos para potenciar la glicosilación incluyen procesos de purificación para enriquecer proteínas o polipéptidos que tienen el perfil de glicosilación deseado.

La vida media de C1 -INH puede verse afectada por el perfil de glicosilación. Por ejemplo, se ha demostrado que el Ruconest® (Pharming N.V.), un polipéptido de C1-INH recombinante que está menos sialilado y/o tiene una distribución de sialilación diferente a la del C1-INH humano derivado de plasma, tiene una vida media mucho más corta que el C1-INH humano derivado plasma. Ver, por ejemplo, Davis, B. & Bernstein, J. A., Conestat alfa for the treatment of angioedema attacks, Ther Clin Risk Manag. 7: 265-273 (2011); Koles, K. et al., Influence of lactation parameters on the N-glycosylation of recombinant human C1 esterase inhibitor isolated from the milk of transgenic rabbits, Glycobiology, 14(11):979-986 (2004); Koles, K. et al., N and O-glycans of recombinant human C1 esterase inhibitor expressed in the milk of transgenic rabbits, Glycobiology, 14(1 ):51 -64 (2004). Aunque el Ruconest® tiene la misma secuencia de aminoácidos que el C1-INH derivado de plasma humano, como se elabora en conejos, su perfil de glicosilación es muy diferente al del C1-INH derivado de plasma humano. El resultado es que el Ruconest® tiene una vida media extremadamente corta de aproximadamente 2,4 a 2,7 horas. Ver la información de prescripción y la etiqueta de la FDA de Ruconest®. Por el contrario, se ha demostrado que el C1-INH derivado de plasma humano tiene una vida media media en el intervalo de aproximadamente 56-62 horas. Ver Información de prescripción de Cinryze®. Como se analiza en la presente, las células de la invención pueden manipularse para mejorar el perfil de glicosilación de la proteína rhC1-INH expresada de tal manera que un rhC1-INH de la invención tenga una vida media similar o más larga que el C1 -INH derivado del plasma.

Sialilación/Contenido de ácido siálico

En algunas realizaciones, la proteína o el polipéptido de C1-INH expresado recombinantemente tiene un perfil de sialilación similar al del C1 -INH derivado de plasma. En algunas realizaciones, la proteína o el polipéptido de C1-INH expresado recombinantemente tiene un perfil de sialilación tal que la proteína C1-INH expresada recombinantemente muestra una vida media similar a la del C1-INH derivado de plasma, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, la proteína o el polipéptido de C1-INH expresado recombinantemente tiene un perfil de sialilación tal que la proteína C1-INH expresada recombinantemente muestra una vida media mayor que la del C1-INH derivado de plasma, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, el inhibidor de esterasa C1 humano recombinante purificado (rhC1-INH o C1-INH) comprende, de media, por lo menos 10, 11, 12, 13 o 14 residuos de glicanos sialilados por molécula. En algunas realizaciones, el inhibidor de esterasa C1 humano recombinante purificado (rhC1-INH o C1-INH) comprende, de media, por lo menos 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, o 29 residuos de glicanos sialilados por molécula. En algunas realizaciones, el inhibidor de esterasa C1 humano recombinante purificado (rhC1-INH o C1-INH) comprende, de media, por lo menos 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 residuos de glicanos sialilados por molécula.

En la técnica se conocen varios métodos para manipular el perfil de sialilación de proteínas. Los métodos para manipular el perfil de sialilación de las proteínas y polipéptidos de C1-INH de la invención incluyen métodos in vitro, in situ e in vivo. En algunas realizaciones, el perfil de sialilación de proteínas o polipéptidos expresados se altera mediante la modificación química posterior a la expresión de la proteína o polipéptido expresado. En algunas realizaciones, las condiciones del cultivo celular se manipulan para lograr la expresión de proteínas que tienen un perfil de sialilación deseado. Estas condiciones de cultivo celular incluyen el control de la producción y el proceso de cultivo, incluyendo la duración del cultivo, los aditivos al medio de cultivo y/o la coexpresión de genes para potenciar la sialilación. Para potenciar la sialilación también pueden usarse la selección de células huésped y clones específicos de células huésped transfectadas. Algunos métodos para potenciar la sialilación incluyen procesos de purificación para enriquecer proteínas o polipéptidos que tienen el perfil de sialilación deseado.

Producción de proteínas C1-INH recombinantes

Una proteína rhC1-INH adecuada para la presente invención puede producirse mediante cualquier medio disponible. Por ejemplo, una proteína rhC1-INH puede producirse recombinantemente utilizando un sistema de células huésped manipulados para expresar un ácido nucleico que codifica la proteína rhC1-INH. Alternativa o adicionalmente, una proteína rhC1-INH puede producirse activando genes endógenos. Alternativa o adicionalmente, puede prepararse parcial o totalmente una proteína rhC1-INH mediante síntesis química.

Cuando las proteínas se producen recombinantemente, puede usarse cualquier sistema de expresión. Para dar unos pocos ejemplos, los sistemas de expresión conocidos incluyen, por ejemplo, células de E. coli, huevo, baculovirus, plantas, levaduras o mamíferos.

En algunas realizaciones, las proteínas rhC1-INH adecuadas para la presente invención se producen en células de mamífero. Los ejemplos no limitativos de células de mamífero que pueden usarse de acuerdo con la presente invención incluyen la línea de mieloma de ratón BALB/c (NSO/l, ECACC N° 85110503); retinoblastos humanos (PER.C6, CruCell, Leiden, Países Bajos); línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embrionario humano (células HEK293 o 293 subclonadas para crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59, 1977); línea celular de fibrosarcoma humano (por ejemplo, HT1080); células de riñón de cría de hámster (BHK21, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino /-DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216, 1980); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol.

Reprod., 23:243-251, 1980); células de riñón de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1 587); células de carcinoma cervical humano (HeLa, ATCC CCL 2); células de riñón canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo (BRL 3A, ^a T^c C CRL 1442); células de pulmón humanas (W138, ATCC CCL 75); células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68, 1982); células MRC 5; células FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2).

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona proteínas rhC1-INH producidas a partir de células humanas. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona proteínas rhC1-INH producidas a partir de células CHO, células HT1080 o células HeK.

Típicamente, las células que se manipulan para expresar una proteína rhC1-INH pueden comprender un transgén que codifica una proteína rhC1-INH descrita en la presente. Debe apreciarse que los ácidos nucleicos que codifican la proteína rhC1-INH pueden contener secuencias reguladoras, secuencias de control de genes, promotores, secuencias no codificantes y/u otras secuencias apropiadas para expresar la proteína rhC1-INH. Típicamente, la región codificante está enlazada operativamente con uno o más de estos componentes de ácido nucleico.

La región codificante de un transgén puede incluir una o más mutaciones silenciosas para optimizar el uso de codones para un tipo de célula particular. Por ejemplo, los codones de un transgén de C1-INH pueden optimizarse para la expresión en una célula de vertebrado. En algunas realizaciones, los codones de un transgén de C1-INH pueden optimizarse para la expresión en una célula de mamífero. En algunas realizaciones, los codones de un transgén de C1-INH pueden optimizarse para la expresión en una célula humana. En algunas realizaciones, los codones de un transgén de C1 -INH pueden optimizarse para la expresión en una célula CHO.

Ácidos nucleicos que codifican proteínas de inhibidor de CI recombinante

En algunas realizaciones, se proporcionan moléculas de ácidos nucleicos que comprenden secuencias de ácidos nucleicos que codifican un gen recombinante de interés (referido en la presente como transgén) como una proteína inhibidora de C1 descrita en varias realizaciones de la presente. En algunas realizaciones, el ácido nucleico que codifica un transgén puede modificarse para proporcionar una expresión aumentada de la proteína inhibidora de C1 codificada, a lo que también se hace referencia como optimización de codones. Por ejemplo, el ácido nucleico que codifica un transgén puede modificarse alterando el marco de lectura abierto para la secuencia codificante. Como se usa en la presente, el término "marco de lectura abierto" es sinónimo de "ORF" y significa cualquier secuencia de nucleótidos que sea potencialmente capaz de codificar una proteína o una porción de una proteína. Un marco de lectura abierto habitualmente comienza con un codón de inicio (representado como, por ejemplo, AUG para una molécula de ARN y ATG en una molécula de ADN en el código estándar) y se lee en tripletes de codones hasta que el marco termina con un codón de PARADA (representado, por ejemplo, como UAA, UGA o UAG para una molécula de ARN y TAA, TGA o TAG en una molécula de ADN en el código estándar). Como se usa en la presente, el término "codón" significa una secuencia de tres nucleótidos en una molécula de ácido nucleico que especifica un aminoácido particular durante la síntesis de proteínas; también llamado triplete o triplete de codones. Por ejemplo, de los 64 codones posibles en el código genético estándar, dos codones, GAA y GAG, codifican el aminoácido Glutamina, mientras que los codones AAA y AAG especifican el aminoácido Lisina. En el código genético estándar, tres codones son codones de parada, que no especifican un aminoácido. Como se usa en la presente, el término "codón sinónimo" significa cualquiera y todos los codones que codifican para un único aminoácido. A excepción de la metionina y el triptófano, los aminoácidos están codificados por de dos a seis codones sinónimos. Por ejemplo, en el código genético estándar, los cuatro codones sinónimos que codifican el aminoácido alanina son GCA, GCC, GCG y GCU, los dos codones sinónimos que especifican la glutamina son GAA y GAG y los dos codones sinónimos que codifican la lisina son AAA y AAG.

En algunas realizaciones, un ácido nucleico que codifica el marco de lectura abierto de una proteína inhibidora de C1 puede modificarse usando métodos estándar de optimización de codones. Hay disponibles varios algoritmos comerciales para la optimización de codones y pueden usarse para poner en práctica la presente invención. Típicamente, la optimización de codones no altera las secuencias de aminoácidos codificadas. La optimización de codones puede llevar a la alteración de aminoácidos, como sustitución, eliminación o inserción. Típicamente, dicha alteración de aminoácidos no altera sustancialmente la actividad de la proteína.

Las secuencias de ácidos nucleicos ejemplares codifican proteínas inhibidoras de C1 que tienen una secuencia de aminoácidos idéntica a la SEQ ID NO:4.

En algunas realizaciones, un cambio de nucleótidos puede alterar un codón sinónimo dentro del marco de lectura abierto para que coincida con el uso del codón endógeno que se encuentra en una célula heteróloga particular seleccionada para expresar la proteína inhibidora de C1. Alternativa o adicionalmente, un cambio de nucleótidos puede alterar el contenido de G+C dentro del marco de lectura abierto para igualar mejor el contenido medio de G+C de los marcos de lectura abiertos que se encuentran en la secuencia de ácidos nucleicos endógena presente en la célula huésped heteróloga. Un cambio de nucleótidos también puede alterar una región polimononucleotídica o un sitio regulador o estructural interno que se encuentra dentro de una secuencia de proteína inhibidora de C1. Por tanto, se prevé una variedad de secuencias de nucleótidos modificadas u optimizadas que incluyen, sin limitación, secuencias de ácidos nucleicos que proporcionan una expresión de proteínas de inhibidores de C1 aumenta en una célula procariota; célula de levadura; célula de insecto; y en una célula de mamífero.

Típicamente, un ácido nucleico modificado codifica una proteína inhibidora de C1 con o sin alteración de la secuencia de aminoácidos. En el caso de que haya una alteración de aminoácidos, tal alteración típicamente no disminuye sustancialmente la actividad de la proteína inhibidora de C1. Tal alteración puede aumentar y/o potenciar la actividad de la proteína inhibidora de C1. La actividad puede referirse a la siguiente lista no limitativa de parámetros: vida media aumentada, expresión de proteína aumentada/elevada por las células huésped, estabilidad aumentada de la proteína expresada, solubilidad aumentada de la proteína expresada, agregación disminuida de la proteína expresada, formulación más simple de la proteína expresada, purificación más simple de la proteína expresada, tolerancia aumentada de la proteína expresada a los cambios en el pH, capacidad aumentada de la proteína para tolerar condiciones de pH alto y bajo, proteína expresada que es adecuada para formulación a concentraciones más altas.

Vectores de expresión

Una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína inhibidora de C1 como se describe en la presente solicitud, puede clonarse (insertarse) molecularmente en un vector adecuado para la propagación o expresión en una célula huésped. Para poner en práctica la presente invención pueden usarse una amplia variedad de vectores de expresión incluyendo, sin limitación, un vector de expresión procariota; un vector de expresión de levadura; un vector de expresión de insecto y un vector de expresión de mamífero. Los vectores ejemplares adecuados para la presente invención incluyen, pero no se limitan a, vectores basados en virus (por ejemplo, vectores basados en AAV, vectores basados en retrovirus, vectores basados en plásmidos). En algunas realizaciones, una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína inhibidora de C1 puede insertarse en un vector adecuado. Típicamente, un ácido nucleico que codifica una proteína inhibidora de C1 está enlazada operativamente con varias secuencias o elementos reguladores.

Secuencias o elementos reguladores

Pueden incorporarse varias secuencias o elementos reguladores en un vector de expresión adecuado para la presente invención. Ejemplos de secuencias o elementos reguladores incluyen, pero no se limitan a, promotores, potenciadores, represores o supresores, secuencias 5' no traducidas (o no codificantes), intrones, secuencias 3' no traducidas (o no codificantes).

Como se usa en la presente, un "promotor" o "secuencia promotora" es una región reguladora de ADN capaz de unirse a una ARN polimerasa en una célula (por ejemplo, directamente o a través de otras proteínas o sustancias unidas al promotor) e iniciar la transcripción de una secuencia codificante. Una secuencia promotora está, en general, unida en su extremo 3' terminal por el sitio de inicio de la transcripción y se extiende en sentido ascendente (dirección 5') para incluir el número mínimo de bases o elementos necesarios para iniciar la transcripción a cualquier nivel. El promotor puede estar asociado operativamente o enlazado operativamente a las secuencias de control de la expresión, incluyendo las secuencias potenciadoras y represoras o con un ácido nucleico que se va a expresar. En algunas realizaciones, el promotor puede ser inducible. En algunas realizaciones, el promotor inducible puede ser unidireccional o bidireccional. En algunas realizaciones, el promotor puede ser un promotor constitutivo. En algunas realizaciones, el promotor puede ser un promotor híbrido, en el que la secuencia que contiene la región reguladora de la transcripción se obtiene de una fuente y la secuencia que contiene la región de inicio de la transcripción se obtiene de una segunda fuente. Los sistemas para enlazar elementos de control a la secuencia codificante dentro de un transgén son bien conocidos en la técnica (las técnicas generales de biología molecular y de ADN recombinante se describen en Sambrook, Fritsch y Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Los vectores comerciales adecuados para insertar un transgén para la expresión en varias células huésped en una variedad de condiciones de crecimiento e inducción también son bien conocidos en la técnica.

En algunas realizaciones, puede usarse un promotor específico para controlar la expresión del transgén en una célula huésped de mamífero como, pero no limitado a, el promotor SRa (ver Takebe et al., Molec. and Cell. Bio.

8:466-472 (1988)), el promotor temprano inmediato del CMV humano (Boshart et al., Cell 41:521-530 (1985); Foecking et al., Gene 45:101 -105 (1986))), el promotor de CMV humano, el promotor de CMV5 humano, el promotor temprano inmediato de CMV murino, el promotor de EF1-a, un promotor de CMV híbrido para la expresión específica del hígado (por ejemplo, elaborado conjugando el promotor inmediato tempranos de CMV con los elementos promotores transcripcionales o del promotor de a-1-antitripsina (HAT) humana o de albúmina (HAL)), o promotores para la expresión específica de hepatoma (por ejemplo, en donde los elementos promotores transcripcionales o de albumina humana (HAL, aproximadamente 1000 bp o a-1-antitripsina humana (HAT, aproximadamente 2000 pb) se combinan con un elemento potenciador de 145 de largo de a-1-microglobulina humana y gen precursor de bikunina (AMBP), HAL-AMBP y HAT-AMBP); la región promotora temprana de SV40 (ver Benoist et al., Nature 290:304-310 (1981)), el promotor temprano inmediato de Orgyia pseudotsugata, el promotor de la timidina quinasa del herpes (ver Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1441-1445 (1981)); o las secuencias reguladoras del gen de la metalotioneína (ver Brinster et al., Nature 296:39-42 (1982)). En algunas realizaciones, el promotor de mamífero es un promotor constitutivo como, pero no limitado a, el promotor de hipoxantina fosforribosil transferasa (HPTR), el promotor de adenosina desaminasa, el promotor de piruvato quinasa, el promotor de beta-actina así como otros promotores constitutivos conocidos a los expertos en la técnica.

En algunas realizaciones, puede usarse un promotor específico para controlar la expresión de un transgén en una célula huésped procariota como, pero no limitado a, el promotor de p-lactamasa (ver Villa-Komaroff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3727-3731 (1978)); el promotor de tac (ver DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25 (1983)); el promotor de T7, el promotor de T3, el promotor de M13 o el promotor de M16; en una célula huésped de levadura como, pero no limitado a, el promotor de GAL1, GAL4 o GAL10, el promotor de ADH (alcohol deshidrogenasa), el promotor de PGK (fosfoglicerol quinasa), el promotor de fosfatasa alcalina, el promotor de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa III (TDH3), el promotor de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa II (TDH2), el promotor de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa I (TDH1), piruvato quinasa (PYK), enolasa (ENO) o triosa fosfato isomerasa (TPI).

En algunas realizaciones, el promotor puede ser un promotor viral, muchos de los cuales pueden regular la expresión de un transgén en varios tipos de células huésped, incluyendo las células de mamífero. Los promotores virales que han demostrado impulsar la expresión constitutiva de secuencias codificantes en células eucariotas incluyen, por ejemplo, promotores de virus de simio, promotores de virus del herpes simple, promotores de virus del papiloma, promotores de adenovirus, promotores del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), promotores del virus del sarcoma de Rous, los promotores del citomegalovirus (CMV), las repeticiones terminales largas (LTR) del virus de la leucemia murina de Moloney y otros retrovirus, el promotor de la timidina quinasa del virus del herpes simple, así como otros promotores virales conocidos por los expertos en la técnica.

En algunas realizaciones, los elementos de control génico de un vector de expresión también pueden incluir secuencias 5' no transcriptoras y 5' no traductoras implicadas en el inicio de la transcripción y la traducción, respectivamente, como una caja TATA, una secuencia de recubrimiento, una secuencia CAAT, secuencia Kozak y similares. Pueden usarse elementos potenciadores opcionalmente para aumentar los niveles de expresión de un polipéptido o proteína a expresar. Los ejemplos de elementos potenciadores que han demostrado funcionar en células de mamífero incluyen el potenciador del gen temprano SV40, como se describe en Dijkema et al., EMBO J. (1985) 4: 761 y el potenciador/promotor derivado de la repetición terminal larga (LTR) del virus del sarcoma de Rous (RSV), como se describe en Gorman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982b) 79:6777 y citomegalovirus humano, como se describe enBoshart et al., Cell (1985) 41:521. Los elementos de control genético de un vector de expresión también incluirán secuencias 3' no transcriptoras y 3' no traductoras implicadas en la terminación de la transcripción y la traducción. Respectivamente, como una señal de poliadenilación (poli A) para la estabilización y el procesamiento del extremo 3' de un ARNm transcrito a partir del promotor. Las señales poli A incluían, por ejemplo, la señal poliA de beta globina de conejo, la señal poliA de hormona de crecimiento bovina, la señal de terminador de beta globina/poliA de pollo o la región poliA tardía de SV40.

