ES2564790T3 - Producción mejorada de glicoproteínas usando manganeso - Google Patents

Abstract

Un método para la producción de una composición eritropoyética que comprende glicoproteínas estimulantes de eritropoyesis sialilada, que comprende las etapas de: crecimiento de una célula huésped CHO sensible al manganeso que produce una glicoproteína estimulante de eritropoyesis en un medio de cultivo que comprende una cantidad eficaz de manganeso para aumentar la sialilación de dicha composición eritropoyética producida por dicha célula huésped sensible al manganeso, en donde la concentración de manganeso en dicho medio de cultivo varía desde aproximadamente 0.01 a aproximadamente 40 mM, y en donde las glicoproteínas estimulantes de eritropoyesis comprenden: a) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:3 (eritropoyetina) o fragmentos eritropoyéticos de la misma; o (b) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2 (darbepoetina) o fragmentos eritropoyéticos de la misma.

Description

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DESCRIPCION

Produccion mejorada de glicoprotelnas usando manganeso

La presente invention reivindica un beneficio bajo 35 U.S.C § 119 de la de la Solicitud de la Patente de los Estados Unidos No. 60/748,880, la cual fue presentada el 8 de diciembre del 2005

Campo de la invencion

La invencion se relaciona con los metodos y medios de cultivo de celulas que comprenden manganeso que mejoran la glicosilacion o sialilacion de glicoprotelnas, incluyendo eritropoyetina y analogos o derivados de las mismas.

Antecedentes

La eritropoyetina (EPO) es una hormona glicoprotelna que es normalmente sintetizada y secretada por las celulas peritubulares en el rinon y funciona como el principal regulador homeostatico de la produccion celular de globulos rojos. La eritropoyetina recombinante humana (rHuEPO) es utilizada cllnicamente para el tratamiento de anemias e incrementa la produccion celular de globulos rojos en numerosas condiciones diferentes, tales como pericirugla, insuficiencia renal cronica, efectos secundarios por VIH o tratamiento de HCV, y efectos secundarios de quimioterapia contra el cancer. La bioslntesis farmaceutica de glicoprotelnas tales como EPO es complicada por la necesidad de altos niveles de expresion y apropiados procesamientos posttranslacionales, lo que implica la adicion de cadenas de oligosacaridos ramificadas N-unido y unidas a O. Strnad (2010, Biotechnol Progress, 26(3):653-663) reporta que los parametros tales como la velocidad de agitation y volumen de funcionamiento pueden afectar la glicosilacion de EPO producido por las celulas CHO.

En las glicoprotelnas, los azucares se unen a cualquiera de los atomos de nitrogeno de la amida en la cadena lateral de asparagina (denominado un N-unido) o el atomo de oxlgeno en la cadena lateral de serina o treonina (denominado un O-unido). El proceso para formar carbohidratos unidos a N comienza con la adicion de 14 monosacaridos a un dicol unido a un llpido en el retlculo endoplasmatico (ER). Despues de su formation, este complejo de carbohidrato luego es transferido a la protelna por el complejo oligosacararitransferasa (OST) en un proceso llamado “glicosilacion de nucleo” en el ER. El complejo oligosacariltransferansa (OST) es una unidad mutiproteica que consiste de riboforina I, II, OST48 y DAD1 (Kelleher and Gilmore 1997 PNAS 94(10):4994-4999; Kelleher et al. 2003 Molecular Cell 12(1):101-111; Kelleher et al. 1992 Cell 69(1):55-65).

Posteriormente, los polipeptidos son transportados al complejo de Golgi, donde las cadenas de azucar unidos a O se adicionan y las cadenas de azucar N-unido son modificadas de diferentes maneras. En los compartimentos cis y medios del complejo de Golgi, el complejo original de 14-sacarido N-unido puede ser recortado a traves de la extraction de residuos manosa (Man) y prolongado a traves de la adicion de N-acetilglucosamina (GlcNac) y/o de residuos de fucosa (FUC). Las diversas formas de carbohidratos unidos a N tienen en comun un nucleo pentasacarido que consiste en tres manosas y dos residuos de N-acetilglucosamina. Finalmente, en el trans de Golgi, otros residuos de GlcNac se pueden adicionar, seguido por galactosa (Gal) y un acido sialico terminal (Sial). El procesamiento de carbohidratos en el complejo de Golgi es llamado “glicosilacion terminal” para distinguir este de la glicosilacion nuclear.

El acido sialico es un nombre generico para una familia aproximadamente 30 acidos monosacaridos de origen natural que son frecuentemente los azucares terminales de los carbohidratos encontrados en las glicoprotelnas y glicollpidos. La sialilacion de glicoprotelnas recombinantes es muy importante y puede dar propiedades muy significativas a la glicoprotelna incluyendo carga, inmunogenicidad, resistencia a la degradation por proteasas, velocidad de depuration plasmatica, y bioactividad

El complejo final de unidades de carbohidratos puede tomar diferentes formas, alguna de las cuales tiene dos, tres o cuatro ramas (llamadas biantenaria, triantenaria o tetraantenaria). Una estructura biantenaria unida a N de ejemplo, se muestra a continuation:

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imagen1

Un numero de enzimas involucradas en la glicosilacion utiliza cationes divalentes como cofactores. Por ejemplo, numerosas enzimas involucradas en la slntesis de oligosacaridos unidos a dolicol requieren cationes divalentes como cofactores para la actividad (Couto et al. 1984 J. Biol. Chem. 259(1):378-382; Jensen and Schutzbach 1981 J. Biol. Chem. 256(24):12899-12904; Sharma et al. 1982 European Journal of Biochemistry 126(2):319-25). La enzima que cataliza la adicion de carbohidratos unidos a O al polipeptido tambien requiere un cation bivalente para la actividad (Sugiura et al. 1982 J. Biol. Chem. 257(16):9501-9507). El manganeso (Mn++) es un cofactor requerido para la enzima b-galactosida-a-1,3,-galactosiltransferasa, que cataliza la adicion de galactosa terminal para alargar los azucares de N- acetilglucosamina (Witsell et al. 1990 J. Biol. Chem. 265(26):15731-7). Fue previamente reportado que el manganeso en concentracion de 0.1 mM o 1mM parcialmente reversa la reduccion en ocupacion de unidos a N y unidos a O de eritropoyetina causada por A23187, un compuesto que agota los cationes divalentes (Kaufman et al. 1994 Biochemistry 33(33):9813-9). EP 1 085 083 A1 revela un medio de crecimiento para cultivar una celula animal con el fin de obtener una protelna producida por dicha celula. Mientras que el medio puede entre otros contener sulfato de manganeso, los autores no comentan sobre concentracion de dicho sulfato de manganeso. WO 98/08934 A1 revela un medio de crecimiento para el cultivo de celulas huespedes en la produccion de protelnas las cuales se dice que comprenden sales de manganeso, tales como MnCl2 en una concentracion por debajo de 0.01 mM.

Se ha demostrado previamente que rHuEPO contiene tres estructuras ramificadas de carbohidratos unidos a N y unidos a O que son altamente sialiladas (Takeuchi et al. 1988 J. Biol. Chem. 263(8):3657-3663). La EPO des-sialilada es virtualmente inactiva para inducir la eritropoyesis in vivo debido a la rapida elimination de esta protelna modificada por el receptor de glicoprotelna aislado de hepatocito (Ashwell and Harford 1982 Annual Review of Biochemistry 51(1 ):531- 554; Goochee et al. 1991 Bio/Technology. 9(12):1347-55). Tambien Yoon et al. (2003, Biotechnol and Bioengineer, 82(3):289-298) enfatizan la importancia de la alta sialilacion de EPO para su actividad biologica in vivo. Otros estudios han demostrado que la sialilacion y glicosilacion disminuyen la cinetica de enlace de EPO con el receptor de EPO. (Darling et al. 2002 Biochemistry 41(49): 14524-31).

La darbepoetina alfa es un nuevo analogo de glicosilacion de la eritropoyetina humana recombinante (rHuEPO) que comprende dos sitios adicionales de glicosilacion N-unido. La darbepoetina ha disminuido la actividad del enlace con el receptor, pero exhibe un tiempo de vida media en suero tres veces mayor e incrementa la actividad in vivo como resultado de esta persistencia incrementada en la circulation. Se ha demostrado que la actividad in vivo de los analogos de EPO se correlaciona con el numero de carbohidratos unidos a N. (Elliott et al, Exp Hematol 2004 32 (12): 1146-1155)

La rHuEPO producida en celulas CHO puede exhibir un grado variable de glicosilacion y sialilacion. (Takeuchi et al., 1989 PNAS 86(20):7819-22, Zanette et al., 2003 Journal of Biotechnology 101(3):275-287). Dado que la sialilacion de EPO es un factor importante en la bioactividad in vivo, la consistencia en la glicosilacion y los altos niveles de sialilacion de rHuEP y sus analogos son cualidades deseables cuando se produce la protelna recombinante para usos terapeuticos. Por lo tanto, existe una necesidad para medios de cultivo y metodos de cultivo que mejoren la glicosilacion o sialilacion de glicoprotelnas producidos en cultivos celulares.