Marcadores seleccionables

Los vectores de expresión incluirán preferiblemente, pero opcionalmente, por lo menos un marcador seleccionable. En algunas realizaciones, el marcador seleccionable es una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un gen de resistencia enlazado operativamente a uno o más elementos reguladores genéticos, para conferir a la célula huésped la capacidad de mantener la viabilidad cuando se cultiva en presencia de un fármaco y/o agente químico citotóxico. En algunas realizaciones, puede usarse un agente seleccionable para mantener la retención del vector de expresión dentro de la célula huésped. En algunas realizaciones, el agente seleccionable puede usarse para evitar la modificación (es decir, la metilación) y/o el silenciamiento de la secuencia transgénica dentro del vector de expresión. En algunas realizaciones, se usa un agente seleccionable para mantener la expresión episomal del vector dentro de la célula huésped. En algunas realizaciones, el agente seleccionable se usa para promover la integración estable de la secuencia transgénica en el genoma de la célula huésped. En algunas realizaciones, un agente y/o gen de resistencia puede incluir, pero no se limita a, metotrexato (MTX), dihidrofolato reductasa (DHFR, Patentes de Estados Unidos N24.399.216; 4.634.665; 4.656.134; 4.956.288; 5.149.636; 5.179.017, ampicilina, neomicina (G418), zeomicina, ácido micofenólico o glutamina sintetasa (GS, Patentes de Estados Unidos N° 5.122.464; 5.770.359; 5.827.739) para célula huésped eucariota; tetraciclina, ampicilina, kanamicina o cloranfenicol para una célula huésped procariota; y URA3, LEU2, HIS3, LYS2, HIS4, ADE8, CUP1 o TRP1 para una célula huésped de levadura.

Los vectores de expresión pueden transfectarse, transformarse o transducirse en una célula huésped. Como se usa en la presente, los términos "transfección", "transformación" y "transducción" se refieren todos a la introducción de una secuencia de ácidos nucleicos exógena en una célula huésped. En algunas realizaciones, los vectores de expresión que contienen secuencias de ácido nucleico que codifican una proteína inhibidora de C1 se transfectan, transforman o transducen en una célula huésped.

Los ejemplos de métodos de transformación, transfección y transducción, que son bien conocidos en la técnica, incluyen la administración de liposomas, es decir, el método de lipofectamina™ (Gibco BRL) de Hawley-Nelson, Focus 15:73 (1193), la electroporación, el método de administración de CaPO4 de Graham and van der Erb, Virology, 52:456-457 (1978), administración medicada con DEAE-dextrano, microinyección, administración de partículas biolísticas, administración mediada por polibreno, administración de lípidos mediada por cationes, transducción e infección viral, como, por ejemplo, retrovirus, lentivirus, adenovirus, virus adenoasociados y Baculovirus (células de insecto). En la técnica se han descrito los aspectos generales de las transformaciones del huésped celular, como por Axel en la Patente de Estados Unidos N° 4.399.216; Sambrook, supra, Capítulos 1-4 y 16-18; Ausubel, supra, capítulos 1, 9, 13, 15 y 16. Para varias técnicas para transformar células de mamífero, ver Keown et al., Methods in Enzymology (1989), Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527- 537 (1990), y Mansour et al., Nature, 336:348-352 (1988).

Una vez introducidos dentro de las células, los vectores de expresión pueden integrarse de manera estable en el genoma o existir como constructos extracromosómicos. Los vectores también pueden amplificarse y puede haber múltiples copias o integrarse en el genoma. En algunas realizaciones, las células de la invención pueden contener 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 o más copias de ácidos nucleicos que codifican una proteína inhibidora de C1. En algunas realizaciones, las células de la invención pueden contener múltiples copias (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 o más) de ácidos nucleicos que codifican la proteína inhibidora de C1 y uno o más más proteínas que potencian la glicosilación, preferiblemente mediante una sialilación aumentada, de la proteína inhibidora de C1 expresada. La sialilación también puede manipularse a través de los varios métodos descritos en la presente. Sin querer estar limitados por ninguna teoría, se descubrió que la sialilación disminuida estaba asociada con una unión a heparina aumentada de los constructos divulgados, impidiendo de este modo que el sitio de unión de C1-INH se uniera a los objetivos. La unión a heparina también aumenta la probabilidad de internalización en el lisosoma, aumentando de este modo la tasa de depuración.

Células huésped

Como se usa en la presente, el término "células huésped" se refiere a células que pueden usarse para producir proteína inhibidora de C1 recombinante. En particular, las células huésped son adecuadas para producir proteína inhibidora de C1 recombinante a gran escala. Las células huésped adecuadas pueden derivarse de una variedad de organismos incluyendo, pero no limitados a, mamíferos, plantas, aves (por ejemplo, sistemas aviares), insectos, levaduras y bacterias. En algunas realizaciones, las células huésped son células de mamífero. En algunas realizaciones, se manipula una célula huésped adecuada para mejorar el perfil de glicosilación de la proteína rhC1-INH expresada. En algunas realizaciones de la invención, el polipéptido de rhC1-INH tiene el mismo perfil de glicosilación o uno similar que las porciones análogas del C1-INH derivado de plasma nativo. En algunas realizaciones, el polipéptido de C1-INH tiene por lo menos un 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de glicanos equivalentes a C1-INH derivado de plasma nativo. En algunas realizaciones, el perfil de glicosilación de la proteína rhC1-INH tiene un perfil de glicosilación humanizado. En algunas realizaciones, la proteína rhC1-INH tiene una sialilación aumentada en comparación con C1-INH derivado de plasma nativo.

La mejora del perfil de glicosilación puede referirse a aumentar la sialilación y/o humanizar el perfil de glicosilación, por ejemplo, expresando en una célula manipulada una proteína rhC1-INH que comprende un polipéptido de C1 -INH, produciendo de este modo un perfil de glicosilación más similar al del C1 -INH humano nativo que un polipéptido de C1-INH expresado en una célula no manipulada. La mejora también puede referirse a aumentar, potenciar y/u optimizar del perfil de glicosilación de C1-INH en comparación con el Ruconest.

En la técnica se conocen varios métodos para cambiar, controlar, manipular, mejorar, potenciar y/u optimizar el perfil de glicosilación de proteínas. Las características del perfil de glicosilación que pueden optimizarse incluyen el número de residuos de glicanos, la localización de la unión del residuo de glicano, la forma de unión del glicano (por ejemplo, tipo de enlace), el proceso de unión del glicano y la identidad de los residuos de glicano unidos a la proteína o polipéptido. Se contemplan el perfil de glicosilación de cualquier parte de las proteínas de la invención como objetivos adecuados para la optimización de la glicosilación. Los métodos para cambiar, controlar, manipular, mejorar, potenciar y/u optimizar el perfil de glicosilación de las proteínas y polipéptidos de C1-INH de la invención incluyen métodos in vitro, in situ e in vivo.

En algunas realizaciones, el perfil de glicosilación de proteínas o polipéptidos expresados se altera a través de la modificación postraduccional y/o química de la proteína o polipéptido expresado.

En algunas realizaciones, la proteína C1-INH que se ha sometido a una modificación química y/o postraduccional tiene un perfil de glicosilación que se cambia, mejora, potencia, humaniza y/u optimiza en comparación con una proteína C1-INH que tiene la misma secuencia que no se ha sometido a dicha modificación postraduccional y/o química. En algunas realizaciones, la proteína C1-INH que se ha sometido a una modificación química y/o postraduccional tiene un perfil de sialilación que se cambia, mejora, potencia, humaniza y/u optimiza en comparación con una proteína C1-INH que tiene la misma secuencia que no ha se ha sometido a dicha modificación postraduccional y/o química.

En algunas realizaciones, la proteína C1-INH se expresa a partir de una línea celular manipulada para potenciar la glicosilación y tiene un perfil de glicosilación que se cambia, mejora, potencia, humaniza y/u optimiza en comparación con una proteína C1-INH que tiene la misma secuencia que es expresada a partir de la misma línea celular que no ha sido manipulada para potenciar la glicosilación. En algunas realizaciones, la proteína C1-INH se expresa a partir de una línea celular manipulada para mejorar la sialilación y tiene un perfil de sialilación que se cambia, mejora, potencia, humaniza y/u optimiza en comparación con una proteína C1-INH que tiene la misma secuencia que es expresada a partir de la misma línea celular que no ha sido manipulada para potenciar la sialilación.

En algunas realizaciones, la proteína C1-INH expresada a partir de una línea celular cultivada en condiciones para potenciar la glicosilación tiene un perfil de glicosilación que se cambia, mejora, potencia, humaniza y/u optimiza en comparación con una proteína C1 -INH que tiene la misma secuencia que se expresa a partir de una línea celular cultivada en condiciones para potenciar la glicosilación. En algunas realizaciones, la proteína C1-INH expresada a partir de una línea celular cultivada en condiciones para potenciar la sialilación tiene un perfil de sialilación que cambia, mejora, potencia, humaniza y/u optimiza en comparación con una proteína C1-INH que tiene la misma secuencia que se expresa a partir de una línea celular cultivada en condiciones para potenciar la sialilación.

En algunas realizaciones, la proteína C1-INH tiene un perfil de glicosilación que se cambia, mejora, potencia, humaniza y/u optimiza en comparación con el Ruconest. En algunas realizaciones, la proteína C1-INH tiene un perfil de glicosilación que se cambia, mejora, potencia, humaniza y/u optimiza en comparación con C1-INH derivado de plasma humano.

En algunas realizaciones, las condiciones del cultivo celular se manipulan para lograr la expresión de proteínas que tienen un perfil de glicosilación deseado. Estas condiciones de cultivo celular incluyen el control de la producción y el proceso de cultivo incluyendo la duración del cultivo, los aditivos al medio de cultivo, la coexpresión de genes para potenciar la glicosilación a través de una glicosilación aumentada y/o la manipulación de células para silenciar, prevenir la expresión, inactivar, o alterar enzimas asociadas con la degradación de glicanos (por ejemplo, la sialiladasa). Los métodos adecuados para la manipulación de la glicosilación incluyen, pero no se limitan a, los descritos en, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos N° 5.047.335; 5.096.816; 5.705.364; 7.645.609; 8.273.723; 8.524.477; 8.617.878; 8.871.723; N2 de Publicación de PCT WO2006/106348; WO2007/095506; WO2008/025856; WO2010/007214; WO2010/099394; y WO2013/093760.

Para potenciar la glicosilación también puede usarse la selección de células huésped y clones específicos de células huésped transfectadas. Algunos métodos para potenciar la glicosilación incluyen procesos de purificación para enriquecer proteínas o polipéptidos que tienen el perfil de glicosilación deseado.

En la técnica se conocen varios métodos para manipular el perfil de sialilación de proteínas. Los métodos para manipular el perfil de sialilación de las proteínas y polipéptidos de C1-INH de la invención incluyen métodos in vitro, in situ e in vivo. En algunas realizaciones, el perfil de sialilación de proteínas o polipéptidos expresados se altera mediante la modificación química posterior a la expresión de la proteína o polipéptido expresado. En algunas realizaciones, se manipulan las condiciones del cultivo celular para lograr la expresión de proteínas que tienen un perfil de sialilación deseado. Estas condiciones de cultivo celular incluyen el control de la producción y el proceso de cultivo, incluyendo la duración del cultivo, los aditivos al medio de cultivo y/o la coexpresión de genes para potenciar la sialilación. Para potenciar la sialilación también puede usarse la selección de células huésped y clones específicos de células huésped transfectadas. Algunos métodos para potenciar la sialilación incluyen procesos de purificación para enriquecer proteínas o polipéptidos que tienen el perfil de sialilación deseado.

La sialilación también puede manipularse a través de los varios métodos descritos en la presente. Sin querer estar limitados por ninguna teoría, se descubrió que la sialilación disminuida estaba asociada con una unión a heparina aumentada de los constructos divulgados, evitando de este modo que el sitio de unión de C1-INH se uniera a los objetivos. La unión a heparina también aumenta la probabilidad de internalización en el lisosoma, lo que aumenta la tasa de depuración.

Líneas celulares de mamíferos

De acuerdo con la presente invención puede usarse como célula huésped cualquier célula de mamífero o tipo de célula susceptible al cultivo celular y a la expresión de polipéptidos. Los ejemplos no limitativos de células de mamífero que pueden usarse de acuerdo con la presente invención incluyen células 293 de riñón embrionario humano (HEK293), células HeLa; línea de mieloma de ratón BALB/c (NSO/l, ECACC N°: 85110503); retinoblastos humanos (PER.C6 (CruCell, Leiden, Países Bajos)); línea CV1 de riñón de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñón embrionario humano (células 293 o 293 subclonadas para crecimiento en cultivo en suspensión, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); células de riñón de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino /- DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); células de sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); células de riñón de mono (CV1 ATCC

CCL 70); células de riñón de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1 587); células de carcinoma cervical humano (HeLa, ATCC CCL 2); células de riñón canino (MD^c K, ATCC CCL 34); células de hígado de rata búfalo

(BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humanas (W138, ATCC CCL 75); células hepáticas humanas (Hep

G2, HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, At Cc CCL51); células t Ri (Mather et al., Annals N.Y. Acad.

Sci., 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células F^s4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2). En algunas realizaciones, una célula de mamífero adecuada no es una célula deficiente en acidificación endosómica.

Además, de acuerdo con la presente invención puede utilizarse cualquier número de líneas celulares de hibridoma disponibles comercialmente y no comercialmente que expresen polipéptidos o proteínas. Un experto en la técnica apreciará que las líneas celulares de hibridoma podrían tener diferentes requisitos nutricionales y/o podrían requerir diferentes condiciones de cultivo para un crecimiento óptimo y la expresión de polipéptidos o proteínas, y podrán modificar las condiciones según sea necesario.

Líneas celulares no de mamíferos

De acuerdo con la presente invención como célula huésped puede utilizarse cualquier tipo de célula o célula derivada no de mamífero susceptible al cultivo celular y a la expresión de polipéptidos. Los ejemplos no limitativos de células huésped y líneas celulares no de mamíferos que pueden usarse de acuerdo con la presente invención incluyen células y líneas celulares derivadas de Pichia pastoris, Pichia methanolica, Pichia angusta, Schizosacccharomyces pombe, Saccharomyces cerevisiae, and Yarrowia lipolytica para levadura.; Sodoptera frugiperda, Trichoplusis ni, Drosophila melangoster and Manduca sexta para insectos; y Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Bacillus subtilis, Bacillus lichenifonnis, Bacteroides fragilis, Clostridia perfringens, Clostridia difficile para bacterias; y Xenopus Laevis de anfibios.

Adaptable al Crecimiento adherente frente a suspensión

En ciertas realizaciones, se selecciona una célula huésped para generar una línea celular en base a ciertos atributos preferibles o crecimiento bajo condiciones particulares elegidas para cultivar células. Un experto en la técnica apreciará que tales atributos pueden determinarse en base a características y/o rasgos conocidos de una línea establecida (es decir, una línea celular caracterizada disponible comercialmente) o a través de una evaluación empírica. En algunas realizaciones, una línea celular puede seleccionarse por su capacidad para crecer en una capa alimentadora de células. En algunas realizaciones, una línea celular puede seleccionarse por su capacidad para crecer en suspensión. En algunas realizaciones, una línea celular puede seleccionarse por su capacidad para crecer como una monocapa adherente de células. En algunas realizaciones, tales células pueden usarse con cualquier recipiente de cultivo de tejidos o cualquier recipiente tratado con un sustrato de adhesión adecuado. En algunas realizaciones, un sustrato de adhesión adecuado se selecciona del grupo que consiste de colágeno (por ejemplo, colágeno I, II, III o IV), gelatina, fibronectina, laminina, vitronectina, fibrinógeno, BD matrigel™, matriz de membrana basal, proteoglicano de sulfato de dermatán, poli-D-lisina y/o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, una célula huésped adherente puede seleccionarse y modificarse en condiciones de crecimiento específicas para crecer en suspensión. Tales métodos de modificación de una célula adherente para que crezcan en suspensión son conocidos en la técnica. Por ejemplo, puede acondicionarse una célula para que crezca en un cultivo en suspensión, eliminando gradualmente el suero animal del medio de crecimiento con el tiempo.

Selección y evaluación de líneas celulares

Una célula manipulada para expresar la proteína rhC1-INH se selecciona por su capacidad para producir la proteína rhC1-INH a una escala comercialmente viable. En particular, las células manipuladas de acuerdo con la presente invención son capaces de producir la proteína rhC1-INH a un nivel alto y/o con alta actividad enzimática, como se define en las reivindicaciones. En algunas realizaciones, las células deseables, una vez cultivadas en una condición de cultivo celular (por ejemplo, una suspensión estándar a gran escala o una condición de cultivo adherente), pueden producir proteína C1-INH en una cantidad de aproximadamente 5 picogramos/célula/día o más

(por ejemplo, más de aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 picogramos/célula/día). En algunas realizaciones, las células deseadas, una vez cultivadas en una condición de cultivo celular (por ejemplo, una suspensión estándar a gran escala o una condición de cultivo adherente), son capaces de producir proteína C1-INH en una cantidad que varía de aproximadamente 5 a 100 picogramos/célula/día

(por ejemplo, de aproximadamente 5 a 90 picogramos/célula/día, de aproximadamente 5 a 80 picogramos/célula/día, de aproximadamente 5 a 70 picogramos/célula/día, de aproximadamente 5 a 60 picogramos/célula/día, de aproximadamente 5 a 50 picogramos/célula/día, de aproximadamente 5 a 40 picogramos/célula/día, de aproximadamente 5 a 30 picogramos/célula/día, de aproximadamente 10 a 90 picogramos/célula/día, de aproximadamente 10 a 80 picogramos/célula/día, de aproximadamente 10 a 70 picogramos/célula/día, aproximadamente 10 a 60 picogramos/célula/día, de aproximadamente 10 a 50 picogramos/célula/día, aproximadamente 10 a 40 picogramos/célula/día, de aproximadamente 10 a 30 picogramos/célula/día, de aproximadamente 20 a 90 picogramos/célula/día, de aproximadamente 20 a 80 picogramos/célula/día, de aproximadamente 20 a 70 picogramos/célula/día, de aproximadamente 20 a 60 picogramos /célula/día, de aproximadamente 20 a 50 picogramos/célula/día, de aproximadamente 20 a 40 picogramos/célula/día, de aproximadamente 20 a 30 picogramos/célula/día).