Resumen de la invencion

En un aspecto, la invention proporciona medios de cultivos que comprenden celulas huesped CHO y una cantidad no toxica eficaz de manganeso para incrementar la sialilacion de una composition de glicoprotelna producida por tales celulas huesped. Especlficamente, la invencion proporciona medios de cultivos que comprenden celulas huesped CHO productoras de glicoprotelnas estimulantes de la eritropoyesis y manganeso en una concentracion desde aproximadamente 0.01 a aproximadamente 40 mM, en donde las glicoprotelnas estimulantes de la eritropoyesis comprenden (a) la secuencia de amino acidos de SEQ ID NO: 3 (eritropoyetina) o fragmentos eritropoyeticos de la

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misma; o (b) la secuencia de amino acidos de la SEQ ID NO: 2 (darbepoetina) o fragmentos eritropoyeticos de la misma.

En una realizacion de este medio de cultivo, las celulas huesped secretan una composicion eritropoyetica.

En otra realizacion de este medio de cultivo, el manganeso esta en una concentracion desde aproximadamente 0.1 a aproximadamente 10 pM.

En otro aspecto, la invencion proporciona metodos para producir una composicion eritropoyetica que comprende glicoprotelnas sialiladas estimulantes de la eritropoyesis, comprendiendo las etapas de: Crecimiento de una celula huesped CHO sensible al manganeso la cual produce una glicoprotelna estimulante de la eritropoyesis en un medio de cultivo que comprende una cantidad de manganeso eficaz para incrementar la sialilacion de dicha composicion eritropoyetica producida por dicha celula huesped sensible al manganeso, en donde la concentracion del manganeso en dicho medio de cultivo varla desde aproximadamente 0.01 a aproximadamente 40 pM, y en donde las glicoprotelnas estimulantes de la eritropoyesis comprenden (a) la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 3 (eritropoyetina), o fragmentos eritropoyeticos de la misma; (b) la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 2 (darbepoetina) o fragmentos eritropoyeticos de la misma.

En una realizacion, el metodo incluye ademas las etapas de recuperacion de una composicion eritropoyetica, en donde menos de aproximadamente 5% de las moleculas estimulantes de eritropoyesis son poco sialiladas.

En otra realizacion, la cantidad de manganeso es eficaz para incrementar el porcentaje de moleculas estimulantes de eritropoyesis altamente sialiladas.

En incluso otra realizacion, la cantidad de manganeso es eficaz para incrementar el porcentaje de moleculas estimulantes de eritropoyesis que son glicosiladas en sitios potenciales de glicosilacion unidos a O.

En una realizacion adicional, la cantidad de manganeso es eficaz para incrementar el porcentaje de galactosa entre los azucares unidos a las moleculas estimulantes de eritropoyesis

En otra realizacion, el medio de cultivo es esencialmente libre de suero.

En incluso otra realizacion, el manganeso esta en una concentracion desde aproximadamente 0.1 a aproximadamente 10 pM. En una posterior realizacion, el manganeso esta una concentracion desde aproximadamente 0.4 a aproximadamente 4 pM.

En otra realizacion, el medio de cultivo comprende ademas uno o mas aminoacidos suplementarios seleccionados del grupo consistente por asparagina, acido aspartico, cistelna, cistina, isoleucina, leucina, triptofano, o valina.

En incluso otra realizacion, las celulas huesped son cultivadas en botellas giratorias.

En una realizacion adicional, el manganeso se adiciona despues de una fase rapida de crecimiento celular. En otra realizacion, la fase rapida de crecimiento celular dura por un periodo en un rango entre aproximadamente 2 a 20 dlas.

En incluso otra realizacion, el manganeso se adiciona despues dos ciclos de cosecha. En otra realizacion, el primer ciclo de cosecha es aproximadamente 8 dlas y el segundo ciclo de cosecha es aproximadamente 7 dlas largos.

Breve descripcion de los dibujos

La figura 1 presenta la cantidad de rHuEPO en la fraccion que fluye como un porcentaje de la cantidad cargada en la columna y muestra los resultados del medio de cultivo sin adiciones de manganeso, y con la adicion de manganeso 4 pM.

La figura 2 presenta la cantidad de rHuEPO en la fraccion retenida-lEX como un porcentaje de la cantidad cargada en la columna y muestra los resultados del medio de cultivo sin adiciones de manganeso, y con la adicion de manganeso 4 pM.

La figura 3 presenta la cantidad de darbepoetina en la fraccion retenida-lEX como un porcentaje de la cantidad cargada en la columna; despues de cada ciclo de cosecha, y muestra los resultados del medio de cultivo sin manganeso adicionado, y con la adicion de manganeso 4 pM.

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La figura 4 presenta el porcentaje de moleculas de rHuEPO en las cuales los sitios-O fueron ocupados con la glicosilacion y muestra los resultados del medio de cultivo sin adiciones de manganeso, y con la adicion de manganeso 4 mM.

La figura 5 presenta el porcentaje de moleculas de darbepoetina en las cuales los sitios-O fueron ocupados con la glicosilacion, despues de cada ciclo de cosecha, y muestra los resultados del medio de cultivo sin adiciones de manganeso, y con la adicion de manganeso 4 pM

La figura 6 presenta el porcentaje de moleculas de darbepoetina en las cuales los sitios-O fueron ocupados con la glicosilacion y muestra los resultados de los medios de cultivo con diferentes concentraciones de manganeso.

La figura 7 presenta las formas representativas de glicosilacion identificadas por MALDI-TOF MS.

La figura 8 presenta el porcentaje de recuperacion de rHuEPO altamente sialilada obtenido despues del cultivo en medio estandar, medio enriquecido (medio estandar suplementado con aminoacidos), y medio enriquecido con diferentes concentraciones de manganeso.

La figura 9 presenta el porcentaje de formas de rHuEPO poco sialiladas obtenidas despues del cultivo en medio estandar, y medio enriquecido con diferentes concentraciones de manganeso.

La figura 10 presenta el porcentaje de ocupacion de sitios-O mediante glicosilacion obtenido despues del cultivo en medio estandar, y medio enriquecido con diferentes concentraciones de manganeso.

Descripcion detallada de la invencion

La invencion proporciona medios de cultivo y metodos de cultivo celular que mejoran la sialilacion de glicoprotelnas particularmente moleculas estimulantes de eritropoyesis tales como eritropoyetina de SEQ ID NO: 3, o analogos, variantes, o derivados de las mismas, incluyendo darbepoetina de SEQ ID NO: 2.

Las glicoprotelnas recombinantes producidas en celulas CHO pueden exhibir glicosilacion y sialilacion variables. Formas altamente sialiladas de moleculas de glicoprotelnas pueden ser separadas desde formas poco sialiladas (incluyendo las no sialiladas) de tales moleculas mediante cromatografla de intercambio anionico. Los acidos sialicos, siendo acidos y de este modo cargados negativamente, son capturados en la columna, por lo que las moleculas altamente sialiladas son retenidas en la columna mientras que las formas poco sialiladas fluyen. La cantidad de glicoprotelnas en cada fraccion (fraccion retenida en la columna vs fraccion que fluye) puede ser determinada y comparada con la cantidad inicial de glicoprotelna cargada desde el medio de cultivo celular.

Se ha demostrado en este documento que la adicion de manganeso al medio de cultivo resulta en alteraciones significantes en el procesamiento postraslacional de las moleculas estimulantes de la eritropoyesis, tales como la eritropoyetina y darbepoetina, mediante la produccion de celulas cultivadas que producen eritropoyetina. El manganeso disminuye la cantidad de glicoprotelna poco sialilada producida (y aumenta la cantidad de glicoprotelna altamente sialilada recuperada), aumenta el numero potencial de sitios de glicosilacion unidos a O que estan ocupados por cadenas de azucar, aumenta el numero de potenciales sitios de glicosilacion unidos a N que estan ocupados por las cadenas de azucar, aumenta la galactosilacion terminal de cadenas de azucar, e incrementa la sialilacion terminal de las cadenas de azucar. El manganeso no parece alterar el grado de ramificacion de las cadenas de azucar (por ejemplo, uno, dos, tres o cuatro ramas). El manganeso tambien invierte la reduccion de sialilacion observada cuando el medio de cultivo es periodicamente suplementado con aminoacidos agotados durante el cultivo celular, por ejemplo, asparagina, acido aspartico, cistelna, cistina, isoleucina, leucina, triptofano y valina.

El termino "composicion eritropoyetica" como se utiliza en este documento significa una recoleccion de moleculas estimulantes de la eritropoyesis que contienen sitios de glicosilacion, y entre los cuales al menos algunas de las moleculas llevan una cadena de azucar que comprende al menos un residuo sialico terminal (i.e., tales moleculas son "sialiladas"). Del mismo modo, el termino "composicion de glicoprotelna" tal como se utiliza en este documento significa una recoleccion de moleculas de glicoprotelna, entre las cuales al menos algunas de las moleculas estan sialiladas.

El termino "moleculas estimulantes de la eritropoyesis" como se utiliza en este documento incluye eritropoyetina humana (SEQ ID NO.:3) o una variante biologicamente activa, derivado o analogo de la misma, incluyendo un derivado qulmicamente codificado de dicha protelna o analogo. Los aminoacidos 1 a 165 de SEQ ID NO: 3 constituyen la protelna madura. Otro ejemplo, de molecula estimulante de la eritropoyesis es la darbepoetina (SEQ ID NO: 2). Los aminoacidos 1 a 165 de SEQ ID NO: 2 constituyen la protelna madura. Tambien se contemplan analogos de eritropoyetina (SEQ ID NO.: 3) o darbepoetina (SEQ ID NO: 2), con una homologla del 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% con la SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 2, respectivamente, y aun reteniendo la actividad eritropoyetica.

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Las secuencias de ejemplo, fabricacion, purificacion y uso de la eritropoyetina humana recombinante de ejemplo, se describen en una serie de publicaciones de patentes, incluyendo, pero no limitado a la Patente de los Estados Unidos Lin 4,703,008 y la Patente de los Estados Unidos Lai et al. 4,667,016. La darbepoetina es una eritropoyetina analoga hiperglicosilada que presenta cinco cambios en la secuencia de aminoacidos de la rHuEPO lo cual provee dos cadenas de carbohidratos adicionales. Mas especlficamente, la darbepoetina contiene dos cadenas adicionales de carbohidratos unidos a N en los residuos de aminoacidos 30 y 88 de SEQ ID. NO: 2. Las secuencias, fabricacion, purificacion y uso de ejemplo, de darbepoetina y otros analogos de eritropoyetina se describen en una serie de publicaciones de patentes, incluyendo Strickland et al., 91/05867, Elliott et al., WO 95/05465, Egrie et al., WO 00/24893, y Egrie et al. WO 01/81405.

Como se utiliza en este documento, "analogos" se refiere a una secuencia de aminoacidos que tiene inserciones, eliminaciones o sustituciones relativas a una secuencia original, mientras que todavla sustancialmente mantenga la actividad biologica de la secuencia original, como se determino mediante ensayos biologicos conocidos para un experto en el arte. "Variantes" incluyen variantes alelicas que ocurren naturalmente, variantes de corte y empalme, o formas polimorficas de la secuencia original. Los "Derivados" de polipeptidos de origen natural, variantes o analogos incluyen aquellos que han sido qulmicamente modificados, por ejemplo, unir pollmeros solubles en agua (por ejemplo, polietilenglicol), radionucleidos u otros diagnosticos o unidades estructurales dirigidas o terapeuticas, cualquiera de los cuales se puede unir directa o indirectamente a traves de enlazantes.

El termino “actividad eritropoyetica” significa actividad para estimular eritropoyesis como se demuestra en un ensayo in vivo, por ejemplo, el ensayo de policitemia exhipoxica en raton. Vease, por ejemplo, Cotes and Bangham, Nature, 191:1065 (1961).

El termino "celula huesped sensible al manganeso" como se utiliza en este documento significa una celula huesped la cual produce una glicoprotelna y que responde a una adicion de manganeso en su medio de cultivo incrementando la sialilacion, ya sea mediante un aumento del porcentaje de las moleculas de glicoprotelna sialilada producidas o aumentando el grado de sialilacion (i.e., el numero de acidos sialicos por molecula) de las moleculas de glicoprotelna producidas. Para composiciones eritropoyeticas, las celulas huesped sensibles a manganeso incluyen las celulas huesped que responden a la adicion de manganeso aumentando el porcentaje de moleculas estimulantes de la eritropoyesis altamente sialiladas recuperadas despues de una cromatografla de intercambio anionico llevada a cabo como se describe a continuacion. En realizaciones de ejemplo, las celulas huesped sensibles al manganeso pueden incluir celulas huesped de crecimiento ancladas a una superficie solida, por ejemplo, en botellas giratorias. Cualquier celula huesped sensible al manganeso descrita en este documento pueden ser utilizada de acuerdo con la invention.

Componentes del medio de cultivo

La invencion proporciona un medio de cultivo que comprende una cantidad eficaz de manganeso para incrementar la sialilacion de una composition de glicoprotelna producida por celulas crecidas en este medio de cultivo. En una realization, dicha cantidad de manganeso no es toxica para las celulas, i.e., no reduce la viabilidad celular, el crecimiento celular o la production de protelnas. En realizaciones relacionadas, la invencion proporciona un medio de cultivo que comprende una cantidad eficaz de manganeso para aumentar la sialilacion de una composicion eritropoyetica producida por las celulas crecidas en este medio de cultivo.

La cantidad de manganeso en los medios de cultivo de la invencion pueden ser mayores que la cantidad "elemento de traza" presente en las composiciones del medio estandar, por ejemplo, superiores a 0.001 pM. Mientras la calidad de las composiciones eritropoyeticas claramente mejorada por la adicion de manganeso 40 pM para los cultivos de celulas huesped, en algunos casos, el rendimiento de protelna secretada en el medio es sustancialmente reducida, indicando un efecto toxico de dicha concentration de manganeso. En realizaciones de ejemplo, la concentration de manganeso en el medio de cultivo (i.e., la concentracion final despues del medio suplementado de manganeso se adiciona a las celulas huesped en cultivo) varla desde aproximadamente 0.01 a aproximadamente 40 pM, o desde aproximadamente 0.1 a aproximadamente 10 pM, o desde aproximadamente 0.4 a aproximadamente 4 pM. En otras realizaciones de ejemplo, la concentracion de manganeso en el extremo inferior del intervalo deseado puede variar desde aproximadamente 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5 o 4 pM o superior; la concentracion de manganeso en el extremo superior del intervalo puede tambien alcanzar hasta aproximadamente 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6,5 o 4 pM.

La concentracion de manganeso en el medio de cultivo adicionado a las celulas puede ser ajustada para lograr la concentracion final deseada de manganeso en el sistema de cultivo. Por ejemplo, con procesos por lotes que involucren remocion y sustitucion completa del medio de cultivo, el remplazo del medio de cultivo que contenga Mn2+ 4 pM se adiciona a las celulas para lograr un medio de cultivo final en Mn2+ 4 pM. Alternativamente, cuando se utilizan procesos de perfusion continuos, la concentracion de manganeso en el medio adicionado necesitara ser mayor para lograr un medio de cultivo final en la concentracion deseada de Mn2+ dentro de un intervalo. Los ajustes de la concentracion se pueden llevar a cabo facilmente por un experto en el arte.

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El medio de cultivo tambien puede incluir otros ingredientes necesarios o deseables conocidos en el arte, tales como carbohidratos, incluyendo glucosa, aminoacidos esenciales y/o no esenciales, llpidos y precursores de llpidos, precursores de acidos nucleicos, vitaminas, sales inorganicas, oligoelementos incluyendo metales raros, y/o factores de crecimiento celular. El medio de cultivo puede ser qulmicamente definido o puede ser suero, hidrolizados de plantas, u otras sustancias derivadas. Los medios de cultivo pueden ser esencial o totalmente libres de suero o libres de componentes animal. Esencialmente libres de suero significa que el medio carece de cualquier suero o contiene una cantidad insignificante de suero.

El medio de cultivo tambien puede incluir aminoacidos suplementarios agotados durante el cultivo celular, por ejemplo, asparagina, acido aspartico, cistelna, cistina, isoleucina, leucina, triptofano, y valina. La suplementacion de aminoacidos puede estar en el medio inicial de crecimiento y/o en el medio agregado durante o despues de la fase de rapido crecimiento.

El medio puede incluir llpidos y/o precursores de llpidos tales como colina, etanolamina, o fosfoetanolamina, colesterol, acidos grasos tales como acido oleico, acido linoleico, acido linolenico, esteres metllicos, D-alfa-tocoferol, por ejemplo, en forma de acetato, acido estearico, acido mirlstico, acido palmltico, acido palmitoleico; o acido araquidonico. Un numero de mezclas de llpidos disponibles comercialmente son accesibles.