Medio y condición de cultivo celular

Pueden usarse varios medios y condiciones de cultivo celular para producir una proteína rhC1-INH usando células manipuladas de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, una proteína rhC1-INH puede producirse en un medio que contiene suero o un medio libre de suero. En algunas realizaciones, se produce una proteína rhC1-INH en medio libre de suero. En algunas realizaciones, se produce una proteína rhC1 -INH en un medio libre de animales, es decir, un medio que carece de componentes derivados de animales. En algunas realizaciones, se produce una proteína rhC1-INH en un medio químicamente definido. Como se usa en la presente, el término "medio nutriente químicamente definido" se refiere a un medio del que se conocen sustancialmente todos los componentes químicos. En algunas realizaciones, un medio nutritivo químicamente definido está libre de componentes derivados de animales como suero, proteínas derivadas de suero (por ejemplo, albúmina o fetuína), y otros componentes. En algunas realizaciones, un medio químicamente definido comprende una o más proteínas (por ejemplo, factores de crecimiento de proteínas o citoquinas). En algunas realizaciones, un medio nutriente químicamente definido comprende uno o más hidrolizados de proteínas. En algunas realizaciones, un medio nutriente químicamente definido es un medio libre de proteínas, es decir, un medio libre de suero que no contiene proteínas, hidrolizados o componentes de composición desconocida.

En algunas realizaciones, un medio químicamente definido puede suplementarse con uno o más componentes derivados de animales. Tales componentes derivados de animales incluyen, pero no se limitan a, suero de ternero fetal, suero de caballo, suero de cabra, suero de burro, suero humano y proteínas derivadas de suero como albúminas (por ejemplo, albúmina de suero bovino o albúmina de suero humano).

Pueden usarse varias condiciones de cultivo celular para producir proteínas rhC1-INH a gran escala que incluyen, pero no se limitan a, cultivos en botellas giratorias, cultivos por lotes en biorreactores, cultivos de perfusión y cultivos por lotes alimentados en biorreactores. En algunas realizaciones, la proteína rhC1-INH se produce mediante células cultivadas en suspensión. En algunas realizaciones, la proteína rhC1-INH es producida por células adherentes. En algunas realizaciones, se usa el cultivo de perfusión para controlar la glicosilación de la proteína expresada. Los métodos ejemplares de cultivo de perfusión incluyen, pero no se limitan a, los descritos en, por ejemplo, Patente de Estados Unidos N° 6.528.286 y Publicación de PCT N° WO1996/039488A1.

Los medios celulares y las condiciones de cultivo ejemplares se describen en las secciones de Ejemplos. No se pretende que los ejemplos sean limitativos.

Inicio del cultivo

Una célula deseada que expresa la proteína C1-INH puede propagarse primero en un cultivo inicial mediante cualquiera de la variedad de métodos bien conocidos por los expertos en la técnica. La célula se propaga cultivándola a una temperatura y en un medio que favorece la supervivencia, el crecimiento y la viabilidad de la célula. El volumen de cultivo inicial puede ser de cualquier tamaño, pero a menudo es más pequeño que el volumen de cultivo del biorreactor de producción usado en la producción final y frecuentemente las células se pasan varias veces con un volumen de cultivo creciente antes de sembrar el biorreactor de producción. El cultivo celular puede agitarse o sacudirse para aumentar la oxigenación del medio y la dispersión de nutrientes a las células. Alternativa o adicionalmente, para aumentar y controlar la oxigenación del cultivo pueden usarse dispositivos de rociado especiales que son bien conocidos en la técnica.

La densidad celular de partida puede ser elegida por un experto en la técnica. De acuerdo con la presente invención, la densidad celular de partida puede ser tan baja como una única célula por volumen de cultivo. En algunas realizaciones, las densidades celulares de partida pueden variar de aproximadamente 1 x 102 células viables por ml hasta aproximadamente 1 x 103, 1 x 104, 1 x 105, 1 x 16 células viables por ml y más.

Los cultivos celulares iniciales e intermedios pueden crecer hasta cualquier densidad deseada antes de sembrar el siguiente biorreactor de producción intermedio o final. En algunas realizaciones, la viabilidad final antes de sembrar el biorreactor de producción es mayor de aproximadamente el 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o más. Las células pueden eliminarse del sobrenadante, por ejemplo, mediante centrifugación a baja velocidad. También puede ser deseable lavar las células eliminadas con un medio antes de sembrar el siguiente biorreactor para eliminar cualquier producto de desecho metabólico o componente del medio no deseado. El medio puede ser el medio en el que se cultivaron previamente las células o puede ser un medio diferente o una solución de lavado seleccionada por el profesional de la presente invención.

Luego, las células pueden diluirse hasta una densidad adecuada para sembrar el biorreactor de producción. En algunas realizaciones, las células se diluyen en el mismo medio que se usará en el biorreactor de producción. Alternativamente, las células pueden diluirse en otro medio o solución, dependiendo de las necesidades y deseos del profesional de la presente invención o para adaptarse a requisitos particulares de las propias células, por ejemplo, si se van a almacenar durante un período corto de tiempo antes de sembrar el biorreactor de producción.

Fase de crecimiento

Típicamente, una vez que se ha sembrado el biorreactor de producción como se ha descrito anteriormente, el cultivo celular se mantiene en la fase de crecimiento inicial en condiciones propicias para la supervivencia, el crecimiento y la viabilidad del cultivo celular. De acuerdo con la presente invención, el biorreactor de producción puede tener cualquier volumen que sea apropiado para la producción a gran escala de proteínas. Ver la subsección "Biorreactor" a continuación.

La temperatura del cultivo celular en la fase de crecimiento se selecciona principalmente en base al intervalo de temperaturas en las que el cultivo celular sigue siendo viable. La temperatura de la fase de crecimiento puede mantenerse a una única temperatura constante, o dentro de un intervalo de temperaturas. Por ejemplo, la temperatura puede aumentarse o disminuirse constantemente durante la fase de crecimiento. En general, la mayoría de las células de mamífero crecen bien dentro de un intervalo de aproximadamente 25° C a 42° C (por ejemplo, de 30° C a 40° C, de aproximadamente 30° C a 37° C, de aproximadamente 35° C a 40° C). En algunas realizaciones, las células de mamífero se cultivan a una temperatura que varía entre aproximadamente 30 y 37° C (por ejemplo, aproximadamente entre 31 y 37° C, aproximadamente entre 32 y 37° C, aproximadamente entre 33 y 37° C, aproximadamente entre 34 y 37° C, aproximadamente entre 35 y 37° C, aproximadamente entre 36 y 37° C). En algunas realizaciones, las células de mamífero se cultivan a una temperatura que varía entre aproximadamente 30 y 34° C (por ejemplo, aproximadamente 31 y 34° C, aproximadamente 31 y 35° C, aproximadamente 32 y 34° C, aproximadamente 33 y 34° C, aproximadamente 33 y 35° C). Típicamente, durante la fase de crecimiento, las células crecen a aproximadamente 28° C, aproximadamente 30° C, aproximadamente 31° C, aproximadamente 32° C, aproximadamente 33° C, aproximadamente 34° C, aproximadamente 35° C, aproximadamente 36° C, aproximadamente 37° C, aproximadamente 38° C, aproximadamente 39° C o aproximadamente 40° C.

Las células pueden cultivarse durante la fase de crecimiento inicial durante una cantidad de tiempo mayor o menor, dependiendo de las necesidades del profesional y los requisitos de las propias células. En una realización, las células se cultivan durante un período de tiempo suficiente para lograr una densidad de células viables que es un porcentaje dado de la máxima densidad de células viables que las células alcanzarían finalmente si se les permitiera crecer sin alteraciones. Por ejemplo, las células pueden crecer durante un período de tiempo suficiente para lograr una densidad de células viables deseada del 1,5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99 por ciento de la densidad máxima de células viables.

En alguna realización, se permite que las células crezcan durante un período de tiempo definido. Por ejemplo, dependiendo de la concentración inicial del cultivo celular, la temperatura a la que crecen las células y la tasa de crecimiento intrínseco de las células, las células pueden crecer durante 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 o más días. En algunos casos, puede permitirse que las células crezcan durante un mes o más.

En algunas realizaciones, se permite que las células crezcan hasta una densidad de células viables deseada. Por ejemplo, una densidad de células viables deseada al final de la fase de crecimiento es mayor de aproximadamente 1,0 x 106 células viables/ml, 1,5 x 106 células viables/ml, 2,0 x 106 células viables/ml, 2,5 x 106 células viables/ml, 5 x 106 células viables/ml, 10 x 106 células viables/ml, 20 x 106 células viables/ml, 30 x 106 células viables/ml, 40 x 106 células viables/ml, o 50 x 106 células viables/ml.

El cultivo celular puede agitarse o sacudirse durante la fase de cultivo inicial para aumentar la oxigenación y la dispersión de nutrientes a las células. De acuerdo con la presente invención, un experto en la técnica comprenderá que puede ser beneficioso controlar o regular ciertas condiciones internas del biorreactor durante la fase de crecimiento inicial, incluyendo pero no limitadas a, el pH, la temperatura, la oxigenación, etc. Por ejemplo, el pH puede controlarse suministrando una cantidad apropiada de ácido o base y la oxigenación puede controlarse con dispositivos de rociado que son bien conocidos en la técnica. En algunas realizaciones, un pH deseado para la fase de crecimiento varía entre aproximadamente 6,8 y 7,5 (por ejemplo, entre aproximadamente 6,9 y 7,4, entre aproximadamente 6,9 y 7,3, entre aproximadamente 6,95 y 7,3, entre aproximadamente 6,95 y 7,25, entre aproximadamente 7,0 y 7,3, entre aproximadamente 7,0 y 7,25, entre aproximadamente 7,0 y 7,2, entre aproximadamente 7,0 y 7,15, entre aproximadamente 7,05 y 7,3, entre aproximadamente 7,05 y 7,25, entre aproximadamente 7,05 y 7,15, entre aproximadamente 7,05 y 7,20, entre aproximadamente 7,10 y 7,3, entre aproximadamente 7,10 y 7,25, entre aproximadamente 7,10 y 7,20, entre aproximadamente 7,10 y 7,15). En algunas realizaciones, un pH deseado para la fase de crecimiento es de aproximadamente 6,8, 6,85, 6,9, 6,95, 7,0, 7,05, 7,1, 7,15, 7,2, 7,25, 7,3, 7,35, 7,4, 7,45 o 7,5.

En algunas realizaciones, un punto de ajuste de oxígeno disuelto deseado para la fase de crecimiento varía entre aproximadamente el 0% y el 70%, entre aproximadamente el 5% y el 60%, entre aproximadamente el 25% y el 50%, entre aproximadamente el 20% y el 40%, entre aproximadamente el 30% y el 60%. En algunas realizaciones, un punto de ajuste de oxígeno disuelto deseado para la fase de crecimiento es de aproximadamente el 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55% o el 60%.

Fase de transición

En algunas realizaciones, cuando las células están listas para la fase de producción, las condiciones de cultivo pueden cambiarse para maximizar la producción de la proteína recombinante de interés. Tal cambio de condiciones de cultivo típicamente tiene lugar en una fase de transición. En algunas realizaciones, dicho cambio puede ser un desplazamiento en una o más de una serie de condiciones de cultivo que incluyen, pero no se limitan a, temperatura, pH, osmolaridad y medio. En una realización, se cambia el pH del cultivo. Por ejemplo, el pH del medio puede aumentarse o disminuirse desde la fase de crecimiento a la fase de producción. En algunas realizaciones, este cambio de pH es rápido. En algunas realizaciones, este cambio en el pH se produce lentamente durante un período de tiempo prolongado. En algunas realizaciones, el cambio de pH se regula mediante la adición de bicarbonato de sodio. En algunas realizaciones, el cambio en el pH se inicia al comienzo de la fase de transición y se mantiene durante la fase de producción posterior.

En una realización, se desplaza la concentración de glucosa del medio de cultivo celular. De acuerdo con esta realización, tras el inicio de la fase de transición, la concentración de glucosa dentro del cultivo celular se ajusta a una tasa más alta que 7,5 mM.

En algunas realizaciones, la temperatura se desplaza hacia arriba o hacia abajo desde la fase de crecimiento hasta la fase de producción. Por ejemplo, la temperatura puede subir o bajar de la fase de crecimiento a la fase de producción en aproximadamente 0,1° C, 0,2° C, 0,3° C, 0,4° C, 0,5° C, 1,0° C, 1,5° C, 2,0° C. C, 2,5° C, 3,0° C, 3,5° C, 4,0° C, 4,5° C, 5,0° C, 5,5° C, 6,0° C, 6,5° C, 7,0° C, 7,5° C, 8,0° C, o más.

Fase de Producción

De acuerdo con la presente invención, una vez que el cultivo celular alcanza la densidad y viabilidad celular deseadas, con o sin una fase de transición, el cultivo celular se mantiene para una fase de producción posterior en las condiciones de cultivo que llevan a la supervivencia y viabilidad del cultivo celular y apropiado para la expresión de la proteína C1-INH a niveles comercialmente adecuados.

En algunas realizaciones, durante la fase de producción, el cultivo se mantiene a una temperatura o intervalo de temperatura inferior a la temperatura o intervalo de temperatura de la fase de crecimiento. Por ejemplo, durante la fase de producción, las células pueden expresar bien la proteína rhC1-INH dentro de un intervalo de aproximadamente 25° C a 35° C (por ejemplo, de aproximadamente 28° C a 35° C, de aproximadamente 30° C a 35° C, de aproximadamente 32° C a 35° C). En algunas realizaciones, durante la fase de producción, las células pueden expresar bien la proteína rhC1-INH a una temperatura de aproximadamente 25° C, aproximadamente 26° C, aproximadamente 27° C, aproximadamente 28° C, aproximadamente 29° C, aproximadamente 30° C, aproximadamente 31° C, aproximadamente 32° C, aproximadamente 33° C, aproximadamente 34° C, aproximadamente 35° C, aproximadamente 36° C, aproximadamente 37° C. En otras realizaciones, durante la fase de producción, el cultivo se mantiene a una temperatura o intervalo de temperatura más alto que la temperatura o intervalo de temperatura de la fase de crecimiento.

Adicional o alternativamente, durante la fase de producción, el cultivo se mantiene a un pH o intervalo de pH que es diferente (más bajo o más alto) que el pH o intervalo de pH de la fase de crecimiento. En algunas realizaciones, el medio para la fase de producción tiene un pH que varía entre aproximadamente 6,8 y 7,5 (por ejemplo, entre aproximadamente 6,9 y 7,4, entre aproximadamente 6,9 y 7,3, entre aproximadamente 6,95 y 7,3, entre aproximadamente 6,95 y 7,25, entre aproximadamente 7,0 y 7,3, entre aproximadamente 7,0 y 7,25, entre aproximadamente 7,0 y 7,2, entre aproximadamente 7,0 y 7,15, entre aproximadamente 7,05 y 7,3, entre aproximadamente 7,05 y 7,25, entre aproximadamente 7,05 y 7,15, entre aproximadamente 7,05 y 7,20, entre aproximadamente 7,10 y 7,3, entre aproximadamente 7,10 y 7,25, entre aproximadamente 7,10 y 7,20, entre aproximadamente 7,10 y 7,15). En algunas realizaciones, el medio tiene un pH de aproximadamente 6,8, 6,85, 6,9, 6,95, 7,0, 7,05, 7,1, 7,15, 7,2, 7,25, 7,3, 7,35, 7,4, 7,45 o 7,5.

En algunas realizaciones, un punto de ajuste de oxígeno disuelto deseado para la fase de producción varía entre aproximadamente el 0% y el 70%, entre aproximadamente el 5% y el 60%, entre aproximadamente el 25% y el 50%, entre aproximadamente el 20% y el 40%, entre aproximadamente el 30% y el 60%. En algunas realizaciones, un punto de ajuste de oxígeno disuelto deseado para la fase de producción es de aproximadamente el 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55% o el 60%.

En algunas realizaciones, las células pueden mantenerse dentro de un intervalo deseado de densidad de células viables a lo largo de la producción. Por ejemplo, durante la fase de producción del cultivo celular, una densidad de células viables deseada puede variar entre aproximadamente 1,0 y 50 x 106 células viables/ml durante la fase de producción (por ejemplo, entre aproximadamente 1,0 y 40 x 106 células viables/ml, entre aproximadamente 1,0 y 30 x 106 células viables/ml, entre aproximadamente 1,0 y 20 x 106 células viables/ml, entre aproximadamente 1,0 y 10x 106 células viables/ml, entre aproximadamente 1,0 y 5 x 106 células viables/ml, entre aproximadamente 1,0 y 4,5 x 106 células viables/ml, entre aproximadamente 1,0 y 4 x 106 células viables/ml, entre aproximadamente 1,0 y 3,5 x 106 células viables/ml, entre aproximadamente 1,0 y 3 x 106 células viables/ml, entre aproximadamente 1,0 y 2,5 x 106 células viables/ml, entre aproximadamente 1,0 y 2,0 x 106 células viables/ml, entre aproximadamente 1,0 y 1,5 x 106 células viables/ml, entre aproximadamente 1,5 y 10 x 106 viables células/ml, entre aproximadamente 1,5 y 5 x 106 células viables/ml, entre aproximadamente 1,5 y 4,5 x 106 células viables/ml, entre aproximadamente 1,5 y 4 x 106 células viables/ml, entre aproximadamente 1,5 y 3,5 x 106 células viables/ ml, entre aproximadamente 1,5 y 3,0 x 106 células viables/ml, entre aproximadamente 1,5 y 2,5 x 106 células viables/ml, entre aproximadamente 1,5 y 2,0 x 106 células viables/ml).

En algunas realizaciones, las células pueden mantenerse durante un período de tiempo suficiente para lograr una densidad de células viables del 1,5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99 por ciento de la densidad máxima de células viables. En algunos casos, puede ser deseable permitir que la densidad de células viables alcance un máximo. En algunas realizaciones, puede ser deseable permitir que la densidad de células viables alcance un máximo y luego permitir que la densidad de células viables disminuya hasta cierto nivel antes de recoger el cultivo. En algunas realizaciones, la viabilidad total al final de la fase de producción es menor de aproximadamente el 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%.

En algunas realizaciones, se permite que las células crezcan durante un período de tiempo definido durante la fase de producción. Por ejemplo, dependiendo de la concentración del cultivo celular al comienzo de la fase de crecimiento posterior, la temperatura a la que se cultivan las células y la tasa de crecimiento intrínseco de las células, las células pueden cultivarse durante aproximadamente de 5 a 90 días (por ejemplo, aproximadamente de 5 a 80 días, aproximadamente de 5 a 70 días, aproximadamente de 5 a 60 días, aproximadamente de 5 a 50 días, aproximadamente de 5 a 40, aproximadamente de 5 a 30 días, aproximadamente de 5 a 20 días, aproximadamente de 5 a 15 días, aproximadamente de 5 a 10 días, aproximadamente de 10 a 90 días, aproximadamente de 10 a 80 días, aproximadamente de 10 a 70 días, aproximadamente de 10 a 60 días, aproximadamente de 10 a 50 días, aproximadamente de 10 a 40 días, aproximadamente de 10 a 30 días, aproximadamente de 10 a 20 días, aproximadamente de 15 a 90 días, aproximadamente de 15 a 80 días, aproximadamente de 15 a 70 días, aproximadamente de 15 a 60 días, aproximadamente de 15 a 50 días, aproximadamente de 15 a 40 días, aproximadamente de 15 a 30 días). En algunas realizaciones, la fase de producción dura aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, o 90 días.