El medio puede incluir un suplemento de hierro que comprende hierro y una molecula de transporte sintetica a la cual el hierro se une. El medio puede incluir compuestos inorganicos u oligoelementos, suministrados como sales apropiadas, tales como sodio, calcio, potasio, magnesio, cobre, hierro, zinc, selenio, molibdeno, vanadio, manganeso, nlquel, silicio, estano, aluminio, bario, cadmio, cromo, cobalto, germanio, potasio, plata, rubidio, circonio, fluor, bromo, yodo y cloruro. Una serie de mezclas disponibles comercialmente de oligoelementos estan disponibles.

El medio tambien puede incluir opcionalmente un surfactante no ionico o agente con actividad de superficie para proteger las celulas desde el se mezcla o aireacion. El medio de cultivo tambien puede comprender soluciones reguladoras tales como bicarbonato de sodio, fosfatos monobasicos y dibasico, HEPES y/o Tris.

En realizaciones de ejemplo, el medio es medio DMEM/F-12 (Gibco) que contiene un 5 % de suero. DMEM incluye las siguientes sales inorganicas: cloruro de calcio, sulfato cuprico, sulfato o nitrato ferrico, cloruro de potasio, sulfato o cloruro de magnesio, cloruro de sodio, dihidrogeno fosfato de sodio, bicarbonato de sodio, sulfato de zinc; los siguientes aminoacidos L-alanina, L-arginina, L-asparagina, acido L-aspartico, L-cistelna, acido L-glutamico, L-glutamina, glicina, L- histidina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L-metionina, L-fenilalanina, L-prolina, L-serina-L-treonina, L-triptofano, L- tirosina, L-valina; los siguientes llpidos y vitaminas: biotina, D- pantoenato de calcio-, cloruro de colina, acido folico, mioinositol, niacinamida, nicotinamida, piridoxina, riboflavina, tiamina, vitamina B12 (cobalamina), timidina, acido linoleico, acido lipoico; y otros componentes incluyendo D-glucosa, rojo fenol, hipoxantina, piruvato sodico, putrescina, y HEPES.

El medio de cultivo tambien puede comprender inductores de la produccion de protelna, tales como, butirato de sodio, o cafelna. Otros inductores conocidos incluyen, pero no se limitan, a los siguientes compuestos: N-acetil-L-cistelna, actinomicina D, 7- amino, bafilamicina A1, Streptomyces griseus, calfostina C, Cladosporium cladosporioides, camptotecina, camptotheca acuminata, CAPE, 2-cloro-2'-deoxiadenosina, 2-cloro-2'-deoxiadenosina 5'-trifosfato, Tetralitio Sal, cicloheximida, ciclofosfamida monohidratada, ciclosporina, trichoderma polisporum, daunorrubicina, clorhidrato, dexametasona, doxorubicina clorhidrato, (-) epigalocatequina galato, etoposido, etoposido fosfato, ET- 18- OCH3, 5-fluorouracilo, H-7, diclorhidrato, genistelna, 4-hidroxinonenal, 4-hidroxifenilretinamida, hidroxiurea, inhibidor de IL-1 b, (6)-s-n-nitroso-n-acetilpenicilamina, S-nitrosoglutation, forbol-12-miristato-13-acetato, puromicina, diclorhidrato, acido 1 -pirrolidincarboditioico, sal de amonio, quercetina dihidrato, rapamicina, butirato de sodio, 4-fenilbutirato de sodio, D- eritro esfingosina, N-acetil, D- eritro -esfingosina, N-octanoil-, estaurosporina, Streptomyces sp., sulindac, tapsigargina, TRAIL, E. coli, Trichostatin A, Streptomyces sp., (±)-verapamilo clorhidrato, veratridina, vitamina D3, 1a,25- dihidroxi, y vitamina E succinato (VWR y Calbiochem).

El medio de cultivo opcionalmente excluye A23187 u otros compuestos los cuales agotan cationes divalentes.

Medios de Cultivo

La invencion tambien proporciona metodos para la produccion de una composition de glicoprotelna, tales como una composition eritropoyetica, la cual puede incluir cultivo de celula huesped sensible a manganeso en cualquiera de los medios de cultivo descritos en este documento. Tales metodos pueden incluir ademas la etapa de recuperation de la composicion de glicoprotelna, por ejemplo, la composicion eritropoyetica a partir de las celulas huesped o del medio de cultivo. El manganeso puede ser incluido en el medio de cultivo inicial durante la fase inicial de crecimiento o se puede ser adicionado en estados posteriores. El manganeso puede tener un mayor efecto cuando se adiciona despues de una fase de rapido crecimiento durante el cual el crecimiento de celulas huesped maximo cercano o al maximo se consigue, por ejemplo, en un periodo mayor de 2, 3, 4, 5, 7, 10, 15 o 22 dlas, o hasta 22, 25, 30, 35, 40, 45, 50, o 55 dlas y puede

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tener un efecto aun mayor despues del crecimiento celular prolongado, por ejemplo, despues de dos ciclos de cosecha. Cuando la proteina recombinante es secretada en el medio, el medio puede ser cosechado periodicamente, de modo que las mismas celulas huesped puedan ser usadas a traves de diferentes ciclos de cosecha. En realizaciones de ejemplo, las celulas huesped productoras de moleculas estimulantes de eritropoyesis se incubaron en tres lotes discretos de ciclos de cosecha. Para cada ciclo, el medio es cosechado y reemplazado con medio fresco. El primer ciclo puede ser de, por ejemplo, 8 dias, el segundo ciclo, por ejemplo, 7 dias; y el tercer ciclo, por ejemplo, 5 dias de duracion.

Cualquiera de las celulas huesped conocidas en el arte para producir proteinas glicosiladas pueden ser usadas, incluyendo celulas de levadura, celulas de plantas, plantas, celulas de insectos, y celulas de mamifero. Celulas de levadura de ejemplo, incluyen Pichia, por ejemplo, P. pastoris, y Saccharomyces por ejemplo, S. cerevisiae, asi como Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces, K. Zactis, K. fragilis, K. bulgaricus, K. wickeramii, K. waltii, K. drosophilarum, K. thernotolerans, y K. marxianus; K. yarrowia; Trichoderma reesia, Neurospora crassa, Schwanniomyces, Schwanniomyces occidentalis, Neurospora, Penicillium, Totypocladium, Aspergillus, A. nidulans, A. niger, Hansenula, Candida, Kloeckera, Torulopsis, y Rhodotorula. Celulas de insecto de ejemplo, incluyen Autographa californica y Spodoptera frugiperda, y Drosophila. Celulas de mamifero de ejemplo incluyen variedades de CHO, BHK, HEK-293, NS0, YB2/3, SP2/0, y celulas humanas tales como PER-C6 o HT1080, asi como VERO, HeLa, COS, MDCK, NIH3T3, Jurkat, Saos, PC-12, HCT 116, L929, Ltk-WI38, CV1, TM4, W138, Hep G2, MMT, una linea celular leucemica, celulas madre embrionaria o celulas de huevo fertilizado.

Una variedad de sistemas de cultivo es conocida en el arte, incluyendo matraces T, centrifugadora y matraces agitadores, botellas giratorias y biorreactores de tanques agitadores.

El cultivo en botellas giratorias es generalmente llevado a cabo sembrando las celulas en las botellas giratorias que estan parcialmente llenas (por ejemplo, a un 10-30% de capacidad) con medio y ligeramente giradas, permitiendo que las celulas se fijen a las paredes de las botellas y crezcan hasta la confluencia. El medio celular es cosechado mediante decantacion del sobrenadante, el cual es reemplazado con medio fresco. El anclaje de las celulas dependientes puede ser tambien cultivado sobre un microportador, por ejemplo, esferas polimericas, que estan mantenidas en suspension en biorreactores de tanques agitadores. Alternativamente, las celulas pueden estar creciendo en suspension de una sola celula.

El medio de cultivo puede ser adicionado en un proceso de lotes, por ejemplo, en donde el medio de cultivo se adiciona una vez a las celulas en un solo lote, o en un proceso de alimentacion de lote en el cual pequenos lotes de medio de cultivo son periodicamente adicionados: El medio puede ser cosechado al final del cultivo o en diferentes momentos durante el cultivo. Continuamente los procesos de production perfundidos son tambien conocidos en el arte, e involucran la alimentacion continua de medio fresco en el cultivo, mientras que el mismo volumen es continuamente retirado del reactor. Los cultivos perfundidos generalmente alcanzan las mas altas densidades celulares que los lotes de cultivo y pueden ser mantenidos por semanas o meses con cosechas repetidas.

Los metodos para controlar la sialilacion de una glicoproteina recombinante, particularmente para controlar los niveles de acido N-glicolilneuraminico (NGNA) en las cadenas de azucar, se describen en la patente la Patente de los Estados Unidos No. 5,459,031, y tales metodos pueden ser usados en conjunto con el medio de cultivo y los metodos de cultivo descritos en este documento. Los metodos implican ajustes en los parametros del cultivo, incluyendo el nivel de dioxido de carbon, para llevar a cabo el deseado contenido de NGNA en el carbohidrato.