En algunas realizaciones, las células se mantienen en la fase de producción hasta que el título de la proteína rhC1-INH alcanza un máximo. En otras realizaciones, el cultivo puede recogerse antes de este punto. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las células se mantienen en la fase de producción hasta que el título de la proteína rhC1-INH alcanza un título deseado. Por tanto, un título de recogida medio deseado para la proteína rhC1-INH puede ser de por lo menos 6 mg por litro por día (mg/l/día) (por ejemplo, por lo menos 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 o 500 mg/l/día, o más). En algunas realizaciones, un título de recogida medio deseado para la proteína rhC1-INH puede variar de aproximadamente 6 a 500 mg/l/día (por ejemplo, de aproximadamente 6 a 400 mg/l/día, de aproximadamente 6 a 300 mg/l/día, de aproximadamente 6 a 200 mg/l/día, de aproximadamente 6 a 100 mg/l/día, de aproximadamente 6 a 90 mg/l/día, de aproximadamente 6 a 80 mg/l/día, de aproximadamente 6 a 70 mg/l/día, de aproximadamente 6 a 60 mg/l/día, de aproximadamente 6 a 50 mg/l/día, de aproximadamente 6 a 40 mg/l/día, de aproximadamente 6 a 30 mg/l/día, de aproximadamente 10 a 500 mg/l/día, de aproximadamente 10 a 400 mg/l/día, de aproximadamente 10 a 300 mg/l/día, de aproximadamente 10 a 200 mg/l/día, de aproximadamente 10 a 100 mg/l/día, de aproximadamente 10 a 90 mg/l/día, de aproximadamente 10 a 80 mg/l/día, de aproximadamente 10 a 70 mg/l/día, de aproximadamente 10 a 60 mg/l/día, de aproximadamente 10 a 50 mg/l/día, de aproximadamente 10 a 40 mg/l/día, de aproximadamente 10 a 30 mg/l/día, de aproximadamente 20 a 500 mg/l/día, de aproximadamente 20 a 400 mg/l/día, de aproximadamente 20 a 300 mg/l/día, de aproximadamente 20 a 200 mg/l/día, de aproximadamente 20 a 100 mg/l/día, de aproximadamente 20 a 90 mg/l/día, de aproximadamente 20 a 80 mg/l/día, de aproximadamente 20 a 70 mg/l/día, de aproximadamente 20 a 60 mg/l/día, de aproximadamente 20 a 50 mg/l/día, de aproximadamente 20 a 40 mg/l/día, de aproximadamente 20 a 30 mg/l/día).

En algunas realizaciones, puede ser beneficioso o necesario suplementar el cultivo celular durante la fase de producción con nutrientes u otros componentes del medio que han sido agotados o metabolizados por las células. Por ejemplo, podría ser ventajoso suplementar el cultivo celular con nutrientes u otros componentes del medio que se haya observado que se han agotado durante el cultivo celular. Alternativa o adicionalmente, puede ser beneficioso o necesario suplementar el cultivo celular antes de la fase de producción. Como ejemplos no limitativos, puede ser beneficioso o necesario suplementar el cultivo celular con moduladores redox, moduladores del crecimiento (por ejemplo, hormonas y/u otros factores de crecimiento), moduladores de la glicosilación, iones particulares (por ejemplo, sodio, cloruro, calcio, magnesio, manganeso, fosfato), tampones, vitaminas, nucleósidos o nucleótidos, elementos traza (compuestos inorgánicos habitualmente presentes en concentraciones finales muy bajas), aminoácidos, lípidos, peptonas, extractos de levadura, hidrolizados de plantas, hidrolizados de soja, suero, suplementos lipídicos, azúcares de nucleótidos, precursores de azúcares de nucleótidos, amoníaco, glucosamina, uridina, precursores de ácido siálico, N-acetilmanosamina, glucosa, galactosa, aminoácidos (por ejemplo, glutamina, cisteína, isoleucina, leucina, triptófano, valina, asparagina, ácido aspártico, glutamato, azúcares (por ejemplo, glucosa, galactosa, ácido siálico) o fuentes de energía.

Estos componentes suplementarios pueden agregarse todos al cultivo celular al mismo tiempo, o pueden proporcionarse al cultivo celular en una serie de adiciones. En algunas realizaciones, los componentes suplementarios se proporcionan al cultivo celular varias veces en cantidades proporcionales. En otras realizaciones, el cultivo celular se alimenta continuamente con estos componentes suplementarios. Típicamente, este proceso se conoce como perfusión y un cultivo celular que implica perfusión se conoce como "cultivo de perfusión". Como se usa en la presente, el término "cultivo de perfusión" se refiere a un método de cultivo de células en el que los componentes adicionales se proporcionan de manera continua o semicontinua al cultivo posteriormente al comienzo del proceso de cultivo. Una parte de las células y/o componentes en el medio se recogen típicamente en una base continua o semicontinua y opcionalmente se purifican.

En algunas realizaciones, el medio se intercambia continuamente mediante un proceso de perfusión durante la fase de producción. Típicamente, el volumen de medio fresco con respecto al volumen de trabajo del reactor por día (VVD) se define como tasa de perfusión. De acuerdo con la presente invención pueden usarse varias tasas de perfusión. En algunas realizaciones, un proceso de perfusión tiene una tasa de perfusión tal que el volumen total añadido al cultivo celular se mantiene en una cantidad mínima. En algunas realizaciones, el proceso de perfusión tiene una tasa de perfusión que varía entre aproximadamente 0,5 y 2 volúmenes de medio fresco/volumen de trabajo del reactor/día (VVD) (por ejemplo, entre aproximadamente 0,5 y 1,5 VVD, entre aproximadamente 0,75 y 1,5 VVD, entre aproximadamente 0,75 y 1,25 VVD, entre aproximadamente 1,0 y 2,0 VVD, entre aproximadamente 1,0 y 1,9 VVD, entre aproximadamente 1,0 y 1,8 VVD, entre aproximadamente 1,0 y 1,7 VVD, entre aproximadamente 1,0 y 1,6 VVD, entre aproximadamente 1,0 y 1,5 VVD, entre aproximadamente 1,0 y 1,4 VVD, entre aproximadamente 1,0 y 1,3 VVD, entre aproximadamente 1,0 y 1,2 VVD, entre aproximadamente 1,0 y 1,1 VVD). En algunas realizaciones, el proceso de perfusión tiene una tasa de perfusión de aproximadamente 0,5, 0,55, 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, 0,95, 1,0, 1,05, 1,10, 1,15, 1,2, 1,25, 1,3, 1,35, 1,4, 1,45, 1,5, 1,55, 1,6, 1,65, 1,7, 1,75, 1,8, 1,85, 1,9, 1,95, o 2,0 VVD.

Un proceso de perfusión también puede caracterizarse por el volumen de medio fresco añadido por célula por día, que se define como tasa de perfusión específica de células. Pueden usarse varias tasas de perfusión específicas de células. En algunas realizaciones, el proceso de perfusión tiene una tasa de perfusión específica de células que varía entre aproximadamente 0,05 y 5 nanolitros por célula por día (nl/célula/día) (por ejemplo, entre aproximadamente 0,05 y 4 nl/célula/día, entre aproximadamente 0,05 y 3 nl/día). célula/día, entre aproximadamente 0,05 y 2 nl/célula/día, entre aproximadamente 0,05 y 1 nl/célula/día, entre aproximadamente 0,1 y 5 nl/célula/día, entre aproximadamente 0,1 y 4 nl/célula/día, entre aproximadamente 0,1 y 3 nl/ célula/día, entre aproximadamente 0,1 y 2 nl/célula/día, entre aproximadamente 0,1 y 1 nl/célula/día, entre aproximadamente 0,15 y 5 nl/célula/día, entre aproximadamente 0,15 y 4 nl/célula/día, entre aproximadamente 0,15 y 3 nl/ célula/día, entre aproximadamente 0,15 y 2 nl/célula/día, entre aproximadamente 0,15 y 1 nl/célula/día, entre aproximadamente 0,2 y 5 nl/célula/día, entre aproximadamente 0,2 y 4 nl/célula/día, entre aproximadamente 0,2 y 3 nl/ célula/día, entre aproximadamente 0,2 y 2 nl/célula/día, entre aproximadamente 0,2 y 1 nl/célula/día, entre aproximadamente 0,25 y 5 nl/célula/día, entre aproximadamente 0,25 y 4 nl/célula/día, entre aproximadamente 0,25 y 3 nl/célula/día, entre aproximadamente 0,25 y 2 nl/célula/día, entre aproximadamente 0,25 y 1 nl/célula/día, entre aproximadamente 0,3 y 5 nl/célula/día, entre aproximadamente 0,3 y 4 nl/célula/día, entre aproximadamente 0,3 y 3 nl/célula/día, entre aproximadamente 0,3 y 2 nl/célula/día, entre aproximadamente 0,3 y 1 nl/célula/día, entre aproximadamente 0,35 y 5 nl/célula/día, entre aproximadamente 0,35 y 4 nl/célula/día, entre aproximadamente 0,35 y 3 nl/célula/día, entre aproximadamente 0,35 y 2 nl/célula/día, entre aproximadamente 0,35 y 1 nl/célula/día, entre aproximadamente 0,4 y 5 nl/célula/día, entre aproximadamente 0,4 y 4 nl/célula/día, entre aproximadamente 0,4 y 3 nl/célula/día, entre aproximadamente 0,4 y 2 nl/célula/día, entre aproximadamente 0,4 y 1 nl/célula/día, entre aproximadamente 0,45 y 5 nl/célula/día, entre aproximadamente 0,45 y 4 nl/célula/día, entre aproximadamente 0,45 y 3 nl/célula/día, entre aproximadamente 0,45 y 2 nl/célula/día, entre aproximadamente 0,45 y 1 nl/célula/día, entre aproximadamente 0,5 y 5 nl/célula/día, entre aproximadamente 0,5 y 4 nl/célula/día, entre aproximadamente 0,5 y 3 nl/célula/día, entre aproximadamente 0,5 y 2 nl/célula/día, entre aproximadamente 0,5 y 1 nl/célula/día). En algunas realizaciones, el proceso de perfusión tiene una tasa de perfusión específica de células de aproximadamente 0,05, 0,1, 0,15, 0,2, 0,25, 0,3, 0,35, 0,4, 0,45, 0,5, 0,55, 0,6, 0,65, 0,7, 0,75, 0,8, 0,85, 0,9, 0,95, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,1, 3,2, 3,3, 3,4, 3,5, 3,6, 3,7, 3,8, 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8, 4,9, o 5,0 nl/célula/ día.

El cultivo celular puede agitarse o sacudirse durante la fase de producción para aumentar la oxigenación y la dispersión de nutrientes a las células. De acuerdo con la presente invención, un experto en la técnica comprenderá que puede ser beneficioso controlar o regular ciertas condiciones internas del biorreactor durante la fase de crecimiento, incluyendo pero no limitadas a, el pH, la temperatura, la oxigenación, etc. por ejemplo, el pH puede controlarse suministrando una cantidad apropiada de ácido o base y la oxigenación puede controlarse con dispositivos de rociado que son bien conocidos en la técnica. También pueden proporcionarse uno o más agentes antiforma.

Puede usarse el mismo medio de cultivo durante todo el proceso de producción, incluyendo la fase de crecimiento, la fase de producción y la profusión. En algunas realizaciones, se usan por lo menos dos medios diferentes en la producción de rhC1-INH. Por ejemplo, a menudo se usa un medio nutriente formulado para el crecimiento celular para apoyar el crecimiento de las células durante la fase de crecimiento celular, y el medio nutriente formulado para la producción de proteínas se usa durante la fase de producción del proceso para apoyar la expresión y recogida de C1-INH. En cualquier caso, el medio nutriente puede contener suero o no u otros componentes derivados de animales (por ejemplo, fetuína).

Las células típicamente se cultivan en suspensión. Sin embargo, las células pueden unirse a un sustrato. En un ejemplo, las células pueden unirse a microperlas o partículas que están suspendidas en el medio nutriente.

Biorreactores

En la presente se describen biorreactores que son útiles para producir rhC1-INH. Los biorreactores pueden ser de perfusión, por lotes, por lotes alimentados, por lotes repetidos o continuos (por ejemplo, modelos de reactores continuos de tanque agitado), por ejemplo. Típicamente, los biorreactores comprenden por lo menos un recipiente diseñado y configurado para contener un medio (por ejemplo, un medio nutriente químicamente definido). El recipiente también comprende típicamente por lo menos una entrada diseñada y configurada para hacer fluir medio nutriente nuevo al interior del recipiente. El recipiente también comprende típicamente por lo menos una salida diseñada y configurada para hacer fluir el medio de desecho fuera del recipiente. En algunas realizaciones, el recipiente puede comprender además por lo menos un filtro diseñado y configurado para minimizar el grado en que las células aisladas del recipiente pasan a través de por lo menos una salida con el medio de desecho. El biorreactor también puede estar equipado con uno o más de otros componentes diseñados para mantener las condiciones adecuadas para el crecimiento celular. Por ejemplo, el biorreactor puede estar equipado con uno o más dispositivos de circulación o mezclado diseñados y configurados para hacer circular o mezclar el medio nutriente dentro del recipiente. Típicamente, las células aisladas que se manipulan para expresar rhC1-INH se suspenden en el medio nutriente. Por lo tanto, en algunos casos, el dispositivo de circulación asegura que las células aisladas permanezcan en suspensión en el medio nutriente. En algunos casos, las células están unidas a un sustrato. En algunos casos, las células están unidas a uno o más sustratos (por ejemplo, microperlas) que están suspendidas en el medio nutriente. El biorreactor puede comprender uno o más puertos para obtener una muestra de la suspensión celular del recipiente. El biorreactor puede estar configurado con uno o más componentes para la monitorización y/o el control de las condiciones del cultivo, incluyendo condiciones como contenido de gas (por ejemplo, aire, oxígeno, nitrógeno, dióxido de carbono), caudales, temperatura, pH y niveles de oxígeno disuelto, y velocidad de agitación/tasa de circulación.

En los biorreactores pueden usarse recipientes de cualquier tamaño apropiado. Típicamente, el tamaño del recipiente es adecuado para satisfacer las demandas de producción de la fabricación de rhC1-INH. En algunas realizaciones, el recipiente está diseñado y configurado para contener hasta 1 l, hasta 10 l, hasta 100 l, hasta 500 l, hasta 1000 l, hasta 1500 l, hasta 2000 l o más del medio nutriente. En algunas realizaciones, el volumen del biorreactor de producción es de por lo menos 10 l, por lo menos 50 l, 100 l, por lo menos 200 l, por lo menos 250 l, por lo menos 500 l, por lo menos 1000 l, por lo menos 1500 l, por lo menos 2000 l, por lo menos 2500 l, por lo menos 5000 l, por lo menos 8000 l, por lo menos 10000 l, por lo menos 12000 l, por lo menos 15000 l, o por lo menos 20000 l o más, o cualquier volumen intermedio. El biorreactor de producción puede construirse con cualquier material que lleve al crecimiento y la viabilidad celular que no interfiera con la expresión o la estabilidad o la actividad de la proteína C1-INH producida. El material ejemplar puede incluir, pero no limitarse a, vidrio, plástico o metal.

En algunas realizaciones, las células pueden cultivarse en un medio químicamente definido que está contenido en un recipiente de un biorreactor. Los métodos de cultivo a menudo implican la perfusión de medio nutriente fresco en el recipiente a través de por lo menos una entrada y la extracción del medio nutriente de desecho del recipiente a través de por lo menos una salida. La extracción se realiza a una tasa de hasta aproximadamente 0,1 volúmenes de recipiente por día, aproximadamente 0,2 volúmenes de recipiente por día, aproximadamente 0,3 volúmenes de recipiente por día, aproximadamente 0,4 volúmenes de recipiente por día, aproximadamente 0,5 volúmenes de recipiente por día, aproximadamente 1 volumen de recipiente por día, aproximadamente 1,5 volúmenes de recipiente por día o más. Los métodos también implican la recogida de un medio nutriente que comprende rhC1-INH. La recogida puede realizarse a una tasa de hasta aproximadamente 0,1 volúmenes de recipiente por día, aproximadamente 0,2 volúmenes de recipiente por día, aproximadamente 0,3 volúmenes de recipiente por día, aproximadamente 0,4 volúmenes de recipiente por día, aproximadamente 0,5 volúmenes de recipientes por día, aproximadamente 1 volumen de recipiente por día, aproximadamente 1,5 volúmenes de recipientes por día o más. También se realiza la perfusión, típicamente a una tasa equivalente a la suma de la tasa de extracción y la tasa de recogida. Por ejemplo, la tasa de perfusión puede ser superior a aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2,0 volúmenes de recipiente por día. En algunas realizaciones, la tasa de perfusión es menor de aproximadamente 5,0, 4,5, 4,0, 3,5, 3,0, 2,5, 2,0, 1,5, 1,4, 1,3, 1,2, 1,1, 1,0, 0,9, 0,8, 0,7, 0,6, 0,5 volúmenes de recipiente por día. Las tasas de perfusión ejemplares se describen a lo largo de la memoria descriptiva.

Monitorización de las condiciones de cultivo

En ciertas realizaciones de la presente invención, el profesional puede encontrar beneficioso o necesario monitorizar periódicamente las condiciones particulares del cultivo celular en crecimiento. La monitorización de las condiciones del cultivo celular permite al profesional determinar si el cultivo celular está produciendo polipéptido o proteína recombinante a niveles subóptimos o si el cultivo está a punto de entrar en una fase de producción subóptima. Para monitorizar ciertas condiciones de cultivo celular, será necesario retirar pequeñas alícuotas del cultivo para su análisis.

Como ejemplo no limitativo, puede ser beneficioso o necesario monitorizar la temperatura, el pH, la densidad celular, la viabilidad celular, la densidad celular viable integrada, la osmolaridad o el título o la actividad de la proteína C1-INH expresada. En la técnica son bien conocidas numerosas técnicas que permitirán a un experto en la técnica medir estas condiciones. Por ejemplo, la densidad celular puede medirse usando un hemocitómetro, un contador Coulter o un examen de densidad celular (CEDEX). La densidad de células viables puede determinarse tiñendo una muestra de cultivo con azul de tripano. Como solo las células muertas absorben el azul de tripano, puede determinarse la densidad de células viables contando el número total de células, dividiendo el número de células que absorben el colorante por el número total de células y tomando el recíproco. Alternativamente, el nivel de la proteína C1 -INH expresada puede determinarse mediante técnicas estándar de biología molecular como la tinción de Coomassie de geles SDS-PAGE, transferencia Western, ensayos de Bradford, ensayos de Lowry, ensayos de Biuret y absorbancia UV. También puede ser beneficioso o necesario monitorizar las modificaciones postraduccionales de la proteína C1-INH expresada, incluyendo la fosforilación y la glicosilación.

Los medios celulares y las condiciones de cultivo ejemplares se describen en las secciones de Ejemplos. Los ejemplos no se pretende que sean limitativos.