Evaluacion de glicosilacion y sialilacion

Para las composiciones de glicoproteina, un incremento o mejoramiento en la sialilacion se puede determinar mediante cromatografia de intercambio anionico de acuerdo con Elliott et al., Biochemistry, 33(37):11237-45 (1994). Las proteinas mas altamente sialiladas se espera que esten negativamente mas cargadas y unidas mas fuertemente a la columna, mientras que las proteinas menos sialiladas y asialoproteinas fluyan a traves o sean facilmente eluias. Se puede determinar la cantidad de moleculas de glicoproteina en cada una de las dos fracciones (fraction retenida sobre resina vs. fraccion fluida), mediante ELISA, y se compara con la cantidad inicial de tales moleculas cargadas desde el medio de cultivo celular. Los kits ELISA de ejemplo, se venden comercialmente e incluyen sistemas R & D, y kit IVD Humana EPO EIA.

La cromatografia se lleva a cabo de la siguiente manera. Para eliminar celulas y residuos, el medio en el cual las celulas mamiferas que producen moleculas estimulantes de eritropoyesis, u otras glicoprotemas, que han sido cultivadas son centrifugadas a aproximadamente 1000 rpm y filtradas a traves de filtro de 0.45 micras. Este material luego es sometido a una cromatografia de intercambio anionico con el fin de prepurificar una fraccion que contiene primariamente las cuatro a siete especies mas altamente sialiladas de las moleculas de glicoproteina. Una resina de intercambio fuertemente ionico se puede utilizar, tal como, por ejemplo, TRICORN™ Mono-Q 5/50 GL (Amersham, part # 7-5166-01) u otra resina de intercambio fuertemente anionica, particularmente aquellas que tienen el amino cuaternario -CH2-N+-

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(CH3)3 como grupo funcional de la resina. El procedimiento exacto dependera del numero maximo teorico de residuos de acido sialico que las moleculas particulares de glicoprotelna puedan contener. Por ejemplo, un numero maximo teorico de residuos de acido sialico para eritropoyetina humana, que tenga 3 sitios N-galicano y 1 sitio de O-galicano; es (3x4) + 2 = 14. Esto asume que cada sitio de N-galicano puede tener hasta cuatro ramas (dado que las especies pentaantenarias son raras) y que cada sitio de O-galicano pueda tener hasta dos ramas. Haciendo suposiciones similares para darbepoetina, la cual tiene 5 sitios N-galicano y 1 sitio O-galicano, el maximo teorico para darbepoetina es (5x4) + 2 = 22. Las soluciones reguladoras utilizadas para eluir las moleculas de glicoprotelna desde la columna de intercambio anionico son disenados para: (1) eluir desde la columna la mayorla o todas las moleculas de protelna pertenecientes a especies que esten menos sialiladas que un grupo de especies consistentes de aproximadamente la tercera parte superior de la mayorla de especies sialiladas (para eritropoyetina, las especies “altamente sialiladas” son aquellas que tienen de 9-14 residuos de acido sialico por molecula de protelna, y para darbepoetina las especies “altamente sialiladas” son aquellas que tienen de 17-22 residuos de acido sialico por molecula de protelna ); (2) luego eluir moleculas de protelna pertenecientes a las cuatro de las siete especies altamente sialiladas, y (3) finalmente remover las especies mas altamente cargadas de la columna, lo cual puede incluir glicoformas que llevan N-glicanos sulfatados. Por lo tanto, la composicion exacta de las soluciones reguladoras de lavado y de elucion pueden ser ajustados de acuerdo con el numero maximo teorico de residuos de acido sialico en la molecula de glicoprotelna. Un experto en el arte puede hacer dichos ajustes basado en la optimizacion emplrica de la rutina de los parametros de la columna y evaluando el material saliente de la columna sobre geles anallticos de enfoque isoelectrico.

Los geles anallticos de enfoque isoelectrico de poliacrilamida que pueden separar diferentes formas cargadas de moleculas estimulantes de eritropoyesis que llevan diferentes numeros de residuos de acido sialico tambien pueden ser mejorados esencialmente como se describe en el Amersham-Pharmacia Guide to Isoelectric Focusing (APB, RW 5/5/98) en urea 6 M utilizando anfolitos comercialmente disponibles (pH 3 a 5 para eritropoyetina humana o pH 2 a 4 para darbepoetina). Otros rangos de pH para anfolitos pueden ser apropiados para otras moleculas estimulantes de eritropoyesis con numeros sustancialmente diferentes de residuos de acido sialico.

Para eritropoyetina, el grado de sialilacion se estima mediante la determinacion del porcentaje total de protelna eritropoyetica cargada sobre una columna de intercambio anionico que eluye en una fraccion que comprende principalmente especies altamente sialiladas de eritropoyetina que tienen de 9 a 14 residuos de acido sialico por molecula de protelna.

Para darbepoetina, el grado de sialilacion se estima mediante la determinacion del porcentaje de protelna eritropoyetica total cargada sobre una columna de intercambio anionico que eluye en una fraccion que contiene principalmente especies altamente sialiladas de darbepoetina que tiene de 18 a 22 residuos de acido sialico por molecula.

Un incremento en el porcentaje de moleculas estimulantes de eritropoyesis recuperadas desde la mezcla retenida en la resina (o una reduccion en el porcentaje de tales moleculas observadas en la fraccion que fluye) respecto al control (por ejemplo, producidas desde el medio sin manganeso o cantidades de oligoelementos del manganeso) indica un incremento en la sialilacion, ya sea mediante el aumento del porcentaje de moleculas sialiladas producidas o mediante el incremento de su grado de sialilacion.

La estructura actual de glicano puede ser determinada por algunas tecnicas conocidas en el arte, incluyendo digestion enzimatica de carbohidratos, inmunotransferencia de lectina, 1D y 2D, espectroscopia 1H-RMN, tecnicas de espectrometrla de masas incluyendo espectrometrla de masas en tandem de ionizacion electroaspersion (ESI MS) o espectrometrla de masas en tiempo de vuelo mediante desorcion-ionizacion por laser asistida por matriz (MALDI-TOF MS), y/o marcadores fluorescentes de N-glicanos liberados enzimaticamente seguidos de resolucion mediante HPLC y comparacion con muestras control conocidas de N-glicano.

Una tecnica de ejemplo, descrita en los ejemplos a continuacion, para determinacion de la cantidad de glicoprotelna con un sitio de O-glicosilacion ocupado implica una digestion con N-Glicanasa para remover los carbohidratos unidos a N seguido de HPLC en fase reversa para separar la composicion de glicoprotelna en dos picos. La identificacion del pico como sitio-O ocupado o sitio-O no ocupado puede ser confirmado por espectrometrla de masas.

La derivacion y sialilacion del sitio-N, incluyendo el porcentaje de moleculas sialiladas producidas y el grado de sialilacion de las moleculas sialiladas, se puede determinar mediante analisis de las glicoprotelnas para el contenido estructural, mediante el mapeo de N-galicano y secuenciacion enzimatica, por ejemplo, mediante digestion con N- Glicanasa y neuraminidasa, acoplado con espectrometrla de masas MALDITOF para la determinacion del tamano de los azucares liberados. Una tecnica de ejemplo, se describe en los ejemplos a continuacion.

Se puede determinar el porcentaje de azucares unidos a las moleculas estimulantes de eritropoyetina que son galactosa, por ejemplo., mediante digestion con neuraminidasa mas galactosidasa seguido de separation por HPLC o espectrometrla de masas MALDI-TOF para la determinacion del tamano de los azucares liberados. Una tecnica de ejemplo, se describe en los ejemplos a continuacion.