Purificación de la proteína C1-INH expresada

Pueden usarse varios métodos para purificar o aislar la proteína C1-INH producida de acuerdo con varios métodos descritos en la presente. La proteína C1-INH expresada puede secretarse en el medio y, por tanto, pueden eliminarse las células y otros sólidos, por ejemplo mediante centrifugación o filtración, como un primer paso en el proceso de purificación. Alternativa o adicionalmente, la proteína C1-INH expresada se une a la superficie de la célula huésped. Las células huésped que expresan el polipéptido o la proteína pueden lisarse para su purificación. La lisis de las células huésped de mamíferos puede lograrse mediante varios medios bien conocidos por los expertos en la técnica, incluyendo la alteración física mediante perlas de vidrio y la exposición a condiciones de pH alto.

La proteína C1-INH puede aislarse y purificarse mediante métodos estándar que incluyen, pero no se limitan a, cromatografía (por ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, afinidad, exclusión por tamaño e hidroxiapatita), filtración en gel, centrifugación o solubilidad diferencial, precipitación con etanol o por cualquier otra técnica disponible para la purificación de proteínas (ver, por ejemplo, Scopes, Protein Purification Principles and Practice 2a Edición, Springer-Verlag, New York, 1987; Higgins, S. J. y Hames, B. D. (eds.), Protein Expression: A Practical Approach, Oxford Univ Press, 1999; y Deutscher, M. P., Simon, M. I., Abelson, J. N. (eds.), Guide to Protein Purification: Methods in Enzymology (Methods in Enzymology Series, Vol 182), Academic Press, 1997). Para la cromatografía de inmunoafinidad en particular, la proteína puede aislarse uniéndola a una columna de afinidad que comprende anticuerpos que se generaron contra esa proteína y se fijaron a un soporte estacionario. Alternativamente, pueden unirse etiquetas de afinidad como una secuencia de cubierta de gripe, polihistidina o glutatión-S-transferasa a la proteína mediante técnicas recombinantes estándar para permitir una fácil purificación mediante el paso por la columna de afinidad apropiada. Pueden añadirse inhibidores de proteasa como fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF), leupeptina, pepstatina o aprotinina en cualquiera o en todas las etapas para reducir o eliminar la degradación del polipéptido o la proteína durante el proceso de purificación. Los inhibidores de proteasa son particularmente deseables cuando las células deben lisarse para aislar y purificar el polipéptido o la proteína expresados.

En las secciones de Ejemplos a continuación se describen los métodos de purificación ejemplares que evitan los problemas asociados con la purificación de proteínas C1-INH. Las resinas adecuadas para la purificación incluyen, pero no se limitan a, resina de intercambio aniónico, resina de afinidad a la albúmina, resina de afinidad al inhibidor de la esterasa C1 y resina de proteína A. Puede preferirse un método de purificación que no requiera una caída en el pH. Puede preferirse un método de purificación que no requiera un pH ácido para la elución. Puede utilizarse un estabilizador que evite la agregación. En algunas realizaciones, se usa el estabilizador que previene la agregación en un método que requiere una caída del pH. Los ejemplos no limitativos de estabilizadores adecuados incluyen EDTA.

Los métodos adecuados para la purificación de las proteínas C1-INH de la invención incluyen, pero no se limitan a, los descritos en, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos N° 5.276.141; US7384754; 8.802.816; Publicaciones de PCT N° WO2012107572; y WO2013009526.

Reducción de Contaminantes

La presente divulgación también proporciona métodos para reducir los contaminantes o impurezas de proteínas no objetivo en un proceso en sentido descendente. El proceso en sentido descendente puede ser de rhC1-INH. Los contaminantes de proteínas no objetivo incluyen, por ejemplo, ADN, ARN, proteínas de células huésped (HCP) y/o virus contaminantes, y/o cualquier otra sustancia que no sea la proteína objetivo. Los contaminantes de proteínas no objetivo pueden reducirse mediante la introducción de un paso de purificación adicional en el proceso en sentido descendente de rhC1-INH. En la Figura 14 se muestra un ejemplo de un proceso en sentido descendente para rhC1-INH, sin el paso de purificación adicional.

La reducción de contaminantes por ADN, HCP y/o virus puede producirse en cualquier etapa del proceso en sentido descendente. Para reducir los contaminantes ouede usarse un absorbente de membrana de intercambio aniónico (AEX). Los ejemplos de absorbentes de membrana AEX pueden incluir Sartobind Q, Sartobind STIC y/o Natrix. La reducción de los contaminantes del ADN y/o de la proteína de la célula huésped puede producirse por la introducción de un paso de membrana de AEX después del paso de purificación de POROS XS representado en la Figura 14. La reducción del ADN, la proteína de la célula huésped y/o los contaminantes del virus puede producirse por la introducción de un paso absorbente de membrana Sartobind Q después del paso de purificación de POROS XS en el proceso en sentido descendente que se representa en la Figura 14. La reducción de los contaminantes del ADN puede producirse por la introducción de un paso absorbente de membrana Sartobind Q después del paso de purificación POROS XS en el proceso en sentido descendente representado en la Figura 14. La reducción de los contaminantes de la proteína de la célula huésped puede producirse por la introducción de un paso absorbente de membrana Sartobind Q después del paso de purificación POROS XS en el proceso en sentido descendente representado en la Figura 14. La reducción de los contaminantes de ADN puede producirse por la introducción de un paso absorbente de membrana Sartobind STIC después del paso de purificación POROS XS en el proceso en sentido descendente representado en la Figura 14. La reducción de los contaminantes de la proteína de la célula huésped puede producirse por la introducción de un paso absorbente de membrana Sartobind STIC después del paso de purificación POROS XS en el proceso en sentido descendente representado en la Figura 14.

La introducción del paso adicional de purificación de contaminantes puede afectar al rendimiento y a la pureza de rhC1-INH. Puede obtenerse un rendimiento y pureza de rhC1-INH aumentados con el uso de la membrana Sartobind Q AEX, en comparación con el uso de las membranas Sartobind STIC o Natrix. Puede obtenerse un rendimiento y pureza de rhC1 -INH aumentados con el uso de la membrana Sartobind Q AEX siguiendo el paso del proceso en sentido descendente de POROS XS.

La reducción de contaminantes puede mejorarse aún más mediante la manipulación de los parámetros de pH y/o conductividad durante el paso de purificación de la membrana AEX. Por ejemplo, reducir la conductividad a aproximadamente 5 mS/cm aumenta la reducción de contaminantes, como ADN, HCP y/o virus contaminantes. Puede lograrse una reducción aumentada de contaminantes teniendo una conductividad de aproximadamente 0,5­ 20 mS/cm. Por ejemplo, la conductividad puede ser de aproximadamente 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5.5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10,0, 10,5, 11,0, 11,5, 12,0, 12,5, 13,0, 13,5, 14,0, 14,5, 15,0, 15,5, 16,0, 16.5, 17,0, 17,5, 18,0, 18,5, 19,0, 19,5 o 20 mS/cm, o cualquier número intermedio. Puede lograrse una reducción de contaminantes aumentada teniendo una conductividad de aproximadamente 0,5-8 mS/cm. Por ejemplo, la conductividad puede ser de aproximadamente 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5 u 8,0 mS/cm, o cualquier número intermedio. En una realización, se consigue una reducción de contaminantes aumentada teniendo una conductividad de aproximadamente 3,0-6,0 mS/cm. Por ejemplo, la conductividad puede ser de aproximadamente 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0 o cualquier número intermedio.

Puede lograrse una reducción de contaminantes aumentada teniendo un pH de aproximadamente 5,0-9,0 en el paso de purificación de membrana AEX. Por ejemplo, el pH puede ser de aproximadamente 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5.4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1, 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,1, 8,2, 8,3, 8,4, 8,5, 8,6, 8,7, 8,8, 8,9 o 9,0. Puede lograrse una reducción aumentada de contaminantes teniendo un pH de aproximadamente 5,0-7,5. Por ejemplo, el pH puede ser de aproximadamente 5,0, 5,1, 5,2, 5,3, 5.4, 5,5, 5,6, 5,7, 5,8, 5,9, 6,0, 6,1,6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1,7,2, 7,3, 7,4 o 7,5.

Composiciones farmacéuticas

La presente invención proporciona además una composición farmacéutica que contiene una proteína rhC1-INH descrita en la presente y un portador fisiológicamente aceptable, como se define en las reivindicaciones. El transportador y la proteína rhC1-INH pueden ser estériles. La formulación debe adaptarse al modo de administración.

Los portadores farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, pero no se limitan a, agua, soluciones salinas (por ejemplo, NaCl), solución salina, solución salina tamponada, alcoholes, glicerol, etanol, goma arábiga, aceites vegetales, alcoholes bencílicos, polietilenglicoles, gelatina, carbohidratos como lactosa, amilosa o almidón, azúcares como manitol, sacarosa u otros, dextrosa, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, aceite de perfume, ésteres de ácidos grasos, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona, etc., así como combinaciones de los mismos. Si se desea, las preparaciones farmacéuticas pueden mezclarse con agentes auxiliares (por ejemplo, lubricantes, conservantes, estabilizantes, humectantes, emulsionantes, sales para influir en la presión osmótica, tampones, colorantes, aromatizantes y/o sustancias aromáticas y similares) que no reaccionan perjudicialmente con los compuestos activos ni interfieren con su actividad. En una realización preferida, para la administración intravenosa se usa un portador soluble en agua adecuado.

Una composición farmacéutica o medicamento adecuado, si se desea, también puede contener cantidades menores de agentes humectantes o emulsionantes, o agentes tamponadores del pH. Una composición puede ser una solución líquida, suspensión, emulsión, comprimido, píldora, cápsula, formulación de liberación sostenida o polvo. Una composición también puede formularse como un supositorio, con aglutinantes y portadores tradicionales como triglicéridos. Las formulaciones orales pueden incluir portadores estándar como grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, polivinilpirrolidona, sacarina de sodio, celulosa, carbonato de magnesio, etc.

Una composición farmacéutica o medicamento puede formularse de acuerdo con los procedimientos de rutina como una composición farmacéutica adaptada para la administración a seres humanos. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una composición para administración intravenosa típicamente es una solución en un tampón acuoso isotónico estéril. Cuando sea necesario, la composición también puede incluir un agente solubilizante y un anestésico local para aliviar el dolor en el lugar de la inyección. En general, los ingredientes se suministran por separado o mezclados en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o un concentrado libre de agua en un recipiente herméticamente cerrado, como una ampolla o una bolsita, que indica la cantidad de agente activo. Cuando la composición es para administrarse por infusión, puede dispensarse con una botella de infusión que contiene agua estéril de grado farmacéutico, solución salina o dextrosa/agua. Cuando la composición se administra por inyección, puede proporcionarse una ampolla de agua estéril para inyección o solución salina para que los ingredientes se mezclen antes de la administración.

Una proteína rhC1-INH descrita en la presente puede formularse como formas neutras o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las formadas con grupos amino libres, como los derivados de los ácidos clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., y las formadas con grupos carboxilo libres, como los derivados del sodio, potasio, amonio, calcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, etc.

Una formulación preferida comprende NaPO4 50 mM (pH 7,2), sorbitol 50 mM y glicina 150 mM. En algunas realizaciones, la formulación comprende NaPO4 aproximadamente 50 mM (pH aproximadamente 7,2), sorbitol aproximadamente 50 mM y glicina aproximadamente 150 mM. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la formulación comprende aproximadamente 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 u 80 mM de NaPO4 (pH 7,2); el pH de NaPO4 es de aproximadamente 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9 u 8,0; la concentración de sorbitol es de aproximadamente 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 u 80 mM; y la concentración de glicina es de aproximadamente 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 190, 195 o 200 mM

Otra formulación preferida comprende 70 mg/ml de rhC1-INH en glicina 150 mM, sorbitol 50 mM y tampón de fosfato de sodio 50 mM a pH 7,1. En algunas realizaciones, la formulación comprende aproximadamente 70 mg/ml de rhC1-INH en glicina aproximadamente 150 mM, sorbitol aproximadamente 50 mM y tampón de fosfato de sodio aproximadamente 50 mM a aproximadamente pH 7,1. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la concentración de rhC1-INH es de aproximadamente 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 mg/ml; la concentración de glicina es de aproximadamente 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 190, 195 o 200 mM; la concentración de sorbitol es de aproximadamente 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 u 80 mM; el tampón de fosfato de sodio es de aproximadamente 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 u 80 mM; el pH del tampón de fosfato de sodio es de aproximadamente 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1, 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, o 8.0

Otra formulación preferida comprende rhC1-INH en glicina 150 mM, sorbitol 50 mM, Arg-HCl 150 mM y tampón de fosfato de sodio 50 mM a pH 7,1. En un aspecto, la formulación tiene una mayor estabilidad a 2° C-8° C y 25° C. En algunas realizaciones, la formulación comprende rhC1-INH en glicina aproximadamente 150 mM, sorbitol aproximadamente 50 mM, Arg-HCl aproximadamente 150 mM y tampón de fosfato de sodio aproximadamente 50 mM a pH 7,1. Por ejemplo, en algunas realizaciones, la formulación comprende rhC1-INH a una concentración de aproximadamente 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 100 mg/ml; la concentración de glicina es de aproximadamente 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 190, 195 o 200 mM; la concentración de sorbitol es de aproximadamente 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 u 80 mM; la concentración de Arg-HCL es de aproximadamente 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 190, 195 o 200 mM; la concentración de fosfato de sodio es de aproximadamente 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 u 80 mM; el pH del tampón de fosfato de sodio es de aproximadamente 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1,7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9 u 8,0.

Las formulaciones pueden ser líquidas o pueden liofilizarse y reconstituirse antes de la administración. Vías de administración

Una proteína rhC1-INH descrita en la presente (o una composición o medicamento que contiene una proteína rhC1 -INH descrita en la presente) se administra por cualquier vía apropiada. En algunas realizaciones, una proteína rhC1-INH o una composición farmacéutica que contiene la misma se administra sistémicamente. La administración sistémica puede ser administración intravenosa, intradérmica, intracraneal, intratecal, por inhalación, transdérmica (tópica), intraocular, intramuscular, subcutánea, intramuscular, oral y/o transmucosal. En algunas realizaciones, una proteína rhC1-INH o una composición farmacéutica que contiene la misma se administra por vía subcutánea. Como se usa en la presente, el término "tejido subcutáneo" se define como una capa de tejido conectivo irregular suelto inmediatamente debajo de la piel. Por ejemplo, la administración subcutánea puede realizarse inyectando una composición en áreas que incluyen, pero no se limitan a, la región del muslo, la región abdominal, la región glútea o la región escapular. En algunas realizaciones, una proteína rhC1-INH o una composición farmacéutica que contiene la misma se administra por vía intravenosa. En algunas realizaciones, una proteína rhC1-INH o una composición farmacéutica que contiene la misma se administra por vía oral. En algunas realizaciones, una proteína rhC1-INH o una composición farmacéutica que contiene la misma se administra por vía intracraneal. En algunas realizaciones, una proteína rhC1-INH o una composición farmacéutica que contiene la misma se administra por vía intratecal. Si se desea, puede usarse más de una ruta concurrentemente.

En algunas realizaciones, una proteína rhC1-INH o una composición farmacéutica que contiene la misma se administra a un sujeto mediante administración intratecal. Como se usa en la presente, el término "administración intratecal" o "inyección intratecal" se refiere a una inyección en el canal espinal (espacio intratecal que rodea la médula espinal). Pueden usarse varias técnicas que incluyen, sin limitación, inyección cerebroventricular lateral a través de un orificio de perforación o punción cisternal o lumbar o similares. En algunas realizaciones, "administración intratecal" o "suministro intratecal" de acuerdo con la presente invención se refiere a la administración o suministro IT a través del área o región lumbar, es decir, administración o suministro IT lumbar. Como se usa en la presente, el término "región lumbar" o "área lumbar" se refiere al área entre la tercera y la cuarta vertebras lumbares (parte baja de la espalda) y más inclusivamente la región L2-S1 de la columna.

En algunas realizaciones, una proteína rhC1-INH o una composición farmacéutica que contiene la misma se administra al sujeto mediante administración subcutánea (es decir, por debajo de la piel). Para tales propósitos, la formulación puede inyectarse usando una jeringuilla. Sin embargo, están disponibles otros dispositivos para la administración de la formulación como dispositivos de inyección (por ejemplo, los dispositivos Inject-ease™ y Genject™); plumas inyectoras (como la GenPen™); dispositivos sin aguja (por ejemplo, MediJector™ y BioJector™); y sistemas de administración de parches subcutáneos.

En algunas realizaciones, puede usarse la administración intratecal junto con otras vías de administración (por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intramuscular, parenteral, transdérmica o transmucosal (por ejemplo, oral o nasal)).

La presente invención contempla administraciones individuales así como múltiples de una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína rhC1-INH o una composición farmacéutica que contiene la misma descrita en la presente. Una proteína rhC1-INH o una composición farmacéutica que contiene la misma puede administrarse a intervalos regulares, dependiendo de la naturaleza, gravedad y extensión del estado del sujeto (por ejemplo, angioedema hereditario). En algunas realizaciones, una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína rhC1-INH o una composición farmacéutica que contiene la misma puede administrarse periódicamente a intervalos regulares (por ejemplo, una vez al año, una vez cada seis meses, una vez cada cinco meses, una vez cada tres meses, bimensual (una vez cada dos meses), mensual (una vez cada mes), quincenal (una vez cada dos semanas), semanalmente, diariamente o de manera continua).

En algunas realizaciones, la administración produce solo un efecto localizado en un individuo, mientras que en otras realizaciones, la administración produce efectos en múltiples partes de un individuo, por ejemplo, efectos sistémicos. Típicamente, la administración da como resultado el suministro de una proteína rhC1-INH a uno o más tejidos objetivo. En algunas realizaciones, la proteína rhC1-INH se administra a uno o más tejidos objetivo que incluyen, pero no se limitan a, corazón, cerebro, piel, sangre, médula espinal, músculo estriado (por ejemplo, músculo esquelético), músculo liso, riñón, hígado, pulmón y/o bazo. En algunas realizaciones, la proteína rhC1-INH se administra al corazón. En algunas realizaciones, la proteína rhC1-INH se administra al sistema nervioso central, particularmente al cerebro y/o la médula espinal. En algunas realizaciones, la proteína rhC1-INH se administra al tríceps, tibial anterior, sóleo, gastrocnemio, bíceps, trapecio, deltoides, cuádriceps y/o diafragma.

Formas de dosificación y régimen de dosificación

En algunas realizaciones, una composición se administra en una cantidad terapéuticamente eficaz y/o de acuerdo con un régimen de dosificación que se correlaciona con un resultado deseado particular (por ejemplo, con la profilaxis de una enfermedad crónica mediada por el complemento, como el HAE).