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Ejemplos Ejemplo 1:

Metodos de produccion de protelna

Este ejemplo, describe un metodo de cultivo celular para la produccion de eritropoyetina humana recombinante (rHuEPO, SEQ ID NO: 3) o darbepoetina (SEQ ID NO: 2). Una llnea celular DHfR menos CHO fue transfectada establemente con una secuencia de ADN genomico que contiene el gen de eritropoyetina humano (la Patente de los Estados Unidos Lin 4,703,008) o una secuencia de ADNc codificada al gen de darbepoetina (SEQ ID NO: 1). Botellas rotatorias (850cm2) fueron inoculados con 1.7x107 de celulas totales y crecidas durante 5 dlas en 450 mL de medio 1:1 DMEM/F-12 (Gibco), que contiene 5% de suero. Los cultivos se lavaron una vez con PBS y luego se incubaron en tres ciclos de cosecha en lotes discreto. El medio fue reemplazado dos veces en los primeros 14 dlas; el tercer ciclo fue de 5 a 6 dlas de duracion. Para la eritropoyetina, en cada cosecha, el medio de cultivo acondicionado fue completamente removido y 1:1 DMEM/F-12 sin suero ("medio estandar") fue adicionado para reemplazar el medio de cosecha. Cuando el manganeso fue incluido en el medio de cultivo, se adiciono cloruro de manganeso (Sigma) para reemplazar todo el medio de cultivo en la concentration deseada; por ejemplo, 0.4, 4 o 40 pM. Las botellas giratorias fueron recubiertas con una mezcla de gas que contiene 80 torr de pCO2, 130 torr de pO2, y N2 balanceado despues de cada adicion al medio. Las celulas productoras de darbepoetina fueron cultivadas bajo condiciones similares a las celulas productoras de eritropoyetina excepto que el medio estandar fue 2X 1:1 DMEM/F-12 (sin suero):

Ejemplo 2:

Cuantificacion de rHuEPO o darbepoetina en medio de cultivo de cosecha

200 ml de medio de cosecha producido de acuerdo con el ejemplo 1, se analizo para la cantidad de rHuEPO o darbepoetina producida, utilizando HPLC fase reversa. Las muestras fueron separadas sobre un pollmero PLRPS (4.6 mm x 150 mm; 1000 A (Polymer Laboratories) bajo condiciones de fase reversa (gradiente lineal aB desde 30% - 55% B durante 17 minutos; solution reguladora A: 0.1% de TFA en H2O, solution reguladora B: 0.1% de TFA en 90% de CH3CN (Sigma)). El tiempo de retention para rHuEPO o darbepoetina dentro del medio de cultivo fue comparado con una rHuEPO purificada o estandar de darbepoetina (Amgen Inc.). El Software Waters Millennium fue usado para integrar manualmente las areas de los picos de rHuEPO o darbepoetina para asegurar una integration consistente. Las areas de los picos integrados de muestras desconocidas se cuantificaron mediante la comparacion a una curva estandar conocida.

Ejemplo 3:

Efecto del manganeso sobre formas altamente sialiladas y poco sialiladas de moleculas estimulantes de eritropoyetina

Las celulas CHO productoras de rHuEPO fueron cultivadas como se describe en el ejemplo 1, con y sin adicion de MnCl2 4 pM. El medio acondicionado recolectado despues del tercer ciclo de cosecha se analizo mediante el porcentaje de recuperation de las formas altamente sialiladas de rHuEPO. Las celulas CHO productoras de darbepoetina fueron cultivadas como se describe en el ejemplo 1, con y sin adicion de MnCh 4 pM. El medio acondicionado recolectado despues de cada uno de los tres ciclos de cosecha se analizo.

Las formas poco sialiladas de rHuEPO fueron separadas del material altamente sialilado utilizando el metodo de intercambio anionico como se describe en Elliott et al., Biochemistry, 33(37):11237-45 (1994). En resumen, la rHuEPO altamente sialilada, que tiene una fuerte carga negativa, se une a la resina mientras que la rHuEPO poco sialilada se lava a traves de la columna. El medio de cultivo celular de cada botella giratoria obtenido como se describe en el ejemplo 1, en primer lugar, se concentro sesenta veces, a aproximadamente 5-15 mg/mL, utilizando una membrana 10,000 MWCO luego la solucion reguladora se intercambio por Tris 10 mM pH 7.0. Este medio de solucion reguladora concentrado e intercambiado fue cargado sobre una columna de intercambio fuertemente anionica que tiene una amina cuaternaria como grupo funcional. El material no unido que fluye con Tris 10 mM o eluido con baja sal fue recolectado como la fraction poco sialilada. El material unido a la columna de intercambio ionico (IEX) fue eluido con sales superiores como la fraccion “recuperable” altamente sialilada.

La cantidad total de rHuEPO en una o ambas fracciones fue medida utilizando un kit ELISA obtenido de R&D Systems (Quantikine IVD Human EPO EIA kit), siguiendo el procedimiento recomendado por los fabricantes y comparado con la cantidad total de rHuEPO en el medio de cosecha cargado en la columna. Las diluciones de 1:1,000,000 y 1:500,000 de cada una de las muestras que flulan se hicieron antes del analisis con el fin de que caigan dentro de la curva de la valoracion. Una fraccion altamente sialilada de darbepoetina se separo utilizando metodos similares como se describio anteriormente para aislar las isoformas con los residuos 17-22 de acido sialico y medidos utilizando RP-HPLC.

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Los resultados de un experimento representative para rHuEPO se muestran en las figuras 1 y 2. La figura 1 presenta la cantidad de rHuEPO en la fraccion que fluye como el porcentaje de la cantidad cargada en la columna y muestra que la adicion de manganeso 4 pM redujo la fraccion poco sialilada de EPO comparada con el control del 10.01% a 3.39%. La figura 2 presenta la cantidad de rHuEPO en la fraccion retenida por IEX como porcentaje de la cantidad cargada en la columna y muestra como la adicion de manganeso 4 pM incrementa el porcentaje recuperable de EPO en la fraccion altamente sialilada comparada con el control del 24% al 28%.

Los resultados de un experimento representativo para darbepoetina se muestran en la figura 3. La figura 3 presenta los datos desde cada ciclo de cosecha y muestra que la adicion de manganeso 4 pM incrementa el porcentaje de recuperacion de darbepoetina en la fraccion altamente sialilada comparada con el control del 32.8% al 36.3% despues de la tercera cosecha. La adicion posterior de N-acetilmanosamina 7 pM parece que mejora un incremento adicional en % recuperable de darbepoetina al 41.1% despues de la tercera cosecha:

Estos datos demuestran que la adicion de Mn2+ al medio de cultivo disminuye la produccion de formas poco sialiladas de eritropoyetina y darbepoetina en celulas de cultivo CHO, e incrementa el porcentaje de recuperacion de formas altamente sialiladas.

En experimentos llevados a cabo con una llnea de celulas CHO adaptadas para el crecimiento en cultivo en suspension en grandes tanques y/o celulas CHO adaptadas a cultivo en suspension en medio libre de suero, no se observo el efecto del manganeso en la fraccion poco sialilada de darbepoetina.

Ejemplo 4:

Caracterizacion de sitios-O de rHuEPO

Las celulas CHO productoras de rHuEPO fueron cultivadas como se describe en el ejemplo 1, con y sin adicion de MgCl2 4 pM. El medio de cultivo recolectado sin fraccionar despues del tercer ciclo cosechado se analizo por el porcentaje de ocupacion del sitio-O de rHuEPO. Las celulas CHO productoras de darbepoetina fueron cultivadas como se describe en el ejemplo 1, con y sin adicion de MgCl2 4 pM. El medio acondicionado recolectado despues de cada uno de los tres ciclos de cosecha se analizo. Las celulas CHO productoras de darbepoetina fueron tambien cultivadas como se describe en el Ejemplo 1 con MgCl2 0.4, 1, 4, 10 y 40 pM y el medio del tercer ciclo de cosecha se analizo.

El porcentaje de sitios-O unidos ocupados con glicosilacion se cuantifico en primer lugar retirando las estructuras N- unido, mediante la digestion con N-Glicanasa (Sigma) del medio de cultivo celular, seguido por cromatografla HPLC fase reversa. Especlficamente, 5 U de N-Glicanasa (Sigma) se adiciono a 10 pL de muestras de medio de cultivo concentrado (1:60) y digeridas a 37 °C por tres horas. A continuacion., las muestras fueron analizadas por cromatografla en fase reversa utilizando una columna Zorbax C-8 (150 mm x 2.1 mm (VWR) utilizando un gradiente lineal AB desde 35% - 60% de B, durante 30 minutos (solucion reguladora A: 0.1% de TFA en H2O, solucion reguladora B: 0.1% de TFA en 90% de CH3CN (Sigma)). El cromatograma resultante separa rHuEPO en dos picos; el primer pico corresponde al sitio-O ocupado por el peptido rHuEPO mientras que el mas pequeno, el segundo pico corresponde a sitios-O no ocupados por el peptido rHuEPO.

Para confirmar que estos dos picos representaran sitios-O ocupados y sitios-O no ocupados, las fracciones correspondientes a estos picos fueron recolectadas y comparadas a rHuEPO purificada digerida con N-Glicanasa (Amgen Inc.). El analisis por SDS-PAGE mostro que la digestion con N-Glicanasa reduce el peso molecular aparente de rHuEPO de 32 kDal a un doblete con un mayor componente de 18.5 kDal y un componente menor que migra ligeramente mas rapido. El mayor pico migro con la banda mayor de rHuEPO digerida con N-Glicanasa mientras que el pico menor migro con la banda mas pequena de rHuEPO. El mapeo de peptidos Lys-C en combinacion con espectrometrla de masas confirmo que el mayor pico corresponde a rHuEPO que contiene un carbohidrato O-unido mientras que el pico mas pequeno corresponde a rHuEPO carente de un carbohidrato O-unido.