Las dosis o cantidades particulares a administrar de acuerdo con la presente invención pueden variar, por ejemplo, dependiendo de la naturaleza y/o el alcance del resultado deseado, de los detalles de la vía y/o la cadencia de la administración, y/o de una o más características (por ejemplo, peso, edad, historial personal, característica genética, parámetro de estilo de vida, gravedad del defecto cardíaco y/o nivel de riesgo de defecto cardíaco, etc., o combinaciones de los mismos). Tales dosis o cantidades pueden ser determinadas por los expertos en la técnica. En algunas realizaciones, se determina una dosis o cantidad apropiada de acuerdo con técnicas clínicas estándar. Alternativa o adicionalmente, en algunas realizaciones, una dosis o cantidad apropiada se determina mediante el uso de uno o más ensayos in vitro o in vivo para ayudar a identificar intervalos de dosificación deseables u óptimos o cantidades a administrar.

En varias realizaciones, se administra una proteína rhC1-INH en una cantidad terapéuticamente eficaz. Generalmente, una cantidad terapéuticamente eficaz es suficiente para lograr un beneficio significativo para el sujeto (por ejemplo, profilaxis, tratamiento, modulación, curación, prevención y/o mejora de la enfermedad o afección subyacente). Generalmente, la cantidad de un agente terapéutico (por ejemplo, una proteína rhC1 -INH) administrada a un sujeto con necesidad de ello dependerá de las características del sujeto. Tales características incluyen el estado, la gravedad de la enfermedad, la salud general, la edad, el sexo y el peso corporal del sujeto. Un experto normal en la técnica podrá determinar fácilmente las dosificaciones apropiadas dependiendo de estos y otros factores relacionados. Además, pueden emplearse opcionalmente ensayos tanto objetivos como subjetivos para identificar intervalos de dosificación óptimos. En algunas realizaciones particulares, pueden extrapolarse las dosis o cantidades apropiadas a administrar a partir de curvas de respuesta a la dosis derivadas de sistemas de prueba in vitro o de modelos animales.

En algunas realizaciones, se proporciona una composición como una formulación farmacéutica. En algunas realizaciones, una formulación farmacéutica es o comprende una cantidad de dosis unitaria para la administración de acuerdo con un régimen de dosificación correlacionado con el logro de la incidencia o el riesgo reducidos de un ataque de HAE.

En algunas realizaciones, una formulación que comprende una proteína rhC1-INH descrita en la presente se administra como una dosis individual. En algunas realizaciones, una formulación que comprende una proteína rhC1-INH descrita en la presente se administra a intervalos regulares. La administración en un "intervalo", como se usa en la presente, indica que la cantidad terapéuticamente eficaz se administra periódicamente (a diferencia de una dosis única). El intervalo puede determinarse mediante técnicas clínicas estándar. En algunas realizaciones, una formulación que comprende una proteína rhC1-INH descrita en la presente se administra cada dos meses, mensualmente, dos veces al mes, cada tres semanas, cada dos semanas, semanalmente, dos veces por semana, tres veces por semana, diariamente, dos veces al día o cada seis horas. No es necesario que el intervalo de administración para un solo individuo sea un intervalo fijo, sino que puede variar con el tiempo, dependiendo de las necesidades del individuo.

Una cantidad terapéuticamente eficaz se administra comúnmente en un régimen de dosificación que puede comprender múltiples dosis unitarias. Para cualquier proteína terapéutica particular, una cantidad terapéuticamente eficaz (y/o una dosis unitaria apropiada dentro de un régimen de dosificación eficaz) puede variar, por ejemplo, dependiendo de la vía de administración, en combinación con otros agentes farmacéuticos. Además, la cantidad terapéuticamente eficaz específica (y/o la dosis unitaria) para cualquier paciente en particular puede depender de una variedad de factores que incluyen el trastorno que se está tratando y la gravedad del trastorno; la actividad del agente farmacéutico específico empleado; la composición específica empleada; la edad, peso corporal, salud general, sexo y dieta del paciente; el momento de la administración, la vía de administración, y/o tasa de excreción o metabolismo de la proteína específica empleada; la duración del tratamiento; y factores similares como es bien conocido en las técnicas médicas.

Como se usa en la presente, el término "bimestral" significa administración una vez cada dos meses (es decir, una vez cada dos meses); el término "mensual" significa administración una vez al mes; el término "cada tres semanas" significa administración una vez cada tres semanas (es decir, una vez cada tres semanas); el término "cada dos semanas" significa administración una vez cada dos semanas (es decir, una vez cada dos semanas); el término "semanal" significa administración una vez por semana; y el término "diario" significa administración una vez al día.

En algunas realizaciones, una formulación que comprende una proteína rhC1-INH descrita en la presente se administra a intervalos regulares indefinidamente. En algunas realizaciones, una formulación que comprende una proteína rhC1-INH descrita en la presente se administra a intervalos regulares durante un período definido.

Debe entenderse además que para cualquier sujeto en particular, los regímenes de dosificación específicos deben ajustarse con el tiempo de acuerdo con la necesidad individual y el juicio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de la terapia de reemplazo enzimático y que los intervalos de dosificación expuestos en la presente son solamente ejemplares y no se pretende que limiten el alcance o la puesta en práctica de la invención reivindicada.

Terapia de combinación

En algunas realizaciones, una proteína rhC1-INH se administra en combinación con uno o más agentes terapéuticos conocidos (por ejemplo, corticosteroides) usados actualmente para el tratamiento de una enfermedad mediada por el complemento. En algunas realizaciones, el agente o agentes terapéuticos conocidos se administran de acuerdo con su régimen y/o programa de dosificación estándar o aprobado. En algunas realizaciones, el agente o agentes terapéuticos conocidos se administran de acuerdo con un régimen que se altera en comparación con su régimen y/o programa de dosificación estándar o aprobado. En algunas realizaciones, dicho régimen alterado difiere del régimen de dosificación estándar o aprobado en que se alteran una o más dosis unitarias (por ejemplo, se reducen o aumentan) en cantidad, y/o en que se altera la frecuencia de la dosificación (por ejemplo, en que se amplían uno o más intervalos entre las dosis unitarias, lo que da como resultado una frecuencia más baja, o se reduce, los que da como resultado una frecuencia más alta).

Trastornos

En algunas realizaciones, las proteínas recombinantes proporcionadas por la invención son adecuadas para su uso en un método de tratamiento de ataques agudos asociados con trastornos mediados por el complemento, por ejemplo, eventos NMOSD, AMR o HAE. Estos ataques pueden ser largos o cortos. En algunas realizaciones, la enfermedad o trastorno es crónico. En algunas realizaciones, las composiciones y los métodos de la invención se usan profilácticamente. Las enfermedades mediadas por el complemento ejemplares que pueden tratarse en métodos que usan las composiciones y los métodos divulgados en la presente incluyen, pero no se limitan a, angioedema hereditario, rechazo mediado por anticuerpos, trastornos del espectro de la neuromielitis óptica, lesión cerebral traumática, lesión de la médula espinal, lesión cerebral isquémica, lesión por quemadurad, necrólisis epidérmica tóxica, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), enfermedad de Parkinson, ataque cerebral, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP), miastenia gravis, neuropatía motora multifocal.

EJEMPLOS

Ejemplo 1: Expresión transitoria de C1-INH humano recombinante

Su usó la secuencia de aminoácidos de C1-INH derivado de plasma humano para crear una secuencia de nucleótidos optimizada para CHO. Luego esta secuencia se insertó en un vector de expresión pXLG6 y se transfectó en células CHO.

Se probaron dos métodos diferentes de transfección (HD1 y HD2) y dos temperaturas de cultivo diferentes (31° C y 37° C). Tanto para HD1 como para HD2, el día de la transfección, las células se pasaron a medio de crecimiento fresco y se añadió a las células una mezcla de polietilenimina lineal de PM 25.000 (PEI) y ADN. Todas las transfecciones mostraron buena viabilidad y buena eficiencia de transfección. Se usaron ensayos ELISA de antígeno y actividad de C1-INH para determinar los títulos de proteína activa en el sobrenadante del cultivo celular.

El inhibidor de C1 se expresó a niveles altos (>200 mg/l) para todas las condiciones probadas. La combinación de HD2 y Solución dio como resultado inesperadamente niveles de expresión muy altos (>600 mg/l). A 37° C, esta condición puede llegar a más de 1000 mg/l en el día 5, que es sorprendentemente alta considerando el corto período de tiempo disponible para la expresión. A 31° C, los títulos observados son generalmente más bajos, pero todavía superiores a 600 mg/l.

Ejemplo 2: Establecimiento de clones estables que producen el inhibidor C1

Se usó una línea celular CHO adaptada a cultivo en suspensión y condiciones de crecimiento libres de suero como línea celular original para generar y desarrollar líneas celulares que expresan establemente C1-INH humano recombinante.

La línea celular CHO original se transfectó con pXLG6-C1-INH mediante transfección química usando tanto HD1 como HD2. Se seleccionaron grupos de células recombinantes durante varios días con puromicina y se analizaron sus niveles de expresión de rhC1-INH. Luego, se generaron poblaciones clónales limitando las diluciones de los grupos. Se eligieron los grupos N° 1 y 12 para su uso en la producción de líneas celulares clonales debido a la combinación de alto nivel de expresión y altas relaciones de actividad/antígeno.

Partiendo de los grupos N° 1 y 12, se realizó la clonación de células individuales usando un método de dilución limitante en placas de 96 pocillos. Se midieron regularmente la densidad celular, la viabilidad y la productividad. Se seleccionaron los clones N° 1 y 31 para desarrollo adicional en base a la alta productividad, la calidad del rhC1-INH expresado y la estabilidad.

Ejemplo 3: Optimización del cultivo celular

Para identificar una combinación robusta de clon/medio, por ejemplo, alta productividad volumétrica y grado deseado de sialilación, para el desarrollo de un proceso de producción escalable, se realizó un estudio de selección de medios de 40 medios comerciales utilizando los clones N° 1 y 31.

Dependiendo del medio de cultivo usado, el Clon N° 1 pudo producir aproximadamente 1000-1200 mg/l de C1-INH recombinante, mientras que el Clon N° 31 produjo aproximadamente 600-800 mg/l. Sin embargo, la sialilación del C1-INH producida por el Clon N° 31 parecía más similar al C1-INH derivado de plasma que al C1-INH producido por el Clon N° 1. Por consiguiente, se seleccionó el Clon No. 31 para un desarrollo adicional.

Ejemplo 4: Optimización de medios y solución

Se estudiaron cuatro soluciones para evaluar su efecto sobre el crecimiento celular y la expresión de C1-INH. Estas fueron: Feed3, PW2, Pep1510 y Pep4601, descritos en la Tabla 1. La viabilidad celular y los títulos se midieron el día 7 y el día 10 para cada condición. Una mezcla de Feed3 y Pep1510 (Feed3: Pep1510 (v/v) = 9:1) maximizó tanto el título como la viabilidad en las condiciones de cultivo del experimento.

Tabla 1: Com onentes de la solución

Se probaron tres medios, detallados en la Tabla 2, seleccionados en base a los resultados de la selección descrita en el Ejemplo 3 en combinación con soluciones para identificar las condiciones de cultivo que maximizan la calidad de las proteínas. Los experimentos se realizaron en biorreactores MaxiTubeSpin® (MTS) en las combinaciones descritas en la Tabla 3. Los cultivos se monitorizaron y suplementaron para mantener niveles adecuados de glucosa y bicarbonato.

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Estos medios se probaron en combinación con soluciones para identificar las condiciones de cultivo que maximizan la calidad de las proteínas. Los experimentos se realizaron en biorreactores MaxiTubeSpin® (MTS) en las condiciones descritas en la Tabla 3. Los cultivos se monitorizaron y suplementaron para mantener niveles adecuados de glucosa y bicarbonato.

T l : m in i n m i l i n r

continuación

El día 3, se usaron las células cultivadas en cada condición para iniciar un cultivo satélite TubeSpin® para probar el efecto de la temperatura (31° C, 34° C y 37° C) sobre la calidad y productividad de las proteínas. El día 10, se midieron las densidades y viabilidades de células viables en estos cultivos satélite usando un citómetro de flujo. Para cada condición se tomaron muestras de CCS para su análisis posterior. Los datos indicaron que las condiciones de uso de PowerCHO 1 maximizaron la cantidad y la calidad del producto.

Ejemplo 5: Producción de inhibidor C1 recombinante a gran escala

Varias series de producción evaluaron varios parámetros para optimizar la producción a gran escala de C1-INH por el Clon N° 31. Se descubrió que la mezcla óptima para alimentar el cultivo era 9 volúmenes de INMEDIAte ADVANTAGE (en la presente referenciado como "Solución3") (Sigma (SAFC), N° de catálogo 8383C) para un volumen de HyPep1510 (en la presente referenciado como "Pep1510") (Sheffield Bioscience, N° de catálogo 5X59053, 200 g/l en agua). Usando la combinación Solución3+Pep1510 en combinación con el medio PowerCH01, se logró un rendimiento de aproximadamente 1,3 g/l (90% de viabilidad) el día 10 y aproximadamente 2,0 g/l (87% de viabilidad) el día 14. Para minimizar la PCO2 y la osmolalidad, el control de pH fue HCl/carbonato. Se roció continuamente una mezcla de aire CO2 al 5% a 0,03 vvm y el pH se mantuvo en 7,2.

Mientras se reutilizaba la misma densidad de siembra y esquema de control de pH, se diseñó otra serie de biorreactores para explorar la posibilidad de reemplazar Solución3, una solución compleja no definida químicamente, con PowerFeed A (en la presente referenciado como "PW2"), (Lonza, N° de catálogo BE02-044Q), una solución químicamente definida. Para todos los reactores se usó una densidad de siembra de 0,5 x 106 células/ml. Sorprendentemente, como se muestra en la Tabla 4, los resultados del título de producción obtenidos usando PW2 estuvieron muy por debajo de las expectativas.

Otras dos combinaciones probadas de medio/solución produjeron buenos resultados: CDCIM/(solución equilibrada suplemento de solución): 1,2 g/l (94% de viabilidad) el día 10 y 2,6 g/l (92% de viabilidad) el día 14 y CDCIM+CB/solución C: 1,0 g/l (98% de viabilidad) el día 10 y 2,0 g/l (82% de viabilidad) el día 14.

En general, todas las condiciones se comportaron extremadamente bien. Se obtuvieron densidades celulares más altas cuando se usó Cell Boost y Solución C, mientras que los títulos más altos se lograron, al final de los 14 días, sin Cell Boost y con Solución equilibrada. El día 10, las diferencias en los títulos no fueron significativas. Por lo tanto, para un proceso de 1 g/l, podrían usarse ambos procesos.

En general, los datos generados demostraron que una línea celular ejemplar de la invención puede producir, en un proceso por lotes de alimentación bien optimizado, rendimientos para el inhibidor de C1 que superan el nivel de 2 g/litro. De manera importante, como lo demuestran los ejemplos a continuación, el proceso de cultivo celular de alto título se logró mientras se mantenían los atributos de calidad del producto deseados: en particular, la sialización requerida para lograr una vida media similar o más prolongada que la del C1-INH humano derivado de plasma.

Ejemplo 6: Purificación del inhibidor de C1 recombinante

Un proceso para purificar rhC1-INH expresado por las células puede incluir la concentración de la recolección, seguido de la inactivación viral de la recolección concentrada usando un tratamiento con detergente solvente (SD), tres pasos de purificación cromatográfica en sentido descendente, un paso de reducción del filtro viral y un paso de concentración/diafiltración final. La Figura 2 representa un proceso ejemplar para la purificación de rhC1-INH.

A continuación en la Tabla 5 se proporcionan los parámetros operativos de la cromatografía ejemplares para la cromatografía AEX que usa Gigacap Q.

Las condiciones de cromatografía definidas están diseñadas para mejorar la calidad del producto eliminando las impurezas del proceso y enriqueciendo los glicanos sialilados. En la Figura 3 se muestra un perfil de elución ejemplar junto con la correspondiente separación de especies neutras y sialiladas (Tabla 6). Además, como se muestra en la Figura 4, el paso de intercambio aniónico desarrollado es capaz de separar impurezas del proceso, como las proteínas de la célula huésped (HCP).

T l : T l ri l r i n m l r i n r i lil

A continuación en la Tabla 7 se proporcionan los parámetros operativos de cromatografía para optimizar la calidad del producto usando la cromatografía catiónica con POROS XS.

Tabla 7: Parámetros de funcionamiento de la cromato rafía.

Las condiciones operativas definidas están diseñadas para mejorar la calidad del producto eliminando los contaminantes del producto y enriqueciendo el perfil de glicosilación deseado. En la Figura 6 se muestra la reducción del contenido de HCP después de la elución de Poros XS. La Figura 5 representa un perfil de elución ejemplar de Poros XS que demuestra el enriquecimiento de las especies de glicanos sialiladas deseadas. En la Tabla 8 se muestra el enriquecimiento de las especies de glicanos sialiladas deseadas por Poros XS.

Ejemplo 7: Análisis de glicanos del inhibidor de C1 recombinante

Aproximadamente el 50% del peso molecular intacto de C1-INH es glicano. Hay seis (6) sitios N-enlazados (tres en el dominio serpina (Asn216, Asn231, Asn330) y 3 en el dominio N-terminal (Asn3, Asn47, Asn59) y ocho (8) sitios O-enlazados, todos en el dominio N-terminal (Ser42, Thr25, Thr26, Thr49, Thr61, Thr66, Thr70, Thr74).

De acuerdo con los métodos descritos en la presente se desarrollaron y/o evaluaron varios métodos analíticos para caracterizar la distribución de N-glicanos y O-glicanos en el inhibidor de C1 recombinante expresado por células CHO. También se usó como comparador un C1-INH humano derivado de plasma comercialmente disponible. Estos métodos son métodos ejemplares para analizar la glicosilación y no se pretende que sean limitativos de ninguna manera.

Cada método requería los pasos previos al ensayo de eliminación de glicanos de la proteína, derivatización de glicanos con un fluoróforo, por ejemplo, ácido 2-aminobenzoico (2-AA), eliminación del exceso de reactivos de derivatización mediante extracción en fase sólida y caracterización de los glicanos marcados resultantes.

1. Análisis de N-glicanos mediante HPLC de intercambio aniónico/fase normal en modo mixto (NP/AE)

Se usó análisis de N-glicanos (NGA) mediante cromatografía de intercambio aniónico/fase normal en modo mixto (NP/AE) para proporcionar un perfil del contenido de glicanos N-enlazados de rhC1-INH, mediante la separación de los glicanos marcados en base principalmente a la carga (debido al contenido de ácido siálico), pero también por el tamaño, la composición de oligosacáridos y los enlaces. Los picos eluidos se agruparon aproximadamente en "grupos de carga" en base al contenido de ácido siálico, mientras que los picos dentro del grupo de carga varían en tamaño, composición de oligosacáridos o enlaces. Se realizaron separaciones de gradiente usando un sistema de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) equipado con un detector de fluorescencia. La integración del cromatograma resultante permitió una cuantificación reproducible de la distribución relativa de N-glicanos, en base al contenido de ácido siálico. ¡Error! Fuente de referencia no encontrada. La Figura 7 presenta un perfil de ejemplo para rhC1-INH, con los grupos de picos marcados en base al contenido de ácido siálico. La identidad de los grupos de picos observados se confirmó mediante espectrometría de masas MALDI-TOF fuera de línea de las fracciones de picos recopiladas (Figura 8).