Los resultados de experimento representativo que analiza la ocupacion de sitios-O para rHuEPO se presentan en la figura 4. La figura 4 muestra que la adicion de manganeso 4 pM incremento la ocupacion de sitios-O de rHuEPO comparados con el control del 88.1 % al 91.6%.

Los resultados de experimentos representativos para darbepoetina se presentan en las figuras 5 y 6. La figura 5 muestra datos de cada ciclo de cosecha y demuestran que la adicion de manganeso 4 pM incrementa la ocupacion de sitios-O de darbepoetina comparada con el control del 76.8% al 86% despues de la tercera cosecha. La figura 6 presenta datos del tercer ciclo de cosecha para darbepoetina y muestra como la ocupacion de sitios-O se incremento con concentraciones aumentadas de manganeso. Sin embargo, el manganeso 40 pM afecto negativamente los niveles de produccion de protelna, resultando en una disminucion relativa total del 17% en los mg de darbepoetina producida

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sobre los tres ciclos de cosecha combinados. En contraste, el manganeso 10 mM no parecio afectar sustancialmente la produccion de protelna.

Estos datos demuestran que la adicion de Mn2+ al medio de cultivo incrementa la ocupacion de sitios-O para eritropoyetina y darbepoetina producidas en cultivos celulares CHO.

Ejemplo 5:

Evaluacion de ramificacion sitio-N y ocupacion del sitio-N de rHuEPO

Para determinar la ramificacion de sitios-N de rHuEPO o darbepoetina producida de acuerdo con el ejemplo 1, las fracciones poco sialiladas se analizan por el contenido estructural mediante mapeo de N-galicano y secuenciacion enzimatica acoplada con espectrometrla de masas MALDI-TOF para la determinacion del tamano. En resumen, el procedimiento requiere que los N-glicanos sean liberados enzimaticamente coni U/mL de N-Glicanasa (Sigma), luego desalificados y desproteinizados utilizando cromatografla PGC (VWR). Los N-glicanos libres son marcados en los terminos reducidos con una etiqueta fluorescente de 2-aminobenzamida (2AB) mediante animacion reductiva (Sigma). Un segundo procedimiento de limpieza es mejorado utilizando cromatografla de papel (VWR). Las mezclas de 2AB - glicano son mapeados sobre una columna Dionex PA1 con deteccion de fluorescencia (excitacion 330 nm, emision 420 nm) utilizando un gradiente isocratico de acetato de sodio de 50-150 mM a 1.67 mM/min con hidroxido de sodio (Sigma) a 50 mM. Las mezclas de 2ABN-glicano son desialilados utilizando 1 U/mL de neuraminidasa A. ureafaciens con y sin 0.5 U/mL de galactosidasa B. testes. Todas las digestiones se realizaron a 37 °C por 18h. El analisis del tamano adicional de todas las mezclas de 2ABN-glicano se obtienen por espectrometrla de masas MALDITOF (Voyager, Applied BioSystems). La matriz se satura con acido 2,5-dihidroxi benzoico en 70% de acetonitrilo, 0.05% de TFA (Sigma) y se mezcla en una relacion 1:1 con la mezcla de 2ABN-glicano en la prueba. Los ajustes de MALD son de la siguiente manera: Voltaje de aceleracion: 20,000 V; Tension de red: 94 %; Alambre de gula: 0.05 %; Tiempo de retardo de Extraccion: 75 nsec; Intensidad de laser: 2300; Rango de masa: 500-5000.

Para determinar la ocupacion de N-unido de rHuEPO, 10 mg de un estandar de rHuEPO (Amgen Inc.) se digieren con 0.04 U de N-Glicanasa (Sigma) durante toda la noche a temperatura ambiente para dar una escalera de peso molecular de rHuEPO con variacion de formas ocupadas de N-unido. 0.1 mg de rHuEPO total recolectados del medio de cosecha se cargan y se separan mediante SDS-PAGE (Novex, Invitrogen) y luego se transfieren a PVDF. Las transferencias son probadas con un anticuerpo monoclonal para rHuEPO.

Ejemplo 6:

Efecto de la suplementacion de aminoacidos sobre la produccion y glicosilacion de rHuEPO

Para determinar el efecto de adicion de aminoacidos en la produccion de rHuEPO durante el cultivo celular, los niveles de todos los veinte aminoacidos fueron determinados mediante analisis de aminoacidos en el medio inicial ("medio standard" del ejemplo 1) y luego de nuevo despues de cinco dlas de incubacion en el tercer ciclo de cosecha como se describe anteriormente en el ejemplo 1. Nueve aminoacidos especlficos (no esenciales y esenciales) fueron agotados a bajos niveles (< 3mg/L) sobre este periodo de cultivo: cistelna, isoleucina, leucina, triptofano, valina, asparagina, acido aspartico, glutamato, y glutamina.

Las concentraciones de estos 8 aminoacidos en el medio estandar fueron duplicadas para crear un medio enriquecido. El medio enriquecido consistio de medio suplementado libre de suero 1:1 dMeM/F 12 con un stock de aminoacidos al 1% (2.25 g/L de asparagina; 1.99 g/L de acido aspartico; 1.76 g/L de cistelna; 3.13 g/L de cistina; 2.21 g/L de acido glutamico; 5.45 g/L de isoleucina; 5.91 g/L de leucina; 0.90 g/L de triptofano; y 5.29 g/L de valina). Las celulas fueron cultivadas en cualquier medio estandar o en medio enriquecido, el cual fue utilizado a traves de todos los veintiun dlas del proceso de cultivo. Despues del tercer ciclo de cosecha, el medio fue recolectado y rHuEPO en el medio cosechado fue cuantificado por HPLC fase reversa.

Las celulas CHO cultivadas en medio enriquecido mostraron un modesto incremento del 12% en la produccion de rHuEPO comparado a las celulas control cultivadas en medio estandar. Sin embargo, aunque el medio enriquecido mejoro la produccion de rHuEPO, la cantidad de material poco sialilado fue incrementada dos veces, conduciendo a una disminucion general en rHuEPO altamente sialilada comparada con los cultivos control.

El cambio en la cantidad de rHuEPO encontrado en la mezcla poco sialilado fue debido a un grado inferior de sialilacion de los carbohidratos individuales en lugar de un grado inferior de los carbohidratos ramificados. Las estructuras de carbohidratos unidos a N encontrados en rHuEPO en las fracciones poco sialiladas fueron analizados por MALDI-TOF. Los resultados se presentan posteriormente en la Tabla 1.

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Con el fin de confirmar algunas de las masas vistas mediante MALDI-TOF, la fraccion poco sialilada fue digerida con ya sea neuraminidasa, o neuraminidasa y galactosidasa. Las masas que representaban estructuras de carbohidratos altamente ramificados fueron analizados y comparados entre el crecimiento de los cultivos control en medio estandar y 5 el crecimiento de los cultivos en presencia de medio enriquecido. Las masas que representaban estructuras de

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carbohidratos altamente ramificados (figura 7; estructuras M - T) fueron observadas. La suplementacion de aminoacidos en el medio enriquecido resulto en una masa correspondiente a una estructura altamente ramificada en la cual hace falta la galactosa terminal (figura 7, estructura L). Masas similares de estructuras ramificadas carentes de galactosa fueron detectadas tanto en el control como en los medios enriquecidos (Figura 7, estructuras E, G, I, K, M-N, Q-R), Estos datos indican que el grado de ramificacion en rHuEPO producida en medio estandar y medio enriquecido es similar y sugiere que la perdida de residuos de acido sialico quizas es debida a la disminucion de galactosilacion de carbohidratos N-unidos altamente ramificados.

Ejemplo 7:

Efectos invertidos de manganeso de suplementos de aminoacidos sobre la glicosilacion

La rHuEPO fue cultivada de acuerdo con el ejemplo 1, en medio enriquecido solo o medio enriquecido mas MnCh 0.4, 4 y 40 mM. En los primeros puntos en el cultivo; cuando los numeros de celulas son bajos y la carga metabolica es minima, el medio enriquecido no tiene efecto sobre la glicosilacion de rHuEPO. Sin embargo, la restauracion de estos llquidos agotados eventualmente causo defectos en ambas la ocupacion de oligosacaridos y sialilacion, despues del tercer ciclo de cosecha.