A modo de comparación, en la Figura 9 se muestra el perfil de glicanos para C1 -INH derivado de plasma.

2. Análisis de N-glicanos por HPLC de interacción hidrófila (HILIC)

El análisis de N-glicanos (NGA) usando cromatografía líquida de interacción hidrófila (NGA-HILIC) proporcionó un perfil de alta resolución del contenido de glicanos N-enlazados de C36, en base principalmente al tamaño de los glicanos, pero también en base al contenido y el enlace de los monosacáridos. Las separaciones de gradiente se realizaron usando un sistema de cromatografía líquida de alto rendimiento equipado con un detector de fluorescencia. La integración del cromatograma resultante permitió una cuantificación reproducible de la distribución relativa de N-glicanos.

La Figura 10 presenta un cromatograma de rhC1-INH HILIC representativo con identidades de picos obtenidas de la evaluación LC/MS en línea. La naturaleza resuelta del valor de referencia del cromatograma permite el cálculo de los niveles relativos de diferentes atributos de glicanos, como fucosilación, antenariedad, sialilación y niveles de galactosa terminal.

Los resultados obtenidos de NGA por cromatografía en modo mixto y HILIC fueron similares para glicanos con de 1 a 4 ácidos siálicos.

3. Análisis de N y O glicanos por HPLC de interacción hidrófila (HILIC)

El análisis de O-glicanos se realizó usando el reactivo de liberación ORELA (Ludger Ltd.). La liberación química de glicanos usando el reactivo ORELA da como resultado una muestra de glicanos compuesta de glicanos enlazados a asparagina (N-enlazados) y enlazados a serina/treonina (O-enlazados). El análisis de una muestra de prueba generada con el reactivo ORELA se compara con una muestra generada usando PNGasa F, de tal manera que el perfil de glicanos totales puede compararse con el perfil de glicanos N-enlazados (solo). Por lo tanto, los picos de glicanos adicionales representan la contribución de los sitios de glicosilación O-enlazados en rhC1-INH. Este análisis se realiza mediante cromatografía de interacción hidrófila (HILIC).

El método de cromatografía HILIC permite la separación de los glicanos marcados en base principalmente al tamaño, pero también del contenido de monosacáridos y enlace. Como resultado, los glicanos O-enlazados que se observan con más frecuencia deberían eluirse temprano en el cromatograma y no deberían coeluirse con los glicanos N-enlazados. Este método utiliza una columna UPLC con un tamaño de partícula de 1,7 pm. Las separaciones de gradiente pueden realizarse usando un sistema HPLC o UPLC equipado con un detector de fluorescencia.

Los nuevos picos observados en la muestra de ORELA representarán glicanos O-enlazados, que pueden identificarse usando o cromatografía líquida de iones negativos/espectrometría de masas (LC/MS) en línea o recogerse y someterse a ionización por desorción láser asistida por matriz fuera de línea-espectrometría de masas de tiempo de vuelo (MALDI-TOF).

La liberación de los glicanos N- y O-enlazados se realizó usando el reactivo de liberación ORELA, como se ha descrito anteriormente. La derivatización de los glicanos N- y O-enlazados se realizó usando 2-AA como marcador fluorescente. Se realizó la evaluación del perfil de glicanos N-enlazados, con desglicosilación de glicanos N-enlazados mediante digestión con PNGasa-F para comparar los perfiles cromatográficos. La Figura 11 presenta los perfiles obtenidos para el perfil de N-glicanos (PNGasa-F) y el perfil de N+O-glicanos (desglicosilación de ORELA) para una muestra representativa de rhC1 -INH. Como se muestra en la Figura 11, se observó un nuevo pico significativo a un tiempo de retención de 16 minutos y un pico más pequeño a aproximadamente 5 minutos. Se observaron picos adicionales eluidos más tarde que coincidían con los tiempos de retención de los glicanos observados en el perfil N-enlazado.

La evaluación de la identidad de los nuevos picos se realizó usando análisis LC/MS en línea en modo de iones negativos. Los resultados de este análisis confirmaron la identificación de los nuevos picos como O-glicanos Core-1 con 1 o 2 ácidos siálicos (Core-1 = N-acetilhexosamina hexosa (HexNAC/Hex)). Es notable que el O-glicano Core-1 con dos ácidos siálicos se observó en dos picos. La razón de esto no está determinada, pero puede estar relacionada con las diferencias en el enlace entre los componentes del glicano. Los resultados observados en el análisis de N+O-glicanos están de acuerdo con las observaciones del mapeo de péptidos de rhC1-INH después de la desialilación, donde se observaron glicopéptidos con O-glicosilación esperada como la forma HexNAC/Hexmodificada.

Ejemplo 8: Análisis estructural de rhC1-INH

Se caracterizó la estructura de una proteína rhC1-INH ejemplar usando una variedad de métodos fisicoquímicos. La estructura primaria y las modificaciones postraduccionales se evaluaron mediante mapeo de péptidos LCMS, MS/MS de rhC1-INH des-N-glicosilado. El método confirmó la secuencia de aminoácidos predicha, que incluye una única diferencia de aminoácidos con respecto al C1-INH de tipo salvaje (E165Q). Los glicanos O­ enlazados se identificaron mediante este método y se confirmaron ortogonalmente a través del mapeo de glicanos en base a LC.

Se emplearon métodos adicionales para evaluar la glicosilación, la sialilación y la distribución global de la carga. Se demostró que los glicanos de rhC1-INH consisten principalmente de glicanos complejos N-enlazados y estructuras O-enlazadas Core-1 di- y trisialiladas a través del mapeo de glicanos en los N- y O-glicanos liberados. El análisis también muestra que no había presentes estructuras de a-galactosa potencialmente inmunogénicas. Los altos niveles de ácido N-acetilneuramínico (NANA) se confirmaron con un ensayo de contenido de ácido siálico, y estos datos son consistentes con los perfiles de glicanos observados y la distribución de pI. La evaluación general de carbohidratos también se alinea con la evaluación de masa intacta, lo que indica un alto grado de glicosilación en la molécula.

La masa intacta media se determinó mediante MALDI-MS y el resultado se comparó con la masa teórica del polipéptido no modificado. La diferencia entre la masa teórica y la medida representa el contenido de carbohidratos y es consistente con el inhibidor de esterasa C1 derivado del plasma. También se investigaron el peso molecular aparente y la distribución de tamaño de rhC1-INH mediante SDS-PAGE y cromatografía de exclusión por tamaño, respectivamente. La estructura de orden superior de rhC1-INH se evaluó mediante DSC y se determinó que era comparable al inhibidor de esterasa C1 derivado del plasma.

Se evaluó la potencia del C1-INH recombinante usando un ensayo enzimático biológicamente relevante frente al estándar internacional y también con respecto al estándar de referencia de desarrollo inicial, que indicó que la molécula recombinante es completamente funcional. Una variedad de métodos han demostrado ser capaces de monitorizar estas vías. Acumulativamente, estos estudios han permitido dilucidar la estructura de rhC1-INH confirmando la estructura primaria y proporcionando una evaluación de la actividad biológica, el perfil de glicosilación, las modificaciones postraduccionales y la estructura de orden superior de la molécula. Además, estos estudios han demostrado que, aunque la rhC1 -INh tiene una estructura de glicosilación diferente del C1-INH derivado del plasma, inesperadamente, rhC1-INH muestra una actividad similar o mejor y propiedades farmacocinéticas similares o mejores, incluyendo la vida media, que el C1-INH derivado de plasma.

Ejemplo 9: Ensayo de unión funcional del inhibidor de C1 recombinante

La actividad de la proteína rhC1-INH puede evaluarse usando un kit de diagnóstico cromogénico, como el kit de reactivos TECHNOCHROM® C1-INH (Technoclone, Viena, Austria). Este kit de diagnóstico comercial se volvió a desarrollar en un ensayo cromogénico de curva completa para medir la potencia de rhC1-INH frente al estándar internacional y también con respecto a un estándar de referencia.

Se determinó que la potencia de un lote de sustancia farmacológica de rhC1 -INH ejemplar era de 7,2 U/mg, con una potencia con respecto al estándar de referencia de desarrollo inicial del 121%. Este ensayo de inhibición de la esterasa C1 cromogénica también se usó para determinar la potencia de rhC1-INH en varias muestras tomadas de series de producción y estudios de degradación forzada descritos en la presente. Se ha observado que el C1-INH derivado de plasma tiene una actividad específica de punto medio de aproximadamente 7 U/mg. La actividad específica de varios lotes de rhC1-INH varió entre 7,1 y 7,3 U/mg. No se observaron diferencias significativas en los valores de actividad específica para lotes de rhC1-INH en comparación con Cinryze®.

Ejemplo 10: Formulación y estabilidad del inhibidor de C1 recombinante

En una realización, se preparó una solución acuosa que contenía 70 mg/ml de rhC1-INH en glicina 150 mM, sorbitol 50 mM y tampón de fosfato de sodio 50 mM a pH 7,1. La concentración de proteína se basó en el perfil de solubilidad y estabilidad de rhCl-INH y se seleccionó para proporcionar la dosis clínica máxima. La elección de fosfato de sodio 50 mM a pH 7,1 estuvo respaldada por la estabilidad bajo estrés térmico. La selección de glicina 150 mM y sorbitol 50 mM se realizó para obtener la isotonicidad apropiada para la administración intravenosa y subcutánea, así como la estabilidad de proteínas óptima.

Se demostró que esta formulación ejemplar tiene una solubilidad y estabilidad adecuadas de rhC1 -INH para almacenamiento a largo plazo (por lo menos 12 meses) a < -65° C y para su uso en el entorno clínico de administración parenteral mediante inyección intravenosa o subcutánea. También se descubrió que esta formulación ejemplar era estable, según lo establecido por análisis estructurales y funcionales (por ejemplo, potencia), a temperatura ambiente durante por lo menos un mes, y estable a 2° C-8° C durante por lo menos seis meses.

La formulación de rhC1-INH se refinó aún más para optimizar la estabilidad a 2° C-8° C y 25° C. Esta formulación refinada contenía rhC1 -INH en glicina 150 mM, sorbitol 50 mM, Arg-HCl 150 mM y tampón de fosfato de sodio 50 mM a pH 7,1. El perfil de agregación de las formulaciones refinadas y ejemplares se monitorizó mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) a 2° C-8° C y 25° C durante tres meses. Los datos de SEC en estas condiciones de almacenamiento mostraron que el nivel de agregados de alto peso molecular (HMW) fue significativamente menor en la formulación refinada. (Ver Figura 13).

Ejemplo 11: Estudios ^{in v iv o} de rhC1 -INH

Se inyectó a conejos C1-INH derivado de plasma o rhC1-INH. El rhC1-INH tenía un perfil de glicosilación del 10-20% de glicanos neutros, aproximadamente el 26% de glicanos monosialilados, aproximadamente el 35% de glicanos disialilados, aproximadamente el 17% de glicanos trisialilados y aproximadamente el 5% de glicanos tetrasialilados. Los resultados del estudio PK en conejos se muestran en la Figura 13.

El análisis de los datos PK indicó que el rhC1-INH mostraba una vida media ligeramente mayor en comparación con el C1-INH derivado del plasma.

Se descubrió que la potencia biológica de rhC1-INH era similar a la de C1-INH derivado de plasma, según se evaluó mediante la comparación de la vida media y numerosos parámetros del complemento. Por consiguiente, rhC1-INH es adecuado para dosificar en cantidades y concentraciones iguales o similares a las de C1-INH derivado de plasma y para su uso en el tratamiento de las mismas indicaciones.

Ejemplo 12: Estudios de seguridad preclínicos

En un estudio de toxicidad en ratas/TK de 14 días período de recuperación de 14 días, se les administraron a ratas dosis de 500, 1000 o 2000 U/kg/día de rhC1-INH formulado como una solución acuosa que contenía 70 mg/ml de rhC1-INH en glicina 150 mM, sorbitol 50 mM y tampón de fosfato de sodio 50 mM a pH 7,1. Cada grupo contenía 10 ratas. Todos los animales sobrevivieron. No se observaron efectos relacionados con rhC1-INH sobre el peso corporal, el consumo de alimentos o los parámetros de patología clínica (hematología, coagulación, química sérica y análisis de orina). No se observaron descubrimientos oftálmicos relacionados con rhC1-INH, observaciones macroscópicas, alteración en el peso de los órganos o cambios histológicos. Se detectaron anticuerpos antifármacos, pero no fueron neutralizantes y no afectaron a la exposición. El nivel sin efecto adverso observado (NOAEL) fue de 2000 U/kg/día, la dosis más alta probada.

En un estudio de toxicidad/TK de 14 días en primates no humanos (NHP) período de recuperación de 14 días, se les administraron a monos cynomolgus dosis de 250, 500 o 1000 U/kg/día de rhC1 -INH formulado como una solución acuosa que contenía 70 mg/ml de rhC1-INH en glicina 150 mM, sorbitol 50 mM y tampón de fosfato de sodio 50 mM a pH 7,1. Cada grupo contenía 4 monos. Todos los animales sobrevivieron. No se produjeron efectos relacionados con rhC1-INH sobre el peso corporal u otras observaciones clínicas relacionadas. No se observaron descubrimientos oftálmicos, electrocardiográficos, macroscópicos o microscópicos relacionados con rhC1-INH ni cambios en el peso de los órganos.

En resumen, los datos no clínicos en animales indican que el rhC1-INH descrito es bien tolerado y seguro para su evaluación en humanos.

Ejemplo 13: Reducción de Contaminantes

Este ejemplo detalla el desarrollo de un paso de reducción de contaminantes (por ejemplo, ADN y/o proteína de la célula huésped) para la purificación de una proteína inhibidora de C1 humana recombinante (rhC1-INH). En la Figura 14 se muestra una descripción general del proceso en sentido descendente actual.

Se evaluaron absorbentes de membrana de intercambio aniónico (Sartobind Q, Sartobind STIC y Natrix) con respecto a proporcionar una depuración de ADN adicional para el proceso en sentido descendente representado en la Figura 14. A continuación se presentan datos que muestran que los absorbentes de membrana de intercambio aniónico (AEX) (Sartobind Q y Sartobind STIC) son pasos del proceso adecuados para la reducción de contaminantes, incluyendo la reducción de ADN, después del tercer paso de cromatografía (es decir, POROS XS (CEX)) de un proceso en sentido descendente de rhC1-INH (ver Figura 14). En base a los estudios de enriquecimiento de ADN, que se detallan a continuación, con ADN de CHO, Sartobind Q tuvo rendimientos de proceso superiores, en comparación con Sartobind STIC. El Sartobind Q tuvo rendimientos de proceso de más del 90% y una depuración de ADN de más de 4,1 log. La depuración de proteínas de la célula huésped medido tanto para Sartobind Q como para Sartobind STIC fue mínimo (<1 log).

Materiales, métodos y equipos generales

Determinación del contenido de proteínas por espectrofotometría UV

La concentración de proteínas para todas las muestras que no contenían medios acondicionados se determinó usando la absorbancia medida a 280 nm y el coeficiente de extinción, £280 = 0,514 ml/(mg x cm).

TME-0499-01, ELISA Genérico de Proteína de Células de Ovario de Hámster Chino (CHOP) - 3a Generación Las muestras analizadas en el proceso de desarrollo usaron TME-0499 para determinar la cantidad de proteína de células CHO en las muestras. Este método usó el kit de proteína de células huésped de ovario de hámster chino de 3a generación fabricado por Cygnus Technologies, número de catálogo F550.

Concentración de ADN

El análisis de ADN de CHO se realizó inicialmente por Pico Green. Este método es una tinción de ácidos nucleicos fluorescente ultrasensible. Las muestras que pueden contener ADNdc se diluyen primero hasta un volumen final de 1,0 ml en tampón TE en una cubeta desechable. Se realizan diluciones de la muestra experimental para disminuir el efecto de interferencia de ciertos contaminantes (por ejemplo, NaCl). Luego, se añade a la cubeta 1,0 ml de solución de trabajo acuosa del reactivo Quant-IT PicoGreen y se incuba, protegida de la luz, durante 2 a 5 minutos. La fluorescencia de la muestra se mide en un espectrofluorómetro y longitudes de onda estándar de fluoresceína (excitación ~480nm, emisión ~520nm). La cuantificación precisa se logra comparando la señal de las incógnitas con los estándares de ADNdc analizados al mismo tiempo. El análisis de ADN de CHO también se realizó mediante qPCR.

Desarrollo de pasos de reducción de ADN

La Tabla 9 muestra los niveles históricos de ADN para los productos intermedios del proceso y el volumen final para el desarrollo de rhC1-INH. Los datos indicaron que los niveles de ADN eran inferiores a los detectables después del primer paso de la columna en el proceso. Sin embargo, después de la concentración del volumen final hasta 70 g/l, todas las series tenían niveles medibles de ADN.

En base a una dosificación típica de la sustancia farmacológica a granel de 70 mg/ml, se recomienda un objetivo de <14 ng de ADN/mg.

Ta al.

Se probaron tres absorbentes de intercambio aniónico (AEX) para determinar su capacidad para reducir los contaminantes, específicamente para reducir el ADN contaminante. Los absorbentes probados fueron membrana Sartobind Q, Sartobind STIC y Natrix.

El eluato POROS XS identificado como la posición más adecuada para aplicar el absorbente AEX

El eluato POROS XS se identificó como la posición más adecuada para aplicar el absorbente AEX. El eluato POROS XS, a pH 6 en comparación con 7,5 para el eluato Gigacap Q, se consideró más adecuado como carga absorbente AEX dado el pl bajo de ~2,7-3,6 para rhC1-INH. La configuración ideal para el absorbente de membrana AEX es hacer que el rhC1-INH fluya a través de la unidad mientras se unen los contaminantes cargados negativamente. Una condición de ejecución con un pH más bajo disminuyó la probabilidad de que la proteína se uniera a la membrana a la vez que permitía que se unieran los contaminantes. La conductividad es otra razón por la que se seleccionó el eluato POROS XS. La conductividad de alta carga generalmente no es deseable para la cromatografía de membrana AEX porque disminuye la afinidad de los contaminantes con la membrana. La conductividad del eluato POROS XS suele ser ligeramente inferior a la del eluato GigacapQ y, por lo tanto, es más adecuado desde esta perspectiva. Además, el eluato GigacapQ se tampona con fosfato 50 mM, un tampón divalente cargado negativamente. Las condiciones de fosfato alto se consideran el peor de los casos ya que la alta fuerza iónica y las múltiples cargas negativas pueden interferir con la cromatografía de intercambio aniónico.

Ejecuciones de perfiles para membranas Sartobind Q, Sartobind STIC y Natrix

Se realizaron ejecuciones de perfiles para determinar si un paso de absorbente AEX podía ejecutarse en modo de flujo continuo para las membranas Sartobind Q, Sartobind STIC y Natrix.

Para estos experimentos se usó flujo continuo de octilo. El flujo continuo de octilo se dializó en Bis Tris 20 mM, NaCl 30 mM, pH 6,0 y se concentró a 1 g/l. Esta condición de bajo contenido de sal se usó como evaluación del peor de los casos para determinar si rhC1-INH se uniría en condiciones de bajo contenido de sal. Se usaron lavados escalonados con fuerzas iónicas crecientes para identificar las condiciones que promovían la liberación de rhC1-INH unido. Se usó una mezcla de tampones para realizar los lavados escalonados. Cada absorbente se ejecutó en la condición de carga mínima requerida para que una sola membrana se usara a una escala de 500 l (por ejemplo, >250 g de rhC1-INH/L de membrana para Sartobind Q y STIC, suponiendo un megatamaño de 1,6 l para una escala de 500 l).

En la Figura 15 se muestran los cromatogramas, las condiciones de ejecución exactas y los rendimientos. Los resultados de Sartobind Q y Sartobind STIC mostraron una unión mínima de C36 a concentraciones de sal por debajo de ~ 150 mM NaCl. La resina de cromatografía POROS XS se eluye en Bis-Tris 20 mM con un gradiente de sal de NaCl de 30-300 mM y se espera que el eluato tenga una concentración de sal cercana a 150 mM. En base a estos experimentos, se seleccionaron Sartobind Q y Sartobind STIC como candidatos favorables para una evaluación adicional.

Por el contrario, se observó la unión del producto a concentraciones de sal muy por debajo de 150 mM para la membrana Natrix. En base a esto, la membrana Natrix se eliminó de la evaluación adicional.

Resultados de Sartobind Q en rendimientos más altos en comparación con Sartobind STIC

Se realizaron análisis de productos comparando los absorbentes Sartobind Q y Sartobind STIC. Sartobind Q y Sartobind STIC se probaron con condiciones de equilibrio y lavado que coincidían con las condiciones de elución esperadas de POROS XS. Aunque los absorbentes de membrana AEX están diseñados para ser desechables, en estos experimentos se incluyeron un lavado y una tira de alta conductividad para permitir la cuantificación del material retenido por la membrana con menor resistencia. Las condiciones experimentales para estas seriess de productos se muestran en la Tabla 10 a continuación.

Los cromatogramas de los resultados de estos experimentos se muestran en la Figura 16. Estos resultados se resumen en la Tabla 11 a continuación.

Tabla 11: Resultados de series de productos - Rendimiento y contenido de HCP

Las trazas de A280 en cada cromatograma muestran como de bien fluye la proteína a través del filtro durante la fase de carga y si el material unido se libera en las fases de lavado y separación de alta conductividad. El Sartobind Q tuvo un rendimiento ligeramente mejor en comparación con el STIC, lo que corresponde al pico de lavado 2 más pequeño y al pico de separación ausente para la serie de Q. El Sartobind Q también fue más robusto en términos de características de flujo; la membrana pudo operar a una presión de entrada por debajo de 35 psi a un caudal alto de 30 MV/min. Por el contrario, se observaron presiones superiores a 90 psi al operar el STIC a 30 MV/min. Para abordar esto, el caudal del proceso se redujo a 5 MV/min. Un caudal de 5 MV/min corresponde a 8 LPM para la membrana de megatamaño de 1,6 l, que es típica para la escala de 500 l. A 8 LPM, el caudal es lo suficientemente alto como para minimizar el tiempo de procesamiento y puede lograrse usando una bomba peristáltica simple. Sin embargo, a pesar de la mejora en el funcionamiento con un caudal más bajo, el rendimiento del STIC fue aún más bajo que el del Sartobind Q (91% frente al 95%).

El análisis de la proteína de la célula huésped se realizó en el grupo de flujo mediante CHOP ELISA. En condiciones ideales, se espera que las membranas AEX proporcionen varios registros de depuración de HCP. Sin embargo, la depuración observada fue <1 registro para ambas membranas. El Sartobind STIC tuvo una depuración ligeramente mejor de 0,2 log, dada la naturaleza tolerante a la sal de este dispositivo. La escasa depuración de HCP para ambos absorbentes podría deberse a las condiciones de alta salinidad del material de carga o al contenido relativamente alto de HCP de la carga (>2000 ng/ml).

Estos datos muestran que Sartobind Q tuvo rendimientos ligeramente superiores en comparación con Sartobind STIC (95% frente a 82-91%), pero Sartobind STIC mostró una eliminación de HCP ligeramente mejor (0,21 frente a 0,14). El STIC también era susceptible a la acumulación de presión a caudales elevados. Se recomienda un caudal máximo de 5 MV/min para ambos absorbentes por conveniencia de fabricación y para evitar altas presiones de entrada durante las operaciones.

Sartobind Q tiene una depuración de ADN superior en comparación con Sartobind STIC

Sartobind Q y Sartobind STIC se probaron en condiciones de equilibrio y lavado que coincidían con las condiciones de elución esperadas para POROS XS. Se incluyeron de nuevo un lavado y una separación de alta conductividad en los experimentos para permitir la cuantificación del material retenido por la membrana a fuerzas iónicas más bajas.

Se usó ADN lambda (Thermo Fischer, número de pieza: SD0011, número de lote: 1304003VS) para un experimento inicial de enriquecimiento sin producto (es decir, una serie de tampón en blanco), que se probó mediante PicoGreen. Las series de enriquecimiento posteriores se realizaron con ADN de CHO (Cygnus, número de pieza: D552, número de lote: 71211A, 9,4 pg/ml) y con material de carga de rhC1-INH de series anteriores. Las fracciones de estos experimentos se analizaron mediante qPCR. Las condiciones de ejecución para los experimentos de enriquecimiento de ADN de CHO se proporcionan en la Tabla 12.

T l 12: n i i n x rim n l r ri nri imi n ADN H

Se realizó una prueba inicial con tampones solo para determinar la capacidad de Sartobind Q para la depuración de ADN. El material de carga consistía de 360 pl de reserva de ADN lambda (298 ng/pl) añadidos a 20 ml de Bis-Tris 20 mM, NaCl 30 mM, pH 6,0. La concentración de ADN resultante para el material de carga se midió mediante A260 y fue de 5,5 ng/pl de ADN. Se realizaron varios lavados de alta conductividad después de la fase de carga y lavado (ver Figura 17). Se recogieron fracciones de efluentes y se analizó su contenido de ADN mediante PicoGreen. La proteína rhC1-INH se excluyó de este experimento porque interfiere con el ensayo PicoGreen. El propósito del experimento era estimar los niveles de depuración de ADN posibles en las condiciones de tampón esperadas para el paso. La cantidad de ADN medida en la fracción no unida fue de 0,874 pg, lo que demuestra una depuración de 5,1 log. El ADN se unió fuertemente a la membrana, como lo demuestran los niveles indetectables de ADN en los lavados posteriores con alto contenido de sal. Se liberó algo de ADN (26% de la carga) del filtro con una tira de NaCI 2 M.

Los estudios de enriquecimiento con ADN de CHO se realizaron con membranas Q y STIC. Se añadió 1 ml de ADN de CHO a una concentración de 9,4 qg/ml a 25-30 ml de eluato del Ciclo 1 de POROS XS para servir como material de carga para cada experimento. Las muestras se analizaron mediante qPCR por Shire. Los cromatogramas para cada uno de estos experimentos se proporcionan en la Figura 18. Los resultados mostraron una depuración de registro de ADN de >4,1 y 3,7 para Sartobind Q con material de carga sin diluir y diluido, respectivamente. Aunque no se esperaría que un material de carga diluido mejorara la depuración del ADN, los experimentos de carga diluida experimentaron picos de presión anormales (ver Figura 18, panel B) durante el procesamiento, lo que puede haber contribuido a este resultado menor. En comparación, la depuración para Sartobind STIC fue de 2,5 registros. Este último resultado fue inesperado dado que se esperaba que Sartobind STIC funcionara mejor en las condiciones de alta salinidad del eluato POROS XS. En consonancia con los resultados anteriores, el Sartobind STIC tuvo un rendimiento ligeramente menor que el Sartobind Q. Los resultados se resumen en la Tabla 13 a continuación. En conjunto, estos datos indican que Sartobind Q tiene un rendimiento superior en rendimiento y depuración de ADN.

Tabla 13: Resultados de series de productos - Rendimiento y contenido de ADN

Serie de carga máxima para Sartobind Q

Se realizaron experimentos para probar el filtro Sartobind Q con carga máxima. En la Tabla 14 a continuación se presenta el diseño experimental para estos experimentos.

T l 14: n i i n x rim n l r ri nri imi n ADN H

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Una composición que comprende inhibidor de esterasa C1 humano recombinante truncado purificado (rhC1-INH) que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a la SEQ ID NO: 4 que tiene una mutación E165Q, en donde: (i) el rhC1-INH truncado purificado tiene una vida media de por lo menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 o 70 horas;

(ii) el rhC1-INH truncado purificado comprende, de media, por lo menos 10, 11, 12, 13 o 14 residuos de glicanos sialilados por molécula y tiene una vida media similar o más larga que el inhibidor de esterasa C1 derivado de plasma humano;

o

(iii) el rhC1-INH truncado purificado comprende, de media, por lo menos un 80% de glicanos cargados por molécula y tiene una vida media similar o más larga que el inhibidor de esterasa C1 derivado de plasma humano.

2. La composición de la reivindicación 1 (i), en donde:

(i) el rhC1-INH truncado purificado tiene un perfil de glicosilación que comprende no más del 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% o 5% de especies de glicanos neutras; y/o

(ii) el rhC1-INH truncado purificado es una proteína de fusión, opcionalmente en donde el rhC1-INH truncado purificado comprende un dominio Fc o un dominio de albúmina fusionado directa o indirectamente con un dominio de C1-INH.

3. La composición de la reivindicación 1(i), o la reivindicación 2, en donde el rhC1-INH truncado purificado tiene un perfil de glicosilación que comprende entre el 5% y el 25% de especies de glicanos neutras; opcionalmente en donde (i) el rhC1-INH truncado purificado contiene menos del 20%, 15%, 10%, 5% o 0% de una o más glicosilaciones de tipo manosa, a-galactosa, NGNA y/o oligomanosa;

(ii) el rhC1-INH truncado purificado tiene un perfil de glicosilación que comprende por lo menos uno de los siguientes:

entre el 5% y el 30% de especies de glicanos neutras;

entre el 10% y el 30% de especies de glicanos monosialiladas;

entre el 30% y el 50% de especies de glicanos disialiladas;

entre el 15% y el 35% de especies de glicanos trisialiladas; o

entre el 5% y el 15% de especies de glicanos tetrasialiladas; y/o (iii) el rhC1-INH truncado purificado tiene un perfil de glicosilación que comprende:

no más del 30% de especies de glicanos neutras;

entre el 20% y el 30% de especies de glicanos monosialiladas;

entre el 30% y el 40% de especies de glicanos disialiladas;

entre el 10% y el 20% de especies de glicanos trisialiladas; y

entre el 5% y el 10% de especies de glicanos tetrasialiladas.

4. La composición de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde:

(i) el rhC1 -INH truncado purificado comprende, de media, por lo menos 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 o 29 residuos de glicanos sialilados por molécula;

(ii) el rhC1 -INH truncado purificado comprende, de media, por lo menos 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 residuos de glicanos sialilados por molécula; y/o

(iii) el rhC1 -INH truncado purificado comprende, de media, por lo menos 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 o 40 moles de ácido siálico por mol de proteína; y/o (iv) el rhC1-INH truncado purificado tiene una vida media en el intervalo del 50%-150% o del 80%-120% de la vida media del inhibidor de esterasa C1 humano derivado de plasma; opcionalmente en donde el rhC1-INH truncado purificado es estable como producto líquido a concentraciones superiores a 20 mg/ml, como a concentraciones superiores a 60 mg/ml, opcionalmente a concentraciones de 70 mg/ml o más, por ejemplo a concentraciones de 100 mg /ml o más, opcionalmente a concentraciones superiores a 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700 o 750 U/ml.

5. Un ácido nucleico que codifica un rhC1-INH truncado que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a la SEQ ID NO: 4 que tiene una mutación E165Q o una célula que comprende dicho ácido nucleico.

6. Una célula huésped que comprende un vector de expresión que codifica un rhC1-INH truncado que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica a la SEQ ID NO: 4 que tiene una mutación E165Q, en donde:

(i) dicha célula huésped, una vez cultivada en condiciones de cultivo celular, es capaz de expresar el rhC1-INH truncado a un título entre 0,1 g/l y 10,0 g/l o a una tasa de productividad específica de más de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 picogramos/célula/día; opcionalmente en donde

(a) dicha célula huésped, una vez cultivada en condiciones de cultivo celular, es capaz de expresar el rhC1-INH truncado a una tasa de productividad específica de más de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 picogramos/célula/día;

(b) la célula huésped es una célula de mamífero, opcionalmente una célula CHO o una célula humana, en donde la célula humana es opcionalmente una célula HT1080 o HEK; y/o

(c) la célula huésped se manipula para aumentar la sialilación del rhC1 -INH truncado expresado; o

(ii) el rhC1-INH truncado se manipula para aumentar la sialilación;

opcionalmente en donde la célula huésped se manipula para expresar una enzima heteróloga para aumentar la sialilación, se manipula para expresar una enzima heteróloga mutante para aumentar la sialilación, se manipula para sobreexpresar una enzima endógena para aumentar la sialilación, se manipula para expresar una enzima endógena mutada para aumentar la sialilación, y/o se manipula para reducir o prevenir la expresión de enzimas endógenas que reducen, inhiben o degradan la sialilación.

7. Un método para producir rhC1-INH truncado que comprende

(i) cultivar la célula huésped de la reivindicación 6 ; o

(ii) que comprende los pasos de:

proporcionar una célula huésped manipulada para expresar rhC1-INH truncado que tiene la secuencia de aminoácidos idéntica a la SEQ ID NO: 4 que tiene una mutación E165Q; y

cultivar la célula huésped en condiciones adecuadas para que la célula produzca rhC1-INH truncado, en donde las condiciones comprenden alimentar a las células con un medio de cultivo que comprende un modulador de glicosilación durante por lo menos un período de tiempo;

opcionalmente, en donde las células se cultivan entre 30° C y 34° C durante por lo menos un período de tiempo.

8. El método de la reivindicación 7, en donde:

(i) las células coexpresan un constructo que modifica glicanos, opcionalmente en donde el constructo que modifica glicanos aumenta la sialilación;

(ii) las células se cultivan en un medio de cultivo celular sin suero;

(iii) el recipiente de cultivo a gran escala es un biorreactor, opcionalmente en donde el biorreactor está a una escala igual o superior a 5 l, 10 l, 200 l, 500 l, 1000 l, 1500 l, 2000 l, 5000 l, 10000 l, 15000 l o 20000 l;

(iv) el paso de cultivo comprende un proceso de perfusión; y/o

(v) el paso de cultivo comprende un proceso de alimentación por lotes, opcionalmente en donde las células se cultivan en un proceso de alimentación por lotes a 30-34° C durante por lo menos un período de tiempo.

9. El método de la reivindicación 7 o la reivindicación 8, en donde:

(i) las células, de media, producen el rhC1-INH truncado a una tasa de productividad específica de más de 5 picogramos/célula/día, opcionalmente de más de 10 picogramos/célula/día; opcionalmente

en donde:

(ii) las células producen el rhC1-INH truncado a un título de recogida medio de por lo menos 5, 6, 8, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290 o 300 mg por litro por día; y/o

(iii) las células de mamífero son células humanas o células CHO.

10. El método de cualquiera de las reivindicaciones 7-9, en donde el medio carece de componentes derivados de animales, opcionalmente en donde:

(i) el medio es un medio químicamente definido;

(ii) el medio está libre de proteínas;

(iii) el medio comprende por lo menos un modulador de la glicosilación;

(iv) el medio comprende por lo menos un modulador del crecimiento, opcionalmente en donde el por lo menos un modulador del crecimiento comprende hipoxantina, como en donde la hipoxantina está a una concentración que varía de 0,1 mM a 10 mM; opcionalmente, en donde el por lo menos un modulador del crecimiento comprende timidina, por ejemplo, an una concentración que varía de 1 pM a 100 mM;

(v) el medio tiene un pH que varía entre 6,8 y 7,5, opcionalmente entre 6,9 y 7,3;

(vi) el paso de cultivo comprende mantener un punto de ajuste de oxígeno disuelto de entre el 20% y el 40% de oxígeno disuelto;

(vii) el paso de cultivo comprende una fase de crecimiento y una fase de producción, opcionalmente en donde las células de mamífero se cultivan a 37° C durante la fase de crecimiento y a entre 32° C y 34° C durante la fase de producción, como en donde las células de mamífero se cultivan a diferentes temperaturas durante la fase de crecimiento y la fase de producción;

(viii) las células de mamífero se cultivan a una temperatura que varía entre 30 y 37° C;

(ix) el medio para la fase de crecimiento y la fase de producción tiene un pH diferente;

(x) el método comprende además un paso de recogida del rhC1-INH truncado; y/o

(xi) el rhC1-INH truncado tiene la secuencia de aminoácidos idéntica a la SEQ ID NO: 4 que tiene la mutación E165Q.

11. Una composición farmacéutica que comprende:

(i) un rhC1-INH truncado purificado de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, y un portador farmacéuticamente aceptable; y/o

(ii) el rhC1-INH truncado de cualquiera de las reivindicaciones 1-4 en un tampón de formulación que comprende Tris 50 mM, sorbitol 50 mM y glicina 150 mM, en donde la composición tiene un pH de 7,2.

12. La composición de las reivindicaciones 1-4 o la composición farmacéutica de la reivindicación 11 en donde: (i) la composición es líquida;

(ii) la composición se liofiliza, por ejemplo, como en donde la composición se reconstituye con un tampón adecuado para la reconstitución, por ejemplo, en donde el tampón adecuado para la reconstitución se selecciona de agua estéril, una solución salina estéril, una solución tampón estéril o una solución estéril que comprende uno o más portadores farmacéuticamente aceptables; y/o

(iii) el rhC1-INH truncado purificado es estable como producto líquido a concentraciones superiores a 20 mg/ml, como concentraciones superiores a 60 mg/ml, por ejemplo, a concentraciones de 70 mg/ml o más, opcionalmente a concentraciones de 100 mg/ml o más, como en concentraciones superiores a 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700 o 750 U/ml.

13. Un kit que comprende una composición farmacéutica de la reivindicación 11 o 12, en donde

(i) el kit comprende opcionalmente además una jeringuilla, en donde la jeringuilla está precargada con la composición farmacéutica líquida de la reivindicación 11 o 12 ; o

(ii) la composición farmacéutica está liofilizada y el kit comprende además un tampón para la reconstitución, en donde el mezclado de la composición liofilizada y el tampón para la reconstitución produce una composición líquida de la reivindicación 11 o 12, y en donde el kit comprende opcionalmente además una jeringuilla.

14. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 11 o 12 para su uso en el tratamiento de un trastorno mediado por el complemento, en donde el trastorno mediado por el complemento se selecciona opcionalmente de angioedema hereditario, rechazo mediado por anticuerpos, trastornos del espectro de la neuromielitis óptica, lesión cerebral traumática, lesión de la médula espinal, lesión cerebral isquémica, lesión por quemaduras, necrólisis epidérmica tóxica, esclerosis múltiple, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), enfermedad de Parkinson, ataque cerebral, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP), miastenia gravis, neuropatía motora multifocal.