Los resultados de diversos experimentos representativos se muestran en las figuras 9, 10 y 11. La figura 8 muestra que el cultivo de las celulas huesped en medio enriquecido (suplementado con aminoacidos) redujo el porcentaje de recuperacion de rHuEPO altamente sialilado (43%, control vs. 29%, con suplementacion de aminoacido,). La figura 8 tambien muestra que, adicionando el manganeso al medio enriquecido en 40, 4 y 0.4 mM mejoro el porcentaje de recuperacion (31% en 40 mM, 42% en 4 mM, 41% en 0.4 mM).

La figura 9 muestra que el cultivo de las celulas huesped en medio enriquecido (suplementado con aminoacidos) incremento el porcentaje de las formas obtenidas de rHuEPO poco sialilada (7.3% de control vs. 13%, con suplementacion de aminoacido). La figura 9 tambien muestra que adicionando manganeso al medio enriquecido reduce en gran medida el porcentaje de rHuEPO poco sialilada producido en todas las concentraciones de Mn2+ (1.6% en 40 mM, 2.1 % en 4 mM, y 2.4% en 0.4 mM).

La figura 10 muestra que cultivando celulas huesped en medio enriquecido (suplementado con aminoacidos) reduce el porcentaje de ocupacion de sitios-O por cadenas de azucar (76.2% de control vs. 74.8% con suplementacion de aminoacidos). La figura 10 tambien muestra que adicionando manganeso al medio enriquecido incrementado el porcentaje de ocupacion de sitios-O (84.4% en 40 mM, 86.1% en 4 mM, 84.6% en 0.4 mM).

Mientras la calidad de rHuEPO fue claramente mejorada mediante la adicion de Mn2+ 40 mM a los cultivos, el rendimiento de protelna rHuEPO secretada en el medio fue sustancialmente reducida en esta concentracion de Mn2+ (a 36% del control en Mn2+ 40 mM). Los niveles de produccion de protelna permanecieron altos cuando las concentraciones de Mn2+ 4 y 0.4 mM fueron adicionadas al medio enriquecido (109 y 114% de control, respectivamente).

Adicionalmente, la adicion de Mn2+ resulto en masas consistente con los azucares ramificados que contienen formas completamente galactosiladas. La digestion adicional con neuraminidasa mas galactosidasa confirma estos resultados como masas fueron obtenidas consistentes con estructuras de nucleo ausentes de residuos de galactosa. Dentro de la mezcla de rHuEPO menos sialilado, la adicion de Mn2+ resulto en estructuras predominantemente bianatenarias en donde el medio control y el medio enriquecido de aminoacidos contienen estructuras de N-Glicanos mas ramificadas ausentes de galactosa terminal como se describio anteriormente. (figura 7; estructuras H, J, O, S).

Para descartar una posible limitacion del nucleotido donador de azucar UDP-Gal como una causa para galactosilacion reducida cada condicion fue tambien evaluada para cantidades relativas de UDP-Gal. Los datos muestran que los niveles de UDP-Gal en cada condicion fueron estadlsticamente indistinguibles y, por lo tanto, no causan galactosilacion reducida observada con suplementacion de aminoacidos en medio enriquecido. Tampoco fue la disponibilidad de UDP- Gal un factor en la mejora de galactosilacion observada despues de la adicion de Mn2+.

Asl, el dato muestra que la adicion de Mn2+ al medio enriquecido, en todas las concentraciones de Mn2+, marcadamente redujo la fraccion de rHuEPO poco sialilada producida y recuperaciones incrementadas de formas de rHuEPO altamente sialiladas. Se mostraron los efectos sobre sializacion para incrementar con concentraciones crecientes de manganeso de una manera dependiente de la dosis. La adicion de manganeso tambien mejoro la galactosilacion de rHuEPO en la fraccion poco sialilada, e incremento la ocupacion del O-unido. El mejoramiento en la glicosilacion fue independiente del nivel de la produccion de rHuEPO. La evaluacion de la ocupacion del sitio-N mediante Western blot como se describe en el Ejemplo 5 tambien sugiere que la adicion del Mn2+ mejora la ocupacion del sitio-N.

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Crowell, et al.

<120> Production mejorada de Glicoprotelnas Utilizando Manganeso <130> 01017/41658A <150> US 60/748,880 5 <151 > 2005-12-08

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211 > 1725 10 <212> ADN

<213> Homo sapiens <400> 1

Claims (21)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   REIVINDICACIONES

   1. Un metodo para la produccion de una composicion eritropoyetica que comprende glicoprotelnas estimulantes de eritropoyesis sialilada, que comprende las etapas de: crecimiento de una celula huesped CHO sensible al manganeso que produce una glicoprotelna estimulante de eritropoyesis en un medio de cultivo que comprende una cantidad eficaz de manganeso para aumentar la sialilacion de dicha composicion eritropoyetica producida por dicha celula huesped sensible al manganeso, en donde la concentracion de manganeso en dicho medio de cultivo varla desde aproximadamente 0.01 a aproximadamente 40 pM, y en donde las glicoprotelnas estimulantes de eritropoyesis comprenden:

   a) la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO:3 (eritropoyetina) o fragmentos eritropoyeticos de la misma; o (b) la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO:2 (darbepoetina) o fragmentos eritropoyeticos de la misma.
2. 2. El metodo de la reivindicacion 1, que comprende ademas la etapa de recuperacion de una composicion eritropoyetica en donde menos de aproximadamente 5% de las moleculas estimulantes de eritropoyesis son poco sialiladas.
3. 3. El metodo de la reivindicacion 1 en el cual la cantidad de manganeso es eficaz para aumentar el porcentaje de moleculas estimulantes de eritropoyesis altamente sialiladas.
4. 4. El metodo de la reivindicacion 1, en donde la cantidad de manganeso es eficaz para aumentar el porcentaje de moleculas estimulantes de eritropoyesis que son glicosiladas en sitios potenciales de glicosilacion 0-unidos
5. 5. El metodo de la reivindicacion 1, en donde la cantidad de manganeso es eficaz para incrementar el porcentaje de galactosa entre los azucares unidos a moleculas estimulantes de eritropoyesis.
6. 6. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el medio de cultivo es esencialmente libre de suero.
7. 7. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el manganeso esta en una concentracion desde aproximadamente 0.1 a aproximadamente 10 pM.
8. 8. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde el manganeso esta en una concentracion desde aproximadamente 0.4 a aproximadamente 4 pM.
9. 9. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde el medio de cultivo comprende ademas uno o mas aminoacidos suplementarios seleccionados del grupo consiste en asparagina, acido aspartico, cistelna, cistina, isoleucina, leucina, triptofano, o valina.
10. 10. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en donde las celulas huespedes son cultivadas en botellas giratorias.
11. 11. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde el manganeso se adiciona despues de una fase de rapido crecimiento celular.
12. 12. El metodo de la reivindicacion 11, en donde la fase de rapido crecimiento celular dura por un periodo que oscila entre aproximadamente 2 y 20 dlas.
13. 13. El metodo de la reivindicacion 12, en donde en el cual el manganeso se adiciona despues de dos ciclos de cosecha.
14. 14. El metodo de la reivindicacion 13, en donde el primer ciclo de cosecha es aproximadamente 8 dlas y el segundo ciclo de la cosecha es aproximadamente 7 dlas de duracion.
15. 15. El metodo de la reivindicacion 1, que comprende ademas la etapa de la recuperacion de la composicion eritropoyetica la cual comprende dichas glicoprotelnas estimulantes de la eritropoyesis sialiladas a partir de las celulas huesped y el medio de cultivo.
16. 16. El metodo de la reivindicacion 1, que comprende ademas la etapa de recuperacion de la composicion eritropoyetica la cual comprende glicoprotelnas estimulantes de la eritropoyesis altamente sialiladas a partir de las celulas huesped y el medio de cultivo.
17. 17. El metodo de la reivindicacion 15 o 16, en donde dicha recuperacion comprende la separacion de moleculas estimulantes de eritropoyesis altamente sialiladas y moleculas estimulantes de eritropoyesis no sialiladas.
18. 18. El metodo de la reivindicacion 17. en donde dicha separacion es realizada mediante cromatografla de intercambio anionica.
19. 19. Un medio de cultivo que comprende celulas huesped CHO que produce glicoprotelnas estimulantes de la eritropoyesis y manganeso en una concentracion desde aproximadamente 0.01 a aproximadamente 40 pM, en donde

    5 las glicoprotelnas estimulantes de la eritropoyesis comprenden:

    (a) la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO:3 (eritropoyetina) o fragmentos eritropoyeticos de la misma;

    (b) la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO:2 (darbepoetina) o fragmentos eritropoyeticos de la misma.
20. 20. El medio de cultivo de reivindicacion 19, en donde las celulas huespedes secretan una composicion eritropoyetica.
21. 21. El medio de cultivo de reivindicacion 19, en donde el manganeso esta en una concentracion desde 10 aproximadamente 0.1 a aproximadamente 10 pM.

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